CN104561283A - 副猪嗜血杆菌血清分型pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明通过比较副猪嗜血杆菌荚膜合成基因簇上的保守基因，并分析各血清型之间保守基因的差别，为15个血清型各设计多对引物，并从中各筛选一对作为血清分型PCR引物，并建立鉴别副猪嗜血杆菌15个血清分型PCR方法。本发明提供了一种准确度高、灵敏度高、特异性强的副猪嗜血杆菌血清分型PCR方法。

Description

副猪嗜血杆菌血清分型PCR方法

技术领域

本发明涉及血清分型方法，具体涉及副猪嗜血杆菌血清分型方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)能引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎，随着世界养猪业的发展，该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要的细菌性疾病。副猪嗜血杆菌可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的猪，发病率一般在10％～15％，严重时死亡率可达50％。主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。此外，副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。近年来，随着我国规模化养猪的发展，副猪嗜血杆菌感染有明显增加趋势，已成为猪场保育仔猪发病率和死亡率增加的重要原因之一，并给养猪业造成重大经济损失。副猪嗜血杆菌血清型众多，共15个血清型。

副猪嗜血杆菌感染的大多数流行病学研究是根据血清学分型信息开展的。传统的血清学分型方法是根据热稳定性可溶性抗原进行的琼脂扩散(GD)和间接血凝试验，已证实有15种血清型。而琼脂扩散的分型率大概只有63％，间接血凝的分型率为80％，仍然有大约20％的菌株不能进行分型，且这2种方法存在费时费力，交叉反应较多，结果不准确的问题。用于这两种方法的标准阳性血清也较难制备，存在制备周期长，血清效价较低，交叉反应难消除，且购买标准阳性血清价格昂贵，结果判断主观差异较大等问题。因为血清型的难于鉴定，导致菌株背景不清楚，临床上可能导致使用的疫苗血清型不对而导致疫苗免疫失败；另外因菌株血清型不清楚也给很多科研工作者的研究工作带来诸多不便。

副猪嗜血杆菌的血清型主要取决于其荚膜(CPS)的抗原性，而荚膜的产生又受控于基因组中的荚膜合成基因簇(CPS locus)。与传统的用抗血清检测血清型比较，基于血清型特异CPS基因的PCR方法是一种简单、可靠、经济的方法。目前临床上还没有这种分子分型的方法出现，所以迫切需要建立一套完善的检测体系能够方便快捷、准确、分型率高地检测出副猪嗜血杆菌的15种血清型，来替代传统落后、不实用且难于实现的血清分型方法。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种准确度高、灵敏度高、特异性强的副猪嗜血杆菌血清分型PCR方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

副猪嗜血杆菌血清分型PCR方法，包括以下步骤，

1)引物设计：比对副猪嗜血杆菌的荚膜合成基因簇上的保守基因，为15种血清型分别对应设计一对引物，作为血清分型PCR引物；

2)PCR扩增：以副猪嗜血杆菌15种血清型的参考菌株的基因组DNA为模板，以无菌双蒸水或超纯水为阴性对照，分别对上述设计的15对PCR引物进行PCR扩增；

3)凝胶成像：PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察每条引物扩增的目的条带，记录目的条带信息；

4)菌株检测：以待测菌株的基因组DNA为模版，以无菌双蒸水或超纯水为阴性对照，分别对上述15对PCR引物扩增，电泳凝胶成像，与参考菌株的目的条带信息进行比对，进行血清分型鉴别。

作为优选，步骤1)所述PCR引物的序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.30。

作为优选，步骤2)所述PCR扩增的条件如下：

50uL反应体系：2×Taq PCR Master Mix 25μL，10mmol/mL引物各1μL，模板DNA 1μL，然后加入无菌双蒸水或超纯水补足至50μL；

PCR反应程序：95℃预变性5min；然后按94℃变性45s，59℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸10min。

作为优选，步骤3)所述电泳成像条件如下：

用1％浓度的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳15min，凝胶成像系统观察每条引物扩增的目的条带大小。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.荚膜多糖是副猪嗜血杆菌的重要毒力因子，也是副猪嗜血杆菌血清型的区分依据。荚膜合成相关基因簇是副猪嗜血杆菌各血清型鉴别的分子基础，本发明针对荚膜进行血清型PCR分型的方法在国内属先例。

2.本发明提供的血清分型PCR方法特异性高。经比对，副猪嗜血杆菌各血清型的CPS基因簇中各自之间无同源性，被认为是血清型特异性基因。本发明提供的血清分型PCR引物，是针对该血清型特异性基因设计和筛选的，不会与其它另14种血清之间发生交叉反应，具有良好的特异性。

3.本发明提供的血清分型PCR方法，可迅速实现对15种血清型的快速甄别检测，相对于琼脂扩散(GD)和间接血凝试验分型方法更加快速简便，耗时短。

4.本发明提供的血清分型PCR方法，经鉴定，与常规琼脂扩散试验结果的符合率一致，具有较高的准确率。

5.本发明提供的血清分型PCR方法，均可适用于副猪嗜血杆菌15种血清型的检测，具有比常规琼脂扩散试验更宽的检测范围，检出率高。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1副猪嗜血杆菌15种血清分型PCR鉴定结果；

图2血清1型PCR特异性结果；

图3血清2型PCR特异性结果；

图4血清3型PCR特异性结果；

图5血清4型PCR特异性结果；

图6血清5型PCR特异性结果；

图7血清6型PCR特异性结果；

图8血清7型PCR特异性结果；

图9血清8型PCR特异性结果；

图10血清9型PCR特异性结果；

图11血清10型PCR特异性结果；

图12血清11型PCR特异性结果；

图13血清12型PCR特异性结果；

图14血清13型PCR特异性结果；

图15血清14型PCR特异性结果；

图16血清15型PCR特异性结果。

具体实施方式

实施例1:PCR引物的设计

比较副猪嗜血杆菌CPS基因簇上的保守基因，并分析比较各血清型之间保守基因的差别，对每个血清型设计多对引物，经大量试验比较其特异性、灵敏性等因素后，最终每个血清型确定一对特异性好，灵敏性高引物作为鉴定PCR引物，PCR引物序列如表1所示，PCR引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.30所示。

表1 各血清型PCR引物序列

实施例2：血清分型PCR方法的建立

PCR扩增：以副猪嗜血杆菌15种血清型的参考菌株的基因组DNA为模板，以无菌双蒸水为阴性对照，分别对上述设计的15对引物进行PCR扩增。

所有PCR扩增均采用50μL反应体系：2×Taq PCR Master Mix 25μL，引物各(10mmol/mL)1μL，模板DNA 1μL，然后加无菌双蒸水或超纯水补足至50μL。

PCR反应程序为：先对体系进行预变性，再经变性-退火-延伸依次循环。其中，预变性温度为95℃，预变性5min。循环中变性温度为94℃，变性45s，退火温度为59℃，退火30s，延伸温度为72℃，延伸30s，循环次数为35次。最后再72℃延伸10min。

电泳成像：PCR扩增后的产物用琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察每条引物扩增的目的条带，实现血清分型鉴别。其中，琼脂糖浓度为1％，采用120V电压电泳10-20min，凝胶成像系统观察成像结果。观察每条引物扩增的目的条带，当采用1％浓度的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳15min，结果如图1所示，每条引物扩增的目的条带大小与预期结果相符。

实施例3：血清分型PCR方法的特异性试验

为了鉴定本发明提供的血清分型PCR方法对单个血清分型的特异性，将每种副猪嗜血杆菌的分型引物分别跟其它14种血清型菌株的基因组DNA进行PCR反应。试验结果如图2-16所示，以上结果证实，各型PCR引物不会与其它14种血清型之间发生交叉反应。

实施例4：血清分型PCR方法的临床试验

用本发明提供的血清分型PCR方法，对89株临床发病猪分离的已通过琼脂扩散试验鉴定的副猪嗜血杆菌进行分型鉴定，以对比本血清分型PCR方法的准确性。

分别以该89株毒株基因组的DNA为模版，以无菌双蒸水或超纯水为阴性对照，对15对PCR引物进行PCR扩增，并对PCR扩增后的产物，进行凝胶电脉试验，凝胶成像系统观察扩增条带，观察和记录条带大小，与参考菌株的目的条带进行比对，鉴定血清分型。

试验结果证实，用常规琼脂扩散试验确定了血清型的89株菌株，与本发明的血清PCR分型方法鉴定结果如表2所示。

表2 89株临床分离副猪嗜血杆菌PCR分型与琼脂扩散分型结果对比表

该结果与用常规琼脂扩散试验结果的符合率完全一致。且某些用琼脂扩散不能分型的菌株，也能用本发明的方法进行鉴定。本发明设计的PCR引物用于副猪嗜血杆菌15种血清型的PCR检测具有简单、特异、准确等优点。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (4)

1.副猪嗜血杆菌血清分型PCR方法，包括以下步骤，

1)引物设计：比对副猪嗜血杆菌的荚膜合成基因簇上的保守基因序列，为15种血清型分别对应设计一对引物，作为血清分型PCR引物；

2)PCR扩增：以副猪嗜血杆菌15种血清型的参考菌株的基因组DNA为模板，以无菌双蒸水或超纯水为阴性对照，分别用上述设计的15对PCR引物进行PCR扩增；

3)凝胶成像：PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察每条引物扩增的目的条带，记录目的条带信息；

4)菌株检测：以待测菌株的基因组DNA为模版，以无菌双蒸水或超纯水为阴性对照，分别用上述15对PCR引物扩增，电泳凝胶成像，与参考菌株的目的条带信息进行比对，进行血清分型鉴别。

2.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌血清分型PCR方法，其特征在于，步骤1)所述15对PCR引物的序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.30。

3.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌血清分型PCR方法，其特征在于，步骤2)所述PCR扩增的条件如下：

50μL反应体系：2×Taq PCR Master Mix 25μL，10mmol/mL引物各1μL，模板DNA 1μL，然后加入无菌双蒸水或超纯水补足至50μL；

PCR反应程序：95℃预变性5min；然后按94℃变性45s，59℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；然后72℃延伸10min。

4.如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌血清分型PCR方法，其特征在于，步骤3)电泳成像条件如下：

用1％浓度的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳15min，凝胶成像系统观察每条引物扩增的目的条带大小。