CN1603422A - 沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重pcr快速检测方法 - Google Patents
沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重pcr快速检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1603422A CN1603422A CN 200410041611 CN200410041611A CN1603422A CN 1603422 A CN1603422 A CN 1603422A CN 200410041611 CN200410041611 CN 200410041611 CN 200410041611 A CN200410041611 A CN 200410041611A CN 1603422 A CN1603422 A CN 1603422A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- listeria monocytogenes
- salmonellas
- fungus
- primer
- hly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种鉴定细菌，特别是鉴定沙门氏菌(Salmonella)、产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)的检测方法。先将沙门氏菌和大肠杆菌(YZU_DSL1)分别采用热裂解法提取各自DNA模板、产单核细胞李斯特菌采用酶解法提取DNA模板，然后进行一次性PCR扩增特定的多个基因，最后经电泳鉴定。本发明通过将样本的DNA，一次性同时对可能存在的沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因、产单核细胞溶血素基因扩增和一定存在的大肠杆菌(YZU_DSL1)质粒进行扩增，形成大量的基因复制片段，比较方便，一次就能鉴定是否为沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌，并对阴性结果的反应体系的正确性作出判断。本发明较经典方法的细菌分离、鉴定和血清学分型试验方法快速、准确。
Description
技术领域
本发明公开了一种鉴定细菌，特别是鉴定沙门氏菌(Salmonella)、产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)的检测方法。
背景技术
沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌是重要的人兽共患病原菌，是世界卫生组织(WHO)所列最主要的两种食源性病原细菌。沙门氏菌不仅能导致动物疾病，还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒，在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第二位；李斯特菌是一种能引起动物和人类流产、败血症和脑膜炎等疾病的食源性病原体，新生儿、老年人、孕妇及免疫缺陷病人是李斯特菌感染的高危人群。世界各国，包括美国等发达国家，沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌食物污染日益增多，我国也不例外，给国家经济造成巨大损失，同时严重威胁着人民的身体健康和生命安全。在发达国家临床李斯特菌病的发病率大约为2～15/10万，死亡率为13～34％。在美国每年大约有2500例李斯特菌病病例，其中500例死亡。因此，尽管李斯特菌病的病例不如其他食源性疾病来的常见，它仍然成为仅次于沙门氏菌感染的第二号致命的食源性感染性疾病。
沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌作为致病菌检测的一项重要指标，在公共卫生、食品安全、畜牧兽医和出入境检验检疫中均是必需检测的项目，有重要社会、经济的意义。传统的沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌检测常用分离培养和血清学方法，分别采用不同的检验程序、方法，分别报告，确诊检验结果至少需5～7天，检验方法存在繁琐、费时费力、特异性低等缺陷，特别是我国已加入世界贸易组织(WTO)，国际贸易量与日俱增。因此，快速、准确、简便的细菌检测方法将是发展的方向。建立一种能同时快速检测沙门氏菌和产单核细胞李斯特菌的检测方法具有重要的意义。
发明内容
本发明目的在于为人们提供一种能快速鉴定出样本是否被沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌污染的检测方法。
本发明提供的方法是：将沙门氏菌和大肠杆菌(YZU_DSL1)分别采用热裂解法提取各自DNA模板、产单核细胞李斯特菌采用酶解法提取DNA模板，然后进行一次性PCR扩增特定的多个基因，最后经电泳鉴定。
由于单个疑似样本中的特征基因数量极少，本发明通过将样本的DNA，一次性同时对可能存在的沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因、产单核细胞溶血素基因扩增和一定存在的大肠杆菌(YZU_DSL1)质粒进行扩增，形成大量的基因复制片段，比较方便，一次就能鉴定是否为沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌，并对阴性结果的反应体系的正确性作出判断。本发明较经典方法的细菌分离、鉴定和血清学分型试验方法快速、准确。
该检测系统具有可监测性。扩增结果无任何条带时，表明检测系统无效；扩增结果出现300bp、495bp、850bp三条带中的任一条带时，表明检测系统有效。扩增结果出现300bp、495bp或495bp时，表明结果为沙门氏菌；扩增结果出现300bp、850bp或850bp时，表明结果为产单核细胞李斯特菌；扩增结果出现300bp、495bp、850bp、或495bp、850bp时，表明结果为沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌。
另外，本发明进行PCR扩增时，采用引物I、II，对沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因进行扩增，所述引物I：5’-[ACT GGC GTT ATC CCTTTC TCT GCT G]-3’；引物II：5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAAGAG A]-3’。
进行PCR扩增时，采用引物hly P1和hly P2对产单核细胞李斯特菌溶血素基因(hly)进行扩增，所述hly P1：5’-[CCT AAG ACG CCA ATC GAAAAG AAA]-3’；所述hly P2：5’-[TAG TTC TAC ATC AAC TGA GAC AGA]-3’。
进行PCR扩增时，采用引物I、II，对大肠杆菌(YZU_DSL1)进行扩增，所述引物I：5’-[ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GCT G]-3’；引物II：5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A]-3’。
具体实施例
一、引物：
根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因高度保守序列和产单核细胞李斯特菌溶血素基因(hly)高度保守序列设计二对特异性引物(引物I、引物II；hly-P1、hly-P2)，上述二对特异性引物由上海博亚生物有限公司合成。预期扩增出的目的片段大小分为沙门氏菌：495bp；产单核细胞李斯特菌：850bp；指示带(大肠杆菌)：300bp。
沙门氏菌：
引物I：5’-[ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GCT G]-3’
引物II：5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A]-3’
产单核细胞李斯特菌：
hly-P1：5’-[CCT AAG ACG CCA ATC GAA AAG AAA]-3’
hly-P2：5’-[TAG TTC TAC ATC AAC TGA GAC AGA]-3’
大肠杆菌(指示菌)：
引物I：5’-[ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GCT G]-3’
引物II：5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A]-3’
二、多重PCR：
1、DNA模板制备：
1)沙门氏菌DNA模板制备：
将沙门氏菌接种于营养肉汤培养基，37℃培养18h，取细菌培养液0.5ml，置于Eppendorf管中，2000rpm离心20min，用灭菌蒸馏水洗涤两次，最后用1ml蒸馏水悬浮，隔水煮沸15min，8000rpm离心15min，取上清，即成沙门氏菌DNA模板溶液。
2)产单核细胞李斯特菌DNA模板制备：
产单核细胞李斯特菌在BHI(购自美国Difco公司)培养基中培养过夜；取250μl过夜培养物加入Eppendorf管，13000rpm离心10分钟；弃上清液，用95μl 1×缓冲液混匀；加4μl溶菌酶(50mg/ml)，颠倒混匀；室温孵育15分钟；加1μl蛋白酶K(20mg/ml)，震荡数秒钟；58℃孵育，直至菌液变清；95℃加热8分钟，使酶失活；离心取上清液，即成产单核细胞李斯特菌DNA模板溶液，备用。
3)大肠杆菌(YZU DSL1)DNA模板制备：
将大肠杆菌(YZU DSL1)接种于营养肉汤培养基，37℃培养18h，取细菌培养液0.5ml，置于Eppendorf管中，2000rpm离心20min，用灭菌蒸馏水洗涤两次，最后用1ml蒸馏水悬浮，隔水煮沸15min，8000rpm离心15min，取上清，即成DNA模板溶液。将DNA模板溶液用超纯水作100倍稀释后，即成大肠杆菌(YZU DSL1)DNA模板，备用。
2、多重PCR扩增：
①10×PCR Buffer(含1.5mmol/LMg2+)： 2.5μl
②dNTP(2.5μmol/L)： 1.5μl
③沙门氏菌引物I和引物II(浓度均为5μmol/l)： 各1μl
产单核细胞李斯特菌引物hly-P1和hly-P2(浓度为20μmol/L)： 各1μl
④大肠杆菌(YZU_DSL1)DNA模板(100倍稀释)： 1μl
⑤待检测样品模板
沙门氏菌 1μl
产单核细胞李斯特菌 2μl
⑥Taq聚合酶(即：华美公司普通PCR扩增酶)： 1μl
⑦灭菌超纯水 12μl
总体积 25μl
扩增条件为：95℃预变性2min；95℃变性10s，60℃退火35s，72℃延伸40s，共32个循环；72℃延伸10min后，4℃保存。
三、PCR扩增产物的鉴定：
取PCR扩增产物8μl，点样于12g/L琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)，以1000bp Marker作为标准分子参照，以5V/cm的电场强度于1倍的TAE电泳缓冲液中电泳2小时，紫外线鉴定，凝胶成像系统拍照。
四、PCR产物的序列鉴定：
利用DNA回收试剂盒(大连宝生物公司)从琼脂糖凝胶中回收PCR产物进行克隆(pGEM-T vector)和DNA序列测定。DNA序列测定由上海联合基因公司完成。
五、总结：
本试验利用两对特异性引物，采用优化的多重PCR反应系统，成功地扩增出沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因、产单核细胞李斯特菌溶血素基因(hly)、大肠杆菌(YZU_DSL1)，PCR产物大小分别为沙门氏菌：495bp；产单核细胞李斯特菌：850bp；指示带(大肠杆菌)：300bp。DNA序列测定结果与报道的三种基因序列一致。
Claims (4)
1、沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR快速检测方法，其特征在于先将沙门氏菌和大肠杆菌(YZU_DSL1)分别采用热裂解法提取各自DNA模板、产单核细胞李斯特菌采用酶解法提取DNA模板，然后进行一次性PCR扩增特定的多个基因，最后经电泳鉴定。
2、根据权利要求1所述沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR快速检测方法，其特征在于进行PCR扩增时，采用引物I、II，对沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因进行扩增，所述引物I：5’-[ACT GGC GTT ATCCCT TTC TCT GCT G]-3’；引物II：5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGGTAA GAG A]-3’。
3、根据权利要求1所述沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR快速检测方法，其特征在于进行PCR扩增时，采用引物hly P1和hly P2对产单核细胞李斯特菌溶血素基因(hly)进行扩增，所述hly P1：5’-[CCT AAGACG CCAATC GAA AAG AAA]-3’；hly P2：5’-[TAG TTC TAC ATC AACTGA GAC AGA]-3’。
4、根据权利要求1所述沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR快速检测方法，其特征在于进行PCR扩增时，采用引物I、II，对大肠杆菌(YZU_DSL1)进行扩增，所述引物I：5’-[ACT GGC GTT ATC CCT TTCTCT GCT G]-3’；引物II：5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAGA]-3’。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200410041611 CN1266284C (zh) | 2004-08-02 | 2004-08-02 | 沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重pcr快速检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200410041611 CN1266284C (zh) | 2004-08-02 | 2004-08-02 | 沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重pcr快速检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1603422A true CN1603422A (zh) | 2005-04-06 |
| CN1266284C CN1266284C (zh) | 2006-07-26 |
Family
ID=34665162
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200410041611 Expired - Fee Related CN1266284C (zh) | 2004-08-02 | 2004-08-02 | 沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重pcr快速检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1266284C (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101149355B (zh) * | 2007-11-09 | 2010-07-21 | 东北农业大学 | 一种检测牛乳中沙门氏菌的方法 |
| CN101113465B (zh) * | 2006-07-25 | 2010-12-01 | 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 | 一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒 |
| CN101235410B (zh) * | 2008-01-25 | 2011-01-19 | 广东省微生物研究所 | 水产品中致病菌多重pcr快速检测试剂盒及检测方法 |
| CN103060447A (zh) * | 2012-12-27 | 2013-04-24 | 许龙岩 | 四种菌的三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 |
| CN103131784A (zh) * | 2013-03-08 | 2013-06-05 | 扬州大学 | 鉴别肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌的多重pcr方法 |
| CN103197078A (zh) * | 2013-03-28 | 2013-07-10 | 扬州大学 | 鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的用途 |
-
2004
- 2004-08-02 CN CN 200410041611 patent/CN1266284C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101113465B (zh) * | 2006-07-25 | 2010-12-01 | 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 | 一种快速检测样品中单增李斯特菌的试剂盒 |
| CN101149355B (zh) * | 2007-11-09 | 2010-07-21 | 东北农业大学 | 一种检测牛乳中沙门氏菌的方法 |
| CN101235410B (zh) * | 2008-01-25 | 2011-01-19 | 广东省微生物研究所 | 水产品中致病菌多重pcr快速检测试剂盒及检测方法 |
| CN103060447A (zh) * | 2012-12-27 | 2013-04-24 | 许龙岩 | 四种菌的三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 |
| CN103060447B (zh) * | 2012-12-27 | 2016-02-17 | 许龙岩 | 四种菌的三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 |
| CN103131784A (zh) * | 2013-03-08 | 2013-06-05 | 扬州大学 | 鉴别肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌及鸡伤寒沙门氏菌的多重pcr方法 |
| CN103197078A (zh) * | 2013-03-28 | 2013-07-10 | 扬州大学 | 鸡白痢沙门菌分泌性蛋白SpiC的用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1266284C (zh) | 2006-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Al-Gallas et al. | Etiology of acute diarrhea in children and adults in Tunis, Tunisia, with emphasis on diarrheagenic Escherichia coli: prevalence, phenotyping, and molecular epidemiology. | |
| Drancourt et al. | New serotype of Bartonella heriselae in endocarditis and cat-scratch disease | |
| Windsor et al. | Incidence of Blastocystis hominis in faecal samples submitted for routine microbiological analysis | |
| Kudinha et al. | Multiplex PCR-based reverse line blot assay for simultaneous detection of 22 virulence genes in uropathogenic Escherichia coli | |
| Seo et al. | Rapid, specific detection of Salmonella Enteritidis in pooled eggs by real-time PCR | |
| Matsiota-Bernard et al. | Evaluation of commercial amplification kit for detection of Legionella pneumophila in clinical specimens | |
| US10724106B2 (en) | Method for determining the presence of diarrhoea causing pathogens | |
| Kanamaru et al. | Subtyping of uropathogenic Escherichia coli according to the pathogenicity island encoding uropathogenic‐specific protein: Comparison with phylogenetic groups | |
| US20230193194A1 (en) | Generic inert bio-vector salmonella sp. and potential uses thereof | |
| Hadi et al. | PCR-based Detection technique for Typhoidal Salmonella in Pune, India | |
| CN101173315A (zh) | 沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌、大肠杆菌多重pcr快速检测试剂盒及其应用 | |
| Xing et al. | Improvement and evaluation of loop-mediated isothermal amplification combined with chromatographic flow dipstick assays for Vibrio parahaemolyticus | |
| Kvitt et al. | Strain variation and geographic endemism in Streptococcus iniae | |
| Khan et al. | Detection of Entamoeba histolytica using polymerase chain reaction in pus samples from amebic liver abscess | |
| CN1266284C (zh) | 沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重pcr快速检测方法 | |
| CN112961805B (zh) | 一种喹诺酮类药物耐药基因gyrA和parE同时发生突变的鼠伤寒沙门菌及其应用 | |
| CN103160587B (zh) | 10种常见致病军团菌的基因分型芯片及检测用试剂盒 | |
| Galbadage et al. | Improvement in detection of enterotoxigenic Escherichia coli in patients with travelers' diarrhea by increasing the number of E. coli colonies tested | |
| CN101717829B (zh) | 食源性致病菌多重扩增内标序列及其制备方法 | |
| AMARANTINI et al. | Identification and characterization of Salmonella typhi isolates from Southwest Sumba District, East Nusa Tenggara based on 16S rRNA gene sequences | |
| Zaghloul et al. | Detection of Cambylobacter spp. in stool samples by new methods in comparison to culture | |
| Kim et al. | Novel Heptaplex PCR-Based Diagnostics for Enteric Fever Caused by Typhoidal Salmonella Serovars and Its Applicability in Clinical Blood Culture | |
| Sanpool et al. | Genetic subtypes of Blastocystis isolated from Thai hospitalized patients in northeastern Thailand | |
| O’Leary et al. | A novel genotyping method for Cryptosporidium hominis | |
| Munir et al. | Early diagnosis of typhoid by PCR for fliC-d gene of Salmonella Typhi in patients taking antibiotics |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210316 Address after: 225000 F205, building 2, 217 Kaifa West Road, Hanjiang District, Yangzhou City, Jiangsu Province Patentee after: Jiangsu Ruibang Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 225009 School of biological science and technology, Yangzhou University, 88 South University Road, Yangzhou, Jiangsu Patentee before: YANGZHOU University |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20060726 Termination date: 20210802 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |