CN109762916A - 定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物 - Google Patents
定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109762916A CN109762916A CN201910203424.0A CN201910203424A CN109762916A CN 109762916 A CN109762916 A CN 109762916A CN 201910203424 A CN201910203424 A CN 201910203424A CN 109762916 A CN109762916 A CN 109762916A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- standard solution
- sample
- tested
- plasmid dna
- standard
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 75
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 title claims abstract description 63
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims abstract description 73
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 69
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 39
- 108010028074 Hydrogensulfite Reductase Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 25
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 abstract description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000010620 bay oil Substances 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L sulfite Chemical compound [O-]S([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- -1 Acyl sulfate Chemical compound 0.000 description 1
- 108010032655 Adenylyl-sulfate reductase Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000186541 Desulfotomaculum Species 0.000 description 1
- 241000605716 Desulfovibrio Species 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBMLMWLHJBBADN-UHFFFAOYSA-N Ferrous sulfide Chemical compound [Fe]=S MBMLMWLHJBBADN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- 229910001448 ferrous ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- JEGUKCSWCFPDGT-UHFFFAOYSA-N h2o hydrate Chemical compound O.O JEGUKCSWCFPDGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011155 quantitative monitoring Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物。本发明提供的方法，包括如下步骤：1)、提取待测样品中细菌的基因组DNA和获得不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液；2)、用成套引物分别对稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液和待测样品中细菌的基因组DNA进行PCR扩增，再以稀释后标准品溶液的不同质粒DNA拷贝数的对数值为横坐标，不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数为纵坐标，建立标准曲线；计算待测样品中异化型亚硫酸盐还原酶基因拷贝数，即为待测样品中硫酸盐还原菌含量；本发明为一种检测快、成本低、特异性强、灵敏度高、可重复性好的广谱检测硫酸盐还原菌的方法。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测鉴定技术领域，属于硫酸盐还原菌的快速分子检测领域，尤其涉及定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物。
背景技术
硫酸盐还原菌是一类能够将硫酸盐异化成硫化物并且氧化各种生长底物的专性厌氧菌。在自然界中，但凡是厌氧的条件，都能拓生出硫酸盐还原菌的生态位，例如酸矿废水、蓝藻微生物垫、深海热液喷口、高盐微生物垫、海洋与淡水沉积物、海洋沉积物的沼气区、油田、厌氧净化植物、植物根系土壤、稻田等特定生态环境。
迄今为止，人们记载过的硫酸盐还原菌已超60个属中的220个品种。在油田中，最常见的硫酸盐还原菌是脱硫弧菌(Desultphovbrio)和脱硫肠状菌(Desulphfotomaculum)。
硫酸盐还原菌能够利用糖类、蛋白质、核酸和脂质几乎所有的降解产物，将硫酸盐离子最终变成H2S等有毒的硫化物，进而导致周围环境的腐蚀和酸化，尤其是针对储油罐、油气井、输油管道、油轮和冷却塔等水环境。比如说，硫酸盐还原菌会寄生在储油罐中，尤其在注水时，会形成大量的H2S，这会导致罐体酸化，进而引起腐蚀和脱离等安全问题。硫酸盐还原菌还能寄生在井身、输油管道等管体、存储容器中，类似地也会产生H2S以及严重的侵蚀现象。硫酸盐还原菌会寄生于储油容器、输油管道、冷却塔里的其他微生物菌落中，形成H2S和其他代谢产物，进而也能引起严重的腐蚀问题。
鉴于硫酸盐还原菌所引起的严重腐蚀现象，探寻一种可以灵敏、迅捷、广谱、可靠地在线定量监测工业操作环境中硫酸盐还原菌含量的方法，在实时分析腐蚀情况、及时采取防腐措施、延长设备使用期限、保障工业生产运行、保护水质生态环境等方面具有非常重要的意义。
在硫酸盐还原菌检测方面，目前使用的方法涉及以下4种类型：1)培养法，例如在液体培养基中检测硫酸盐还原菌的最大可能数法(国标方法)，其原理是利用硫化物与培养基中的亚铁离子反应生成黑色的硫化亚铁，根据测试瓶变黑的数目和待测样品的稀释倍数，查询数目表来得到样品中的硫酸盐还原菌的浓度。此方法虽有极高的准确性和极低的检出限，但耗时较久，只能检测出可培养的硫酸盐还原菌；2)基于特征化合物的检测方法，例如腺苷酰硫酸还原酶测定法，其原理是显色剂能够与待测样品细胞中裂解释放出的腺苷酰硫酸还原酶结合并产生蓝色响应，响应颜色的深浅与该酶的含量成正比关系，酶含量越高，产生的蓝色越深，最终通过比色卡读出硫酸盐还原菌的检测结果。此方法检测速度快，支持固体和半固体样品检测以及检测所有硫酸盐还原菌菌株(包含标准培养基无法培养的菌株)，但操作可重复性一般，有误差，需要对待测样品采取浓缩措施才能达到极低的检出限；3)基于细胞的检测方法，例如凝集反应检测法，其原理是细菌或者细胞等颗粒性抗原与抗体结合后，凝集成凝聚态颗粒，以出现凝集现象的最高稀释倍数推测待测样品中硫酸盐还原菌的数量。此方法特异性强，响应灵敏，检测迅速，但缺乏普适性抗体，且受主观影响较大，难以精确确定硫酸盐还原菌的数量；4)基于遗传物质的检测方法，例如聚合酶链式反应(PCR)检测法，其原理是根据硫酸盐还原菌特有的遗传标记物质(例如异化型亚硫酸盐还原酶基因序列)设计引物，通过检测扩增产物的琼脂糖凝胶电泳条带的亮度值来确定硫酸盐还原菌的含量。
发明内容
为了快速准确定量检测待测样品中硫酸盐还原菌含量，本发明提供了如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种定量检测待测样品中硫酸盐还原菌含量的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)、提取待测样品中细菌的基因组DNA和获得不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液；
所述获得不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的方法包括如下步骤：
1)-a、制备标准品溶液：将含有异化型亚硫酸盐还原酶基因的质粒溶于水中，得到标准品溶液；
1)-b、检测所述标准品溶液的质粒DNA拷贝数：
先检测所述标准品溶液的OD260值，再按照如下公式1至公式3计算标准品溶液的质粒DNA拷贝数：
标准品的浓度A(ng/μL)＝标准品溶液的OD260值×50(ng/μL)(公式1)；
标准品的摩尔质量B(g)＝标准品碱基数的对数×660(g)(公式2)；
标准品溶液的质粒DNA拷贝数(copies/μL)＝6.02×1023×标准品的浓度A×10-9(g/μL)/标准品的摩尔质量B(公式3)；
1)-c、按照所述标准品溶液的质粒DNA拷贝数进行梯度稀释，得到稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液；
2)、用成套引物分别对所述稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液和待测样品中细菌的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，得到不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数和待测样品的荧光定量PCR扩增反应初始循环数；
再以稀释后标准品溶液的不同质粒DNA拷贝数的对数值为横坐标，不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数为纵坐标，建立标准曲线；
再将所述待测样品的荧光定量PCR扩增反应初始循环数代入标准曲线，计算获得待测样品中异化型亚硫酸盐还原酶基因的拷贝数，即为待测样品中硫酸盐还原菌含量；
所述成套引物，为能扩增靶序列的引物对；
所述靶序列为由引物F和引物R扩增得到的片段；
所述引物F为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物R为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
由于异化型亚硫酸盐还原酶基因在单个硫酸盐还原菌中为单拷贝，因此，待测样品中异化型亚硫酸盐还原酶基因拷贝数(copies/μL)＝待测样品中质粒DNA拷贝数(copies/μL)＝待测样品中细菌浓度(个/μL)。
上述方法中，
所述异化型亚硫酸盐还原酶基因为如下c1)或c2)：
c1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
上述方法中，
所述按照所述标准品溶液的质粒DNA拷贝数进行10倍梯度稀释至102copies/μL，得到稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液；
上述成套引物、标准品溶液和记载所述公式1至公式3)的可读载体在定量检测待测样本硫酸盐还原菌含量中的应用也是本发明保护的范围。
上述成套引物、标准品溶液和记载所述公式1至公式3)的可读载体在制备定量检测待测样本硫酸盐还原菌含量产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种定量检测待测样本硫酸盐还原菌含量产品，包括上述中的成套引物、标准品溶液和记载所述公式1至公式3)的可读载体。
本发明采用特异性引物对目标基因序列进行荧光定量PCR，获得待测样品中硫酸盐还原菌的相对含量，克服了现有检测方法在培养周期、可操作性、菌种局限性及计数稳定性等方面的缺陷，是一种检测快、成本低、特异性强、灵敏度高、可重复性好的广谱检测硫酸盐还原菌的方法。
本发明技术方案相对于现有硫酸盐还原菌定量分子检测方法的优点在于：无需筛选培养硫酸盐还原菌的纯系单菌，也无需进行琼脂糖凝胶电泳成像，引物设计简单、节省设备成本、操作便捷、检测费用低。
附图说明
图1是荧光定量PCR反应初始循环数与样品质粒DNA拷贝数(硫酸盐还原菌含量，单位为：个/mL)关系的标准曲线；
图2是荧光定量PCR扩增反应中标准样品与待测样品的熔解峰图谱；
图3是梯度稀释样品后，荧光定量PCR法与绝迹稀释法检测趋势对比图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、用于检测硫酸盐还原菌的引物及其专用试剂盒
一、用于检测硫酸盐还原菌的引物
根据异化型亚硫酸盐还原酶(dissimilatory sulfite reductase)的基因序列(详见序列表中序列3)，设计如下引物：
正向引物：CAACATCGTYCAYACCCAGGG(序列1)；
反向引物：GTGTAGCAGTTACCGCA(序列2)。
二、定量PCR检测硫酸盐还原菌的方法的建立
1、待测样品基因组DNA的提取
提取待测样品中细菌的基因组DNA。
2、不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的制备
1)制备标准品溶液
标准品为含有异化型亚硫酸盐还原酶基因质粒，该质粒为将序列表中序列3所示的异化型亚硫酸盐还原酶基因插入pMD 19-T载体(TaKaRa公司，TaKaRa Code:6013)中得到的质粒。
标准品溶液：将含有异化型亚硫酸盐还原酶基因的质粒溶于水中，得到标准品溶液。
2)、不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的制备
用BioDrop分光光度计检测标准品溶液的OD260值；
按照如下公式进行计算标准品溶液的质粒DNA拷贝数：
标准品的浓度A(ng/μL)＝标准品溶液的OD260值×50(ng/μL)(公式1)；其中，OD260是分光光度计的吸光度，50是每个吸光度对应的DNA浓度。
标准品的摩尔质量B(g)＝标准品碱基数的对数×660(g)(公式2)；其中，660是一对核苷酸的平均相对分子质量。
标准品溶液的质粒DNA拷贝数(copies/μL)＝6.02×1023×标准品的浓度A×10-9(g/μL)/标准品的摩尔质量B(公式3)；其中，6.02×1023是阿伏伽德罗常数，10-9是单位的换算。
按照标准品溶液的质粒DNA拷贝数，将标准品溶液进行10倍梯度稀释至质粒DNA拷贝数为102copies/μL，得到稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液。
3、荧光定量PCR扩增
采用上述正向引物(序列1)和反向引物(序列2)对不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液和待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，得到不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数和待测样品的荧光定量PCR扩增反应初始循环数；
上述荧光定量PCR扩增的反应体系如下：SYBR Green qPCR Master Mix(绿色荧光染料混合试剂，TaKaRa公司(包含Taq DNA聚合酶、dNTP、反应缓冲液、荧光染料SYBR Green等试剂)10μL，浓度为20μΜ的正向引物和反向引物各0.5μL(终浓度0.5μΜ)，标准样品或待测样品DNA 1μL，无菌水补足至20μL。
上述荧光定量PCR仪由Bio-Rad公司制造，型号为iQTM5。
上述荧光定量PCR扩增的程序设置为：1)95℃保温10min；2)95℃保温20s；3)60℃保温1min；4)重复执行2)-3)40次；5)从60℃开始每10s增加0.5℃至达到95℃为止。
4、待测样品中硫酸盐还原菌的定量分析
由于异化型亚硫酸盐还原酶基因在单个硫酸盐还原菌中为单拷贝，因此，待测样品中异化型亚硫酸盐还原酶基因拷贝数(copies/μL)＝待测样品中质粒DNA拷贝数(copies/μL)＝待测样品中细菌浓度(个/μL)。
以稀释后标准品溶液的不同质粒DNA拷贝数的对数值为横坐标，不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数为纵坐标，建立标准曲线。
将待测样品的荧光定量PCR扩增反应初始循环数代入标准曲线，计算获得待测样品中异化型亚硫酸盐还原酶基因拷贝数，即为待测样品中硫酸盐还原菌含量。
三、试剂盒的制备
将单独包装的正向引物和反向引物制备检测硫酸盐还原菌的试剂盒。
或将荧光定量PCR扩增的反应体系制备检测硫酸盐还原菌的试剂盒；其中，荧光定量PCR扩增的反应体系包括绿色荧光染料混合试剂、正向引物和反向引物。
上述检测硫酸盐还原菌的试剂盒还包括标准品溶液和记载公式1)-3)的可读载体。
标准品溶液为含有异化型亚硫酸盐还原酶基因的质粒水溶液。
含有异化型亚硫酸盐还原酶基因质粒为将序列表中序列3所示的异化型亚硫酸盐还原酶基因插入pMD 19-T载体(TaKaRa公司，TaKaRa Code:6013)中得到的质粒。
实施例2、定量PCR检测硫酸盐还原菌
我国渤海油田某平台采油井产出液样品中硫酸盐还原菌的检测。
1、待测样品基因组DNA的提取
使用Axygen细菌基因组DNA提取试剂盒提取待测样品渤海油田某平台采油井产出液中的细菌DNA。
2、不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的制备
1)制备标准品溶液
标准品为含有异化型亚硫酸盐还原酶基因质粒，该质粒为将序列表中序列3所示的异化型亚硫酸盐还原酶基因插入pMD 19-T载体(TaKaRa公司，TaKaRa Code:6013)中得到的质粒。
标准品溶液：将含有异化型亚硫酸盐还原酶基因的质粒溶于水中，得到标准品溶液。
2)、不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的制备
用BioDrop分光光度计检测标准品溶液的OD260值；
按照如下公式进行计算标准品溶液的质粒DNA拷贝数：
标准品的浓度A(ng/μL)＝标准品溶液的OD260值×50(ng/μL)；
其中，OD260是分光光度计的吸光度，50是每个吸光度对应的DNA浓度。
标准品的摩尔质量B(g)＝标准品碱基数的对数×660(g)；
其中，660是一对核苷酸的平均相对分子质量。
标准品溶液的质粒DNA拷贝数(copies/μL)＝6.02×1023×标准品的浓度A×10-9(g/μL)/标准品的摩尔质量B；
其中，6.02×1023是阿伏伽德罗常数，10-9是单位的换算。
按照标准品溶液的质粒DNA拷贝数，将标准品溶液进行10倍梯度稀释至DNA拷贝数为102copies/μL，得到稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液。
上述标准品的浓度A(ng/μL)为196.9ng/μL；根据前面的质粒DNA拷贝数的公式计算出标准品溶液中质粒DNA的拷贝数为3.88×1010copies/μL。
计算出拷贝数以后，对质粒DNA的拷贝数进行10倍梯度稀释，一般将标准样品系列溶液的浓度控制在109-102copies/μL，得到稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液。
3、荧光定量PCR扩增
采用上述正向引物(序列1)和反向引物(序列2)对不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液和待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，得到不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数和待测样品的荧光定量PCR扩增反应初始循环数；
上述荧光定量PCR扩增的反应体系如下：SYBR Green qPCR Master Mix(绿色荧光染料混合试剂，TaKaRa公司(包含Taq DNA聚合酶、dNTP、反应缓冲液、荧光染料SYBR Green等试剂)10μL，浓度为20μΜ的正向引物和反向引物各0.5μL(终浓度0.5μΜ)，标准样品或待测样品DNA 1μL，无菌水补足至20μL。
上述荧光定量PCR仪由Bio-Rad公司制造，型号为iQTM5。
上述荧光定量PCR扩增的程序设置为：1)95℃保温10min；2)95℃保温20s；3)60℃保温1min；4)重复执行2)-3)40次；5)从60℃开始每10s增加0.5℃至达到95℃为止。
4、待测样品中硫酸盐还原菌的定量分析：
由于异化型亚硫酸盐还原酶基因在单个硫酸盐还原菌中为单拷贝，因此，待测样品中异化型亚硫酸盐还原酶基因拷贝数(copies/μL)＝待测样品中质粒DNA拷贝数(copies/μL)＝待测样品中细菌浓度(个/μL)。
以稀释后标准品溶液的不同质粒DNA拷贝数的对数值为横坐标，不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数为纵坐标，建立标准曲线。
将待测样品的荧光定量PCR扩增反应初始循环数代入标准曲线，计算获得待测样品中异化型亚硫酸盐还原酶基因拷贝数，即为待测样品中硫酸盐还原菌含量。
表1为经过10倍梯度稀释所得标准样品的定量数据。绘制标准样品的荧光定量PCR反应初始循环数与样品中硫酸盐还原菌含量关系的标准曲线见图1。待测样品渤海油田某平台采油井产出液的荧光定量PCR反应初始循环数及定量检测结果见表2。
表1标准样品的荧光定量PCR扩增数据
表2渤海油田某平台采油井产出液样品的荧光定量PCR扩增数据
(注：实验中，对待测样品进行3组平行检测)
结合表1、表2和标准曲线(图1)，可以确定渤海油田某平台采油井产出液样品中硫酸盐还原菌的浓度为1.76×104个/mL。
实施例3、定量PCR检测硫酸盐还原菌的灵敏度和特异性检测
一、定量PCR检测硫酸盐还原菌的灵敏度
实施例2的荧光定量PCR扩增反应熔解峰图谱如图2所示，各个样品(图谱中的熔解曲线包含3个平行待测样品、8级梯度稀释的标样，每级一个样品，共11条曲线叠合而成)实时荧光定量PCR产物均只有一个特征峰，故判定为引物灵敏性良好，且为特异性扩增，即样品中只有硫酸盐还原菌被检测了。
二、方法的准确性与可靠性验证
对实施例2的待测样品采用绝迹稀释法(SY/T 5329-2012《碎屑岩油藏注水水质指标及分析方法》；SY/T 0532-2012《油田注入水细菌分析方法绝迹稀释法》)校对实时荧光定量PCR的检测结果。
结果如图3所示，两种方法中逐级稀释样品的SRB含量均呈现了梯度变化，实时荧光定量PCR方法的稳定性更好，基本呈现了10倍梯度的变化趋势，体现了该方法的准确性与可靠性。
SEQUENCE LISTING
<110>中国海洋石油集团有限公司 中海油研究总院有限责任公司
<120>检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> y为t/u或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> y 为 t/u或c
<400> 1
caacatcgty cayacccagg g 21
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gtgtagcagt taccgca 17
<210> 3
<211> 383
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
tcaacatcgt tcacacccag ggatggattc actgccatac cccggcctcc gatgcgtccg 60
gtacggtcaa ggccaccatg gacgttctgt ttgatgattt caaacagcac agaatgcccg 120
ctcacgttcg agtgtccatg gcctgctgtc tgaacatgtg cggcgcggtt cactgctcgg 180
atatcgccat tctgggatac cacagaaaac ctcccatgct cgatcacgaa tatctggaca 240
aaatgtgcga aattcctctg gccatcgcag cttgccccac ggcggccatt aaaccggcca 300
aggtgaccct gcccagcgga acccaggttc agaatgttgc agtcaataac gaacgctgca 360
tgttctgcgg taactgctac aca 383
Claims (6)
1.一种定量检测待测样品中硫酸盐还原菌含量的方法，包括如下步骤：
1)、提取待测样品中细菌的基因组DNA和获得不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液；
所述获得不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的方法包括如下步骤：
1)-a、制备标准品溶液：将含有异化型亚硫酸盐还原酶基因的质粒溶于水中，得到标准品溶液；
1)-b、检测所述标准品溶液的质粒DNA拷贝数：
先检测所述标准品溶液的OD260值，再按照如下公式1至公式3计算标准品溶液的质粒DNA拷贝数：
标准品的浓度A(ng/μL)＝标准品溶液的OD260值×50(ng/μL) (公式1)；
标准品的摩尔质量B(g)＝标准品碱基数的对数×660(g) (公式2)；
标准品溶液的质粒DNA拷贝数(copies/μL)＝6.02×1023×标准品的浓度A×10-9(g/μL)/标准品的摩尔质量B (公式3)；
1)-c、按照所述标准品溶液的质粒DNA拷贝数进行梯度稀释，得到稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液；
2)、用成套引物分别对所述稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液和待测样品中细菌的基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，得到不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数和待测样品的荧光定量PCR扩增反应初始循环数；
再以稀释后标准品溶液的不同质粒DNA拷贝数的对数值为横坐标，不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数为纵坐标，建立标准曲线；
再将所述待测样品的荧光定量PCR扩增反应初始循环数代入标准曲线，计算获得待测样品中异化型亚硫酸盐还原酶基因拷贝数，即为待测样品中硫酸盐还原菌含量；
所述成套引物，为能扩增靶序列的引物对；
所述靶序列为由引物F和引物R扩增得到的片段；
所述引物F为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物R为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述异化型亚硫酸盐还原酶基因为如下c1)或c2)：
c1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述按照所述标准品溶液的质粒DNA拷贝数进行10倍梯度稀释至102copies/μL，得到稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液。
4.权利要求1-3中任一所述方法中的成套引物、标准品溶液和记载所述公式1至公式3)的可读载体在定量检测待测样本硫酸盐还原菌含量中的应用。
5.权利要求1-3中任一所述方法中的成套引物、标准品溶液和记载所述公式1至公式3)的可读载体在制备定量检测待测样本硫酸盐还原菌含量产品中的应用。
6.一种定量检测待测样本硫酸盐还原菌含量产品，包括权利要求1-3中任一所述方法中的成套引物、标准品溶液和记载所述公式1至公式3)的可读载体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910203424.0A CN109762916A (zh) | 2019-03-18 | 2019-03-18 | 定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910203424.0A CN109762916A (zh) | 2019-03-18 | 2019-03-18 | 定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109762916A true CN109762916A (zh) | 2019-05-17 |
Family
ID=66458400
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910203424.0A Pending CN109762916A (zh) | 2019-03-18 | 2019-03-18 | 定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109762916A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112210621A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-01-12 | 江苏宏众百德生物科技有限公司 | 一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法 |
| CN114317793A (zh) * | 2022-01-14 | 2022-04-12 | 西南石油大学 | 一种硫酸盐还原菌的检测引物及快速检测方法 |
| CN114958981A (zh) * | 2021-02-19 | 2022-08-30 | 壹宏(深圳)基因有限公司 | 一种通过灰度值计算微生物单元数浓度的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101086022A (zh) * | 2007-06-08 | 2007-12-12 | 哈尔滨工业大学 | 用于定量检测硫酸盐功能菌的引物及荧光探针 |
| CN101086021A (zh) * | 2007-06-08 | 2007-12-12 | 哈尔滨工业大学 | 用于检测硫酸盐还原菌的引物和荧光探针 |
| CN101089195A (zh) * | 2007-06-08 | 2007-12-19 | 哈尔滨工业大学 | 用于检测硫酸盐还原菌的引物和荧光探针 |
| CN105112543A (zh) * | 2015-09-22 | 2015-12-02 | 北京世纪金道石油技术开发有限公司 | 一种硫酸盐还原菌的分子检测方法 |
-
2019
- 2019-03-18 CN CN201910203424.0A patent/CN109762916A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101086022A (zh) * | 2007-06-08 | 2007-12-12 | 哈尔滨工业大学 | 用于定量检测硫酸盐功能菌的引物及荧光探针 |
| CN101086021A (zh) * | 2007-06-08 | 2007-12-12 | 哈尔滨工业大学 | 用于检测硫酸盐还原菌的引物和荧光探针 |
| CN101089195A (zh) * | 2007-06-08 | 2007-12-19 | 哈尔滨工业大学 | 用于检测硫酸盐还原菌的引物和荧光探针 |
| CN105112543A (zh) * | 2015-09-22 | 2015-12-02 | 北京世纪金道石油技术开发有限公司 | 一种硫酸盐还原菌的分子检测方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 张双庆等: "《营养组学》", 30 November 2015, 中国协和医科大学出版社 * |
| 张玉等: "东海海域表层沉积物中硫酸盐还原菌分布特征研究", 《中国环境科学》 * |
| 景晓等: "《蚊媒传染病监测技术及应用》", 31 August 2017, 山东人民出版社 * |
| 李永峰: "《环境生物技术 典型厌氧环境微生物过程》", 31 August 2014, 哈尔滨工业大学出版社 * |
| 贾钦等: "微生物对汞矿区农田土壤汞甲基化的影响", 《环境科学》 * |
| 顾卿等: "奉化江底泥碳、氮、硫转化功能基因的定量研究", 《环境污染与防治》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112210621A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-01-12 | 江苏宏众百德生物科技有限公司 | 一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法 |
| CN114958981A (zh) * | 2021-02-19 | 2022-08-30 | 壹宏(深圳)基因有限公司 | 一种通过灰度值计算微生物单元数浓度的方法 |
| CN114317793A (zh) * | 2022-01-14 | 2022-04-12 | 西南石油大学 | 一种硫酸盐还原菌的检测引物及快速检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pernthaler et al. | Fluorescence in situ hybridization (FISH) with rRNA-targeted oligonucleotide probes | |
| Cichocki et al. | Bacterial mock communities as standards for reproducible cytometric microbiome analysis | |
| CN109762916A (zh) | 定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物 | |
| Shafi et al. | Aquatic bacterial diversity: Magnitude, dynamics, and controlling factors | |
| CN101570783A (zh) | 水产品中9种致病性微生物检测试剂盒及检测方法 | |
| CN105316422A (zh) | 一种用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒及其应用 | |
| CN106755287B (zh) | 一种微生物相对含量检测计数方法 | |
| CN102213721B (zh) | 一种发光菌毒性测定方法 | |
| Deng et al. | Improving the accuracy of flow cytometric quantification of microbial populations in sediments: importance of cell staining procedures | |
| CN116926218A (zh) | 一种检测拟柱孢藻菌型的探针组合、基因芯片、试剂盒及方法 | |
| CN103088133B (zh) | 一种硫酸盐还原菌的检测方法 | |
| CN101633952A (zh) | 水产品中5种致病性弧菌检测试剂盒及其检测方法 | |
| Tidwell et al. | Flow cytometry as a tool for oilfield biocide efficacy testing and monitoring | |
| CN102230009A (zh) | 定量湖泊沉积物中氨氧化古菌的方法 | |
| Peng et al. | Methods for genomic characterization and maintenance of anaerobic fungi | |
| CN101974633B (zh) | 一种定量检测微囊藻的方法及其专用标准品 | |
| CN108277290A (zh) | 金黄色葡萄球菌干粉化lamp快速检测试剂盒 | |
| CN112342279A (zh) | 一种同时检测水华蓝藻拉氏尖头藻和产拟柱胞藻毒素特异基因的试剂盒及其方法 | |
| CN106520757A (zh) | 一种单增李斯特氏菌核酸标准物质的制备方法 | |
| Chen et al. | Real-time quantitative PCR with gene probe, fluorochrome and flow cytometry for microorganism analysis | |
| Romanova et al. | Methodological aspects of the determination of the bacterioplankton number, biomass, and production | |
| Zhao et al. | Application of the Ludox-QPS method for estimating ciliate diversity in soil and comparison with direct count and DNA fingerprinting | |
| CN104975090A (zh) | 一种丁烷氧化菌丰度的自动化检测方法 | |
| CN101381765B (zh) | 副溶血性弧菌的实时fq-pcr检测试剂盒及检测方法 | |
| CN102605069B (zh) | 肠出血性大肠杆菌o104︰h4检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190517 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |