CN102703600A - 一种植物乳杆菌肠道定殖性的定性、定量测定方法 - Google Patents
一种植物乳杆菌肠道定殖性的定性、定量测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种植物乳杆菌肠道定殖性的定性、定量测定方法。该定性测定方法包括如下步骤：（1）将经预处理后的被测粪便样品进行总DNA提取；（2）然后进行总DNA的PCR扩增；（3）之后进行V3区PCR扩增；（4）将步骤（3）获得的V3区PCR扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，以及凝胶成像图谱分析；（5）将步骤（4）得到的变性梯度凝胶的条带与空白组以及对照标记组相比对，即可。该定量测定方法包括如下步骤：分别将被测样品、植物乳杆菌系列浓度的菌粉，按前述步骤（1）~（4）操作，然后将系列浓度植物乳杆菌变性梯度凝胶上条带亮度与含量之间建立标准曲线，之后依据标准曲线计算定殖的植物乳杆菌数量。该方法快速、简便。
Description
技术领域
本发明属于微生物研究领域，涉及一种植物乳杆菌肠道定殖性的定性、定量测定方法。
背景技术
植物乳杆菌是乳酸杆菌中的一种，多数是从植物中分离得到。植物乳杆菌通过与病原菌对限制性营养素的能力竞争，来抑制病原菌的生长，调节肠道微生态的组成，形成生物学屏障。同时，通过其代谢所产生的有机酸、细菌素、过氧化氢以及双乙酰等对其他细菌的作用，可以调节肠道微生物菌群的平衡，增强机体的免疫力，降低胆固醇水平，抑制肿瘤细胞的形成等。植物乳杆菌在人体或动物中具有多种对健康的调节和促进作用，这些作用的发挥，其前提条件是其必须能粘附到黏膜的表面或者相关部位上皮细胞上，进行生长和繁殖，并与已存在或可能侵入该部位的致病菌通过竞争性排除和替代、共凝集和拮抗等作用，使自己定殖（又称“定植”）而抑制其它微生物生长。研究植物乳杆菌在肠道定殖性，对于了解其在宿主体内定殖情况与益生菌的筛选具有非常重要的意义。
研究植物乳杆菌在肠道中的定殖性，目前主要有3种方法：传统上是采用选择培养计数方法，该方法操作复杂，准确度低，有很大的局限性。随着分子生物学技术的发展，尤其是细菌16SrDNA技术的发展，为植物乳杆菌的定殖性研究提供了更多方法，其中，琼脂糖凝胶电泳和实时荧光PCR图谱分析方法存在抗干扰能力差，无法在肠道菌群构成复杂的混合物中准确测定殖物乳杆菌是否存在的缺陷；而变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术、16SrRNA与测序技术相结合的分子生物学方法则操作复杂、效率低、测试成本高、无法处理大量样品，且无法定量测定。
DGGE技术是DNA指纹技术，又称为多态性分析技术的一种，原理是：在碱基序列上存在差异的不同DNA双链解链时需要不同的变性剂浓度，DNA双链一旦解链，其在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降；因此，将聚合酶链式反应（PCR）扩增得到的等长的DNA片段加入到含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳，序列不同的DNA片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性，发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，以至停留在其相应的不同变性剂梯度位置，染色后可以在凝胶上呈现为分开的条带。现有的DGGE技术一般步骤包括如下：（1）细菌DNA提取，（2）DNA扩增，（3）凝胶电泳分离，（4）割胶、溶胶，（5）转化，（6）克隆，（7）测序。因凝胶电泳分离结束后，每个通道上都存在很多片断，每个片断包含不定数量的DNA产物，若对凝胶图谱上所有胶带都割胶、测序，其工作量太大，费用也很高，基本是不可能的。该现状亟待解决。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了现有的变性梯度凝胶电泳技术方法测定特定序列的DNA片段存在操作繁琐、工作量大、费用高的缺陷，而提供了可以快速、简便的植物乳杆菌定殖性的定性、定量测定方法。
本发明提供一种植物乳杆菌定殖性的定性测定方法包括如下步骤：
（1）将经预处理后的被测粪便样品进行总DNA提取；
（2）然后进行总DNA的PCR扩增；使用以下引物：
P1其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，
P2其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，
其中，所述的总DNA的PCR扩增的体系试剂含有：10×Buffer，Buffer含有500mmol.L-1 KCl、100mmol.L-1Tris-HCl和15mmol.L-1 MgCl2，0.04mmol.L-1 dNTP（三磷酸脱氧核糖核苷酸），0.2mmol.L-1的引物P1，0.2mmol.L-1引物P2，0.02ng/μL步骤（1）提取得到的总DNA为模板，0.2mmol.L-1TaqDNA聚合酶，其余为二次蒸馏无菌水；
其中，所述的PCR扩增程序是：①95℃预变性4min；②95℃变性60S，③50℃退火60S，④72℃延伸120S；步骤②~④共25个循环，⑤72℃延伸10min。
（3）之后进行V3区PCR扩增；使用以下引物：
P3其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，
P4其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，
其中，所述的V3区PCR扩增的体系试剂含有：10×Buffer，Buffer含有500mmol.L-1 KCl、100mmol.L-1Tris-HCl和15mmol.L-1 MgCl2，0.04mmol.L-1dNTP（三磷酸脱氧核糖核苷酸），0.1mmol.L-1引物P3，0.1mmol.L-1的引物P4，0.01ng/μL步骤（2）得到的总DNA的PCR扩增产物为模板，0.15mmol.L-1TaqDNA聚合酶，其余为二次蒸馏无菌水；
其中，所述的PCR扩增程序是：①94℃预变性4min，②94℃变性30S，③58℃退火30S，④72℃延伸1min；步骤②~④共30个循环，⑤72℃再延伸7min。
（4）将步骤（3）获得的V3区PCR扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，以及凝胶成像图谱分析；
（5）将步骤（4）得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带与空白组以及对照标记组的对应位置相比对，即可；
其中，所述的对照标记组为植物乳杆菌（lactobacillus plantaru）经过步骤（1）~（4）得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带；其中，此处所述的植物乳杆菌是指微生物种属水平层面上的任一种植物乳杆菌（lactobacillusplantaru），不同植物乳杆菌菌株之间在该步骤差异较小，因而可使用同种的植物乳杆菌，更佳的为与被测粪便样品含有的植物乳杆菌在微生物种属水平层面上的同菌株的植物乳杆菌，使用的具体存在形式可为植物乳杆菌菌粉；
其中，所述的空白组为被测粪便样品所属的测试对象在摄入植物乳杆菌前的粪便样品经过步骤（1）~（4）处理后得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带。
下面，进一步对本发明植物乳杆菌定殖性的定性测量方法进行详细介绍：
本发明中，所述的植物乳杆菌为本领域常规所说的植物乳杆菌，较佳的为植物乳杆菌（lactobacillus plantaru）ST-III、植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）LP115、植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP-ONLY或植物乳杆菌（lactobacillus plantaru）6003。此处即指本发明方法适用的植物乳杆菌种类。
步骤（1）中，所述的被测粪便样品为本领域常规所用，一般为摄入植物乳杆菌5-10天进行预定殖后，停止摄入植物乳杆菌48h以上，无菌采新鲜粪便0.1g-0.2g。
步骤（1）中，所述的预处理为本领域常规操作，一般为液氮冻干，研磨，使用10g无菌生理盐水溶解备用。
步骤（1）中，所述的总DNA提取为本领域常规操作，一般为包括如下步骤：①将400μL TE缓冲液：pH为8.0，含有10mmol.L-1 Tris-HCl和1mmol.L-1 EDTA，加入装有经过预处理后的粪便样品0.1g在1.5mL离心管中悬浮后，置65℃水浴20-30分钟，再加入200μL 10wt%的十二烷基硫酸钠、25μL 20μg/mL的胰RNA酶、30μL 500μg/ml的蛋白酶K溶液、以及100μL的25mg/mL溶菌酶均匀混合，再置65℃水浴20-30分钟，之后离心3分钟，取上清液100μL至离心管中；
②然后加入200μL异丙醇均匀混合，移至吸附柱中，离心30秒，弃去收集管中的液体，之后将吸附柱放入同一收集管中；
③加入200μL TE：pH=8.0、含有10mmol.L-1 Tris-HCl和1mmol.L-1EDTA的缓冲液溶解；加入200μL体积比25：24：1的苯酚、氯仿和异戊醇混合溶液振荡混匀，离心，取上清液至另一管；
④加入上清液等体积的体积比25：24：1的苯酚、氯仿和异戊醇混合溶液，振荡混匀，离心，取上清溶液至另一管；
⑤加入上述上清液1/2体积的7.5mol/L乙酸氨、以及上述上清液2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min，离心，倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉；
⑥加入1mL70v/v%乙醇水溶液，65℃水浴静置5分钟后，离心1分钟，去除上清液后，再加入1mL70v/v%乙醇水溶液，65℃水浴静置5分钟后，离心1分钟，将离心管中上清液去除，室温（一般25℃）干燥，即获得DNA，加入50μL无菌超纯水于-20℃保存。
其中，所述的均匀混合、以及水浴操作过程中，按本领域常规，一般将离心管来回颠倒数次实现均匀。
步骤（4）中，所述的变性梯度凝胶电泳处理为本领域常规操作，较佳的操作条件为：丙烯酰胺凝胶100g/L，变性剂线性梯度范围为30%-60%，其中，100%变性剂相当于7mol.L-1尿素和400mL.L-1甲酰胺；以0.5×TAE缓冲液，TAE含有40mmol.L-1Tris-乙酸和1mmol.L-1EDTA，pH=8.0。
步骤（4）中，所述的变性梯度凝胶电泳处理的电泳条件较佳的为60℃、160V和6h。
步骤（4）中，所述的步骤（3）获得的V3区PCR扩增后的产物用量较佳的为40μL，此处的用量可根据具体使用的变性梯度凝胶量的大小适当调整。
步骤（4）中，所述的凝胶成像图谱分析为本领域常规操作，较佳的为将经电泳后的变性梯度凝胶进行溴化乙锭（EB）染色15～20分钟，显色至条带清晰，用紫外凝胶呈像仪（UVI）成像系统对染色后的凝胶进行成像。
步骤（5）中，所述的比对为按常规操作进行，即将步骤（4）得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带（被测粪便样品）、空白组以及对照标记组的变性梯度凝胶上迁移条带的样品亮度进行比较，确定是否定殖。具体地，观察如被测样品所对应位置（对应于对照标记组的变性梯度凝胶上迁移条带的亮度位置）与空白组相比出现明显亮带，则样品中存在植物乳杆菌，即该植物乳杆菌可以在肠道内定殖；如被测样品所对应位置与空白组亮度无差异，则该植物乳杆菌不能在体内定殖。
本发明还提供一种植物乳杆菌定殖性的定量测定方法包括如下步骤：
分别将被测样品、以及分别为105、106、107、108、109、1010cfu/g的含植物乳杆菌（lactobacillus plantaru）的菌粉（此处所述的植物乳杆菌是指微生物种属水平层面上的任一种植物乳杆菌（lactobacillus plantaru），不同植物乳杆菌菌株之间在该步骤差异较小，因而可使用同种的植物乳杆菌，更佳的为与被测样品含有的植物乳杆菌在微生物种属水平层面上的同菌株的植物乳杆菌），按前述步骤（1）~（4）操作，然后将105、106、107、108、109、1010cfu/g的植物乳杆菌的变性梯度凝胶上植物乳杆菌迁移条带的亮度与含量之间建立标准曲线，之后依据标准曲线，根据被测样品的变性梯度凝胶上植物乳杆菌迁移条带的亮度计算定殖的植物乳杆菌数量。
本发明中，上述条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳测定方法。
本发明所用的试剂和设备除特殊说明外，均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1、本发明的植物乳杆菌定殖性的定性测量方法简便、准确，适用分析肠道等复杂菌群中植物乳杆菌的定性测定，通过该方法研究植物乳杆菌在肠道中的定殖性，有利于研究判定殖植物乳杆菌是否可以在人体及动物肠道中定殖，及定殖持续的时间。
2、本发明的植物乳杆菌定殖性的定量测定方法省去连接、克隆、转化、测序等步骤，方法操作简便，测定效率高，准确率高，抗干扰能力强，成本较低，有助于加深对植物乳杆菌的深入研究，使筛选更简便和严谨，更便于筛选可以在肠道定殖的植物乳杆菌，促进植物乳杆菌的应用，产生积极的社会效益。
附图说明
图1为实施例1测量的日摄入108cfu植物乳杆菌（lactobacillus plantaru）ST-III的定殖性成像图谱。
图2为实施例2测量的日摄入1010cfu植物乳杆菌（lactobacillus plantaru）6003的定殖性成像图谱。
图3为实施例3测量的日摄入1010cfu植物乳杆菌（lactobacillus plantaru）ST-III的定殖性成像图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中所有使用试剂、原料均市售可得，其中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1植物乳杆菌定殖性的定性测定方法
含106cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III的脱脂牛奶、植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III菌粉，光明乳业股份有限公司。
被测粪便样品取样：将含106cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III的脱脂牛奶4-10℃冷藏，受试对象日摄入100g该脱脂牛乳，连续摄入3d时间，停止摄入该含植物乳杆菌的脱脂牛乳后3天开始，每天取一次的粪便样品，无菌采集0.1g-0.2g。
植物乳杆菌定殖性的定性测定方法包括如下步骤：
（1）将经预处理后的被测粪便样品进行总DNA提取；
所述的预处理为将被测粪便样品液氮冻干，研磨，使用10g无菌生理盐水溶解备用；
所述的总DNA提取为包括如下步骤：
①将400μL TE缓冲液：pH为8.0，含有10mmol.L-1 Tris-HCl和1mmol.L-1EDTA，加入装有经过预处理后的粪便样品0.1g在1.5mL离心管中悬浮后，置65℃水浴20-30分钟，再加入200μL10wt%的十二烷基硫酸钠、25μL 20μg/mL的胰RNA酶、30μL 500μg/ml的蛋白酶K溶液、以及100μL的25mg/mL溶菌酶均匀混合，再置65℃水浴20-30分钟，之后离心3分钟，取上清液100μL至离心管中；
②然后加入200μL异丙醇均匀混合，移至吸附柱中，离心30秒，弃去收集管中的液体，之后将吸附柱放入同一收集管中；
③加入200μL TE：pH=8.0、含有10mmol.L-1 Tris-HCl和1mmol.L-1EDTA的缓冲液溶解；加入200μL体积比25：24：1的苯酚、氯仿和异戊醇混合溶液振荡混匀，离心，取上清液至另一管；
④加入上清液等体积的体积比25：24：1的苯酚、氯仿和异戊醇混合溶液，振荡混匀，离心，取上清溶液至另一管；
⑤加入上述上清液1/2体积的7.5mol/L乙酸氨、以及上述上清液2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min，离心，倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉；
⑥加入1mL70v/v%乙醇水溶液，65℃水浴静置5分钟后，离心1分钟，去除上清液后，再加入1mL70v/v%乙醇水溶液，65℃水浴静置5分钟后，离心1分钟，将离心管中上清液去除，室温干燥，即获得DNA，加入50μL无菌超纯水于-20℃保存。
其中，所述的均匀混合、以及水浴操作过程为将离心管来回颠倒数次实现均匀。
（2）然后进行总DNA的PCR扩增；使用以下引物：
P1其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，
P2其核苷酸序列如SEQID No.2所示，
其中，所述的总DNA的PCR扩增的体系试剂含有：2.5μL的10×Buffer，Buffer含有500mmol.L-1 KCl、100mmol.L-1 Tris-HCl和15mmol.L-1 MgCl2，0.04mmol.L-1 dNTP，0.2mmol.L-1的引物P1，0.2mmol.L-1引物P2，0.5ng步骤（1）提取得到的总DNA为模板，0.2mmol.L-1TaqDNA聚合酶，其余为二次蒸馏无菌水，共25μL；
其中，所述的PCR扩增程序是：①95℃预变性4min；②95℃变性60S，③50℃退火60S，④72℃延伸120S；步骤②~④共25个循环，⑤72℃延伸10min。
（3）之后进行V3区PCR扩增；使用以下引物：
P3其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，
P4其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，
其中，所述的V3区PCR扩增的体系试剂含有：5μL的10×Buffer，Buffer含有500mmol.L-1KCl、100mmol.L-1Tris-HCl和15mmol.L-1MgCl2，0.04mmol.L-1 dNTP，0.1mmol.L-1引物P3，0.1mmol.L-1的引物P4，0.5ng步骤（2）得到的总DNA的PCR扩增产物为模板，0.15mmol.L-1 TaqDNA聚合酶，其余为二次蒸馏无菌水，共50μL；
其中，所述的PCR扩增程序是：①94℃预变性4min，②94℃变性30S，③58℃退火30S，④72℃延伸1min；步骤②~④共30个循环，⑤72℃再延伸7min。
（4）将步骤（3）获得的V3区PCR扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，以及凝胶成像图谱分析；
所述的变性梯度凝胶电泳处理的操作条件为：丙烯酰胺凝胶100g/L，变性剂线性梯度范围为30%-60%，其中，100%变性剂相当于7mol.L-1尿素和400mL.L-1甲酰胺；以0.5×TAE缓冲液，TAE含有40mmol.L-1 Tris-乙酸和1mmol.L-1EDTA，pH=8.0；电泳条件60℃、160V、6h；取步骤（3）获得的V3区PCR扩增后的产物40μL。
所述的凝胶成像图谱分析为将经电泳后的变性梯度凝胶进行溴化乙锭（EB）染色15～20分钟，显色至条带清晰，用紫外凝胶呈像仪（UVI）成像系统对染色后的凝胶进行成像。
（5）将步骤（4）得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带与空白组以及对照标记组的对应位置相比对，即可；
其中，所述的对照标记组为植物乳杆菌（lactobacillus plantaru）ST-III菌粉经过步骤（1）~（4）得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带；
其中，所述的空白组为被测粪便样品所属的测试对象在摄入植物乳杆菌前的粪便样品经过步骤（1）~（4）处理后得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带。
步骤（5）中，所述的比对为将步骤（4）得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带（被测粪便样品）、空白组以及对照标记组的变性梯度凝胶上迁移条带的样品亮度进行比较，确定是否定殖。
本实施例的实验结果记录于图1中，如图1所示，图1表明受试对象日摄入108cfu的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III后，在停止摄入3天后，1（停止摄入第4天），2-7（停止摄入第5-10天），与B（空白组），ST（对照标记组）进行比较，连续7天测试的粪便样品中，植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III所对应的条带位置与空白组相比，并无明显差异，结果表明日摄入108cfu的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III并不能使该菌在肠道中定殖。
实施例2植物乳杆菌定殖性的定性测定方法
植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）6003，轻工部微生物发酵所；含108cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）6003的脱脂牛奶，光明乳业股份有限公司。
被测粪便样品取样：将含108cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）6003的脱脂牛奶4-10℃冷藏，受试对象日摄入100g该脱脂牛乳，连续摄入3d时间，停止摄入该含植物乳杆菌的脱脂牛乳后3天开始，每天取一次的粪便样品，无菌采集0.1g-0.2g。
按实施例1中的植物乳杆菌定殖性的定性测定方法进行测定，判定各对象是否存在植物乳杆菌。
本实施例的实验结果记录于图2中，如图2所示，图2表明受试对象日摄入1010cfu的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）6003，在停止摄入3天后，1（停止摄入第4天），2-3（停止摄入第5-6天），与B（空白组），ST（对照标记组）进行比较，连续3天测试的粪便样品中，植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）6003所对应的条带位置与空白组相比，并无明显差异，结果表明日摄入1010cfu的摄入量下，植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）6003并不能在肠道中定殖。
实施例3植物乳杆菌定殖性的定性测定方法
植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III、含108cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III的脱脂牛奶，光明乳业股份有限公司。
被测粪便样品取样：将含108cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III的脱脂牛奶4-10℃冷藏，受试对象日摄入100g该脱脂牛乳，连续摄入3d时间，停止摄入该含植物乳杆菌的脱脂牛乳后3天开始，每天取一次的粪便样品，无菌采集0.1g-0.2g。
按实施例1中的植物乳杆菌定殖性的定性测定方法进行测定，判定各对象是否存在植物乳杆菌。
本实施例的实验结果记录于图3中，如图3所示，图3表明受试对象日摄入1010cfu的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III后，在停止摄入3天后，1（停止摄入第4天），2-6（停止摄入第5-9天），与B（空白组），ST（对照标记组）进行比较，连续7天测试的粪便样品中，与对照标记组植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III所对应的条带位置及空白组相比，1-3组差异明显，表明1-3组植物乳杆菌有明显定殖，结果表明日摄入1010cfu的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III，停止摄入后植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III可以在肠道中定殖6天。
实施例4植物乳杆菌定殖性的定量测定方法
植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III，光明乳业股份有限公司；植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP115，丹尼斯克菌种有限公司；植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP-ONLY，上海交大昂立股份有限公司；含108cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III的脱脂牛奶、含108cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP115的脱脂牛奶、含108cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP-ONLY的脱脂牛奶，光明乳业股份有限公司。
被测粪便样品取样：分别将含108cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）ST-III的脱脂牛奶、含108cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）LP115的脱脂牛奶、含108cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）LP-ONLY的脱脂牛奶4-10℃冷藏，三组受试对象分别日摄入100g这三组脱脂牛乳，连续摄入7d时间，之后停止摄入脱脂牛乳后3天分别取粪便样品，无菌采集0.1g-0.2g；共得三组被测粪便样品；分别记为ST-III组（摄入植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III）、LP115组（摄入植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP115）与LP-ONLY组（摄入植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP115）。
植物乳杆菌定殖性的定量测定方法包括如下步骤：
分别将被测粪便样品、以及分别为105、106、107、108、109、1010cfu/g的含植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III的菌粉，按实施例1中的步骤（1）~（4）操作，然后将105、106、107、108、109、1010cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III菌粉的变性梯度凝胶上植物乳杆菌迁移条带的亮度与含量之间建立标准曲线，之后依据标准曲线，根据被测样品的变性梯度凝胶上植物乳杆菌迁移条带的亮度计算定殖的植物乳杆菌数量。
其中，凝胶成像分析软件，测量对应位置条带亮度，植物乳杆菌条带所在位置0.22（该位置是指在变性梯度凝胶水平方向上所占的百分比，即电泳停止时，该条带通过了整个脚带的22%长度），植物乳杆菌数量与亮度对应关系见表1。
表1植物乳杆菌数量对成像亮度的影响
| 数量(cfu/g) | 105 | 106 | 107 | 108 | 109 | 1010 |
| 成像亮度 | 1420 | 2060 | 2500 | 3010 | 3530 | 4000 |
根据表1，计算的植物乳杆菌数量与亮度关系的标准曲线方程是：
Y=10x/509.14+2.09
被测粪便样品，LP115组、LP-ONLY组和ST-III组的亮度（亮度为分析软件对的相对测量反映，无单位）分别为3200，1700，2500，根据该线性方程与计算得LP115组样品中所含植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP115为2.37×108cfu/g，LP-ONLY组样品中所含植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）LP-ONLY为2.69×105cfu/g，ST-III组样品中所含植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III为1.0×107cfu/g。
实施例5
植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP115，丹尼斯克菌种有限公司；含108cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP115的脱脂牛奶，光明乳业股份有限公司。
被测粪便样品取样：将含108cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP115的脱脂牛奶4-10℃冷藏，受试对象日摄入100g该脱脂牛乳，连续摄入3d时间，停止摄入该含植物乳杆菌的脱脂牛乳后3天开始，每天无菌采集一次粪便样品。
按实施例4方法测量植物乳杆菌存在数量，结果记录于表2中。
同一批次被测粪便样品，按传统培养方法（周德庆，微生物学教程．高等教育出版社，2011），用无菌生理盐水溶解震荡，10倍稀释，挑取合适稀释度在ROGOSA平板，厌氧培养14h。观察菌落形态，计数培养平板数量在30-300之间的平板，再计数与植物乳杆菌菌落特征相符的菌落。接种环挑取其中的部分菌落，载玻片涂片，革兰氏染色，显微镜观察菌体形态与植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP115染色后相符的菌落，并计数其中该菌的比率，计算得到样品中植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP115的数量，结果记录于表2中。
表2本发明方法与传统培养方法对比
| 测定方法 | 本发明方法 | 传统培养 |
| 是否定殖 | 是 | 是 |
| 植物乳杆菌数量（cfu/g） | 2.9×105 | 5×105 |
| 操作耗时 | 16h | 120h |
| 测定是否包活性与非活性菌 | 是 | 否 |
| 劳动强度 | 低 | 高 |
| 批量测量可行性 | 有 | 无 |
为验证传统培养方法的精确性，挑取部分菌落特征及形态与LP115完全相同的菌落，用生理生化方法进行进一步碳水化合物实验测定：按法国梅里埃（bioMe′rieux）公司的细菌鉴定产品API50CH使用手册，采用API50CH试剂盒试剂中API CHL培养基进行49种碳水化合物的发酵试验。碳水化合物试验结果表明，传统培养方法检测到符合植物乳杆菌镜检特征的菌落中，60%的为植物乳杆菌。传统培养方法尽管已经通过各种方法减小误差，减少杂菌的干扰，其方法所得到的5×105cfu/g结果中，仍有40%的并非植物乳杆菌，而是类似的其它杆菌，这一结果与本发明方法的检测结果极为接近。
表2可以看出，传统培养方法操作时间长，劳动强度，且仅能测量在粪便样品处理后仍为活菌状态的植物乳杆菌，且由于粪便样品中菌群复杂，完全依靠培养基的选择性与人工观察区分，与植物乳杆菌形状接近的其它乳杆菌会干扰试验结果，导致试验结果出现的偏差不确定。与传统培养方法研究植物乳杆菌定殖性相比，本发明方法简便，快捷，比传统培养方法节约87%时间，结果准确，优势明显。
实施例6
植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III、含108cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III的脱脂牛奶，光明乳业股份有限公司。
按实施例3方法取样被测粪便样品，按实施例4方法测量植物乳杆菌存在数量为3.2×108cfu/g，结果记录于表3中。
同一批次被测粪便样品，按照琼脂糖电泳-实时荧光PCR方法，中国专利ZL200910177908.9公开的方法，PCR扩增后，使用琼脂糖凝胶电泳与实时荧光PCR分析，结果记录于表3。
表3本发明方法与琼脂糖电泳-实时荧光PCR方法对比
| 测定方法 | 本方法 | 琼脂糖电泳—实时荧光PCR方法 |
| 植物乳杆菌数量（cfu/g） | 3.2×108 | / |
| 是否适用乳制品测量 | 是 | 是 |
| 是否适用粪便样品 | 是 | 否 |
| 测定是否包活性与非活性菌 | 是 | 否 |
| 抗其它杆菌干扰能力 | 强 | 低 |
| 批量测量可行性 | 有 | 有 |
表3可以看出，琼脂糖凝胶电泳-实时荧光PCR分析方法与本发明方法相比同样快捷，简便，但琼脂糖凝胶电泳-实时荧光PCR分析方法抗干扰能力差，在菌群复杂的肠道及粪便样品中，由于存在大量的其他乳杆菌等，扩增后的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳并不能很好地分开植物乳杆菌与其它乳杆菌。因此与琼脂糖凝胶电泳-实时荧光PCR分析方法相比，本发明方法通用性强，抗其它杆菌干扰能力高，结果更准确。
实施例7
植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III、含108cfu/g的植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）ST-III脱脂牛奶，光明乳业股份有限公司。
按实施例3方法取样被测粪便样品，按实施例4方法测量植物乳杆菌存在数量为3.2×108cfu/g，结果记录于表4中。
同一批次被测粪便样品，按照PCR-DGGE-测序方法，《应用变性梯度凝胶电泳和16SrDNA序列分析对山羊瘤胃细菌多样性分析》（姚文，朱伟云，韩正康；中国农业科学，2004，37（9）：1374～1378）公开的方法进行PCR扩增后，使用变性梯度凝胶电泳分离，染色后，通过割胶、连接、克隆、转化、测序等步骤，结果记录于表4。
表4本发明方法与PCR-DGGE-测序方法对比
| 测定方法 | 本方法 | PCR-DGGE-测序方法 |
| 是否可定性 | 是 | 是 |
| 是否可定量判定 | 是 | 否 |
| 是否适用粪便样品 | 是 | 是 |
| 测定是否包活性与非活性菌 | 是 | 是 |
| 抗其它杆菌干扰能力 | 强 | 强 |
| 批量测量可行性 | 有 | 否 |
| 测试成本 | 低 | 高 |
表4可以看出，PCR-DGGE-测序方法研究植物乳杆菌的定殖性主要依靠测序结果判定植物乳杆菌是否存在，尽管定性结果准确，但不能定量测定，且该方法涉及连接、克隆、转化、测序，操作复杂，工序繁琐，在研究植物乳杆菌在肠道中的定殖方便并不适用。因此本发明方法与PCR-DGGE-测序方法与，操作简便，成本较低，且具有初步定量测定的优势。
Claims (10)
1.一种植物乳杆菌定殖性的定性测定方法，其特征在于，其包括如下步骤：
（1）将经预处理后的被测粪便样品进行总DNA提取；
（2）然后进行总DNA的PCR扩增；使用以下引物：
P1其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，
P2其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，
其中，所述的总DNA的PCR扩增的体系试剂含有：10×Buffer，Buffer含有500mmol.L-1 KCl、100mmol.L-1Tris-HCl和15mmol.L-1 MgCl2，0.04mmol.L-1 dNTP，0.2mmol.L-1的引物P1，0.2mmol.L-1引物P2，0.02ng/μL步骤（1）提取得到的总DNA为模板，0.2mmol.L-1TaqDNA聚合酶，其余为二次蒸馏无菌水；
其中，所述的PCR扩增程序是：①95℃预变性4min；②95℃变性60S，③50℃退火60S，④72℃延伸120S；步骤②~④共25个循环，⑤72℃延伸10min；
（3）之后进行V3区PCR扩增；使用以下引物：
P3其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，
P4其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，
其中，所述的V3区PCR扩增的体系试剂含有：10×Buffer，Buffer含有500mmol.L-1KCl、100mmol.L-1Tris-HCl和15mmol.L-1MgCl2，0.04mmol.L-1dNTP，0.1mmol.L-1引物P3，0.1mmol.L-1的引物P4，0.01ng/μL步骤（2）得到的总DNA的PCR扩增产物为模板，0.15mmol.L-1TaqDNA聚合酶，其余为二次蒸馏无菌水；
其中，所述的PCR扩增程序是：①94℃预变性4min，②94℃变性30S，③58℃退火30S，④72℃延伸1min；步骤②~④共30个循环，⑤72℃再延伸7min；
（4）将步骤（3）获得的V3区PCR扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，以及凝胶成像图谱分析；
（5）将步骤（4）得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带与空白组以及对照标记组的对应位置相比对，即可；
其中，所述的对照标记组为植物乳杆菌（lactobacillus plantaru）经过步骤（1）~（4）得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带；
其中，所述的空白组为被测粪便样品所属的测试对象在摄入植物乳杆菌前的粪便样品经过步骤（1）~（4）处理后得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带。
2.如权利要求1所述的植物乳杆菌定殖性的定性测定方法，其特征在于，所述的植物乳杆菌为植物乳杆菌（lactobacillus plantaru）ST-III、植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP115、植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）LP-ONLY或植物乳杆菌（lactobacillus plantaru）6003；所述的对照标记组中的植物乳杆菌（lactobacillus plantaru）较佳的为与被测粪便样品含有的植物乳杆菌在微生物种属水平层面上的同菌株的植物乳杆菌。
3.如权利要求1所述的植物乳杆菌定殖性的定性测定方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的被测粪便样品为摄入植物乳杆菌5-10天进行预定殖后，停止摄入植物乳杆菌48h以上，无菌采新鲜粪便0.1g-0.2g；所述的预处理为液氮冻干，研磨，使用10g无菌生理盐水溶解备用。
4.如权利要求1所述的植物乳杆菌定殖性的定性测定方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的总DNA提取为包括如下步骤：
①将400μL TE缓冲液：pH为8.0，含有10mmol.L-1 Tris-HCl和1mmol.L-1EDTA，加入装有经过预处理后的粪便样品0.1g在1.5mL离心管中悬浮后，置65℃水浴20-30分钟，再加入200μL10wt%的十二烷基硫酸钠、25μL20μg/mL的胰RNA酶、30μL500μg/ml的蛋白酶K溶液、以及100μL的25mg/mL溶菌酶均匀混合，再置65℃水浴20-30分钟，之后离心3分钟，取上清液100μL至离心管中；
②然后加入200μL异丙醇均匀混合，移至吸附柱中，离心30秒，弃去收集管中的液体，之后将吸附柱放入同一收集管中；
③加入200μL TE：pH=8.0、含有10mmol.L-1Tris-HCl和1mmol.L-1EDTA的缓冲液溶解；加入200μL体积比25：24：1的苯酚、氯仿和异戊醇混合溶液振荡混匀，离心，取上清液至另一管；
④加入上清液等体积的体积比25：24：1的苯酚、氯仿和异戊醇混合溶液，振荡混匀，离心，取上清溶液至另一管；
⑤加入上述上清液1/2体积的7.5mol/L乙酸氨、以及上述上清液2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min，离心，倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉；
⑥加入1mL70v/v%乙醇水溶液，65℃水浴静置5分钟后，离心1分钟，去除上清液后，再加入1mL70v/v%乙醇水溶液，65℃水浴静置5分钟后，离心1分钟，将离心管中上清液去除，室温干燥，即获得DNA，加入50μL无菌超纯水于-20℃保存。
5.如权利要求1所述的植物乳杆菌定殖性的定性测定方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的变性梯度凝胶电泳处理的操作条件为：丙烯酰胺凝胶100g/L，变性剂线性梯度范围为30%-60%，其中，100%变性剂相当于7mol.L-1尿素和400mL.L-1甲酰胺；以0.5×TAE缓冲液，TAE含有40mmol.L-1Tris-乙酸和1mmol.L-1EDTA，pH=8.0。
6.如权利要求1所述的植物乳杆菌定殖性的定性测定方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的变性梯度凝胶电泳处理的电泳条件为60℃、160V和6h。
7.如权利要求1所述的植物乳杆菌定殖性的定性测定方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的步骤（3）获得的V3区PCR扩增后的产物用量为40μL。
8.如权利要求1所述的植物乳杆菌定殖性的定性测定方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的凝胶成像图谱分析为将经电泳后的变性梯度凝胶进行溴化乙锭染色15～20分钟，显色至条带清晰，用紫外凝胶呈像仪成像系统对染色后的凝胶进行成像。
9.如权利要求1所述的植物乳杆菌定殖性的定性测定方法，其特征在于，步骤（5）中，所述的比对为将步骤（4）得到的变性梯度凝胶的植物乳杆菌条带、空白组以及对照标记组的变性梯度凝胶上迁移条带的样品亮度进行比较，确定是否定殖。
10.一种植物乳杆菌定殖性的定量测定方法，其特征在于，其包括如下步骤：分别将被测样品、以及分别为105、106、107、108、109、1010cfu/g的含植物乳杆菌（lactobacillus plantaru）的菌粉，按如权利要求1~9任一项所述的步骤（1）~（4）操作，然后将105、106、107、108、109、1010cfu/g的植物乳杆菌的变性梯度凝胶上植物乳杆菌迁移条带的亮度与含量之间建立标准曲线，之后依据标准曲线，根据被测样品的变性梯度凝胶上植物乳杆菌迁移条带的亮度计算定殖的植物乳杆菌数量；所述的含植物乳杆菌（lactobacillus plantaru）的菌粉中的植物乳杆菌较佳的为与被测样品含有的植物乳杆菌在微生物种属水平层面上的同菌株的植物乳杆菌。
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