CN103060447B - 四种菌的三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。本发明利用三重实时荧光PCR方法，将猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌共有序列用于检测猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌，伤寒沙门氏菌的特异序列用于检测伤寒沙门氏菌，鸡伤寒沙门氏菌的特异序列用于检测鸡伤寒沙门氏菌，通过一次实时荧光PCR扩增来判断样品中是否受到猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌的污染，再通过单一荧光PCR扩增区分猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，检测快速，可在31h完成从制备样品到出具检测结果的过程，结果可靠，且灵敏度高、特异性强。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及猪霍乱沙门氏菌（Salmonellacholeraesuis）、丙型副伤寒沙门氏菌（Salmonellaparatyphi）、伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphi）和鸡伤寒沙门氏菌（Salmonellagallinarum）的三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。
背景技术
沙门氏菌（Salmonella）属肠杆菌科，是人类重要的肠道致病菌，也可在动物肠道中繁殖或引起疾病。目前已知的沙门氏菌有2500多个血清型，我国发现了200多个血清型。沙门氏菌所致的疾病主要有两大类。一类是伤寒和副伤寒，由伤寒或副伤寒沙门氏菌引起，偶见由其他沙门氏菌引起伤寒样的感染，如猪霍乱沙门氏菌和肠炎沙门氏菌等。鸡伤寒沙门氏菌（Salmonellagallinarum）是鸡的重要致病菌，主要引起鸡伤寒（fowltyphoid）。
食品中沙门氏菌的检测主要是依靠传统的培养的方法，该方法需选择性增菌培养、生化鉴定、血清分型，通常要5-6天才能得出检测结果，不利于及时诊断、查找病源，控制病情的蔓延。沙门氏菌的传统方法鉴定需要经过病原的初步分离、生化鉴定并结合血清学分型，然后不同血清型之间发生的交叉反应会干扰血清学诊断的准确性。如肠炎沙门氏菌菌毛蛋白在沙门氏菌D群血清型中仍有编码。用该菌毛蛋白进行的凝集试验常与鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌等发生交叉凝集，即使是应用SEFl4菌毛抗原制成的纯化单克隆抗体进行胶乳凝集试验，仍与都柏林沙门氏菌发生交叉反应，从而使传统的检测方法中存在一定比例的假阳性等问题。随着分子生物学技术的发展，已有针对invA、16srRNA、SpvC、invB、fimA、agfA、SEFl4、sefA、sdf、ssaQ、fimY等为目标基因，用普通PCR或实时荧光PCR检测沙门氏菌的报道，但以上述序列作为目的片段的PCR法，只能检测到一部分Sa血清型或其毒力基因，不能同时得出所检测沙门氏菌属的血清型、毒素分泌类型等。目前也有商业化的杜邦公司生产的Bax系统，该系统利用荧光PCR技术从属的水平上检测沙门氏菌，具有较高的特异性，但不能对沙门氏菌进行分型。Camila等针对ompC、SdfI、ViaB、Spy为目的基因设计引物，建立了多重PCR检测沙门氏菌（Salmonellaspp）、SE（Enteritidis）、伤寒Sa（Typhi）、ST（Typhimurium）的方法，应用于鸡肉中的沙门氏菌检测，KIM等也根据鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌的特异序列设计多对引物，建立了多重PCR检测鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌的方法，均得到较好的效果，但上述方法需通过凝胶电泳判定结果，操作较为繁琐。EdelO'Regan等用flic、sefA、sdf、acek基因设计引物探针，用多重荧光PCR方法检测Enteritidis,Gallinarum,Typhimurium,Kentucky和Dublin沙门氏菌，但sefA为目的基因无法准确区分Enteritidis,Gallinarum和Dublin，flic为目的片段则无法区分Typhimurium和Kentucky，DavidFde等用普通PCR和应该光PCR来检测猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，但该研究也未对荧光PCR扩增体系的扩增效率等进行系统的评价。
因此，建立快速检测猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡沙门氏菌的方法，对于食品中沙门氏菌的检测、预防与控制具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速、可靠、灵敏度高、特异性强的猪霍乱沙门氏菌（SC）、丙型副伤寒沙门氏菌（SP）、伤寒沙门氏菌（ST）、鸡伤寒沙门氏菌（SG）三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法，通过一次实时荧光PCR扩增就能判断样品是否受到猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的污染，再通过单一荧光PCR扩增区分猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌。
本发明用猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列（GenBank：AE017220.1）、伤寒沙门氏菌的特异序列（GenBank：NC_016832.1）、鸡伤寒沙门氏菌的特异序列（GenBank:HQ703462）、猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列（GenBank：CP000857）分别设计检测引物和检测探针，猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列用于检测猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，伤寒沙门氏菌的特异序列用于检测伤寒沙门氏菌，鸡伤寒沙门氏菌的特异序列用于检测鸡伤寒沙门氏菌，猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列用于区分猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，利用基于Taqman探针的三重实时荧光PCR方法，通过一次实时荧光PCR扩增来判断样品中是否受到猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌的污染，再通过单一实时荧光PCR扩增区分猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，达到简便、快速、可靠、灵敏度高和特异性强的目的，从而实现了本发明的目的。
本发明的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列：
SCF：5`-GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3`；（如SEQIDNO.1所示）
SCR：5`-GGTGCAGATAACTCCAACAGG-3`；（如SEQIDNO.2所示）
针对伤寒沙门氏菌特异序列：
STF：5`-GTGGCTATGCAGTGAAAATGG-3`；（如SEQIDNO.3所示）
STR：5`-CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3`；（如SEQIDNO.4所示）
针对鸡伤寒沙门氏菌特异序列：
SGF：5`-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3`；（如SEQIDNO.5所示）
SGR：5`-TCATGCACTACCACCATAACG-3`。（如SEQIDNO.6所示）
针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列：
SPF：5`-AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3`；（如SEQIDNO.7所示）
SPR：5`-TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3`；（如SEQIDNO.8所示）。
本发明的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：
猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的探针：
SCP：5`-AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-3`；（如SEQIDNO.9所示）
伤寒沙门氏菌特异序列的探针：
STP：5`-ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3`；（如SEQIDNO.10所示）
鸡伤寒沙门氏菌特异序列的探针：
SGP：5`-ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3`；（如SEQIDNO.11所示）
猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的探针
SPP：5`-AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3`；（如SEQIDNO.12所示）
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，四个探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
所述的荧光报告基因优选为FAM、HEX、TET或ROX，所述的荧光淬灭基团优选为TAMARA或BHQ1。
本发明的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光PCR反应液、UNG酶、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物包括四对：
（1）针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列：
SCF：5`-GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3`；（如SEQIDNO.1所示）
SCR：5`-GGTGCAGATAACTCCAACAGG-3`；（如SEQIDNO.2所示）
（2）伤寒沙门氏菌特异序列：
STF：5`-GTGGCTATGCAGTGAAAATGG-3`；（如SEQIDNO.3所示）
STR：5`-CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3`；（如SEQIDNO.4所示）
（3）鸡伤寒沙门氏菌特异序列：
SGF：5`-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3`；（如SEQIDNO.5所示）
SGR：5`-TCATGCACTACCACCATAACG-3`。（如SEQIDNO.6所示）
（4）猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列：
SPF：5`-AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3`；（如SEQIDNO.7所示）
SPR：5`-TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3`；（如SEQIDNO.8所示）
所述的检测探针包括：
（1）猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的探针：
SCP：5`-AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-3`；（如SEQIDNO.9所示）
（2）伤寒沙门氏菌特异序列的探针：
STP：5`-ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3`；（如SEQIDNO.10所示）
（3）鸡伤寒沙门氏菌特异序列的探针：
SGP：5`-ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3`；（如SEQIDNO.11所示）
（4）猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的探针：
SPP：5`-AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3`；（如SEQIDNO.12所示）
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，四个探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
本发明的非疾病的诊断和治疗目的的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；
（2）使用上述针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列、伤寒沙门氏菌特异序列和鸡伤寒沙门氏菌特异序列的检测引物及检测探针，与实时荧光PCR扩增用的反应液、UNG酶及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
（3）将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数（Ct）；
（4）根据各样品的Ct值，按照建立的标准曲线，判断样品中是否含有猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌；
（5）上述步骤（4）得出的样品检测结果中如果扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，则以步骤（1）所提取的增菌液中菌体的基因组DNA作为模板，使用上述针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的检测引物和检测探针，与实时荧光PCR扩增用的反应液、UNG酶及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行单一实时荧光PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数（Ct），根据各样品的Ct值，按照建立的标准曲线，区分样品中的猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌。
所述的样品优选为食品。
所述的步骤（2）的扩增反应体系优选为：模版DNA3μL，10×TaqMan缓冲液4μl，5mmol/LMgCl22μl，2.5mmol/LdNTPs3μl，三种20μmol/L检测探针SCP，STP和SGP各1μl，共3μl，六条20μmol/L检测引物SCF、SCR、STF、STR、SGF和SGR各1μl，共6μl，0.55UUNG酶0.2μl，2.5U/μlTaq聚合酶3μl，去离子水5.8μl。
所述步骤（3）的进行实时荧光PCR反应，其反应参数优选为：95℃30s、95℃5s、60℃34s、40个循环。结果判断标准：以荧光PCR检测扩增曲线指数期明显，且Ct<37为阳件判定原则，如果扩增曲线指数期明显且Ct<35可直接判定为阳性，如果Ct值在35～37之间判断为可疑，需要加大模板量进行重复实验，若出现指数期明显的扩增曲线方可判定为阳性，否则为阴性。
所述步骤（5）的扩增反应体系优选为：模版DNA1μL，10×TaqMan缓冲液4μl，5mmol/LMgCl22μl，2.5mmol/LdNTPs3μl，20μmol/L针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的检测探针SPP和检测引物SPF、SPR各1μl，0.55UUNG酶0.2μl，2.5U/μlTaq聚合酶3μl，去离子水13.8μl。
所述步骤（5）的进行单一实时荧光PCR反应，其反应参数优选为：95℃30s、95℃5s、60℃34s、40个循环。结果判断标准：以荧光PCR检测扩增曲线指数期明显，且Ct<37为阳件判定原则，如果扩增曲线指数期明显且Ct<35可直接判定为阳性，如果Ct值在35～37之间判断为可疑，需要加大模板量进行重复实验，若出现指数期明显的扩增曲线方可判定为阳性，否则为阴性。
本发明根据猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列（GenBank:AE017220.1）、伤寒沙门氏菌的特异序列（GenBank:NC_016832.1）、鸡伤寒沙门氏菌的特异序列（GenBank:HQ703462）、霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列（GenBank:CP000857）分别设计检测引物和检测探针，利用该检测引物和检测探针按照本发明的方法对样品进行三重实时荧光PCR检测，用猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列检测猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，用伤寒沙门氏菌的特异序列检测伤寒沙门氏菌，用鸡伤寒沙门氏菌的特异序列检测鸡伤寒沙门氏菌，在一次实时荧光PCR扩增反应中完成对猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的检测，再通过单一实时荧光PCR扩增区分猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，从而简便、快速、可靠地判断样品是否受到猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的污染。以本发明的检测引物及检测探针按照本发明的方法对样品进行三重实时荧光PCR检测，检测快速，可在31h完成从制备样品到出具检测结果的过程，不受假阳性和交叉污染等干扰，结果可靠，且灵敏度高、特异性强，为沙门氏菌进行流行病学调查提供了有利工具。适用于食品的检验检疫，可供检验检疫局、疾病预防控制中心和质量监督部门对样品进行简便、快速、准确的检测。
附图说明
图1是猪霍乱沙门氏菌特异性试验荧光PCR扩增图；
图2是丙型副伤寒沙门氏菌特异性试验荧光PCR扩增图；
图3是伤寒沙门氏菌特异性试验荧光PCR扩增图；
图4是鸡伤寒沙门氏菌特异性试验荧光PCR扩增图；
图5是区别丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌荧光PCR扩增图；
图6是猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释三重荧光PCR扩增图，其中，红色为FAM，绿色为TET，黄色为HEX；
图7是丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌梯度稀释三重荧光PCR扩增图，其中，红色为FAM，绿色为HEX，蓝色为TET；
图8是添加猪霍乱沙门氏菌的猪肉样品荧光PCR扩增图；
图9是添加丙型副伤寒沙门氏菌的猪肉样品荧光PCR扩增图；
图10是添加伤寒沙门氏菌的猪肉样品荧光PCR扩增图；
图11是添加鸡伤寒沙门氏菌的猪肉样品荧光PCR扩增图；
图12是添加猪霍乱沙门氏菌的鸡肉样品荧光PCR扩增图；
图13是添加丙型副伤寒沙门氏菌的鸡肉样品荧光PCR扩增图；
图14是添加伤寒沙门氏菌的鸡肉样品荧光PCR扩增图；
图15是添加鸡伤寒沙门氏菌的鸡肉样品荧光PCR扩增图；
图16是添加猪霍乱沙门氏菌的鱼肉样品荧光PCR扩增图；
图17是添加丙型副伤寒沙门氏菌的鱼肉样品荧光PCR扩增图；
图18是添加伤寒沙门氏菌的鱼肉样品荧光PCR扩增图；
图19是添加鸡伤寒沙门氏菌的鱼肉样品荧光PCR扩增图；
图20是污染了猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的猪肉样品荧光PCR扩增图，其中红色为FAM，绿色为TET，黄色为HEX；
图21是污染了猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的鸡肉样品荧光PCR扩增图，其中红色为FAM，绿色为TET，黄色为HEX；
图22是污染了猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的鱼肉样品荧光PCR扩增图，其中红色为FAM，绿色为TET，黄色为HEX；
图23是污染了丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的猪肉样品荧光PCR扩增图，其中红色为FAM，绿色为TET，黄色为HEX；
图24是污染了丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的鸡肉样品荧光PCR扩增图，其中红色为FAM，绿色为TET，黄色为HEX；
图25是污染了丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的鱼肉样品荧光PCR扩增图，其中红色为FAM，绿色为TET，黄色为HEX。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1菌株的选取及检测引物、检测探针的设计
选取34种不同血清型沙门氏菌共142株，包括丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株1株（IQCC10527）、丙型副伤寒沙门氏菌分离株21株（SP1-SP21）、猪霍乱沙门氏菌标准菌株1株（IQCC10502）、猪霍乱沙门氏菌分离株24株（SC1-SC24）、伤寒沙门氏菌标准菌株1株（CMCC50071）、伤寒沙门氏菌分离株30株（ST1-ST30）、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株1株（CMCC50770）、鸡伤寒沙门氏菌分离株33株（SG1-SG33）、30株其他血清型沙门氏菌，除此之外选取变形杆菌等21株非沙门氏菌，菌株信息如表1所示。上述菌株均经API20E试剂条和血清学试验进行确证。上述菌株来自中国普通微生物菌种保藏管理中心、广东省疾病预防控制中心、中国检验检疫科学研究院、广东出入境检验检疫局技术中心。
表1实验用菌株信息表
根据GenBank公布的猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列（GenBank：AE017220.1）、伤寒沙门氏菌的特异序列（GenBank：NC_016832.1）、鸡伤寒沙门氏菌的特异序列（GenBank:HQ703462）、猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列（GenBank：CP000857），用Oligo软件设计检测引物和检测探针，委托宝生物工程（大连）有限公司合成。所设计的检测引物和检测探针序列如表2所示：
表2荧光PCR引物和探针序列
具体为：
针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列：
SCF：5`-GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3`；（如SEQIDNO.1所示）
SCR：5`-GGTGCAGATAACTCCAACAGG-3`；（如SEQIDNO.2所示）
针对伤寒沙门氏菌特异序列：
STF：5`-GTGGCTATGCAGTGAAAATGG-3`；（如SEQIDNO.3所示）
STR：5`-CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3`；（如SEQIDNO.4所示）
针对鸡伤寒沙门氏菌特异序列：
SGF：5`-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3`；（如SEQIDNO.5所示）
SGR：5`-TCATGCACTACCACCATAACG-3w。（如SEQIDNO.6所示）
针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列：
SPF：5`-AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3`；（如SEQIDNO.7所示）
SPR：5`-TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3`；（如SEQIDNO.8所示）。
所设计的检测探针如下：
猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的探针：
SCP：5`-FAM-AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC-BHQ1`-3`；（如SEQIDNO.9所示）
伤寒沙门氏菌特异序列的探针：
STP：5`-HEX-ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAABHQ1-3`；（如SEQIDNO.10所示）
鸡伤寒沙门氏菌特异序列的探针：
SGP：5`-TET-ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC–TAMARA-3`；（如SEQIDNO.11所示）
猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的探针
SPP：5`-ROX-AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT–BHQ1-3`；（如SEQIDNO.12所示）
实施例2：模板DNA的制备
将上述22株丙型副伤寒沙门氏菌、25株猪霍乱沙门氏菌、31株伤寒沙门氏菌、34株鸡伤寒沙门氏菌、30株其他血清型沙门氏菌和21株非沙门氏菌均用缓冲蛋白胨水（BP）37℃培养10h，然后分别取10ml上述培养的菌液接种于90mlTTB增菌液中，44.5℃培养18h，再分别取1ml上述培养的菌悬液移入离心管，12000r/min离心5min去上清，用1ml去离子水漂浮沉淀，再12000r/min离心3min去上清，重复两次，最后加200μl去离子水，在核酸提取仪上提取DNA用于实时荧光PCR扩增。
实施例3：检测引物和检测探针特异性试验
单一实时荧光PCR反应体系30μl，包括：模板DNA1μl，10×TaqMan缓冲液4μl，5mmol/LMgCl22μl，2.5mmol/LdNTPs3μl，20μmol/l检测探针1μl，20μmol/l检测引物各1μl(共2μl)，0.55UUNG酶0.2μl，2.5U/μlTaq聚合酶3μl，去离子水13.8μl。荧光PCR反应参数为95℃30s、95℃5s、60℃34s，40个循环。
1、特异性试验1：猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌特异性试验
按照实施例2所述的方法提取25株猪霍乱沙门氏菌、22株丙型副伤寒沙门氏菌、31株伤寒沙门氏菌、34株鸡伤寒沙门氏菌、30株其他血清型沙门氏菌和21株非沙门氏菌的DNA，按照上述单一实时荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR扩增（检测引物和检测探针为针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的检测引物SCF、SCR和检测探针SCP）。其检测结果如图1和图2所示，CT值如表3所示，从图1和图2中可以看出，25株猪霍乱沙门氏菌和22株丙型副伤寒沙门氏菌的实时荧光PCR扩增曲线指数器明显，从表3中可以看出Ct值在7~15之间。而31株伤寒沙门氏菌、34株鸡伤寒沙门氏菌、30株其他血清型沙门氏菌和21株非沙门氏菌扩增结果为阴性，由此可见，针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的检测引物和检测探针特异性好，能特异地扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌。
2、特异性试验2：伤寒沙门氏菌特异性试验
按照实施例2所述的方法提取31株伤寒沙门氏菌、25株猪霍乱沙门氏菌、22株丙型副伤寒沙门氏菌、34株鸡伤寒沙门氏菌、30株其他血清型沙门氏菌和21株非沙门氏菌的DNA，按照上述单一实时荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR扩增（检测引物和检测探针为针对伤寒沙门氏菌特异序列的检测引物STF、STR和检测探针STP）。其检测结果如图3所示，CT值如表3所示，从图3中可以看出，31株伤寒沙门氏菌的实时荧光PCR扩增曲线指数器明显，从表3中可以看出Ct值在7~18之间。而25株猪霍乱沙门氏菌、22株丙型副伤寒沙门氏菌、34株鸡伤寒沙门氏菌、30株其他血清型沙门氏菌和21株非沙门氏菌扩增结果为阴性，由此可见，针对伤寒沙门氏菌特异序列的检测引物和检测探针特异性好，能特异地扩增出伤寒沙门氏菌。
3、特异性试验3：鸡伤寒沙门氏菌特异性试验
按照实施例2所述的方法提取34株鸡伤寒沙门氏菌、31株伤寒沙门氏菌、25株猪霍乱沙门氏菌、22株丙型副伤寒沙门氏菌、30株其他血清型沙门氏菌和21株非沙门氏菌的DNA，按照上述单一实时荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR扩增（检测引物和检测探针为针对鸡伤寒沙门氏菌特异序列的检测引物SGF、SGR和检测探针SGP）。其检测结果如图4所示，CT值如表3所示，从图4中可以看出，34株鸡伤寒沙门氏菌的实时荧光PCR扩增曲线指数器明显，从表3中可以看出Ct值在10~15之间。而25株猪霍乱沙门氏菌、22株丙型副伤寒沙门氏菌、30株其他血清型沙门氏菌和21株非沙门氏菌扩增结果为阴性，由此可见，针对鸡伤寒沙门氏菌特异序列的检测引物和检测探针特异性好，能特异地扩增出鸡伤寒沙门氏菌。
4、特异性试验4：猪霍乱和丙型副伤寒沙门氏菌区别特异性试验
按照实施例2所述的方法提取25株猪霍乱沙门氏菌、22株丙型副伤寒沙门氏菌的DNA，按照上述单一实时荧光PCR反应体系进行实时荧光PCR扩增（检测引物和检测探针为针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的检测引物SPF、SPR和检测探针SPP）。其检测结果如图5所示，CT值如表3所示，从图5中可以看出，22株丙型副伤寒沙门氏菌的实时荧光PCR扩增曲线指数期明显，从表3中可以看出Ct值在12~20之间。而25株猪霍乱沙门氏菌扩增结果为阴性，由此可见，针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的检测引物和检测探针只能扩增丙型副伤寒沙门氏菌，能够用来区分猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌。
结合特异性试验1、特异性试验2、特异性试验3及特异性试验4的结果，说明本发明的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌的检测引物和检测探针具有高度的特异性，分别适合对猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌进行特异性检测。
表3猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌特异性试验CT值
*:区分SC和SP引物扩增22株SP的CT值。
实施例4：三重实时荧光PCR扩增方法的建立、敏感性试验及标准曲线制作
三重实时荧光PCR反应体系30μl，包括：模版DNA3μL（猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌各1μL；或丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌各1μL），10×TaqMan缓冲液4μl，5mmol/LMgCl22μl，2.5mmol/LdNTPs3μl，20μmol/l检测探针各1μl（包括针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌共有序列的检测探针SCP1μl、针对伤寒沙门氏菌特异序列的检测探针STP1μl和针对鸡伤寒沙门氏菌特异序列的检测探针SGP1μl，共3μl），20μmol/l检测引物各1μl（包括针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的2条检测引物SCF、SCR各1μl、针对伤寒沙门氏菌特异序列的2条检测引物STF、STR各1μl和针对鸡伤寒沙门氏菌特异序列的2条检测引物SGF、SGR各1μl，共6μl），0.55UUNG酶0.2μl，2.5U/μlTaq聚合酶3μl，去离子水5.8μl。三重实时荧光PCR反应参数为95℃30s、95℃5s、60℃34s，40个循环。
1、猪霍乱沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌敏感性试验及标准曲线制作
原始浓度分别为3.1×107cfu/ml、3.5×107cfu/ml、3.0×107cfu/ml的猪霍乱沙门氏菌标准菌株IQCC10502、伤寒杆菌沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770培养液，分别进行10倍梯度稀释，从每个稀释度中取1ml培养液按照实施例2所述的方法提取DNA，按照上述三重实时荧光PCR体系进行实时荧光PCR扩增，评价三重荧光PCR体系的最低检测浓度。在荧光PCR仪上选择标准品模式，仪器配套软件自动绘制标准曲线。敏感性试验用GB4789.4-2010《食品卫生微生物检验沙门氏菌》进行对照。
结果表明：猪霍乱沙门氏菌标准菌株IQCC10502、伤寒杆菌沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770三个实时荧光PCR扩增曲线指数期明显（如图6所示），而且3株菌株的模板浓度与Ct值之间也出现良好的线性关系，猪霍乱沙门氏菌标准菌株IQCC10502、伤寒杆菌沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770的线性系数为别为0.996、0.994、0.999，扩增效率分别为91.6%、94.5%、88.2%，最低检测浓度分别达到310cfu/ml、350cfu/ml、300cfu/ml（如表4和表5所示）。
2、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌敏感性试验及标准曲线制作
原始浓度分别为3.3×107cfu/ml、3.5×107cfu/ml、3.0×107cfu/ml的丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株IQCC10527、伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒标准菌株CMCC50770培养液，分别进行10倍梯度稀释，从每个稀释度中取1ml培养液按照实施例2所述的方法提取DNA，按照上述三重实时荧光PCR体系进行实时荧光PCR扩增，评价三重荧光PCR体系的最低检测浓度。在荧光PCR仪上选择标准品模式，仪器配套软件自动绘制标准曲线。敏感性试验用GB4789.4-2010《食品卫生微生物检验沙门氏菌》进行对照。
结果表明：丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株IQCC10527、伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770三个实时荧光PCR扩增曲线指数期明显（如图7所示），而且3株菌株的模板浓度与Ct值之间也出现良好的线性关系，丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株IQCC10527、伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒标准菌株CMCC50770的线性系数为别为0.996、0.994、0.999，扩增效率分别为91.6%、93.1%、84.5%，最低检测浓度分别达到330cfu/ml、350cfu/ml、300cfu/ml（如表4和表5所示）。
表4：三重荧光PCR敏感度检测结果
注：表达式为菌液浓度（cfu/ml）与Ct值之间线性关系表达式，式中y为对应的CT值，x为模板起始浓度的对数；R2为菌液浓度与Ct值的相关系数。
表5三重荧光PCR敏感性试验结果
实施例5：模拟样品的检测
1、单污染模拟样品检测
分别秤取25g猪肉、鸡肉、鱼肉，每份样品中按照表6所示的菌液添加浓度（cfu/ml）分别添加1ml菌液，4个不同浓度的猪霍乱沙门氏菌标准菌株IQCC10502、丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株IQCC10527、伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770菌悬液（未添加菌液的样品作为阴性对照），制成48份模拟样品。再向每份样品中加入225ml缓冲蛋白胨水（BP），用拍打器拍打2min，37℃培养10h，然后取10ml移入90mlTTB增菌液，44.5℃培养18h，然后取一部分按照实施例2所述的方法提取DNA，按照实施例4的方法进行三重实时荧光PCR扩增，同时取一部分按GB4789.4-2010《食品卫生微生物检验沙门氏菌》继续进行检测。
其三重时荧光PCR扩增结果如图8-19和表6所示，结果表明：添加了猪霍乱沙门氏菌标准菌株IQCC10502的猪肉样品扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的扩增曲线（如图8所示），添加了丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株IQCC10527的猪肉样品扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的扩增曲线（如图9所示），添加了伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071的猪肉样品扩增出伤寒沙门氏菌特异序列的扩增曲线（如图10所示），添加了鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770的猪肉样品扩增出鸡伤寒沙门氏菌特异序列的扩增曲线（如图11所示）；添加了猪霍乱沙门氏菌标准菌株IQCC10502的鸡肉样品扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的扩增曲线（如图12所示），添加了丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株IQCC10527的鸡肉样品扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的扩增曲线（如图13所示），添加了伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071的鸡肉样品扩增出伤寒沙门氏菌特异序列的扩增曲线（如图14所示），添加了鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770的鸡肉样品扩增出鸡伤寒沙门氏菌特异序列的扩增曲线（如图15所示）；添加了猪霍乱沙门氏菌标准菌株IQCC10502的鱼肉样品扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的扩增曲线（如图16所示），添加了丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株IQCC10527的鱼肉样品扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的扩增曲线（如图17所示），添加了伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071的鱼肉样品扩增出伤寒沙门氏菌特异序列的扩增曲线（如图18所示），添加了鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770的鱼肉样品扩增出鸡伤寒沙门氏菌特异序列的扩增曲线（如图19所示）。按照GB4789.4-2010《食品微生物学检验沙门氏菌检验》检测的模拟样品，均分离出与添加的菌株相符的猪霍乱沙门氏菌标准菌株IQCC10502、丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株IQCC10527、伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770，结果与三重实时荧光PCR法相同。
2、混合污染模拟样品检测
分别秤取25g猪肉、鸡肉、鱼肉，每份样品中按照表7所示的菌液添加浓度分别添加相同数量级的4个不同浓度的猪霍乱沙门氏菌标准菌株IQCC10502、伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770菌悬液各1ml，制成12份模拟样品；再分别秤取25g猪肉、鸡肉、鱼肉，每份样品中按照表7所示的菌液添加浓度分别添加相同数量级的4个不同浓度的丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株IQCC10527、伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770菌悬液各1ml，制成12份模拟样品，共制成24份模拟样品。在每份样品中加入225ml缓冲蛋白胨水，用拍打器拍打2min，37℃培养10h，取10ml移入90mlTTB增菌液，44.5℃培养18h，然后取一部分按照实施例2所述的方法提取DNA，再按照实施例4的方法进行三重实时荧光PCR扩增，同时取一部分按GB4789.4-2010《食品卫生微生物检验沙门氏菌》继续进行检测。
结果如图20-25和表7所示，结果表明：添加了猪霍乱沙门氏菌标准菌株IQCC10502、伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770的猪肉样品扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的扩增曲线、伤寒沙门氏菌特异序列扩增曲线和鸡伤寒沙门氏菌特异序列扩增曲线（如图20所示）；添加了猪霍乱沙门氏菌标准菌株IQCC10502、伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770的鸡肉样品扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的扩增曲线、伤寒沙门氏菌特异序列扩增曲线和鸡伤寒沙门氏菌特异序列扩增曲线（如图21所示）；添加了猪霍乱沙门氏菌标准菌株IQCC10502、伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770的鱼肉样品扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的扩增曲线、伤寒沙门氏菌特异序列扩增曲线和鸡伤寒沙门氏菌特异序列扩增曲线（如图22所示）；添加了丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株IQCC10527、伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770的猪肉样品扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的扩增曲线、伤寒沙门氏菌特异序列扩增曲线和鸡伤寒沙门氏菌特异序列扩增曲线（如图23所示）；添加了丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株IQCC10527、伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770的鸡肉样品扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的扩增曲线、伤寒沙门氏菌特异序列扩增曲线和鸡伤寒沙门氏菌特异序列扩增曲线（如图24所示）；添加了丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株IQCC10527、伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770的鱼肉样品扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的扩增曲线、伤寒沙门氏菌特异序列扩增曲线和鸡伤寒沙门氏菌特异序列扩增曲线（如图25所示）；对应的Ct值如表7所示，按照GB4789.4-2010《食品微生物学检验沙门氏菌检验》检测的模拟样品，均分离出与添加的菌株相符的猪霍乱沙门氏菌标准菌株IQCC10502、丙型副伤寒沙门氏菌标准菌株IQCC10527、伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50071、鸡伤寒沙门氏菌标准菌株CMCC50770，结果与三重实时荧光PCR法相同。
综上所述，本发明的三重实时荧光PCR检测方法，其特异性高，检测的敏感性与单重实时荧光PCR检测体系相当，可应用于食品中猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌的检测。本发明的三重实时PCR扩增敏感性试验结果表明，模板浓度与Ct值有良好的线性关系，检测灵敏度均可达到102cfu/ml数量级，具有很好的应用前景。
表6单污染模拟样品荧光PCR检测结果
表7混合污染模拟样品荧光PCR检测结果
Claims (8)
1.一种猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌的三重实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光PCR反应液、UNG酶、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物包括四对：
(1)针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列：
SCF：5`-GATAGGGCTGGTGTTGAAGAG-3`；
SCR：5`-GGTGCAGATAACTCCAACAGG-3`；
(2)伤寒沙门氏菌特异序列：
STF：5`-GTGGCTATGCAGTGAAAATGG-3`；
STR：5`-CACCAAATTTCACAGCTCCAG-3`；
(3)鸡伤寒沙门氏菌特异序列：
SGF：5`-CGATATAGCTTACTGTGTCCCG-3`；
SGR：5`-TCATGCACTACCACCATAACG-3`；
(4)猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列：
SPF：5`-AGTTGAAGCTGAACAGTCGC-3`；
SPR：5`-TCGCCAACAGAGACTTTGATC-3`；
所述的检测探针包括：
(1)猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的探针：
SCP：5`-AGCACGCTGGTTAGGTGGAATAACTC`；
(2)伤寒沙门氏菌特异序列的探针：
STP：5`-ACAGATGGTACTGGCGTTGCTCAAA-3`；
(3)鸡伤寒沙门氏菌特异序列的探针：
SGP：5`-ACATCCCTCATATCGGCGCGAAC-3`；
(4)猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的探针：
SPP：5`-AGCCTCTATGGAAGTTCCGTCTCCT-3`；
探针的5`端标记有荧光报告基团，3`端标记有荧光淬灭基团，猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的探针、伤寒沙门氏菌特异序列的探针和鸡伤寒沙门氏菌特异序列的探针的5`端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。
2.根据权利要求1所述的三重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光报告基因为FAM、HEX、TET或ROX，所述的荧光淬灭基团为TAMARA或BHQ1。
3.一种非疾病的诊断和治疗目的的猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌的三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；
(2)将权利要求1中的针对猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列、伤寒沙门氏菌特异序列和鸡伤寒沙门氏菌特异序列的引物，及猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的共有序列的探针、伤寒沙门氏菌特异序列的探针和鸡伤寒沙门氏菌特异序列的探针，与实时荧光PCR扩增用的反应液、UNG酶及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
(3)将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数Ct；
(4)根据各样品的Ct值，按照建立的标准曲线，判断样品中是否含有猪霍乱沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌；
(5)上述步骤(4)得出的样品检测结果中如果扩增出猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌，则以步骤(1)所提取的增菌液中菌体的基因组DNA作为模板，使用权利要求1中的猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的引物和猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌的差异序列的探针，与实时荧光PCR扩增用的反应液、UNG酶及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行单一实时荧光PCR反应，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录各检测样品的PCR扩增循环次数，根据各样品的Ct值，按照建立的标准曲线，区分样品中的猪霍乱沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌。
4.根据权利要求3所述的三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的样品为食品。
5.根据权利要求3所述的三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)的扩增反应体系为：模版DNA3μL，10×TaqMan缓冲液4μl，5mmol/LMgCl22μl，2.5mmol/LdNTPs3μl，20μmol/LTaqMan权利要求1中的检测探针SCP，STP和SGP各1μl，共3μl，20μmol/L权利要求1中的检测引物SCF、SCR、STF、STR、SGF和SGR各1μl，共6μl，0.55UUNG酶0.2μl，2.5U/μlTaq聚合酶3μl，去离子水5.8μl。
6.根据权利要求3所述的三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的进行实时荧光PCR反应，其反应参数为：95℃30s、95℃5s、60℃34s、40个循环。
7.根据权利要求3所述的三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(5)的扩增反应体系为：模版DNA1μL，10×TaqMan缓冲液4μl，5mmol/LMgCl22μl，2.5mmol/LdNTPs3μl，20μmol/L权利要求1中的检测探针SPP和权利要求1中的检测引物SPF、SPR各1μl，0.55UUNG酶0.2μl，2.5U/μlTaq聚合酶3μl，去离子水13.8μl。
8.根据权利要求3所述的三重实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(5)的进行单一实时荧光PCR反应，其反应参数为：95℃30s、95℃5s、60℃34s、40个循环。
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| CN1603422A (zh) * | 2004-08-02 | 2005-04-06 | 扬州大学 | 沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重pcr快速检测方法 |
| CN1861802A (zh) * | 2005-05-09 | 2006-11-15 | 吕占军 | 一种多重pcr反应试剂盒及其检测方法 |
| CN101173315A (zh) * | 2007-09-30 | 2008-05-07 | 中国农业大学 | 沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌、大肠杆菌多重pcr快速检测试剂盒及其应用 |
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| CN103060447A (zh) | 2013-04-24 |
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