CN101717829B - 食源性致病菌多重扩增内标序列及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种检疫技术领域的食源性致病菌PCR检测中的多重扩增内标序列及其制备方法；所述食源性致病菌PCR检测中的多重扩增内标序列的碱基序列如下：1054F--15bp--hlyAF--15bp--PrsF--15bp--PSF--15bp--SA1F--扩增内标序列--SA1R--15bp--hlyAR--15bp--PSR---15bp--PrsR--15bp--1054R；所述多重扩增内标序列的制备方法包括如下步骤：随机重排SEQ ID NO：1所示的碱基序列，得到相应的核酸，选取与所要检测的五种目的基因无同源性的核酸作为扩增内标序列；随机重排碱基序列ATTTCCAAGGTGAGC，选择任一序列作为长度为15bp的序列；采用常规多重扩增内标构建方法，利用步骤一所得的扩增内标序列、长度为15bp的序列以及碱基序列如SEQ ID NO：8～17所示的10条序列构建得到多重扩增内标。使用本发明的多重扩增内标可使PCR检测结果能指示假阴性的发生，提高PCR检测的准确率。

Description

食源性致病菌多重扩增内标序列及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的多重扩增内标序列及其制备方法，具体是一种食源性致病菌PCR检测中的多重扩增内标序列及其制备方法。

背景技术

mIAC(multiple internal amplification control)是指多重扩增内标，即添加到PCR反应体系中，用以指示假阴性现象的一段DNA序列或者是一段致病菌的看家基因序列。中国加入WTO后，食品安全问题越来越成为制约我国对外贸易的主要障碍，严重地阻碍着我国的经济发展、影响人民的身体健康，因此通过发展快速的检测技术来解决食品安全问题是国家所需求的。但是目前我国对食品中5种重要致病菌枛副溶血弧菌、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的国标检验方法仍是采用传统的培养方法，由于此方法费时费力，而且灵敏度又不高，已不能满足食品加工与生产中对致病菌快速检测的需求。

所以建立准确、快速的食源性致病菌PCR检测方法能促进我国及时、有效地进行食源性疾病的预防、预警和控制，保障人民的身体健康。虽然随着PCR技术的不断发展、改进，此技术已在许多方面都有了很大程度的提高，但在近来的一些应用实践中显示，PCR反应结果常常会呈现假阴性现象，究其原因，PCR反应会因抑制剂等的影响而抑制反应的发生，造成假阴性现象的发生，因此，在PCR检测中出现假阴性的现象就成为研究者所最为关心的问题之一，而这一问题也一直没有得到很好的解决。

经对现有技术的文献检索发现，刘斌等人于2006年根据沙门氏菌stn基因的一段特异DNA序列运用复合引物技术构建了扩增内标，并用于沙门氏菌的普通PCR检测(刘斌，史贤明；扩增内标在沙门氏菌PCR检测方法中的应用.微生物学通报，2006，33：156～161)。但由于刘斌等人用于构建内标的序列是源于沙门氏菌本身，这样难免会出现错配、同源性交联干扰等现象；

Younes Maaroufi等于2006年建立了一种多重扩增内标合成方法，该方法运用复合引物技术将EBV、CMV、TGO、hoPoV和HBV的特异检测引物序列依次添加到一段扩增内标序列上，构建了同时含这五种病毒检测引物序列的多重扩增内标(Younes Maaroufi，Jean-Marc deBruyne，Valerie Duchateau，Robert Scheen and Francoise Crokaert.Development ofa multiple internal control for clinical diagnostic real-time amplificationassays.FEMS Immunology and Medical Microbiology，2006，48：183～191.)  (YounesMaaroufi，Jean-Marc de Bruyne，Valerie Duchateau，Robert Scheen and FrancoiseCrokaert.用于临床诊断实时扩增实验的多重扩增内标的研制.FEMS免疫学与医学微生物学.2006，48：183～191.)。而Younes Maaroufi等构建的多重扩增内标是用于临床研究方面的，而在食品安全检测方面，添加有多重扩增内标的检测方法却还很少有人加以研究应用；

2007年，Jessica L.Nordstrom等人在用多重荧光定量PCR检测牡蛎中的全部及致病性的副溶血弧菌时，将一条人工构建的扩增内标添入检测体系中，用以指示假阴性(JessicaL.Nordstrom，Michael C.L.Vickery，George M.Blackstone，Shelley L.Murray，and Angelo DePaola.Development of a Multiplex Real-Time PCR Assay with anInternal Amplfication Control for the Detection of Total and Pathogenic Vibrioparahaemolyticus Bacteria in Oysters.Applied and Environmental Microbiology，2007，73(18)：5840～5847)  (Jessica L.Nordstrom，Michael C.L.Vickery，GeorgeM.Blackstone，Shelley L.Murray，and Angelo DePaola.用于检测牡蛎中所有及致病性副溶血弧菌的添加有扩增内标的多重荧光定量PCR实验的建立.应用与环境生物学.2007，73(18)：5840～5847)。Jessica L.Nordstrom等人用一条外源DNA作为扩增内标，他们所构建的扩增内标是非竞争性的扩增内标，也即所用的检测引物不能同时扩增目的片段和扩增内标，整个PCR体系中至少有两对引物，一对用于扩增目的片段，一对用于扩增扩增内标，这样很容易引起引物间的相互干扰作用，同时也很难达到PCR的最佳反应条件；

2008年，龙飞等人在检测单核细胞增生李斯特菌时将扩增内标进行了进一步地改进，构建了活菌内标，使得所构建的扩增内标不仅仅在PCR扩增反应中能起到指示假阴性的作用，而且在增菌培养、菌体收集、DNA提取等所有过程都能指示假阴性的出现(Fei Long，Xin-na Zhu，Zhong-ming Zhang，Xian-ming Shi.Development of a quantitativepolymerase chain reaction method using a live bacterium as internal control forthe detection of Listeria monocytogenes.Diagnostic Microbiology and InfectiousDisease，2008，62：374～381)  (龙飞，朱欣娜，张忠明，史贤明.以活菌作为扩增内标的用于检测单核细胞增生李斯特菌的PCR反应体系的建立.诊断微生物学与传染病.2008，62：374～381)，尽管龙飞等人构建的扩增内标可以达到全程指示假阴性，但是他们所构建的扩增内标是单一的，不能应用于多种食源性致病菌的PCR检测中去。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种食源性致病菌PCR检测中的多重扩增内标序列及其制备方法。使用本发明的多重扩增内标可使PCR检测结果能够指示假阴性的发生，避免了因样品中存在抑制剂或操作失误而导致检测结果呈现假阴性以至于做出错误的结果判断，从而提高了PCR检测的准确率，可满足检疫执法的需要。

本发明通过以下技术方案实现，

本发明涉及一种食源性致病菌PCR检测中的多重扩增内标序列，该序列的碱基序列如下：

1054F--15bp--hlyAF--15bp--PrsF--15bp--PSF--15bp--SA1F--扩增内标序列--SA1R--15bp--hlyAR--15bp--PSR---15bp--PrsR--15bp--1054R；

其中，

所述1054F的碱基序列如SEQ ID NO：8所示；

所述1054R的碱基序列如SEQ ID NO：9所示；

所述hlyAF的碱基序列如SEQ ID NO：10所示；

所述hlyAR的碱基序列如SEQ ID NO：11所示；

所述PrsF的碱基序列如SEQ ID NO：12所示；

所述PrsR的碱基序列如SEQ ID NO：13所示；

所述PSF的碱基序列如SEQ ID NO：14所示；

所述PSR的碱基序列如SEQ ID NO：15所示；

所述SA1F的碱基序列如SEQ ID NO：16所示；

所述SA1R的碱基序列如SEQ ID NO：17所示；

所述15bp为由如SEQ ID NO：18所示的的碱基序列随机重排后得到的任一序列；

所述扩增内标序列具体为：随机重排SEQ ID NO：1所示的碱基序列，得到相应的核酸，选取与所要检测的五种目的基因无同源性的任一核酸作为扩增内标序列；所述五种目的基因具体为碱基序列分别如SEQ ID NO：3～7所示的基因。

优选地，所述多重扩增内标序列的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

所述食源性致病菌PCR检测中的多重扩增内标序列的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，随机重排SEQ ID NO：1所示的碱基序列，得到相应的核酸，选取与所要检测的五种目的基因无同源性的任一核酸作为扩增内标序列；所述五种目的基因具体为碱基序列分别如SEQ ID NO：3～7所示的基因；

随机重排碱基序列ATTTCCAAGGTGAGC，选择任一序列作为长度为15bp的序列；

步骤二，采用常规多重扩增内标构建方法，利用步骤一所得的扩增内标序列、长度为15bp的序列以及碱基序列如SEQ ID NO：8～17所示的10条序列构建如下的多重扩增内标：

1054F--15bp--hlyAF--15bp--PrsF--15bp--PSF--15bp--SA1F--扩增内标序列--SA1R--15bp--hlyAR--15bp--PSR---15bp--PrsR--15bp--1054R。

本发明的技术方案中，术语“无同源性”是指，所得核酸的碱基序列与目的基因的碱基序列之间的连续同源碱基数不超过20bp。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：利用本发明的多重扩增内标可以检测如下五种细菌：副溶血弧菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌。在独自检测5种细菌时，如样品中的被检菌的DNA含量高于检测灵敏度时，电泳结果中含有目的基因的扩增片段，检测结果呈阳性；当样品中不含或者含量低于检测灵敏度时，电泳结果中只含有多重扩增内标的扩增片段，检测结果为阴性；当电泳结果中不出现任何扩增片段时，检测结果即为假阴性；该多重扩增内标的使用使PCR检测结果能够指示假阴性的发生，避免了因样品中存在抑制剂或操作失误而导致检测结果呈现假阴性以至于做出错误的结果判断，从而提高了PCR检测的准确率，可满足检疫执法的需要。

附图说明

图1为多重扩增内标的特异检测引物的排列顺序示意图；

图2为引物1054的特异性实验电泳图；

图3为引物hlyA的特异性实验电泳图；

图4为引物Prs的特异性实验电泳图；

图5为引物PS的特异性实验电泳图；

图6为引物SA1的特异性实验电泳图；

图7为培养物水平的抗干扰实验示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。对于实施例中涉及的菌株，本领域的技术人员均可以很容易地通过公开的市售渠道获得。

实施例1

多重扩增内标的制备

步骤一，随机重排SEQ ID NO：1所示的碱基序列，得到相应的核酸，选取与所要检测的五种目的基因无同源性的核酸作为扩增内标序列；所述五种目的基因具体为碱基序列分别如SEQ ID NO：3～7所示的基因；随机重排碱基序列ATTTCCAAGGTGAGC，选择一序列作为长度为15bp的序列(SEQ ID NO：19)；

选取副溶血弧菌基因组中的一段DNA序列(碱基序列如SEQ ID NO：1所示)，利用软件BioToolKit 320(Chang Bioscience Inc.)中的Randomizer程序进行DNA序列的随机重排，最后通过GenBank数据库中的blastn软件进行同源性匹配分析，选取与5种食源性致病菌均无同源性的一条DNA序列作为扩增内标；所述五种目的基因具体为碱基序列分别如SEQ IDNO：3～7所示的基因；

制备碱基序列如SEQ ID NO：8～17所示的10条引物；

步骤二，采用常规多重扩增内标构建方法，利用步骤一所得的扩增内标序列、长度为15bp的序列以及碱基序列如SEQ ID NO：8～17所示的10条序列构建结果如下的多重扩增内标：

1054F--15bp--hlyAF--15bp--PrsF--15bp--PSF--15bp--SA1F--扩增内标序列--SA1R--15bp--hlyAR--15bp--PSR---15bp--PrsR--15bp--1054R；(见图1)

用重组法(详见Basto AP，Portugal RS，Nix RJ，Cartaxeiro C，Boinas F，DixonLK，Leitao A，Martins C.Development of a nested PCR and its internal controlfor the detection of African swine fever virus(ASFV)in Ornithodoros erraticus.Archives of Virology，2006，151：819～826.)(Basto AP，Portugal RS，Nix RJ，Cartaxeiro C，Boinas F，Dixon LK，Leitao A，Martins C.添加有扩增内标的检测鹦鹉病中非洲猪瘟病毒(ASFV)巢式PCR方法的建立，病毒学文献，2006，151：819～826.)构建多重扩增内标，将5对特异检测引物按如下顺序连接到扩增内标的两端，在引物与引物间分别插入长度为15bpDNA序列，既有利于使所构建的多重扩增内标与被检的5种食源性致病菌无同源性，又有利于使多重扩增内标的扩增片段大小大于各特异检测引物的目的产物，同时也有利于在琼脂糖凝胶电泳图上能明显地与目的产物区分开来，最终得到碱基序列如SEQ IDNO：2所示的多重扩增内标。

实施例2

模板DNA的灵敏度测定

多重扩增内标及5种食源性致病菌纯培养各自总基因组DNA的定量测定

多重扩增内标和5种食源性致病菌纯培养的各自总基因组DNA，经DU-800紫外分光光度计(Beckman Coulter)测量，其含量分别为369.8ng/μL(多重扩增内标)、1150.0ng/μL(副溶血弧菌ATCC33846)、474.9ng/μL(大肠杆菌O157:H7 ATCC43889)、56.0ng/μL(单核细胞增生李斯特菌ATCCBAA-751)、925.8ng/μL(鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028)、55.0ng/μL(金黄色葡萄球菌ATCC27664)。根据计算公N copies/μL＝PCR片段的质量(g/μL)/(660g/mol×碱基数)×(6.023×10²³)可以得到1μL多重扩增内标的拷贝数为1.13×10¹¹copies；

(1)未添加扩增内标时的检测灵敏度

将上述经过测定的5种食源性致病菌各自总的DNA溶液用无菌水作10倍梯度稀释，如副溶血弧菌从115ng/μL～1.15fg/μLDNA溶液中分别取5μL加入20μL PCR反应体系(20μL反应体系的组分为：10μM的上下游引物各0.5μL，2.5mM dNTP 1.0μL，25mM Mg²⁺ 1.5μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶(天根生化科技(北京)有限公司)0.4μL，10×Buffer2.0μL，最后以无菌水补足。PCR循环参数：在94℃预变性5min，接着做35个扩增循环，每个循环包括94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，所有循环结束后，在72℃延伸10min，最后保持在12℃)，使每个PCR反应体系分别含DNA的浓度为：28.8ng/μL，2.88ng/μL，288pg/μL，28.8pg/μL，2.88pg/μL，288fg/μL，28.8fg/μL，2.88fg/μL，0.288fg/μL。扩增结果如图2C所示，只是含0.288fg/μL DNA的PCR反应体系没有目标序列扩增带，而其他PCR反应体系均有目标序列扩增带。因此，其检测灵敏度为2.88fg/μL。同理测定其他4种食源性致病菌的检测灵敏度，从图3C、图4C、图5C以及图6C可知，其余各病菌的检测灵敏度分别为：11.8fg/μL(大肠杆菌O157:H7)、14fg/μL(单核细胞增生李斯特菌)、2.32fg/μL(沙门氏菌)及13.8fg/μL(金黄色葡萄球菌)。

(2)添加多重扩增内标后的检测灵敏度

多重扩增内标先用无菌水作10倍梯度稀释，从1.13×10¹⁰copies/μL～1.13×10²copies/μL。利用(1)中PCR检测体系，分别加入多重扩增内标，研究多重扩增内标对灵敏度的影响。在分别对副溶血弧菌、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌进行PCR检测时，当PCR反应体系添加扩增内标的量为1.13×10⁵copies/μL时，均不会影响它们检测的灵敏度，同时均能达到指示假阴性的作用(如图2C、图3C、图4C、图5C所示)。而在检测金黄色葡萄球菌时，添加的扩增内标的量为1.13×10⁶copies/μL时才能达到指示假阴性的作用，同时也不影响其检测灵敏度(如图6C)。

图2为引物1054的特异性实验电泳图；图中，

A：未添加IAC时，引物1054的特异性实验电泳图，图中，泳道1：Vibrioparahaemolyticus ATCC33846；泳道2：Vibrio parahaemolyticus ATCC17802；泳道3～12：Vibrio parahaemolyticus isolated strains；泳道13：SGL；泳道14：Vibrioalginolyticus；泳道15：Vibrio vulnificu ATCC27562；泳道16：Vibrio campbeffiATCC33863；泳道17：Vibrio damsela；泳道18：Vibrio harveyi ATCC33842；泳道：19：Vibrio fluvialis ATCC33810；泳道20：Vibrio anguillarum；泳道21：Vibrio mimicusATCC33653；泳道22：Vibrio cholerae ATCC25871；泳道23：Salmonella typhimuriumATCC14028；N：negative control；M：100bp DNA分子量标准。

B：添加IAC时，引物1054的特异性实验电泳图，图中，泳道1：Vibrioparahaemolyticus ATCC33846；泳道2：Vibrio parahaemolyticus ATCC17802；泳道3～12：Vibrio parahaemolyticus isolated strains；泳道13：SGL；泳道14：Vibrioalginolyticus；泳道15：Vibrio vulnificu ATCC27562；泳道16：Vibrio campbeffiATCC33863；泳道17：Vibrio damsela；泳道18：Vibrio harveyi ATCC33842；泳道：19：Vibrio fluvialis ATCC33810；泳道20：Vibrio anguillarum；泳道21：Vibrio mimicusATCC33653；泳道22：Vibrio cholerae ATCC25871；泳道23：Salmonella typhimuriumATCC14028；N：negative control；M：100bp DNA分子量标准。

C：未添加IAC与添加IAC时，引物1054的灵敏度实验电泳图，图中，泳道1～9：每个PCR反应中所含有的模板DNA浓度分别为28.8ng/μL，2.88ng/μL，288pg/μL，28.8pg/μL，2.88pg/μL，288fg/μL，28.8fg/μL，2.88fg/μL，0.288fg/μL；N：negativecontrol；M：100bp DNA分子量标准。

图3引物hlyA的特异性实验电泳图；图中，

A：未添加IAC时，引物hlyA的特异性实验电泳图，图中，泳道1：Escherichia coliO157:H7 ATCC43889；泳道2：Salmonella typhimurium ATCC14028；泳道3：Listeriamonocytogenes ATCC7644；泳道4：Staphylococcus aureaus O114；泳道5：Vibriocholerae ATCC25871；泳道6：Hemoclastic Escherichia coli；泳道7：Bacillussubtilis ATCC6633；泳道8：Klebsiella pneumonia ATCC27336；泳道9：Shigellaflexneri CMCC51311；泳道10～17：Escherichia coli isolated strains；泳道18：Pseudomonas aeruginosa CDC B32116；泳道19：Enterobacter cloacae ATCC700323；泳道20：Proteus mirabilis ATCC12453；泳道21：Enterococcus avium ATCC14025；泳道22：Micrococcus luteus ATCC9341；泳道23：Serratia marcescens ATCC27592；N：negativecontrol；M：100bp DNA分子量标准。

B：添加IAC时，引物hlyA的特异性实验电泳图，图中，泳道1：Escherichia coliO157:H7 ATCC43889；泳道2：Salmonella typhimurium ATCC14028；泳道3：Listeriamonocytogenes ATCC7644；泳道4：Staphylococcus aureaus O114；泳道5：Vibriocholerae ATCC25871；泳道6：Hemoclastic Escherichia coli；泳道7：Bacillussubtilis ATCC6633；泳道8：Klebsiella pneumonia ATCC27336；泳道9：Shigellaflexneri CMCC51311；泳道10～17：Escherichia coli isolated strains；泳道18：Pseudomonas aeruginosa CDC B32116；泳道19：Enterobacter cloacae ATCC700323；泳道20：Proteus mirabilis ATCC12453；泳道21：Enterococcus avium ATCC14025；泳道22：Micrococcus luteus ATCC9341；泳道23：Serratia marcescens ATCC27592；N：negativecontrol；M：100bp DNA分子量标准。

C：未添加IAC与添加IAC时，引物hlyA的灵敏度实验电泳图，图中，泳道1～9：每个PCR反应中所含有的模板DNA浓度分别为11.8ng/μL，1.18ng/μL，118pg/μL，11.8pg/μL，1.18pg/μL，118fg/μL，11.8fg/μL，1.18fg/μL，0.118fg/μL；N：negativecontrol；M：100bp DNA分子量标准。

图4引物Prs的特异性实验电泳图；图中，

A：未添加IAC时，引物Prs的特异性实验电泳图，图中，泳道1：Listeriamonocytogenes ATCC21-AB；泳道2：Listeria monocytogenes ATCC7644；泳道3：Listeriamonocytogenes ATCC27708；泳道4：Listeria monocytogenes ATCC54002；泳道5：Listeria monocytogenes ATCCBAA-751；泳道6：Listeria monocytogenes ATCC15313；泳道7：Listeria monocytogenes ATCC13932；泳道8～12：Listeria monocytogenesisolated strains；泳道13～15：Listeria spp.；泳道16：Salmonella typhimuriumATCC14028；泳道17：Staphylococcus aureaus O114；泳道18：Klebsiella peneumoniaeATCC27336；泳道：19：Shigella flexneri CMCC51311；泳道20：Enterococcus faecalisATCC49452；泳道21：Hemoclastic Escherichia coli；泳道22：Vibrio alginolyticus；泳道23：Vibrio mimicus ATCC33653；N：negative control；M：100bp DNA分子量标准。

B：添加IAC时，引物Prs的特异性实验电泳图，图中，泳道1：Listeria monocytogenesATCC21-AB；泳道2：Listeria monocytogenes ATCC7644；泳道3：Listeria monocytogenesATCC27708；泳道4：Listeria monocytogenes ATCC54002；泳道5：Listeriamonocytogenes ATCCBAA-751；泳道6：Listeria monocytogenes ATCC15313；泳道7：Listeria monocytogenes ATCC13932；泳道8～12：Listeria monocytogenes isolatedstrains；泳道13～15：Listeria spp.；泳道16：Salmonella typhimurium ATCC14028；泳道17：Staphylococcus aureaus O114；泳道18：Klebsiella peneumoniae ATCC27336；泳道：19：Shigella flexneri CMCC51311；泳道20：Enterococcus faecalis ATCC49452；泳道21：Hemoclastic Escherichia coli；泳道22：Vibrio alginolyticus；泳道23：Vibriomimicus ATCC33653；N：negative control；M：100bp DNA分子量标准。

C：未添加IAC与添加IAC时，引物Prs的灵敏度实验电泳图，图中，泳道1～9：每个PCR反应中所含有的模板DNA浓度分别为1.4ng/μL，140pg/μL，14pg/μL，1.4pg/μL，140fg/μL，14fg/μL，1.4fg/μL，0.14fg/μL，0.014fg/μL；N：negative control；M：100bp DNA分子量标准。

图5引物PS的特异性实验电泳图；图中，

A：未添加IAC时，引物PS的特异性实验电泳图，图中，泳道1：Salmonellatyphimurium ATCC14028；泳道2：Salmonella typhimurium ATCC13311；泳道3：Salmonella arizonae ATCC13314；泳道4：Salmonella paratyphi b CMCC50004；泳道5：Salmonella paratyphi c CMCC50017；泳道6：Salmonella enteritidis ATCC13076；泳道7：Salmonella vellore ATCC15611；泳道8：Salmonella Tallahassee ATCC12002；泳道9：Salmonella Abaetetuba CMCC51812；泳道10：Salmonella choleraesuis ATCC10708；泳道11：Salmonella Infantis CMCC51741；泳道12：Salmonella typhi CMCC 50098；泳道13：Listeria monocytogenes ATCC7644；泳道14：Staphylococcus aureaus O114；泳道15：Bacillus subtilis ATCC6633；泳道16：Klebsiella pneumonia ATCC27336；泳道：17：Serratia marcescens ATCC27592；泳道18：Shigella flexneri CMCC51311；泳道19：Vibrio cholerae ATCC25871；泳道20：Citrobacter freundii ATCC8090；泳道21：Enterococcus faecium ATCC27270；泳道22：Pseudomonas aeruginosa CDC B32116；泳道23：Vibrio mimicus ATCC33653；N：negative control；M：100bp DNA分子量标准。

B：添加IAC时，引物PS的特异性实验电泳图，图中，泳道1：Salmonella typhimuriumATCC14028；泳道2：Salmonella typhimurium ATCC13311；泳道3：Salmonella arizonaeATCC13314；泳道4：Salmonella paratyphi b CMCC50004；泳道5：Salmonella paratyphic CMCC50017；泳道6：Salmonella enteritidis ATCC13076；泳道7：Salmonella velloreATCC15611；泳道8：Salmonella Tallahassee ATCC12002；泳道9：Salmonella AbaetetubaCMCC51812；泳道10：Salmonella choleraesuis ATCC10708；泳道11：SalmonellaInfantis CMCC51741；泳道12：Salmonella typhi CMCC 50098；泳道13：Listeriamonocytogenes ATCC7644；泳道14：Staphylococcus aureaus O114；泳道15：Bacillussubtilis ATCC6633；泳道16：Klebsiella pneumonia ATCC27336；泳道：17：Serratiamarcescens ATCC27592；泳道18：Shigella flexneri CMCC51311；泳道19：Vibriocholerae ATCC25871；泳道20：Citrobacter freundii ATCC8090；泳道21：Enterococcusfaecium ATCC27270；泳道22：Pseudomonas aeruginosa CDC B32116；泳道23：Vibriomimicus ATCC33653；N：negative control；M：100bp DNA分子量标准。

C：未添加IAC与添加IAC时，引物PA的灵敏度实验电泳图，图中，泳道1～9：每个PCR反应中所含有的模板DNA浓度分别为23.2ng/μL，2.32ng/μL，232ng/μL，23.2pg/μL，2.32pg/μL，232fg/μL，23.2fg/μL，2.32fg/μL，0.232g/μL；N：negative control；M：100bp DNA分子量标准。

图6引物SA1的特异性实验电泳图；图中，

A：未添加IAC时，引物SA1的特异性实验电泳图，图中，泳道1：Staphylococcusaureaus B272；泳道2：Staphylococcus aureaus C209；泳道3：Staphylococcus aureausC299；泳道4：Staphylococcus aureaus D184；泳道5：Staphylococcus aureaus F104；泳道6：Staphylococcus aureaus G064；泳道7：Staphylococcus aureaus L022；泳道8：Staphylococcus aureaus ATCC27664；泳道9：Staphylococcus aureaus L103；泳道10：Staphylococcus aureaus O114；泳道11：Staphylococcus aureaus Q153；泳道12：Staphylococcus aureaus Q236；泳道13：Vibrio parahaemolyticus ATCC17802；泳道14：Salmonella typhimurium ATCC14028；泳道15：Listeria monocytogenes ATCC7644；泳道16：Escherichia coli O157:H7 ATCC43889；泳道：17：Vibrio cholerae ATCC25871；泳道18：Hemoclastic Escherichia coli；泳道19：Enterobacter sakazakii ATCC29544；泳道20：Bacillus subtilis ATCC6633；泳道21：Klebsiella pneumonia ATCC27336；泳道22：Shigella flexneri CMCC51311；泳道23：Vibrio vulnificus ATCC 27562；N：negative control；M：100bp DNA分子量标准。

B：添加IAC时，引物SA1的特异性实验电泳图，图中，泳道1：Staphylococcus aureausB272；泳道2：Staphylococcus aureaus C209；泳道3：Staphylococcus aureaus C299；泳道4：Staphylococcus aureaus D184；泳道5：Staphylococcus aureaus F104；泳道6：Staphylococcus aureaus G064；泳道7：Staphylococcus aureaus L022；泳道8：Staphylococcus aureaus L029；泳道9：Staphylococcus aureaus L103；泳道10：Staphylococcus aureaus O114；泳道11：Staphylococcus aureaus Q153；泳道12：Staphylococcus aureaus Q236；泳道13：Vibrio parahaemolyticus ATCC17802；泳道14：Salmonella typhimurium ATCC14028；泳道15：Listeria monocytogenes ATCC7644；泳道16：Escherichia coli O157:H7 ATCC43889；泳道：17：Vibrio cholerae ATCC25871；泳道18：Hemoclastic Escherichia coli；泳道19：Enterobacter sakazakii ATCC29544；泳道20：Bacillus subtilis ATCC6633；泳道21：Klebsiella pneumonia ATCC27336；泳道22：Shigella flexneri ATCC27336；泳道23：Vibrio vulnificus ATCC27562；N：negative control；M：100bp DNA分子量标准。

C：未添加IAC与添加IAC时，引物SA1的灵敏度实验电泳图，图中，泳道1～9：每个PCR反应中所含有的模板DNA浓度分别为1.38ng/μL，138pg/μL，13.8pg/μL，1.38pg/μL，138fg/μL，13.8fg/μL，1.38fg/μL，0.138fg/μL，0.0138fg/μL；N：negativecontrol；M：100bp DNA分子量标准。

实施例3

特异性检测

对副溶血弧菌进行PCR检测时，将多重扩增内标添加到PCR检测体系中，所有副溶血弧菌阳性菌株均可扩增到一条451bp大小的目的产物(在目的模板浓度较低时也能扩增出688bp的扩增内标)，而非副溶血弧菌的阴性菌株则只能扩增到688bp大小的扩增内标(如图2B)。类似地，对大肠杆菌O157:H7进行PCR检测时，所有阳性菌株都能扩增到363bp的目的产物(在目的模板浓度较低时也能扩增出546bp的扩增内标)，而所有阴性菌株就只能扩增出一条546bp大小的扩增内标(如图3B)；对单核细胞增生李斯特菌进行PCR检测时，阳性菌株能扩增到370bp的目的产物(在目的模板浓度较低时也能扩增出583bp的扩增内标)，但阴性菌株就只能扩增到583bp大小的扩增内标(如图4B)；对沙门氏菌进行PCR检测时，所有阳性菌株的进行PCR扩增后都能得到362bp大小的目的产物(在目的模板浓度较低时也能扩增出509bp的扩增内标)，阴性菌株却只能扩增到509bp大小的扩增内标(如图5B)；对金黄色葡萄球菌进行PCR检测时，其阳性菌株的PCR产物中都有一条203bp大小的目的产物(在目的模板浓度较低时也能扩增出404bp的扩增内标)，而非金黄色葡萄球菌的其他阴性菌株的PCR产物就只有404bp大小的扩增内标(如图6B)。

实施例4

抗干扰检测

(1)基因组DNA水平的抗干扰实验

分别提取副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus ATCC33846)、美人鱼弧菌(Vibriodamsela)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、SGL(一种淡水弧菌)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和河流弧菌(Vibrio fluvialis)基因组DNA，并测定他们各自的初始浓度，测定结果分别为1.20×10³ng/μL、6.85×10²ng/μL、1.22×10³ng/μL、4.34×10²ng/μL、5.25×10²ng/μL、4.84×10²ng/μL和2.21×10²ng/μL。然后再对所有的基因组DNA分别作10倍梯度稀释至10^-5，再取各干扰菌(即非副溶血弧菌)基因组DNA高(单一干扰菌时：高浓度是指10²～10³ng；五种干扰菌时：高浓度是指2.3μg)、中(单一干扰菌时：中浓度是指20～10²ng；五种干扰菌时：中浓度是指234.7ng)、低三个浓度(单一干扰菌时：低浓度是指1～20ng；五种干扰菌时：低浓度是指23.4ng)分别加入到PCR检测体系中，再进行灵敏度实验，扩增结果如表1所示。

表1副溶血弧菌基因组DNA水平上的抗干扰实验的PCR检测结果

注：+阳性结果；-阴性结果。

(2)纯培养物水平的抗干扰实验

将溶藻弧菌、创伤弧菌和哈维氏弧菌作为干扰菌，以检测对副溶血弧菌的菌落灵敏度的影响。从甘油管中取溶藻弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌，分别接入5ml LB液体培养基中，在37℃中培养8h，然后用灭菌的生理盐水分别作10倍梯度稀释至10^-10，并取1mL稀释度为10^-6、10^-7和10^-8的菌液作平板计数，计算溶藻弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌各自纯培养的起始浓度。经计算溶藻弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌各自的起始浓度分别为3.0×10⁸CFU/mL、4.8×10⁹CFU/mL、3.6×10⁹CFU/mL和1.6×10⁹CFU/mL。

分别取1mL副溶血弧菌10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9及10^-10的稀释菌液加入到装有6ml LB液体培养基的PA瓶中，并再作两组重复，然后，再分别取1mL N×10⁴、N×10⁶和N×10⁸CFU/mL的溶藻弧菌、创伤弧菌与哈维氏弧菌的菌悬液分别加入到3组PA瓶中(如图7所示)。将PA瓶中的菌液与培养基混匀后，从每个PA瓶里取1mL菌体混合液放入1.5mL已灭菌的离心管中，10000rpm离心5min，倒掉上清，加入1000μL无菌水，在沸水中煮10min，立即放入-20℃冰冻直至完全结冰，4℃解冻，12000rpm离心5min，取5μL上清液作为模板进行PCR扩增。然后，再将3组所有的PA瓶均放于37℃摇床上，以150rpm进行增菌培养，并每隔2h取1mL混合液，进行上述相同处理，之后再进行PCR检测。PCR检测结果表明，干扰菌对副溶血弧菌的菌落灵敏度几乎不产生干扰作用，但在增菌过程中有一段时间会有干扰作用(增菌时间为2h、8h时，干扰菌浓度为N×10⁶和N×10⁸CFU/mL时会出现干扰现象)。

实施例5

准确率评价

(1)人工污染样品的检测

人工污染样品的制备：先将约含10⁷CFU/mL的副溶血弧菌ATCC33846接入养有蚝的水中，接着做两组平行，分别用不同的处理方式对染菌后的样品进行处理，一组是通过添加消毒剂的方法进行处理(取样时间为处理后30min、60min)；另一组是通过净化的方式进行处理(取样时间为处理后12h、24h)。然后从处理前与处理后的样品各取25g样，分别进行匀质，再各取匀浆液1mL，低速离心，将上清稀释到合适的浓度进行平板计数，计算样品起始带菌量，结果见表2。

表2人工污染相关数据及PCR检查结果

注：+阳性结果；F假阴性结果。

人工污染样品的增菌及样品中副溶血弧菌DNA的提取：采集人为污染严重的海产品-蚝，从处理前后的样品中各取25g，分别进行匀质，再将各匀浆物各自移入225mL的3％NaCl₂碱性蛋白胨水(APW)液体培养基中，混匀后均取1mL放入1.5mL的离心管中，将其余的混合物放在37℃的摇床(150r/min)中增菌，并且在增菌后每2h取样一次，每次取样1mL，放入1.5mL离心管中，在沸水浴中煮30min，从沸水浴中取出后，立即在20℃放置30min。在37℃解冻后，3000r/min离心2min，沉淀培养物中的食品残渣。取上清液，12000r/min离心5min，上清液为PCR模板DNA溶液，分别取2μL加入PCR反应体系，进行PCR检测，同时以无菌水代替DNA模板作阴性对照。

人工污染样品的检测灵敏度：人工污染的食品样品蚝，按上述方法处理后结果显示起始染菌量为3.5×10⁷CFU/mL；经消毒剂处理30min和60min后，样品带菌量分别降至6×10⁵CFU/mL和8×10⁴CFU/mL；经净化处理12h和24h后，样品带菌量则分别降到3×10⁴CFU/mL和4×10⁴CFU/mL。进行添加有IAC的PCR检测，第一次取的样(即不经任何处理，染菌后直接取的样)，增菌培养0h后进行PCR检测就可被检出，第二次取的样(即经消毒剂处理30min后取的样)，增菌培养2h后进行PCR检测即可被检出，第三次取的样(即经消毒剂处理60min后所取的样)，增菌培养4h后进行PCR检测也可被检出，而第四、五次取的样(分别为经净化处理12h后取的样及经净化处理24h后取的样)，尽管直接以原液为模板时，增菌培养4h及6h以上仍检测不出，但将样品经过稀释处理再进行PCR检测，则可被检出，所以五次取的样品在增菌培养4h均可被检出，PCR检测结果如表2所示。从表2中PCR检测结果中可以看出有20份为阳性，15份为假阴性。出现假阴性的样品的DNA溶液经过稀释后(稀释10×处理)，再次进行检测，假阴性样品显示为11阳性结果，4份仍为假阴性结果。这说明从上述7份假阴性样品中提取得到的模板DNA溶液中存在PCR抑制因子，而4份仍为假阴性的结果说明其所含的抑制因子浓度很高；将PCR检测结果仍为假阴性的4份样品DNA溶液进一步稀释，其结果为阴性，这可能是由于稀释后，浓度过低，达不到检测灵敏度。

(2)实际食品样品的检测

采集106份水产品食品样品，每份取25g，移入225mL的APW(含3％NaCl)液体培养基中，37℃的摇床(150r/min)中增菌10h。用煮沸法提取DNA进行添加IAC的PCR检测，检测结果中有55份为阳性，43份阴性，8份为假阴性。出现假阴性的样品经过稀释DNA处理后，再次进行检测，假阴性样品2份为阳性结果，6份为阴性结果。这说明从这2份假阴性样品中提取得到的模板DNA溶液中存在PCR反应的抑制因子。可见，本实施例涉及的多重扩增内标序列在进行大量样品检测时确实能够指示假阴性，提高了检测的准确率。

序列表

<110>上海交通大学

<120>食源性致病菌PCR检测中的多重扩增内标序列及其制备方法

<130>10008

<160>19

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>360

<212>DNA

<213>副溶血弧菌

<400>1

tagttcttct aacacccgac tctctttccc tttatttaca tcacgtagca atacacgcat    60

cggcgtagct ttagggtaca agacttcagc ctctactgta tcaccattca ctagagccat    120

atcaaaacct gacaccccaa atatcacgct aaacgcggaa cgtttatgct cttctgcaaa    180

ctcacatgca atttctgggt ctcgtgaggt tgataaatat gcaggatcaa ctccaaattc    240

gccttctgca accgacccaa acgcatctct taatcgagaa cctctataag tttttgtcaa    300

tacatctaat ggctctttcg ccaccgcttt tgataaacct atatccagta attgctccgc    360

<210>2

<211>688

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>人工序列

<400>2

ggtgtctttc caatcctttc ctttaaagga ctggccagta gggaagcgaa cagagctgtg    60

ttaccaagag gctgaagaga ttgcgaaaga agctaacgtt ggagtactgt caccgtggtc    120

cagtttacac ctgaagtatg gtctatttgc tgtattaggt ggcggcgcca tcccctatct    180

actttgcccc ggtcatcttt ttgaatcact ggtctattac actagttgaa aatgcgttgg    240

tcgcatctag acacacatac gtaacgccat atcagaacca ttttcattct cctcctagac    300

ttatgtagca atcactgtgt gatcgtcgca tccataatct ttttagcacc ttcagaaact    360

agcacaaact acactgaaca atgaccgtca gtaatgaccg cttccagaac ccttcccacc    420

ttcgagtttc tgatcatatc ttgttactca ataattgaac ctccatcacg gccgaacgta    480

tcagaaatcg agctacaaca gggttcttac actctaaatg tctcggttag tcggaagtct    540

ttacgggtag gtatgcacta cgcttcaggc acacggagct tgaagagttc tgtcaccatt    600

ggtgatggtc ttgtcgtaga cttcggctag accgcaaatc caaggtttct ttgcagacat    660

gtttggaccg ctacagttgt tcgatacc                                      688

<210>3

<211>1842

<212>DNA

<213>副溶血弧菌

<400>3

ttatttgttc ttacctttgc ctggtgaaga cccgccagaa tcaggagatg attgcagcgc    60

cacagtcacc attgctgtcg acgtaacatt accgctggtg atcgtatagc taaagctgtc    120

ttgattcttg aatcgcttcg ctggcgtgta ttggatactc ccatcagaaa gtagcttcac    180

cgttccttta ctcggtgcgc tcattgctga gatctcgaca gacacaccat cagcaatgat    240

gtcattaccc aacacattaa tggttaccgt tgaaactttg ctcatctgaa cgttatcgtc    300

aaccgccacg acatcaccac tgcccgtttg ctgctcagca acggcatacg ttgcttgtgt    360

cgccacgttg taagcctcat ctttcgtgtt taccacatta aacgtcacag ggtagtcacc    420

agaggttgca cttagagcag aagtcaccgc gatggtagcc acgctagact cgccagacgc    480

aagggaaata gattgagagc tcgcttgcca gccactctct acttgagcag acacatcaaa    540

acgaatcgtg ccacaaacgt cattcgccgt gtttgttacc gtcagttgat attcaaccgt    600

gtcgccagca ttaacttgtg tatcagacgt cgctttcaca gacacacttg gcgcagacat    660

ctcgcaaacg cttggagtta ccgtatcacc aaacgatacg ttcacaccgg caaaaccatt    720

ggctgcactc gcaagattaa tcgtgagacc agaaactgga tcggtgaaac tgtcacccac    780

tggtaacgcg gtgtctttcc aatcctttcg gccataaact tggctgtaat ccgagtttgg    840

cttcatgtgc agaatgtaac tttcttccgc gccttcttcg actaaacgaa caatcacacc    900

gtccgtcaca tcaccacgaa acagcatata agagcggtca tctaaaaatt ggtcataacc    960

catcgcttga cgatattcga catagaacca ctccttcaag ccactattag ggttcacacc    1020

gcgaggtatt tttaacgcga tgttttgtgt tatgtcttgg gtttcgtact ctgcgatttc    1080

atacaaacca tcttgagttg ccgtaagaat gtttggtgat tccgcatcat tcaaccatcc    1140

catacgttct ttgtagtacg tattgatgta acccatatca ggagtaccca taacatcgta    1200

cgagtcgccg tattcaatta cgctacagtt gttcgatacc gacgcatcgc cacaatccaa    1260

cgccttagcg tggctcaaac caaggttgtg cccgaactca tgtgcaatca ctcttgctga    1320

cagcgtgcca tctatgtatg cacgactcgg gaacgttttc cctgttgttg cagaaccacc    1380

accagcacaa cctgattgcg tcatgatgta aatgatgcgc tgataatcct caagcactat    1440

gccatcagca cgcgccattt tatccgcttc cgcttgaacc gaaggataat cacacacctg    1500

atccgataca ggcaatgtgt accaacctgc aacttgacca cttagccatg tcttgccgta    1560

ggagttttct tggtaaaaat cgttaacttc accaaatact aacgcgtgcg cctcttctga  1620

cgtgatcggt tgatcgttag gattctcttt gaaattcaat agcatcacca acgtatcttg  1680

ttggcctatt gaactgcctg cagctttggc gtactggata ttttgtagaa atagaaataa  1740

gacgagtaag aaaaagatcc ctttatttag ggcgtgctta ttcatgcgga gtttatcaat  1800

cactgcttca cctgaaataa ttataataat tatccttccc ac                     1842

<210>4

<211>2997

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>4

atgacagtaa ataaaataaa gaacattttc aataatgcga cattgactac aaaatcagca    60

tttaatacag catcatcaag cgtacgttcc gctggaaaaa aactcatatt attaatacct    120

gataattatg aagctcaggg cgtgggtatt aatgagttgg tcaaagctgc tgatgagctt    180

ggaatagaaa tacaccgtac tgaacgagat gatacagcga ttgcaaacca gttttttggt    240

gcagcagaaa aagttgtagg attaactgaa cgtggtgttg caatattcgc accacaactt    300

gacaaacttc tgcagaagta tcagaaagtt gggagtaaaa taggaggaac cgctgaaaat    360

gtaggtaata atctgggaaa agccggaaca gttctctcag cactacagaa ttttacgggg    420

attgctttat caggcatggc tcttgatgaa ttgctgagaa aacaacgggc aggagaggat    480

ataagtcaga atgatattgc caaaagtagt attgaactta ttaatcagct tgtagataca    540

gtatcaagta taaacagtac cgttgattca ttttctgagc agcttaacca gcttggctca    600

tttttatcca gtaaacctcg attaagttct gttggtggga aattacaaaa tttaccagac    660

ctgggccccc tgggggatgg gctggatgtt gtctccggaa ttctttctgc tgtatcagca    720

agctttattc tgggaaacag tgacgcacat acaggaacaa aagctgcagc gggtatcgaa    780

ctgacaactc aggttcttgg aaatgttggt aaagctgttt cgcaatatat tctggctcag    840

agaatggcac aggggttatc gacaacagct gcaagtgcgg gtctgatcac atcggctgtt    900

atgctggcta tcagtcctct ttctttcctg gctgctgcag ataaatttga gcgagctaag    960

cagcttgaat catattctga acgatttaaa aaattgaatt atgaagggga tgctttactc    1020

gcagcctttc ataaagaaac cggagctata gatgcagccc tgacaacaat aaatactgtc    1080

ctgagttctg tatctgcggg agttagtgca gcctccagtg catccctcat aggggccccg    1140

ataagcatgc tggtgagtgc attaaccggt acgatatctg gcattctgga agcatcaaaa    1200

caggctatgt ttgagcacgt tgcagagaaa ttcgctgctc ggatcaatga atgggaaaag    1260

gagcatggca aaaattattt tgagaatgga tatgacgcaa gacatgctgc gtttttagaa    1320

gactctctgt ctttgcttgc tgatttttct cgtcagcatg cagtagaaag agcagtcgca    1380

ataacccagc aacattggga tgagaagatc ggtgaacttg caggcataac ccgtaatgct    1440

gatcgcagtc agagtggtaa ggcatatatt aattatctgg aaaatggagg gcttttagag    1500

gctcaaccga aggagtttac acaacaagtg tttgatcctc aaaaagggac catagacctt    1560

tcaacaggta atgtatcaag tgttttgaca tttataacac caacatttac cccaggagaa    1620

gaagttagag aaagaaaaca gagtggtaaa tatgaatata tgacatctct tattgtaaat    1680

ggtaaggata catggtctgt aaaaggcata aaaaatcata aaggtgtata tgattattca    1740

aaattgattc agtttgttga aaagaataac aaacactatc aggcgagaat aatttctgag    1800

ctcggagata aagacgatgt ggtttattct ggagcaggct catcagaagt atttgctggt    1860

gaaggttatg ataccgtatc ttataataag acggatgttg gtaaactaac aattgatgca    1920

acaggagcat caaaacctgg tgagtatata gtttcaaaaa atatgtatgg tgacgtgaag    1980

gtattgcagg aagtcgttaa ggaacaggag gtgtcagtag ggaagcgaac agagaaaata    2040

caatatcgtg attttgaatt cagaaccggt ggaattcctt atgatgtaat agataatctt    2100

cattctgttg aagagctcat tggcggaaaa catgatgatg aattcaaagg cggtaagttt    2160

aatgatatat tccatggcgc agatgggaac gattatatcg aaggtaatta tggtaatgat    2220

cgactatacg gcgatgatgg ggatgattat atatccggag gacagggaga cgaccagtta    2280

tttggtggta gtggaaacga taaattgagt ggaggggatg gtaataatta tctgacagga    2340

ggaagcggta atgatgagct tcaggcacac ggagcttata atattctgtc aggtggtact    2400

ggtgatgata aactttatgg tggtggtggt attgatcttc tggatggagg ggaaggtaat    2460

gactatctga atggtggttt tggtaatgat atttatgttt atgggcaaaa ctatggtcat    2520

catacaattg cagatgaagg aggtaaagga gatcgtttgc acttatctga tattagcttt    2580

gatgatatcg catttaagag agttggaaat gatcttatca tgaataaagc cattaatggt    2640

gtactttcat ttaatgagtc aaatgatgtc aatgggataa catttaaaaa ctggtttgcg    2700

aaagatgcct caggagcaga taatcatctt gttgaggtta taacagataa agatggtcga    2760

gagataaaag ttgataagat acctcataat aataatgaac ggtcaggtta tataaaagcc    2820

agtaatatag catctgaaaa aaacatggtt aatatcacca gtgttgccaa tgatattaat    2880

aagattattt cttcagtttc agggttcgat tcaggtgatg aacgattagc atctttatat    2940

aatttatcct tacatcaaaa caacacacac tcaacaactt taacgacaac tgtctga       2997

<210>5

<211>957

<212>DNA

<213>单核细胞增生李斯特菌

<400>5

atgtcaaacg agtattttga tccaaagttg aagattttct cgctaaattc taatcgtgaa    60

ctagctgaag agattgcgaa agaagtaggt attgagttag ggaaatcaag cgttactcat    120

tttagtgatg gagaaatcca aattaacatt gaagaaagta tccgtggttg tcatgtatat    180

gttattcaat caacgagtaa tcctgtaaac cagaatttaa tggaactttt gatcatgatt    240

gatgcgttga aacgcgcttc cgcagcaaca attaatattg ttatgcctta ctatggttat    300

gcacgtcaag accgtaaagc aagaagtcgt gaaccaatca cagcgaaatt agtagcaaac    360

ttaatcgaaa ctgctggtgc aactagaatg attacacttg atatgcatgc accgcaaatc    420

caaggtttct ttgatattcc aattgaccat ttgaatgcag ttcgccttct aagtgactat    480

ttcagcgaac gtcatttagg tgatgattta gttgtagttt cacctgacca cggcggggtt    540

acacgtgctc gtaaaatggc tgaccgtttg aaagcgccga ttgctatcat tgataagcgt    600

cgtccgcgtc caaacgtagc tgaagtaatg aacatcgttg gaaatgttga aggaaaagtt    660

tgtattatca ttgacgacat tatcgacaca gctggaacaa tcacgcttgc tgcaaaagca    720

ttacgtgaag ctggcgcgac aaaagtatac gcatgttgtt cgcacccagt tctttctggc    780

ccagcaatga aacgtattga agattcacca atcgaaaaac tagttgtaac aaactccatc    840

gctcttccag aagaaaaatg gatcgataaa atggagcaac tttctgtagc agctcttctt    900

ggtgaagcga tcgttcgcgt tcatgaaaat gcttctgtaa gttctttatt tgaataa       957

<210>6

<211>2058

<212>DNA

<213>鼠伤寒沙门氏菌

<400>6

ttatattgtt tttataacat tcactgactt gctatctgct atctcaccga aagataaaac    60

ctccagatcc ggaaaacgac cttcaatcat tttcttaata aatcgacgga catcgacaga    120

cgtaaggagg acaagatctt tatgtgcaat caataaatca tccaacttaa gtgtaatgag    180

atccatcaaa ttagcggagg cttccgggtc aaggctgagg aaggtactgc cagaggtctg    240

acggatccct ttgcgaataa catcctcaac ttcagcagat accattactg ctcgtaattc    300

gccgccattg gcgaatttat gacaaatata acgcgccatt gctccacgaa tatgctccac    360

aaggttaatg acatcttttt ctcttggcgc ccacaatgcg agcgcttcca taattaactt    420

catattacgc acggaaacac gttcgcttaa caaacgctgc aaaacttcag atatacgttg    480

taccgtggca tgtctgagca cttctttaag taaatcagga aatttcgctt ccagttggtc    540

cagcatatgt tttgtttcct gaataccgaa atattcattg acgttgcgcg ccagcgtcac    600

cgccagacag tggtaaagct catcaagcgc gttccgcaac acatagccaa gctcccggag    660

tttctccccc tcttcatgcg ttacccagaa atactgactg ctaccttgct gatggattgt    720

tggattaata ccaaaggaca cgacttcatc ggaataattt accactcgca tcaaatcaaa    780

atagaccgta aattgttcaa cacggatctc attaatcaac aatacgatgc tgttatcgtc    840

caggccctcg ccatcgcgta acaatacttc cggcaggcgc acgccataat caataaagaa    900

ctgactacgt agacgctccg caagttgagc tttttccaga tcttcacgcc ggctcttcgg    960

cacaagtaat atcaacggta cggtctctgt agagacttta tcgagatcgc caatcagtcc    1020

taacgacgac ccttcttttt cctcaatact gagcggctgc tcgcctttgc tggttttagg    1080

tttggcggcg ctacgttttg cttcacggaa tttaaaatag aagagtacgc ttaaaaccac    1140

cgataaaata acaaaaaccg gcagtgggaa tcccggcaga gttcccattg aaatggtcaa    1200

aatagccgta acaaccaata caaatgggtt gttcaacagc tgcgtcatga tattccgccc    1260

catattatcg ctatcgccat ttacgcgggt cacgataaaa ccggcactaa tcgcaatcaa    1320

caatgcgggg atctgggcga caagaccatc accaatggtc agcatggtat aagtagacag    1380

ggcggaggac aaatccatac catggcgagt catccccacc gaaataccgc caataaagtt    1440

cacaaagata ataatgatgc cggcaatagc gtcacctttg ataaacttca tcgcaccgtc    1500

aaaggaaccg taaagctggc tttccctttc cagtacgctt cgccgttcgc gcgcggcatc  1560

cgcatcaata ataccggcct tcaaatcggc atcaatactc atctgtttac cgggcatacc  1620

atccagagaa aatcgggccg cgacttccgc gacacgttct gaacctttgg taataacgat  1680

aaactggacc acggtgacaa tagagaagac aacaaaaccc accgccaggc tatcgccaat  1740

aacgaattgc ccgaacgtgg cgataatttc accggcatcg gcttcaatca agataagacg  1800

actggtactg atcgataatg ccagacgaaa gagcgtggta attaacagta ccgcaggaaa  1860

cgttgaaaaa ctgaggattc tgtcaatgta gaacgacccc ataaacacca atatcgccag  1920

tacgatattc agtgcgatca ggaaatcaac cagataggta ggtaatggaa tgacgaacat  1980

agaaatgatc atcaccatta gtaccagaat cagtaattca ggtcgtaaac gagcactgtt  2040

aagtagagaa agcagcac                                                2058

<210>7

<211>999

<212>DNA

<213>金黄色葡萄球菌

<400>7

ttataacttt ttcacggtta ataataagta tatgaagaat ggggcaccaa aagcagcaat    60

aaatacacct gctggcactt ctttaggtaa gaataaggta cgcccaatta agtctgcaat    120

aacaattgat atggcaccaa tcattgctga cattagtaac tttttagcat aacttccgcg    180

aacgattgtt ttcgcgatgt gtggtgcaat taaaccgaca aacccaatat ttcctactaa    240

actgattgcc atagatacga gtattgtaga agtgattaat tgaatcagct tcatacgttg    300

tacatgtaaa cctaagccaa tcgctacagg gtcatcaagt atagatattt tcattttagg    360

tataacaaga aataacaacg gaataacagc tacgattacc atacccaaaa tgaatgtatc    420

tttaaacgtt gcaccgtaaa gacttccgac taaccaagta taagctttgg ctgcagatag    480

ttgctttgtt gtaataagta gcccttgtac aagtgcaata aataatgttt gcattgaaat    540

accgatgatt atgagtgttg tcggtcgaat gtgacctttc gtttgaaaca ctaatagaat    600

caccattgca attgcgccac ctaatacagc aaatagagga agtaaatgta tcgttaaatg    660

gctgaaaaat gcaataaaga caacagcact taagctagca ccacctgtga ttccgataat    720

atctggtgag gcaattggat ttttcaagac attttgtaac attaaaccgc tcatccctag    780

tgctgcacca gctaatatcg caagtgtaat gcgaggtaag cgtaatactt ctaaagtgaa    840

ttgatctata ctgtcatttg gatttataaa gtacatcagt acgcgttgta atggtataaa    900

gcttgaacca accatcatac ttaccactga aacgatggct aaaaagatta acgcgaagat    960

gagatggtaa ttgtcctttt tattaacctt ttcggtcat                           999

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>1054F

<400>8

ggtgtctttc caatcctttc    20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>1054R

<400>9

ggtatcgaac aactgtagcg    20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>hlyAF

<400>10

cagtagggaa gcgaacagag      20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>hlyAR

<400>11

aagctccgtg tgcctgaagc      20

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>PrsF

<400>12

gctgaagaga ttgcgaaaga ag   22

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>PrsR

<400>13

caaagaaacc ttggatttgc gg    22

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>PSF

<400>14

tgtcaccgtg gtccagtt        18

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>PSR

<400>15

cgacaagacc atcaccaatg       20

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>SA1F

<400>16

ctatttgctg tattaggtgg cg    22

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>SA1R

<400>17

ccgtaaagac ttccgactaa cc    22

<210>18

<211>15

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>人工序列

<400>18

atttccaagg tgagc    15

<210>19

<211>15

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>随机重排后的序列

<400>19

ctttaaagga ctggc    15

Claims (2)

1.一种食源性致病菌PCR检测中的多重扩增内标序列，其特征在于，该序列的碱基序列如下：

1054F--15bp--hlyAF--15bp--PrsF--15bp--PSF--15bp--SA1F--扩增内标序列--SA1R--15bp--hlyAR--15bp--PSR---15bp--PrsR--15bp--1054R；

其中，

所述1054F的碱基序列如SEQ ID NO：8所示；

所述1054R的碱基序列如SEQ ID NO：9所示；

所述hlyAF的碱基序列如SEQ ID NO：10所示；

所述hlyAR的碱基序列如SEQ ID NO：11所示；

所述PrsF的碱基序列如SEQ ID NO：12所示；

所述PrsR的碱基序列如SEQ ID NO：13所示；

所述PSF的碱基序列如SEQ ID NO：14所示；

所述PSR的碱基序列如SEQ ID NO：15所示；

所述SA1F的碱基序列如SEQ ID NO：16所示；

所述SA1R的碱基序列如SEQ ID NO：17所示；

所述15bp为由如SEQ ID NO：18所示的的碱基序列随机重排后得到的任一序列；

所述多重扩增内标序列的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种根据权利要求1所述的食源性致病菌PCR检测中的多重扩增内标序列的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，随机重排SEQ ID NO：1所示的碱基序列，得到相应的核酸，选取与所要检测的五种目的基因无同源性的任一核酸作为扩增内标序列；所述五种目的基因具体为碱基序列分别如SEQ ID NO：3～7所示的基因；

随机重排碱基序列ATTTCCAAGGTGAGC，选择任一序列作为长度为15bp的序列；

步骤二，采用常规多重扩增内标构建方法，利用步骤一所得的扩增内标序列、长度为15bp的序列以及碱基序列如SEQ ID NO：8～17所示的10条序列构建如下的多重扩增内标：

1054F--15bp--hlyAF--15bp--PrsF--15bp--PSF--15bp--SA1F--扩增内标序列--SA1R--15bp--hlyAR--15bp--PSR--15bp--PrsR--15bp--1054R。

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