CN1266284C - 沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重pcr快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定细菌,特别是鉴定沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌的检测方法。先将沙门氏菌和大肠杆菌YZU_DSL1分别采用热裂解法提取各自DNA模板、产单核细胞李斯特菌采用酶解法提取DNA模板,然后进行一次性PCR扩增特定的多个基因,最后以大肠杆菌为指示菌电泳鉴定。本发明通过将样本的DNA,一次性同时对可能存在的沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因、产单核细胞溶血素基因扩增和一定存在的大肠杆菌YZU_DSL1质粒进行扩增,形成大量的基因复制片段,比较方便,一次就能鉴定是否为沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌,并对阴性结果的反应体系的正确性作出判断。本发明较经典方法的细菌分离、鉴定和血清学分型试验方法快速、准确。
Description
技术领域
本发明公开了一种鉴定细菌,特别是鉴定沙门氏菌(Salmonella)、产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)的检测方法。
背景技术
沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌是重要的人兽共患病原菌,是世界卫生组织(WHO)所列最主要的两种食源性病原细菌。沙门氏菌不仅能导致动物疾病,还能使人类发生伤寒、副伤寒、败血症、胃肠炎和食物中毒,在世界各地的食物中毒中,沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第二位;李斯特菌是一种能引起动物和人类流产、败血症和脑膜炎等疾病的食源性病原体,新生儿、老年人、孕妇及免疫缺陷病人是李斯特菌感染的高危人群。世界各国,包括美国等发达国家,沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌食物污染日益增多,我国也不例外,给国家经济造成巨大损失,同时严重威胁着人民的身体健康和生命安全。在发达国家临床李斯特菌病的发病率大约为2~15/10万,死亡率为13~34%。在美国每年大约有2500例李斯特菌病病例,其中500例死亡。因此,尽管李斯特菌病的病例不如其他食源性疾病来的常见,它仍然成为仅次于沙门氏菌感染的第二号致命的食源性感染性疾病。
沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌作为致病菌检测的一项重要指标,在公共卫生、食品安全、畜牧兽医和出入境检验检疫中均是必需检测的项目,有重要社会、经济的意义。传统的沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌检测常用分离培养和血清学方法,分别采用不同的检验程序、方法,分别报告,确诊检验结果至少需5~7天,检验方法存在繁琐、费时费力、特异性低等缺陷,特别是我国已加入世界贸易组织(WTO),国际贸易量与日俱增。因此,快速、准确、简便的细菌检测方法将是发展的方向。建立一种能同时快速检测沙门氏菌和产单核细胞李斯特菌的检测方法具有重要的意义。
发明内容
本发明目的在于为人们提供一种能快速鉴定出样本是否被沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌污染的检测方法。
本发明提供的方法是:先将沙门氏菌和大肠杆菌YZU_DSL1分别采用热裂解法提取各自DNA模板、产单核细胞李斯特菌采用酶解法提取DNA模板,然后进行一次性PCR扩增特定的多个基因,最后以大肠杆菌为指示菌电泳鉴定。
由于单个疑似样本中的特征基因数量极少,本发明通过将样本的DNA,一次性同时对可能存在的沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因、产单核细胞溶血素基因扩增和一定存在的大肠杆菌(YZU_DSL1)质粒进行扩增,形成大量的基因复制片段,比较方便,一次就能鉴定是否为沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌,并对阴性结果的反应体系的正确性作出判断。本发明较经典方法的细菌分离、鉴定和血清学分型试验方法快速、准确。
该检测系统具有可监测性。扩增结果无任何条带时,表明检测系统无效;扩增结果出现300bp、495bp、850bp三条带中的任一条带时,表明检测系统有效。扩增结果出现300bp和495bp,或只出现495bp时,表明结果为沙门氏菌;扩增结果出现300bp和850bp,或只出现850bp时,表明结果为产单核细胞李斯特菌;扩增结果同时出现300bp和495bp和850bp,或同时出现495bp和850bp时,表明结果为沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌。
另外,本发明进行PCR扩增时,采用引物I、II,对沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因进行扩增,所述引物I:5’-[ACT GGC GTT ATC CCTTTC TCT GCT G]-3’;引物II:5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAAGAG A]-3’。
进行PCR扩增时,采用引物hly P1和hly P2对产单核细胞李斯特菌溶血素基因(hly)进行扩增,所述hly P1:5’-[CCT AAG ACG CCA ATC GAAAAG A AA]-3’;所述hly P2:5’-[TAG TTC TAC ATC AAC TGA GAC AGA]-3’。
进行PCR扩增时,采用引物I、II,对大肠杆菌(YZU_DSL1)进行扩增,所述引物I:5’-[ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GCT G]-3’;引物II:5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A]-3’。
具体实施例
一、引物:
根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因高度保守序列和产单核细胞李斯特菌溶血素基因(hly)高度保守序列设计二对特异性引物(引物]、引物II;hly-P1、hly-P2),上述二对特异性引物由上海博亚生物有限公司合成。预期扩增出的目的片段大小分为沙门氏菌:495bp;产单核细胞李斯特菌:850bp;指示带(大肠杆菌):300bp。
沙门氏菌:
引物I:5’-[ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GCT G]-3’
引物II:5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A]-3’
产单核细胞李斯特菌:
hly-P1:5’-[CCT AAG ACG CCA ATC GAA AAG AAA]-3’
hly-P2:5’-[TAG TTC TAC ATC AAC TGA GAC AGA]-3’
大肠杆菌(指示菌):
引物I:5’-[ACT GGC GTT AT CCT TTC TCT GCT G]-3’
引物II:5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A]-3’
二、多重PCR:
1、DNA模板制备:
1)沙门氏菌DNA模板制备:
将沙门氏菌接种于营养肉汤培养基,37℃培养18h,取细菌培养液0.5ml,置于Eppendorf管中,2000rpm离心20min,用灭菌蒸馏水洗涤两次,最后用1ml蒸馏水悬浮,隔水煮沸15min,8000rpm离心15min,取上清,即成沙门氏菌DNA模板溶液。
2)产单核细胞李斯特菌DNA模板制备:
产单核细胞李斯特菌在BHI(购自美国Difco公司)培养基中培养过夜;取250μl过夜培养物加入Eppendorf管,13000rpm离心10分钟;弃上清液,用95μl 1×缓冲液混匀;加4μl溶菌酶(50mg/ml),颠倒混匀;室温孵育15分钟;加1μl蛋白酶K(20mg/ml),震荡数秒钟;58℃孵育,直至菌液变清;95℃加热8分钟,使酶失活;离心取上清液,即成产单核细胞李斯特菌DNA模板溶液,备用。
3)大肠杆菌(YZU_DSL1)DNA模板制备:
将大肠杆菌(YZU_DSL1)接种于营养肉汤培养基,37℃培养18h,取细菌培养液0.5ml,置于Eppendorf管中,2000rpm离心20min,用灭菌蒸馏水洗涤两次,最后用1ml蒸馏水悬浮,隔水煮沸15min,8000rpm离心15min,取上清,即成DNA模板溶液。将DNA模板溶液用超纯水作100倍稀释后,即成大肠杆菌(YZU_DSL1)DNA模板,备用。
2、多重PCR扩增:
①10×PCR Buffer(含1.5mmol/LMg2+):②dNTP(2.5μmol/L):③沙门氏菌引物I和引物II(浓度均为5μmol/l):产单核细胞李斯特菌引物hly-P1和hly-P2(浓度为20μmol/L):④大肠杆菌(YZU_DSL1)DNA模板(100倍稀释):⑤待检测样品模板沙门氏菌产单核细胞李斯特菌⑥Taq聚合酶(即:华美公司普通PCR扩增酶):⑦灭菌超纯水 | 2.5μl1.5μl各1μ1各1μl1μl1μl2μl1μl12μl |
总体积 | 25μl |
扩增条件为:95℃预变性2min;95℃变性10s,60℃退火35s,72℃延伸40s,共32个循环;72℃延伸10min后,4℃保存。
三、PCR扩增产物的鉴定:
取PCR扩增产物8μl,点样于12g/L琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭),以1000bp Marker作为标准分子参照,以5V/cm的电场强度于1倍的TAE电泳缓冲液中电泳2小时,紫外线鉴定,凝胶成像系统拍照。
四、PCR产物的序列鉴定:
利用DNA回收试剂盒(大连宝生物公司)从琼脂糖凝胶中回收PCR产物进行克隆(pGEM-Tvector)和DNA序列测定。DNA序列测定由上海联合基因公司完成。
五、总结:
本试验利用两对特异性引物,采用优化的多重PCR反应系统,成功地扩增出沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因、产单核细胞李斯特菌溶血素基因(hly)、大肠杆菌(YZU_DSL1),PCR产物大小分别为沙门氏菌:495bp;产单核细胞李斯特菌:850bp;指示带(大肠杆菌):300bp。DNA序列测定结果与报道的三种基因序列一致。
Claims (4)
1、沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR快速检测方法,其特征在于先将沙门氏菌和大肠杆菌YZU_DSL1分别采用热裂解法提取各自DNA模板、产单核细胞李斯特菌采用酶解法提取DNA模板,然后进行一次性PCR扩增特定的多个基因,最后以大肠杆菌为指示菌电泳鉴定。
2、根据权利要求1所述沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR快速检测方法,其特征在于进行PCR扩增时,采用引物I、II,对沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因进行扩增,所述引物I:5’-[ACT GGC GTTATC CCT TTC TCT GCT G]-3’;引物II:5’-[ATG TTG TCC TGC CCCTGG TAA GAG A]-3’。
3、根据权利要求1所述沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR快速检测方法,其特征在于进行PCR扩增时,采用引物hly P1和hly P2对产单核细胞李斯特菌溶血素基因hly进行扩增,所述hly P1:5’-[CCT AAGACG CCA ATC GAA AAG AAA]-3’;hly P2:5’-[TAG TTC TAC ATCAAC TGAGACAGA]-3’。
4、根据权利要求1所述沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌多重PCR快速检测方法,其特征在于进行PCR扩增时,采用引物I、II,对大肠杆菌YZU_DSL1进行扩增,所述引物I:5’-[ACT GGC GTT ATC CCTTTC TCT GCT G]-3’;引物II:5’-[ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAAGAG A]-3’。
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