CN104293966A - 一种副猪嗜血杆菌的二重pcr检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体为一种副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法。本发明以具有该病原体基因型特点的保守性16SrRNA基因，及其毒力因子编码基因vtaA基因，作为PCR检测的两个基因靶点，将扩增该2个基因片段的2对引物放在一个PCR反应体系，通过对退火温度、特异性等各项参数调整优化，建立直接从样品中一次检测副猪嗜血杆菌的二重PCR方法。本发明方法体系可用于检测具有呼吸道症状和(或)关节肿大的病猪肺组织和关节液的副猪嗜血杆菌，既可以准确检测病原体，还可以对其毒力因子编码基因结构变异进行分析，从而掌握其变异趋势，起到一箭双雕作用。

Description

一种副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种能检测副猪嗜血杆菌的二重PCR方法。
背景技术
副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)为一种多形态、非溶血性、不运动、革兰氏阴性菌，属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，为猪的格氏病(Glasser‘s disease)病原菌，广泛存在于普通饲养猪群上呼吸道，可引发猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。随着养猪业的发展，该菌感染引起的疾病已经成为影响全球养猪业的一种重要细菌性疾病，给养殖业带来巨大经济损失，已经引起各国对副猪嗜血杆菌研究的高度重视，我国是养猪大国，研究副猪嗜血杆菌快速准确的检测方法对于养殖业具有重要意义。
副猪嗜血杆菌对于营养要求比较苛刻，在实验中较难培养，同时在采样过程中分离率也较低，采用传统病原学诊断方法具有较大难度，并且传统的血清型诊断方法有操作繁琐复杂，耗时耗力，特异性和灵敏性低等多种不足。由于细菌16SrRNA序列保守性极高，是细菌分类鉴定较为理想的靶序列，所以可用16S rRNA可对副猪嗜血杆菌进行检测。副猪嗜血杆菌是猪呼吸道的常在菌或条件性致病菌，而且常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等猪呼吸道病原微生物混合或继发感染，所以区分出正常栖生菌株与致病性菌株是确诊的关键所在，而毒力因子是区分致病性与非致病菌株的重要标志物。研究表明与毒力相关的自转运蛋白vtaA具有良好的免疫原性，并且该转运蛋白基因只在感染的机体内表达，自转运蛋白具有粘附素、红血球凝集素和侵袭素的一些特征。且自转运蛋白与细菌的粘附、入侵和毒力有关，能够介导生成生物被膜和产生血清抗性，是副猪嗜血杆菌的一种重要的毒力因子。
多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。所以建立副猪嗜血杆菌的PCR检测方法对于养殖业HPS的防治具有重要意义，可以为其防治提供有力的技术手段。
发明内容
鉴于副猪嗜血杆菌是当前集约化猪场的常见重要病原体，且往往与其他常见病原体混合感染，传统的诊断技术如细菌分离、免疫学实验等费时费力，不适于临床快速诊断，也不适于大规模的流行病学调查的现状，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种直接从样品中检测副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法。本发明的方法在检测病原体的同时，可以对其毒力因子编码基因结构变异进行分析，从而掌握其变异趋势。
本发明本着既能检测病原体又能分析其重要毒力因子编码基因变异特点的原则，从已发表的文献中筛选出具有该病原体基因型特点的保守性基因片段16SrRNA(821bp)，同时筛选该病原体重要的毒力因子编码基因片段vtaA基因(406bp)，作为PCR检测的两个基因靶点，将扩增这2个基因片段的2对引物放在一个PCR反应体系，通过对退火温度、特异性等各项参数调整优化，建立直接从样品中检测副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法。
本发明是通过以下的技术方案实现的。
一种副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法，以具有副猪嗜血杆菌基因型特点的保守性基因片段16SrRNA和毒力因子编码基因片段vtaA基因，作为PCR检测的两个基因靶点，将扩增这2个基因片段的2对引物放在一个PCR反应体系进行扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳检测鉴定PCR扩增产物；其中：扩增16SrRNA基因的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；扩增vtaA基因的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示；下游引物的序列如SEQ ID NO.4所(见表1)示。
表1副猪嗜血杆菌16SrRNA基因和vtaA基因引物
上述PCR检测方法中，所述PCR反应体系如下：cDNA模板1μl，2对上、下游引物各0.5μl，PCR Mix 12.5μl，超纯水补充至25μl。PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s，58℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明筛选具有该病原体基因型特点的保守性基因片段和毒力因子编码基因片段，作为PCR检测的两个基因靶点，在退火温度及其他反应体系参数等方面进行探索，确定灵敏度高、特异性强的多重PCR检测体系，建立直接从样品中检测副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法。实验证明，较现有报道的PCR检测方法，本发明的多重PCR检测方法重复性好，特异性强，提高了检测效率。
附图说明
图1是vtaA基因和16s rRNA引物退火温度优化结果；其中：M：标准分子量；泳道1：52℃；泳道2：54℃；泳道3：56℃；泳道4：58℃；泳道5：60℃；泳道6：62℃；泳道7：64℃。
图2是vtaA基因和16s rRNA特异性试验结果；其中：M：NDA 2000Marker；泳道1：大肠杆菌；泳道2：沙门氏菌；泳道3：副猪嗜血杆菌；泳道4：链球菌；泳道5：多杀性巴氏杆菌。
图3是二重PCR检测实际样品结果；其中：M：NDA 2000Marker；泳道1-6为肺组织培养菌落；7-11为关节液培养菌落。
具体实施方式
本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件。
将养猪场送检的疑似副猪嗜血杆菌感染的组织样品在TSA培养基上划线，37℃培养24h后挑取单菌落接种于TSB培养液中，12h后取菌液作为提取猪多杀性巴氏杆菌DNA样品。
实施例1检测副猪嗜血杆菌二重PCR方法退火温度的确定
1细菌DNA提取
本发明采用常规DNA提取方法，步骤如下：
1.1将上述菌液悬于1.5ml溶菌酶溶液(0.15mol/lNaCl，0.1mol/l Na2EDTA，15mg/ml溶菌酶，pH＝8)；
1.2.37℃温浴2h；
1.3.加入1.5ml 10％SDS(0.1mol/l NaCl，0.5mol/l Tris，10％SDS，pH＝8)反复颠倒混匀10min，10000r/min离心10min，取上清；
1.4用等体积苯酚：氯仿：异戊醇各抽提1次，水相中加入40μl的3mol/l乙酸铵和3ml无水乙醇，-20℃沉淀DNA1h，12000r/min离心10min；
1.5收集DNA沉淀，用100μl TE溶解。
2二重PCR扩增反应体系建立
在PCR反应体系，特别是多重PCR反应体系中，退火温度是一个关键的因素。本发明为了二重PCR体系中适合2对引物的退火温度，二重PCR反应体系如下：cDNA模板1μl，2对上、下游引物各0.5μl，PCR Mix 12.5μl，超纯水补充至25μl。PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s,依次设定退火温度为52℃，54℃，56℃，58℃，60℃，退火温度梯度1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min，PCR结束后，取8μlPCR产物于1℅的凝胶琼脂上电泳检测，分别确定vtaA基因和16s rRNA基因退火温度，结果显示二重PCR检测体系在退火温度58℃时能更好的扩增出预期的条带，故选择58℃为本二重PCR体系的退火温度。
3结果
通过退火温度梯度试验确定二重PCR最佳退火温度，结果如图1所示。结果.显示在退火温度58℃(4泳道)时，扩增出预期的条带染色鲜亮，故确定该二重PCR体系退火温度为58℃。
实施例2检测副猪嗜血杆菌二重PCR方法体系特异性
特异性是PCR反应体系又一个关键的因素。本发明为了确保所建立的二重PCR体系的特异性，利用大肠杆菌、沙门氏菌、嗜血杆菌、链球菌2型等作为对照，验证该体系的特异性，以体系只能扩增出副猪嗜血杆菌两个目的基因片段，而对照组不能扩增出片段为特异性合格。将实验室保存的沙门氏菌、大肠杆菌在LB培养基上划线，37℃培养过夜后挑单菌落接种于2ml LB液体培养基中，12h后取沙门氏菌、大肠杆菌菌液作为对照PCR模板；将实验室保存的猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌、链球菌2型在TSA培养基上划线，37℃培养24h后挑取单菌落接种于TSB液体培养基中，12h后取菌液作为对照PCR模板。副猪嗜血杆菌按实施例1的方法进行培养。
1细菌DNA提取
同实施例1。
2二重PCR扩增反应体系建立
二重PCR反应体系如下：cDNA模板1μl，2对上、下游引物各0.5μl，PCR Mix12.5μl，超纯水补充至25μl。PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s，58℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min，PCR结束后，取8μl产物作琼脂糖凝胶电泳分析。
3结果
对vtaA基因和16s rRNA进行特异性试验，结果如图2所示。电泳图片显示只有副猪嗜血杆菌(3泳道)出现两个预期条带，而其余泳道全部阴性，因此双重PCR方法具有良好的特异性，可用于副猪嗜血杆菌的检测。
实施例3二重PCR方法检测实际样品中副猪嗜血杆菌
为了进一步验证本发明提供的检测副猪嗜血杆菌二重PCR方法的实用性,本发明对采自浦东猪场具有呼吸道症状和(或)关节肿大的病猪肺组织和关节液进行细菌的分离，首先将病料在TSA培养基上划线，37℃培养24h后挑取单克隆菌落接种于TSB培养基中，12h后取菌液作为提取猪多杀性巴氏杆菌DNA样品。
1细菌DNA提取
同实施例1。
2二重PCR扩增反应体系扩增
二重PCR反应体系如下：cDNA模板1μl，2对上、下游引物各0.5μl，PCR Mix12.5μl，超纯水补充至25μl。PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s，58℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min，PCR结束后，取8μl产物作琼脂糖凝胶电泳分析。
3结果
如图3所示，电泳图片中的3-11泳道均出现了副猪嗜血杆菌两个被检基因片段的条带，这表明此双重PCR方法可用于实际病料中副猪嗜血杆菌的检测。

Claims (2)

1.一种副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法，其特征在于：以具有副猪嗜血杆菌基因型特点的保守性基因片段16SrRNA和毒力因子编码基因片段vtaA基因，作为PCR检测的两个基因靶点，将扩增这2个基因片段的2对引物放在一个PCR反应体系进行扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳检测鉴定PCR扩增产物；其中：
扩增16SrRNA基因的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示；
扩增vtaA基因的上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示；下游引物的序列如SEQID NO.4所示。
2.如权利要求1所述的二重PCR检测方法，其特征在于：所述PCR反应体系如下：cDNA模板1μl，2对上、下游引物各0.5μl，PCR Mix 12.5μl，超纯水补充至25μl；PCR反应条件：95℃预变性5min，进入95℃60s，58℃1min和72℃1min的循环，循环35次，最后72℃延伸5min。
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