CN103088133B - 一种硫酸盐还原菌的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测硫酸盐还原菌的特异性引物对（正向：GCGTAGATATCAGGAGGAACAC，反向：CACCTAGCACCCATCGTTTAT）及使用该引物对检测硫酸盐还原菌的方法。采用该特异性引物对结合荧光定量PCR方法可对环境样品中嗜热脱硫肠状菌（Desulfotomaculum thermocisternum）进行快速定量分析。本发明方法克服了传统技术的缺陷，具有特异性强，操作便捷、检测准确等特点。

Description

一种硫酸盐还原菌的检测方法
技术领域
本发明涉及微生物检测鉴定技术领域，尤其是涉及一种硫酸盐还原菌的快速检测方法。
背景技术
硫酸盐还原菌（SRB）是一类能够还原硫酸盐的细菌的总称，目前已发现18个属约几十种。虽然已经对SRB进行了大量研究，但目前对有些SRB的生理生长特性还没有完全认识，对其培养方法也了解甚少。此外，某些SRB由于生长条件苛刻，培养难度较大，因此依赖培养的方式还无法对所有SRB进行系统的定量分析。研究表明，高温环境中SRB主要以脱硫肠状菌属(Desulfotomaculum)为主。Desulfotomaculum为中温型或高温型，是直或弯的杆菌，大小为0.3~1.5×3~6μm，端圆，一般单生，有时也呈链状，能以周生鞭毛运动。其孢子呈卵圆形或球形，丛端生到次端生。孢子可以使细胞膨胀，一般为革兰氏阴性。脱硫肠状菌属是有机化能营养型细菌，呼吸代谢过程中，可以利用硫酸盐、亚硫酸盐和还原性硫化物作为电子受体，并将硫元素还原为S2-。可以利用乳酸盐和丙酮酸盐为电子受体；一般不能利用碳水化合物和乙酸盐。脱硫肠状菌属在含有还原性硫化物和有机生长因子的培养基内生长，一般将有机物氧化为醋酸盐或其同系物，并生成二氧化碳。脱硫肠状菌属是严格厌氧型细菌，其生长的最适温度为35~55℃，有些菌种的最高耐受温度可达到70℃。
嗜热硫酸盐还原菌一般生长在较深的地层水体中，对高热环境中管道（如油田采油井油管和套管等）、金属设施（泵）等的腐蚀有重要影响。特异性地对嗜热硫酸盐还原菌进行检测可以了解高热环境中硫酸盐还原菌的发育情况，并可据此对腐蚀情况进行分析，以便采取适当的措施有效控制腐蚀。嗜热脱硫肠状菌Desulfotomaculum thermocisternum在高热环境中普遍发育，是最具典型的硫酸盐还原菌，快速检测分析Desulfotomaculumthermocisternum在保障生产正常运行、延长高热环境中金属设施的使用寿命、保护地层环境等方面具有非常重要的现实意义。
在硫酸盐还原菌检测分析方面，传统技术主要包括以下3种方法：
（1）直接镜检法；(2)液体培养方法（测试瓶法）：将待测样品进行梯度稀释，利用硫酸盐还原菌选择性培养基培养不同稀释度的待检测样品，获得硫酸盐还原菌培养液，根据培养液性状结合最大概率数法（MPN法）确定细菌浓度；(3)固体培养方法：用硫酸盐还原菌选择性固体培养基筛选分离硫酸盐还原菌，根据菌落数确定细菌浓度。
待测样品一般通过采集的方法获得，其中包括多种微生物，单就硫酸盐还原菌而言，也是多种多样：既包括嗜热硫酸盐还原菌，也包括中低温硫酸盐还原菌；既包括可培养硫酸盐还原菌，也包括不可培养硫酸盐还原菌。同时，不同菌的丰度相差巨大。因此，按照前述的3种传统方法检测硫酸盐还原菌存在如下缺陷：对于丰度低的硫酸盐还原菌，可能出现漏检；对于各种不同生理特性的硫酸盐还原菌，往往因为培养条件不适而造成漏检；检测周期长、消耗大、工作量大；镜检等方法不能有效将硫酸盐还原菌区分开而导致较大的测定误差；对于嗜热硫酸盐还原菌和非嗜热硫酸盐还原菌不能有效地区分开，造成嗜热菌检测上的误差；环境（如油藏）中孕育着丰富多样的微生物，其中绝大多数嗜高温硫酸盐还原菌生长在较深的地层不易培养和分离，用传统方法无法准确检测到这些微生物，并及时了解较深地层管道的腐蚀情况。
本发明采用特异性引物结合荧光定量PCR扩增目标DNA的方法，获得环境样品中嗜热脱硫肠状菌属的相对含量，克服了传统技术中培养及计数等方面的一系列缺陷。本发明方法特异性强，操作便捷、检测准确。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种针对性强、操作快捷简便的硫酸盐还原菌检测方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
提供一种检测硫酸盐还原菌的特异性引物对，其序列为：
正向：GCGTAGATATCAGGAGGAACAC（SEQ ID NO:1）；
反向：CACCTAGCACCCATCGTTTAT(SEQ ID NO:2）。
提供一种检测硫酸盐还原菌的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样品中微生物的DNA；
（2）采用上述特异性引物对
正向：GCGTAGATATCAGGAGGAACAC（SEQ ID NO:1），
反向：CACCTAGCACCCATCGTTTAT(SEQ ID NO:2），
对嗜热脱硫肠状菌（Desulfotomaculum thermocisternum）标准样品DNA和步骤（1）获得的待测样品DNA进行荧光定量PCR扩增；
（3）读取荧光定量PCR扩增反应初始循环数，获得环境样品中嗜热脱硫肠状菌（Desulfotomaculum thermocisternum）的定量结果。
本发明的硫酸盐还原菌检测方法中，提取嗜热脱硫肠状菌Desulfotomaculum thermocisternum标准样品DNA和待测样品DNA的方法按照Axygen公司的细菌组DNA提取试剂盒说明书进行（Axygen生物科技有限公司，美国）。
所述的嗜热脱硫肠状菌Desulfotomaculum thermocisternum标准样品DNA的系列溶液按以下方式制备：取纯培养Desulfotomaculumthermocisternum样品，测定细菌浓度后按10倍梯度稀释，分别提取不同稀释样品的DNA。
所述的嗜热脱硫肠状菌Desulfotomaculum thermocisternum标准样品DNA，在针对不同待测样品检测时可重复使用。
所述的荧光定量PCR扩增，反应体系组成如下：9.5μL无菌水、12.5μL Universal SYBR Green Master Mix（普通SYBR绿色荧光染料混合试剂，Bio-Rad生物科技有限公司，美国）和12.5μM的正向和反向引物各0.5μL、2μL标准样品DNA或待测样品DNA。
待测样品DNA的浓度控制在20至100ng/μL。
所用荧光定量PCR仪由Bio-Rad公司制造，型号为C1000 ThermalCycler。
所述的荧光定量PCR扩增，程序设置为：a)95°C保温3min；b)94°C保温20s；c)60°C保温30s；d)重复执行b）~c）39次；e)从65℃开始每5s增加0.5℃至达到95℃为止；f)读取荧光定量PCR扩增反应初始循环数。
由荧光定量PCR反应初始循环数及标准样品细菌浓度和反应循环数对应关系，确定待测环境样品中嗜热脱硫肠状菌（Desulfotomaculumthermocisternum）的浓度。
附图的简要说明
图1为初始循环数与嗜热脱硫肠状菌（Desulfotomaculumthermocisternum）细菌浓度关系的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。该实施例仅仅是对本发明的举例说明，并不意味着对本发明范围的限制。
实施例
我国华北油田某采油井产出液样品中嗜热脱硫肠状菌Desulfotomaculum thermocisternum的检测
1.硫酸盐还原菌的特异性引物
本发明设计的特异性引物（正向：GCGTAGATATCAGGAGGAACAC，反向：CACCT AGCACCCATCGTTTAT）。
2.纯培养嗜热脱硫肠状菌Desulfotomaculum thermocisternum，测定其细菌浓度为2×105个/mL。
3.系列稀释纯培养嗜热脱硫肠状菌（Desulfotomaculumthermocisternum）样品，按照Axygen细菌基因组DNA提取试剂盒（Axygen生物科技有限公司，美国）说明书提取稀释样品嗜热脱硫肠状菌（Desulfotomaculum thermocisternum）的DNA，获得对应不同细菌浓度的标准样品DNA。
4.按照Axygen细菌基因组DNA提取试剂盒（Axygen生物科技有限公司，美国）说明书提取待测样品华北油田某采油井产出液中微生物的DNA。
5.采用特异性引物（正向：GCGTAGATATCAGGAGGAACAC，反向：CACCTAGCACCCATCGTTTAT）对获得的标准样品DNA和待测样品华北油田某采油井产出液中微生物的DNA进行荧光定量PCR扩增，反应体系和反应条件如下：
1）荧光定量PCR扩增反应体系：荧光定量PCR扩增反应总体系为25μL，PCR扩增反应总体系的详细组成包括：9.5μL无菌水，12.5μLUniversal SYBR Green Master Mix（普通SYBR绿色荧光染料混合试剂，Bio-Rad生物科技有限公司，美国），12.5μM的正反向引物各0.5μL，2μL标准样品DNA或待测样品DNA。待测样品DNA的浓度控制在20至100ng/μL。
2）荧光定量PCR扩增反应条件：荧光定量PCR仪使用Bio-Rad公司的C1000Thermal Cycler。荧光定量PCR扩增程序设置为：a)95°C保温3min；b)94°C保温20s；c)60°C保温30s；d)重复执行b）~c）39次；e)从65℃开始每5s增加0.5℃至达到95℃为止；f)读取PCR反应初始循环数。
6.待测样品中嗜热脱硫肠状菌（Desulfotomaculum thermocisternum）的定量分析
表1为系列稀释标准菌的数据。绘制标准菌的细菌浓度与初始循环数标准曲线见图1，待测样品华北油田某采油井产出液初始循环数及检测结果见表2。
表1标准样品的荧光定量PCR扩增数据表
(注：“D.thermocisternum”为“Desulfotomaculum thermocisternum”的简写，下同)。
表2华北油田某采油井产出液样品的PCR扩增定量数据
结合表1、表2和标准曲线（图1），可以确定华北油田某采油井产出液样品中嗜热脱硫肠状菌（Desulfotomaculum thermocisternum）细菌浓度为1.72×102个/mL。

Claims (6)

1.一种检测硫酸盐还原菌用的引物对，其序列为：
正向：GCGTAGATATCAGGAGGAACAC；
反向：CACCTAGCACCCATCGTTTAT，
所述引物对是针对嗜热脱硫肠状菌Desulfotomaculum thermocisternum设计的。
2.一种检测硫酸盐还原菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品中微生物的DNA；
(2)采用权利要求1所述引物对，对Desulfotomaculumthermocisternum标准样品DNA和步骤(1)获得的待测样品DNA进行荧光定量PCR扩增；
(3)读取荧光定量PCR扩增反应初始循环数，获得环境样品中Desulfotomaculum thermocisternum的定量结果。
3.如权利要求2所述的检测硫酸盐还原菌的方法，其特征在于，其中所述Desulfotomaculum thermocisternum标准样品DNA的系列溶液按以下方式制备：取纯培养Desulfotomaculum thermocisternum样品，测定细菌浓度后按10倍梯度稀释，分别提取不同稀释样品的DNA。
4.如权利要求2所述的检测硫酸盐还原菌的方法，其中所述Desulfotomaculum thermocisternum标准样品DNA在针对不同待测样品检测时可重复使用。
5.如权利要求2所述的检测硫酸盐还原菌的方法，其中所述荧光定量PCR扩增的反应体系组成如下：9.5μL无菌水、12.5μL Universal SYBRGreen Master Mix、12.5μM的正向和反向引物各0.5μL、2μL标准样品DNA或待测样品DNA。
6.如权利要求2所述的检测硫酸盐还原菌的方法，其中所述荧光定量PCR扩增的程序设置为：a)95℃保温3min；b)94℃保温20s；c)60℃保温30s；d)重复执行b)～c)39次；e)从65℃开始每5s增加0.5℃至达到95℃为止；f)读取荧光定量PCR扩增反应初始循环数。
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