CN105112543A - 一种硫酸盐还原菌的分子检测方法 - Google Patents

一种硫酸盐还原菌的分子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种硫酸盐还原菌的分子检测方法。该检测方法所用的特异性引物对的核苷酸序列为SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2所示；所述检测方法包括：(1)建立硫酸盐还原菌定量检测标准曲线和线性方程；(2)预处理样品；(3)以预处理后的样品为模板，利用所述引物对建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(4)琼脂糖凝胶电泳检测；(5)利用凝胶成像系统对电泳结果进行分析，得到条带亮度值相对值，查标准曲线和线性方程定量确定硫酸盐还原菌浓度。本发明硫酸盐还原菌定量分子检测方法耗时短、操作简单、灵敏度高、检测费用低，具有广谱性检测效果，可用于各类样品中硫酸盐还原菌的定量检测。

Description

一种硫酸盐还原菌的分子检测方法
技术领域
本发明涉及硫酸盐还原菌的定性或定量检测，尤其涉及用于检测硫酸盐还原菌分子的特异性引物对、应用该引物对定量检测硫酸盐还原菌的检测方法以及检测试剂盒，属于硫酸盐还原菌的检测领域。
背景技术
硫酸盐还原菌于1895年首先由Beijerinck发现，至今已有百年历史。据不完全统计，硫酸盐还原菌已有59个属近100个种，D.desulfuricans(脱硫弧菌)是最一般的活动细菌。
硫酸盐还原菌普遍生长在土壤、河水、海水中，并发现在地下71米的粘土及水深3000米的海底中也有这类细菌生存，鉴别特征：单细胞，无色，无芽孢，具弯轴(非螺旋状)的杆状有机体，宽度小于2微米，以单根鞭毛运动，革兰氏阴性、厌氧、异养，在广泛利用有机物的同时，把硫酸盐、亚硫酸盐、硫、硫代硫酸盐和连二亚硫酸盐还原成H2S，并且不沉积铁的氧化物，沉积FeS。
在油田中，硫酸盐还原菌产生的H2S对注采设备及集输管道具有极强的腐蚀性。经硫酸盐还原菌的腐蚀，输油管路容易出现漏油、跑油的问题，严重时引发爆炸等安全事故；硫酸盐还原菌腐蚀也是造成井口装置失灵，闸门丝杆断裂，油套管穿孔的主要原因；另外，硫酸盐还原菌的腐蚀产物中有Fe2S等存在，导致水质恶化，水变黑、发臭，直接影响原油质量。
因此研制一种广谱快速灵敏的硫酸盐还原菌检测方法，实时检测油田水质中硫酸盐还原菌的含量，对腐蚀情况进行分析，适时采取防腐措施，在保障油田正常生产运行，延长金属设备的使用寿命，保护地层地面水质环境方面具有重要的现实意义。
目前使用的硫酸盐还原菌检测方法主要包括以下3种方法：(1)直接镜检法，该方法较为直观，但是准确性低，就算专业人士难以辨认出所有硫酸还原菌；(2)基于可培养技术的检测方法，具体包括液体培养方法(测试瓶法)和固体培养方法：液体培养法是将待测样品进行梯度稀释，根据培养液性状结合最大概率数法(MPN法)确定细菌浓度；固体培养方法，用硫酸盐还原菌选择性固体培养基筛选分离硫酸盐还原菌，根据菌落数确定细菌浓度。这些方法操作较为简捷，但耗时过长，一般需要7天，而且检测的准确性和灵敏度不高，依赖于硫酸盐还原菌的可培养技术，难以检出所有硫酸盐还原菌。(3)基于分子生物学的硫酸盐还原菌检测方法，即检测检测硫酸盐还原菌的特定基因确定细菌含量，具体方法，主要有PCR、PCR-RFLP和原位杂交，常用的遗传标记主要有SRB16SrRNA基因的特征序列、亚硫酸盐异化酶基因和APS基因等。该方法快速、灵敏针对特定的硫酸盐还原菌特异性高，但是，检测成本高、目前只能针对某种硫酸盐还原菌进行检测，没有研制出一种广谱的硫酸盐还原菌检测方法。
因此，克服传统可培养技术检测方法的各种缺陷，不需要提取DNA也不需要进行长时间的细菌培养，建立一种检测快、成本低、灵敏度高、广谱性好的的硫酸盐还原菌检测方法显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一对灵敏度高、特异性强、广谱性好的检测硫酸盐还原菌的引物对。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种快速、灵敏、准确且具有广谱性的定量检测硫酸盐还原菌的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
本发明首先公开了用于检测硫酸盐还原菌的特异性的引物对，引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的反向引物组成；其中，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，D代表碱基A、G或T。
上述引物对的衍生序列也为本发明的保护范围，所述衍生序列包括引物序列的互补链序列，同时还可以向5'端和3'端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
利用本发明设计的特异性引物对扩增硫酸盐还原菌特征基因，确定所需DNA模板浓度下限值，结果表明25μL体系需要细菌DNA模板量下限为4ng，表明本发明提供的特异性引物对扩增硫酸盐还原菌特征基因具有高度灵敏性。
本发明进一步公开了一种硫酸盐还原菌的定量检测方法，包括以下步骤：(1)建立硫酸盐还原菌定量检测标准曲线和线性方程；(2)预处理样品；(3)以预处理后的样品为模板，利用的由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的反向引物组成的引物对(其中，碱基Y代表C或T，碱基R代表A或G，碱基D代表A、G或T)建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(4)琼脂糖凝胶电泳检测；(5)利用凝胶成像系统对电泳结果进行分析，得到条带亮度值相对值，查标准曲线和线性方程定量确定硫酸盐还原菌浓度。
其中，步骤(1)中所述硫酸盐还原菌定量检测标准曲线和线性方程是按照以下方法建立：(1)预处理样品；(2)将预处理后的样品进行最大稀释度梯度稀释；(3)以稀释后的样品为模板，利用的由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的反向引物组成的引物对(其中，碱基Y代表C或T，碱基R代表A或G，碱基D代表A、G或T)建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(4)琼脂糖凝胶电泳检测；(5)利用凝胶成像系统对电泳结果进行分析，检测每个条带亮度值，设定最大稀释梯度样品检出的亮度值为1，得到各浓度硫酸盐还原菌亮度值的相对值，根据各硫酸盐还原菌浓度与其亮度值相对值之间的关系建立标准曲线和线性方程。
优选的，步骤(5)中所述标准曲线和线性方程的建立是按照以下方法建立：利用凝胶成像系统对电泳结果进行分析，检测每个条带亮度值，设定最大稀释梯度样品检出的亮度值为1，得到各浓度硫酸盐还原菌亮度值的相对值，以硫酸盐还原菌的浓度值为横坐标，亮度相对值为纵坐标，建立标准曲线和线性方程；
更优选的，设定菌浓度为10个/ml的亮度值为1，以硫酸盐还原菌的浓度值：8000个/ml、6000个/ml、4000个/ml、2000个/ml、1000个/ml、100个/ml为横坐标，以各浓度对应的亮度相对值：21.944、18.452、14.17、10.83、7.87、5.937为纵坐标，建立标准曲线和线性方程；
其中，所述亮度值等于条带光密度积分条带面积；
所述预处理样品包括以下步骤：(1)取待测水样，过滤，除掉杂质；(2)取滤液于离心管中，离心，去上清液；(3)加入溶菌酶处理；(4)离心，去上清溶菌酶液体，加入蒸馏水，重新悬浮破壁菌体，离心，去上清液，留破壁菌体；(5)加入蒸馏水再次悬浮破壁菌体，用沸水中煮一段时间，即得。
优选的，预处理样品包括以下步骤：(1)取待测水样，过滤，除掉杂质；(2)取滤液1ml于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min，倒掉上清液体；(3)加入100μL溶菌酶37℃处理半小时；(4)12000rpm离心10min，用枪头吸掉上清溶菌酶液体，于离心管中加入500μL蒸馏水，重新悬浮破壁菌体，12000rpm离心10min，倒掉上清液体，留下底部破壁菌体；(5)加入11.5μL蒸馏水再次悬浮破壁菌体，将离心管置于沸水中煮5min，取出待用；
其中，步骤(3)所述溶菌酶是终浓度为20mg/ml的20mMTris，pH＝8和2mMNa2-EDTA配置的缓冲液。
所述的PCR反应体系为25μl：样品11.5μl，2×EasyTaqSuperMix12.5μl，10μM正反向引物各0.5μl。
所述的PCR扩增的反应程序为：阶段一：95℃3min；阶段二：94℃变性45s，52℃退火45s，72℃1min，35个循环；阶段三：72℃，10min。
所述琼脂糖凝胶电泳检测的缓冲液为0.5×TBE，染料为Gel-red，上样量为2μl。
利用本发明方法对能检测的硫酸盐还原菌菌浓度下限进行了检测，结果显示终浓度为4个/ml的菌液样品扩增产物条带明显，即检测的下限值为4个/ml，表明本发明使用的方法对硫酸盐还原菌检测具有高度灵敏性。
利用不同引物对对不同种属类型的硫酸盐还原菌的检测试验表明，由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的反向引物组成引物对1对两种非硫酸盐还原菌检测结果为阴性，18种硫酸盐还原菌检测结果为阳性，说明该引物对硫酸盐还原菌具有广谱性检出效果，可以检测目前发现的大部分硫酸盐还原菌，利用由核苷酸序列为SEQIDNo.3所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.4所示的反向引物组成的引物对2，在使用本发明提供的方法进行检测时，只有部分硫酸盐还原菌的检测结果呈阳性，其余呈阴性；利用由核苷酸序列为SEQIDNo.5所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.6所示的反向引物组成的引物对3，对所有供测试的18种不同种属的硫酸盐还原菌的检测结果为阴性，仅对嗜热脱硫肠状菌(Desulfotomaculumthermocisternum)的检测为阳性，说明这两对引物对于硫酸盐还原菌的检测不具有广谱性，不能用于不同种属硫酸盐还原菌的检测中。
利用本发明方法对辽河油田某区块油井硫酸盐还原菌浓度检测，通过简单稀释，利用硫酸盐还原菌浓度数量级＝样品最大稀释倍数×4(本发明硫酸盐还原菌浓度检测下限值)得到量两样品的硫酸盐还原菌浓度数量级分别大于400个/ml，大于4000个/ml。使用仪器BioRadMolecularImagerGelDocTMXR+，检测样品1及样品2，其跑胶条带的相对光亮度值分别为7.24、16.05，查标准曲线和线性方程可知：样品1硫酸盐还原菌的浓度为571个/ml，样品2硫酸盐还原菌浓度为4976个/ml。
本发明还公开了硫酸盐还原菌的检测试剂盒，包括：2×EasyTaqSuperMix，扩增引物对，其特征在于：所述扩增引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的反向引物组成，其中，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，D代表碱基A、G或T。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明硫酸盐还原菌定量检测方法相对于常规分子检测方法的优点在于，不需要提取细菌DNA，也不需要对细菌进行培养，检测耗时短、操作简单、灵敏度高、检测费用低，具有广谱性检测效果。
附图说明
图1梯度稀释硫酸盐还原菌样品扩增硫酸盐还原菌特征基因琼脂糖凝胶检测图；其中8000、6000、4000、2000、1000、100代表硫酸盐还原菌的浓度，单位为：个/ml；
图2硫酸盐还原菌定量检测标准曲线图；其中，横坐标是硫酸盐还原菌的浓度值，纵坐标是各浓度所对应的亮度相对值；
图3不同DNA模板浓度扩增硫酸盐还原菌特征基因琼脂糖凝胶检测图；其中，1、2、3、4、5、6、7代表25μL体系中DNA模板量分别为480ng、320ng、160ng、80ng、40ng、8ng、4ng的扩增条带；
图4不同硫酸盐还原菌浓度样品扩增硫酸盐还原菌特征基因琼脂糖凝胶检测图；其中，2、4、8、12、16代表硫酸盐还原菌的浓度，单位为：个/ml。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
1.实验材料、试剂、设备
1.1引物
由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的反向引物组成的引物对1，其中，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，D代表碱基A、G或T；由核苷酸序列为SEQIDNo.3所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.4所示的反向引物组成的引物对2，其中，K代表碱基G或T，Y代表碱基C或T；由核苷酸序列为SEQIDNo.5所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.6所示的反向引物组成的引物对3。
1.2主要试剂与仪器
2×EasyTaqSuperMix购于北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司，其它试剂均为国产的分析纯；
硫酸盐还原菌试剂瓶购于北京华兴化学试剂厂；
PCR仪、凝胶成像系统BioRadMolecularImagerGelDocTMXR+、Nanodrop2000微量紫外分光光度计、离心机、移液器、恒温培养箱等。
实施例1硫酸盐还原菌定量检测的标准曲线和线性方程的建立
1.试验方法
1.1样品采集和处理
使用硫酸盐还原菌试剂瓶于55℃条件下选择性培养辽河油田某区块油井采出液中的硫酸盐还原菌，七天后检测试剂瓶中硫酸盐菌浓度为1×108个/ml，做表1所示稀释梯度。
表1菌液稀释浓度与对应相对亮度值
1.2预处理样品
1、取稀释后的菌液1ml于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min，倒掉上清液体。
2、加入100μL溶菌酶37℃处理半小时，溶菌酶使用20mMTris，pH＝8；2mMNa2-EDTA缓冲液进行配置，终浓度为20mg/ml。
3、12000rpm离心10min，用枪头吸掉上清溶菌酶液体，于离心管中加入500μL蒸馏水，重新悬浮破壁菌体，12000rpm离心10min，倒掉上清液体，留下底部破壁菌体。
4、加入11.5μL蒸馏水再次悬浮破壁菌体，将离心管置于沸水中煮5min，取出待用。
1.3PCR扩增
以预处理后的样品为模板，以样品11.5μl，2×EasyTaqSuperMix12.5μl，10μM正反向引物各0.5μL的25μl的PCR反应体系进行扩增，其中，所用引物对为：由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的反向引物组成；其中，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，D代表碱基A、G或T。PCR扩增的反应程序为：阶段一：95℃3min；阶段二：94℃变性45s，52℃退火45s，72℃1min，35个循环；阶段三：72℃，10min。
1.4琼脂糖凝胶电泳
在扩增后的产物中加入染料Gel-red，进行混合，2.0％琼脂糖凝胶中进行电泳，所用的缓冲液为0.5×TBE，上样量为2μl。
1.5DNA检测
利用凝胶成像系统BioRadMolecularImagerGelDocTMXR+进行观察，分析，并照相记录。
2、试验结果
结果如图1所示，使用凝胶成像系统BioRadMolecularImagerGelDocTMXR+，检测每个条带亮度值，亮度值等于条带光密度积分条带面积。设定菌浓度为10个/ml的亮度值为1，取亮度值的相对值。当菌浓度在8000个/ml-100个/ml范围内菌浓度与扩增DNA条带相对亮度值成线性关系，绘制标准曲线如图2所示，标准曲线对应的线性方程：y＝0.002x+6.098。
实验例1DNA模板浓度下限值的确定试验
1.实验方法
1.1样品采集和处理
取辽河油田某区块油井采出液中的硫酸盐还原菌，55℃条件下，在硫酸盐还原菌试剂瓶培养7天。
1.2DNA提取(提取方法参照天根细菌基因组提取试剂盒说明书)
利用NanoDrop2000检测DNA的浓度为160ng/μL。
1.3PCR扩增
以提取的菌体DNA为模板，按表2配置PCR扩增体系进行扩增(微量DNA模板用ddH2O稀释后加入)，其中，所用引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的反向引物组成；其中，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，D代表碱基A、G或T。PCR扩增的反应程序为：阶段一：95℃3min；阶段二：94℃变性45s，52℃退火45s，72℃1min，35个循环；阶段三：72℃，10min。
表2PCR扩增体系
1.4琼脂糖凝胶电泳
在扩增后的产物中加入染料Gel-red，进行混合，2.0％琼脂糖凝胶中进行电泳，所用的缓冲液为0.5×TBE，上样量为2μl。
1.5DNA检测
利用凝胶成像系统BioRadMolecularImagerGelDocTMXR+进行观察，分析，并照相记录。
2.试验结果
扩增结果如图3。从图中可以看出：25μL体系需要细菌DNA模板量下限为4ng，即每25μL，加入160ng/μL的DNA模板0.025μL，表明本发明提供的特异性引物对扩增硫酸盐还原菌特征基因具有高度灵敏性。
实验例2硫酸盐还原菌菌浓度下限值的确定试验
1.试验方法
1.1样品采集和处理
使用硫酸盐还原菌试剂瓶于37℃条件下选择性培养新疆克拉玛依油田某区块油井采出液中的硫酸盐还原菌，七天后检测试剂瓶中硫酸盐菌浓度为2×105个/ml。对培养的硫酸盐菌，做表3所示稀释。
表3菌液稀释浓度
1.2预处理样品
1、取稀释后的菌液1ml于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min，倒掉上清液体。
2、加入100μL溶菌酶37℃处理半小时，溶菌酶使用20mMTris，pH＝8；2mMNa2-EDTA缓冲液进行配置终浓度为20mg/ml。
3、12000rpm离心10min，用枪头吸掉上清溶菌酶液体，于离心管中加入500μL蒸馏水，重新悬浮破壁菌体，12000rpm离心10min，倒掉上清液体，留下底部破壁菌体。
4、加入11.5μL蒸馏水再次悬浮破壁菌体，将离心管置于沸水中煮5min，取出待用。
1.3PCR扩增
以预处理后的样品为模板，样品11.5μl，2×EasyTaqSuperMix12.5μl，10μM正反向引物各0.5μL的25μl的PCR反应体系进行扩增，其中，所用引物对为由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的反向引物组成；其中，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，D代表碱基A、G或T。PCR扩增的反应程序为：阶段一：95℃3min；阶段二：94℃变性45s，52℃退火45s，72℃1min，35个循环；阶段三：72℃，10min。
1.4琼脂糖凝胶电泳
在扩增后的产物中加入染料Gel-red，进行混合，2.0％琼脂糖凝胶中进行电泳，所用的缓冲液为0.5×TBE，上样量为2μl。
1.5DNA检测
利用凝胶成像系统BioRadMolecularImagerGelDocTMXR+进行观察，并照相记录。
2.试验结果
扩增结果如图4，从图中可以看出，终浓度为4个/ml的菌液样品扩增产物条带明显，表明本发明使用的方法对硫酸盐还原菌检测具有高度灵敏性，检测菌浓度下限为4个/ml。
实验例3不同种属类型的硫酸盐还原菌的检测
1、试验方法
选取硫酸盐还原菌中具有代表性的18个种属及两种非硫酸盐还原菌种(Anoxybacillussp.CGMCC6570Ureibacillussp.CGMCC5818)，硫酸盐还原菌使用北京华兴试剂厂硫酸盐还原菌培养试剂瓶在厌氧条件下进行培养，两种非硫酸盐还原菌种使用LB培养基在有氧条件下进行培养。将培养好的硫酸盐还原菌在12000rpm转速下离心收集并提取细菌DNA(提取方法参照天根细菌基因组提取试剂盒说明书)。
将提取的DNA，进行扩增，PCR扩增体系为25μL体系包括：10μM正反向引物各0.5μL，2×EasyTaqSuperMix(TranGenBiotech产品CodeAS#111)12.5μL，DNA模板1μL，ddH2O10.5μL。其中，所用引物对为：由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的反向引物组成引物对1，其中，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，D代表碱基A、G或T；由核苷酸序列为SEQIDNo.3所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.4所示的反向引物组成的引物对2，其中，K代表碱基G或T，Y代表碱基C或T；由核苷酸序列为SEQIDNo.5所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.6所示的反向引物组成的引物对3。PCR扩增程序为：阶段一：95℃3min；阶段二：94℃变性45s，52℃退火45s，72℃1min，35个循环；阶段三：72℃，10min；将扩增好的PCR产物使用2％琼脂糖凝胶进行检测，0.5×TBE为缓冲buffer，使用Gel-red做DNA染料，检测上样2μL。
2、试验结果
引物对1检测结果见表4，从表中可以看出：利用由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的反向引物组成引物对1能检测出所有供测试的不同种属的硫酸盐还原菌，而对于两种非硫酸盐还原菌检测结果为阴性，说明利用引物1并使用本发明方法对硫酸盐还原菌具有广谱性检出效果，可以检测目前发现的大部分硫酸盐还原菌，而非硫酸盐还原菌对本引物的检测不存在干扰。利用由核苷酸序列为SEQIDNo.3所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.4所示的反向引物组成的引物对2，在使用本发明提供的方法进行检测时，只有部分硫酸盐还原菌的检测结果呈阳性，其余呈阴性；利用由核苷酸序列为SEQIDNo.5所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.6所示的反向引物组成的引物对3，对所有供测试的18种不同种属的硫酸盐还原菌的检测结果为阴性，而对嗜热脱硫肠状菌(Desulfotomaculumthermocisternum)的检测为阳性，说明这两对引物对于硫酸盐还原菌的检测不具有广谱性，不能用于不同种属硫酸盐还原菌的检测中。
表4引物对1对不同种属硫酸盐还原菌检出结果
实验例4辽河油田某区块油井硫酸盐还原菌浓度检测
1.试验方法
1.1样品的采集和处理
使用硫酸盐还原菌试剂瓶选择性的取辽河油田某区块油井硫酸盐还原菌采出液，用纱布进行过滤，除掉水样中的固体杂质，对样品做最大倍数稀释。
1.2预处理样品
1、取稀释后的菌液1ml于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min，倒掉上清液体。
2、加入100μL溶菌酶37℃处理半小时，溶菌酶使用20mMTris，pH＝8；2mMNa2-EDTA缓冲液进行配置终浓度为20mg/ml。
3、12000rpm离心10min，用枪头吸掉上清溶菌酶液体，于离心管中加入500μL蒸馏水，重新悬浮破壁菌体，12000rpm离心10min，倒掉上清液体，留下底部破壁菌体。
4、加入11.5μL蒸馏水再次悬浮破壁菌体，将离心管置于沸水中煮5min，取出待用。
1.3PCR扩增
以上述硫酸盐还原菌样品为模板，样品11.5μl，2×EasyTaqSuperMix12.5μl，10μM正反向引物各0.5μL的25μl的PCR反应体系进行扩增，其中，所用引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的反向引物组成；其中，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，D代表碱基A、G或T。PCR扩增的反应程序为：阶段一：95℃3min；阶段二：94℃变性45s，52℃退火45s，72℃1min，35个循环；阶段三：72℃，10min。
1.4琼脂糖凝胶电泳
在扩增后的产物中加入染料Gel-red，进行混合，2.0％琼脂糖凝胶中进行电泳，所用的缓冲液为0.5×TBE，上样量为2μl。
1.5DNA检测
利用凝胶成像系统BioRadMolecularImagerGelDocTMXR+进行观察，分析，并照相记录。
2、试验结果
试验结果如表5所示：
表5样品稀释及检测结果
本发明使用方法检测菌浓度下限为4个/ml，根据硫酸盐还原菌浓度数量级＝样品最大稀释倍数×4(本方法硫酸盐还原菌浓度检测下限值)，得倒样品1硫酸盐还原菌浓度数量级为102个/ml，且大于400个/ml，样品2数量级为103且大于4000个/ml。
使用仪器BioRadMolecularImagerGelDocTMXR+，检测样品1及样品2，其跑胶条带的相对光亮度值分别为7.24、16.05，查标准曲线和对应的线性方程可知：样品1硫酸盐还原菌的浓度为571个/ml，样品2硫酸盐还原菌浓度为4976个/ml。

Claims (10)

1.用于检测硫酸盐还原菌的引物对，其特征在于：所述引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的反向引物组成；其中，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，D代表碱基A、G或T。
2.权利要求1所述的引物对在定性或定量检测硫酸盐还原菌中的应用。
3.一种硫酸盐还原菌的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)建立硫酸盐还原菌定量检测标准曲线和线性方程；(2)预处理样品；(3)以预处理后的样品为模板，利用权利要求1所述的引物对建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(4)琼脂糖凝胶电泳检测；(5)利用凝胶成像系统对电泳结果进行分析，得到条带亮度相对值，查标准曲线和线性方程定量确定硫酸盐还原菌浓度。
4.按照权利要求3所述的定量检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述硫酸盐还原菌定量检测标准曲线和线性方程是按照以下方法建立：(1)预处理样品；(2)将预处理后的样品进行最大稀释度梯度稀释；(3)以稀释后的样品为模板，利用权利要求1所述的引物对建立PCR反应体系，进行PCR扩增；(4)琼脂糖凝胶电泳检测；(5)利用凝胶成像系统对电泳结果进行分析，检测每个条带亮度值，设定最大稀释梯度样品检出的亮度值为1，得到各浓度硫酸盐还原菌亮度值的相对值，根据各硫酸盐还原菌浓度与其亮度值相对值之间的关系建立标准曲线和线性方程。
5.按照权利要求4所述的定量检测方法，其特征在于：步骤(5)中所述标准曲线和线性方程的建立是按照以下方法建立：利用凝胶成像系统对电泳结果进行分析，检测每个条带亮度值，设定最大稀释度样品检出的亮度值为1，得到各浓度硫酸盐还原菌亮度值的相对值，以硫酸盐还原菌的浓度值为横坐标，亮度相对值为纵坐标，建立标准曲线和线性方程；优选的，设定菌浓度为10个/ml的亮度值为1，以硫酸盐还原菌的浓度值：8000个/ml、6000个/ml、4000个/ml、2000个/ml、1000个/ml、100个/ml为横坐标，以各浓度对应的亮度相对值：21.944、18.452、14.17、10.83、7.87、5.937为纵坐标，建立标准曲线和线性方程。
6.按照权利要求3或4所述的定量检测方法，其特征在于，所述预处理样品包括以下步骤：(1)取待测水样，过滤，除掉杂质；(2)取滤液于离心管中，离心，去上清液；(3)加入溶菌酶处理；(4)离心，去上清溶菌酶液体，加入蒸馏水，重新悬浮破壁菌体，离心，去上清液，留破壁菌体；(5)加入蒸馏水再次悬浮破壁菌体，用沸水中煮一段时间，即得。
7.按照权利要求3或4所述的定量检测方法，其特征在于，所述预处理样品包括以下步骤：(1)取待测水样，过滤，除掉杂质；(2)取滤液1ml于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min，倒掉上清液体；(3)加入100μL溶菌酶37℃处理半小时；(4)12000rpm离心10min，用枪头吸掉上清溶菌酶液体，于离心管中加入500μL蒸馏水，重新悬浮破壁菌体，12000rpm离心10min，倒掉上清液体，留下底部破壁菌体；(5)加入11.5μL蒸馏水再次悬浮破壁菌体，将离心管置于沸水中煮5min，即得。
8.按照权利要求7所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(3)所述溶菌酶是终浓度为20mg/ml的20mMTris，pH＝8和2mMNa2-EDTA配置的缓冲液。
9.按照权利要求3或4所述的定量检测方法，其特征在于：所述的PCR反应体系为25μl：样品11.5μl，2×EasyTaqSuperMix12.5μl，10μM正反向引物各0.5μl；所述的PCR扩增的反应程序为：阶段一：95℃3min；阶段二：94℃变性45s，52℃退火45s，72℃1min，35个循环；阶段三：72℃，10min；所述琼脂糖凝胶电泳检测的缓冲液为0.5×TBE，染料为Gel-red，上样量为2μl。
10.一种硫酸盐还原菌的检测试剂盒，包括：2×EasyTaqSuperMix，扩增引物对，其特征在于：所述扩增引物对由核苷酸序列为SEQIDNo.1所示的正向引物和核苷酸序列为SEQIDNo.2所示的反向引物组成，其中，Y代表碱基C或T，R代表碱基A或G，D代表碱基A、G或T。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018191222A1 (en) * 2017-04-12 2018-10-18 Saudi Arabian Oil Company Biochips and rapid methods for detecting organisms involved in microbially influenced corrosion (mic)
CN109762916A (zh) * 2019-03-18 2019-05-17 中国海洋石油集团有限公司 定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物
CN113956860A (zh) * 2021-09-16 2022-01-21 华东理工大学 一种油田系统微生物腐蚀控制体系构建方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703600A (zh) * 2012-07-10 2012-10-03 光明乳业股份有限公司 一种植物乳杆菌肠道定殖性的定性、定量测定方法
CN103013866A (zh) * 2012-12-04 2013-04-03 南京大学 一株耐硝酸盐的硫酸盐还原菌

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703600A (zh) * 2012-07-10 2012-10-03 光明乳业股份有限公司 一种植物乳杆菌肠道定殖性的定性、定量测定方法
CN103013866A (zh) * 2012-12-04 2013-04-03 南京大学 一株耐硝酸盐的硫酸盐还原菌

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018191222A1 (en) * 2017-04-12 2018-10-18 Saudi Arabian Oil Company Biochips and rapid methods for detecting organisms involved in microbially influenced corrosion (mic)
CN110506130A (zh) * 2017-04-12 2019-11-26 沙特阿拉伯石油公司 用于检测参与微生物腐蚀(mic)的生物的生物芯片和快速方法
US11035009B2 (en) 2017-04-12 2021-06-15 Saudi Arabian Oil Company Biochips and rapid methods for detecting organisms involved in microbially influenced corrosion (MIC)
CN109762916A (zh) * 2019-03-18 2019-05-17 中国海洋石油集团有限公司 定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物
CN113956860A (zh) * 2021-09-16 2022-01-21 华东理工大学 一种油田系统微生物腐蚀控制体系构建方法

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