CN105238873B - 一种扩增内标及细菌多重pcr的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种扩增内标及细菌多重PCR的检测方法。所述的扩增内标的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该检测方法包括如下步骤：(1)提取待检测样品的基因组DNA，制得DNA溶液；(2)以基因组DNA为模板，PCR扩增体系中加入所述的扩增内标，进行PCR扩增，制得PCR产物；(3)根据经琼脂糖凝胶电泳后的PCR产物，判断是否有假阳性的结果存在。本发明所述扩增内标为多重PCR检测多个目标菌共用，并非现有技术中不同目标菌采用不同扩增内标融合获得，因其总体长度短，合成难度大大降低，且检测效果稳定性和准确度高。

Description

一种扩增内标及细菌多重PCR的检测方法
技术领域
本发明涉及一种扩增内标及细菌多重PCR的检测方法，属于基因检测技术领域。
背景技术
PCR法虽快速灵敏，但当扩增体系中存在抑制物时，结果往往出现假阴性，假阴性意味着漏检，对食品的安全和人们的健康带来了潜在的威胁。
扩增内标是添加到PCR反应体系中用以指示假阴性现象的一段人工构建DNA序列或者是一段致病菌的保守基因序列。扩增内标作用的主要原理是：将扩增内标添加到PCR反应体系中，使之与目的基因进行共同扩增，如果在反应体系中存在一些抑制因素，则扩增内标和目的基因的扩增反应都将受到抑制，从而达到指示PCR反应假阴性的目的。
扩增内标可分为竞争性扩增内标和非竞争性扩增内标，竞争性扩增内标具有与目的基因相同的引物结合位点，而非竞争性扩增内标具有独自的引物结合位点。扩增内标应该具有稳定性，与待检菌无非特异性交叉反应，扩增片段大小与目的DNA的有所区别等特点。
目前，扩增内标已广泛应用于RT-PCR定量检测和常规PCR定性检测中，检测范围覆盖动植物及微生物，欧洲标准化委员会(The European Standardization Committee,CEN)与国际标准化组织(International Standard Organization,ISO)联合制定的针对食源性致病菌的PCR检测标准(EN ISO 22174:2005)中明确规定检测体系中必须添加扩增内标，且许多研究也已证明扩增内标可有效指示PCR假阴性结果。
中国专利文献CN101717829A(申请号201010300888.2)公开了一种检疫技术领域的食源性致病菌PCR检测中的多重扩增内标序列及其制备方法；所述食源性致病菌PCR检测中的多重扩增内标序列的碱基序列如下：1054F－15bp－hlyAF－15bp－PrsF－15bp－PSF－15bp－SA1F－扩增内标序列－SA1R－15bp－hlyAR－15bp－PSR－15bp－PrsR－15bp－1054R；所述多重扩增内标序列的制备方法包括如下步骤：随机重排SEQ ID NO：1所示的碱基序列，得到相应的核酸，选取与所要检测的五种目的基因无同源性的核酸作为扩增内标序列；随机重排碱基序列ATTTCCAAGGTGAGC，选择任一序列作为长度为15bp的序列；采用常规多重扩增内标构建方法，利用步骤一所得的扩增内标序列、长度为15bp的序列以及碱基序列如SEQ ID NO：8～17所示的10条序列构建得到多重扩增内标。使用本发明的多重扩增内标可使PCR检测结果能指示假阴性的发生，提高PCR检测的准确率。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种扩增内标及细菌多重PCR的检测方法。该扩增内标与食源性致病菌基因组同源性较低，引入PCR后，可有效指示假阴性，提高检测准确率。
本发明技术方案如下：
一种扩增内标，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种细菌多重PCR的检测方法，包括如下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组DNA，制得DNA溶液；
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，PCR扩增体系中加入上述扩增内标，进行PCR扩增，制得PCR产物；
所述PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
沙门氏菌invA基因引物：
F-5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAAC-3’；SEQ ID NO.5
R-5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG-3’；SEQ ID NO.6
大肠杆菌fliC基因引物：
F-5’-CTGCGAAGTCTTATGTGGAT-3’；SEQ ID NO.7
R-5’-CAGGTTGGTAGTGGTGTTGT-3’；SEQ ID NO.8
(3)将步骤(2)制得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，当显示有大小为287bp条带和内标扩增产物大小为174bp条带时，待检测样品中含有肠炎沙门氏菌，检测结果为阳性；当显示有大小为344bp条带和内标扩增产物大小为174bp条带时，待检测样品中含有大肠杆菌，检测结果为阳性；当只显示内标扩增产物大小为174bp条带时，则该检测结果为阴性；当未显示内标扩增产物大小为174bp条带时，则该检测结果为假阴性。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中扩增内标加入PCR扩增体系后的质量浓度为8～80fg/ml。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的提取待检测样品的基因组DNA，步骤如下：
取待检测样品，室温8000r/m离心5min，弃上清，沉淀重悬于TE(Tris-EDTA溶液，pH8.0)中，加入6μL 50mg/mL溶菌酶，37℃作用2h，再加2mol/L NaCl 150μL，10wt％SDS(十二烷基硫酸钠)110μL，20mg/mL蛋白酶K 3μL，50℃作用3h或37℃过夜；
然后加等体积的混合液，混合液为酚：氯仿：异戊醇按体积比25:24:1的比例混合，颠倒混匀，室温放置5～10min，12000r/min离心10min，抽提，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置5～10min，12000r/min离心10min。晾干后溶于ddH2O中备用。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下，反应体系50μL：
5×PCR Buffer 5μL，2.5mM dNTP 4μL，25mM MgCl2 3μL，5U/μL Taq酶0.5μL、10μM的肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7上下游引物各1μL，ddH2O，33.5μL。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
上述沙门氏菌invA基因序列为SEQ ID NO.3，大肠杆菌fliC基因序列为SEQ IDNO.4。
有益效果
1、本发明通过选取pREST-B载体上一段与两目的菌同源性(与invA、fliC同源性分别为3.61％、4.42％)极低的DNA序列，通过设计引物，PCR扩增，克隆，最终得到一个与目的菌共用一对引物的竞争性扩增内标，该扩增内标可以在多重PCR检测肠炎沙门氏菌、大肠杆菌时，避免假阴性对结果准确率的影响；
2、本发明所述扩增内标为多重PCR检测多个目标菌共用，并非现有技术中不同目标菌采用不同扩增内标融合获得，因其总体长度短，合成难度大大降低，且检测效果稳定性和准确度高。
附图说明
图1是本发明所述的非竞争性扩增内标和竞争性扩增内标的制备流程图；
图2是实施例2中的竞争性扩增内标的电泳结果照片；
泳道M：DL-2000；
泳道1：肠炎沙门氏菌103CFU/ml、大肠杆菌O157:H7103CFU/ml、竞争性扩增内标80fg/ml；
泳道2：肠炎沙门氏菌102CFU/ml、大肠杆菌O157:H7102CFU/ml、竞争性扩增内标80fg/ml；
泳道3：肠炎沙门氏菌101CFU/ml、大肠杆菌O157:H7101CFU/ml、竞争性扩增内标80fg/ml；
泳道4：竞争性扩增内标80fg/ml；
泳道5：肠炎沙门氏菌103CFU/ml、大肠杆菌O157:H7103CFU/ml、竞争性扩增内标8fg/ml；
泳道6：肠炎沙门氏菌102CFU/ml、大肠杆菌O157:H7102CFU/ml、竞争性扩增内标8fg/ml；
泳道7：肠炎沙门氏菌101CFU/ml、大肠杆菌O157:H7101CFU/ml、竞争性扩增内标8fg/ml；
泳道8：竞争性扩增内标8fg/ml；
泳道9：阴性对照；
图3A：是实施例3的1/64原抑制物浓度影响的电泳结果照片；
泳道M：DL-2000；
泳道1：肠炎沙门氏菌104CFU/ml、大肠杆菌O157:H7 104CFU/ml、竞争性扩增内标8fg/ml；
泳道2：肠炎沙门氏菌103CFU/ml、大肠杆菌O157:H7 103CFU/ml、竞争性扩增内标8fg/ml；
泳道3：肠炎沙门氏菌102CFU/ml、大肠杆菌O157:H7 102CFU/ml、竞争性扩增内标8fg/ml；
泳道4：肠炎沙门氏菌101CFU/ml、大肠杆菌O157:H7 101CFU/ml、竞争性扩增内标8fg/ml；
泳道5：阴性对照；
图3B：是实施例3的1/32原抑制物浓度影响的电泳结果照片；
泳道M：DL-2000；
泳道1：肠炎沙门氏菌104CFU/ml、大肠杆菌O157:H7 104CFU/ml、竞争性扩增内标8fg/ml；
泳道2：肠炎沙门氏菌103CFU/ml、大肠杆菌O157:H7 103CFU/ml、竞争性扩增内标8fg/ml；
泳道3：肠炎沙门氏菌102CFU/ml、大肠杆菌O157:H7 102CFU/ml、竞争性扩增内标8fg/ml；
泳道4：肠炎沙门氏菌101CFU/ml、大肠杆菌O157:H7 101CFU/ml、竞争性扩增内标8fg/ml；
泳道5：阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆：实验室手册(NEW YORK:Cold Soring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件。
实施例子中涉及的菌种均为本领域普通市售产品。
pREST-B质粒购自宝生物工程(大连)有限公司；
pMD18-T质粒购自宝生物工程(大连)有限公司；
实施例1
一、竞争性扩增内标的获得
1.选取扩增内标DNA序列
通过DNAman软件序列对比，取pREST-B质粒中与pMD18-T质粒无同源性的一段DNA序列，将此片段在NCBI上与目的细菌基因组(以肠炎沙门氏菌和大肠杆菌为例)进行Blast同源性对比，与肠炎沙门氏菌invA基因同源性为3.61％，与大肠杆菌O157:H7fliC基因同源性为4.42％，依据同源性极低的一段序列设计引物，引物扩增片段即为非竞争性扩增内标DNA序列。
2.pREST-B质粒培养与提取
将含有pREST-B质粒的细菌在添加有氨苄青霉素钠的LB培养基中进行培养，pREST-B质粒提取采用试剂盒法。
3.引物设计
采用引物设计软件Primer 5.0进行设计，得到引物1：
F1(上游引物)5’-CGATAGGGTTGAGTGTTGTT-3’，
R1(下游引物)5’-CTTGATTTGGGTGATGGTTC-3’。
4.PCR扩增
在优化的PCR反应条件下进行PCR扩增，得到一段大小为130bp的DNA产物，纯化鉴定正确后可作为非竞争性扩增内标，核苷酸序列SEQ ID NO.2。
PCR扩增体系(50μL)：
5×PCR Buffer 5μL，2.5mM dNTP 4μL，25mM MgCl2 3μL，5U/μl Taq酶0.5μL、10μM的肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7引物各1μL，ddH2O 33.5μL。
PCR扩增程序：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
5.克隆
产物经胶回收纯化后克隆至pMD18-T载体，阳性菌落交由上海生物工程公司测序，经检测，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.PCR扩增
经测序鉴定正确的质粒，用引物2(以沙门氏菌为例)进行扩增，引物2核苷酸序列如下：
F-5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCGATAGGGTTGAGTGTTGTT-3’，
R-5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCTTGATTTGGGTGATGGTTC-3’；
上述斜体部分为肠炎沙门氏菌引物，黑体部分为引物1。
得到一段大小为174bp的DNA产物，即为扩增内标，经检测，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。该扩增内标为竞争性扩增内标。
PCR扩增体系：
5×PCR Buffer 5μL，2.5mM dNTP 4μL，25mM MgCl2 3μL，5U/μL Taq酶0.5μL、10μM的肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7引物各1μL，ddH2O，33.5μL。
PCR扩增程序：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
7.克隆
将得到的PCR产物胶回收纯化再次克隆至pMD18-T载体，测序鉴定得到阳性克隆菌落。
8.竞争性扩增内标的提取和纯化
用沙门氏菌invA基因引物进行PCR扩增，产物纯化后即可作为竞争性扩增内标使用。其扩增片段大小与肠炎沙门氏菌特异检测引物的目的产物大小不相同，有利于在电泳图上明显的与目的产物分开。
9.保存
将非竞争性扩增内标和竞争性扩增内标置于-20℃保存备用。
实施例2最优浓度测定
分别将肠炎沙门氏菌菌株与大肠杆菌分别用无菌水作10倍梯度稀释，获得肠炎沙门氏菌103CFU/ml、大肠杆菌O157:H7 103CFU/ml、肠炎沙门氏菌102CFU/ml、大肠杆菌O157:H7102CFU/ml、肠炎沙门氏菌101CFU/ml、大肠杆菌O157:H7101CFU/ml。
将经设计获得的肠炎沙门氏菌菌株与大肠杆菌的竞争性扩增内标经核酸蛋白测定仪测定浓度为40ng/μl，将其用无菌超纯水作10倍梯度稀释，获得浓度为4fg/μl、0.4fg/μl的竞争性扩增内标。
优选浓度实验的分组，共分为9组，分别为肠炎沙门氏菌103CFU/ml、大肠杆菌O157:H7103CFU/ml、竞争性扩增内标质量浓度为4fg/μl；肠炎沙门氏菌102CFU/ml、大肠杆菌O157:H7102CFU/ml、竞争性扩增内标质量浓度为4fg/μl；肠炎沙门氏菌101CFU/ml、大肠杆菌O157:H7101CFU/ml、竞争性扩增内标质量浓度为4fg/μl；竞争性扩增内标质量浓度为4fg；肠炎沙门氏菌103CFU/ml、大肠杆菌O157:H7103CFU/ml、竞争性扩增内标质量浓度为0.4fg/μl；肠炎沙门氏菌102CFU/ml、大肠杆菌O157:H7102CFU/ml、竞争性扩增内标质量浓度为0.4fg/μl；肠炎沙门氏菌101CFU/ml、大肠杆菌O157:H7101CFU/ml、竞争性扩增内标质量浓度为0.4fg/μl；竞争性扩增内标质量浓度为0.4fg/μl；阴性对照。
对上述样品进行多重PCR的检测方法，包括如下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组DNA，制得DNA溶液，具体步骤如下：
取待检测样品，室温8000r/m离心5min，弃上清，沉淀重悬于TE(Tris-EDTA溶液，pH8.0)中，加入6μL 50mg/mL溶菌酶，37℃作用2h，再加2mol/L NaCl 150μL，10wt％SDS(十二烷基硫酸钠)110μL，20mg/mL蛋白酶K 3μL，50℃作用3h或37℃过夜；
然后加等体积的混合液，混合液为酚：氯仿：异戊醇按体积比25:24:1的比例混合，颠倒混匀，室温放置10min，12000r/min离心10min，抽提，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min，12000r/min离心10min。晾干后溶于ddH2O中备用。
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，PCR扩增体系中分别加入扩增内标，使扩增内标的质量浓度分别为80fg/ml、8fg/ml，进行PCR扩增，制得PCR产物；
所述PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
沙门氏菌invA基因引物：
F-5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAAC-3’；SEQ ID NO.5
R-5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG-3’；SEQ ID NO.6
大肠杆菌fliC基因引物：
F-5’-CTGCGAAGTCTTATGTGGAT-3’；SEQ ID NO.7
R-5’-CAGGTTGGTAGTGGTGTTGT-3’；SEQ ID NO.8
PCR扩增体系：
5×PCR Buffer 5μL，2.5mM dNTP 4μL，25mM MgCl2 3μL，5U/μl Taq酶0.5μL、10uM的肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7引物各1μL，扩增内标1μL，ddH2O，32.5μL。
PCR扩增程序：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
(3)将步骤(2)制得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，结果如图2所示，在扩增内标浓度为80fg/ml和8fg/ml时，均可见扩增内标的174bp条带；因原二重PCR的两种待检目的菌最低检出值为101CFU/ml，其显示竞争性扩增内标质量浓度为80fg/ml和8fg/ml时，均可见扩增内标174bp条带及大肠杆菌的287bp条带、肠炎沙门氏菌344bp条带。由此可见，当竞争性扩增内标质量浓度为8fg/ml时，不会影响原二重PCR灵敏度。
实施例3抑制物对竞争性扩增内标-PCR的影响
取经传统培养方法(国标检验方法)和PCR检测后，肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7均为阴性的禽肉样本，悬浮于灭菌水中(50:50，W/V)，均质2min，13000r/min离心2min，储存上清液作为PCR检测抑制物溶液。将抑制物用超纯水进行倍比稀释，至原浓度的1/64、1/32，分别按现有技术和本发明所述方法进行检测，以测定其对竞争性扩增内标-PCR体系扩增的影响。
对上述样品进行多重PCR的检测方法，包括如下步骤：
分别将肠炎沙门氏菌菌株与大肠杆菌分别用无菌水作10倍梯度稀释，获得肠炎沙门氏菌103CFU/ml、大肠杆菌O157:H7 103CFU/ml、肠炎沙门氏菌102CFU/ml、大肠杆菌O157:H7102CFU/ml、肠炎沙门氏菌101CFU/ml、大肠杆菌O157:H7101CFU/ml。
将经设计获得的肠炎沙门氏菌菌株与大肠杆菌的竞争性扩增内标经核酸蛋白测定仪测定浓度为40ng/μl，将其用无菌超纯水作10倍梯度稀释，获得质量浓度为0.4fg/μl的竞争性扩增内标。
抑制物对竞争性扩增内标-PCR的影响实验的分组，共分为9组，肠炎沙门氏菌104CFU/ml、大肠杆菌O157:H7104CFU/ml、竞争性扩增内标质量浓度为0.4fg/μl、1/64原抑制物浓度；肠炎沙门氏菌103CFU/ml、大肠杆菌O157:H7103CFU/ml、竞争性扩增内标终物质的量为0.4fg/μl、1/64原抑制物浓度；肠炎沙门氏菌102CFU/ml、大肠杆菌O157:H7102CFU/ml、竞争性扩增内标终物质的量为0.4fg/μl、1/64原抑制物浓度；肠炎沙门氏菌101CFU/ml、大肠杆菌O157:H7101CFU/ml、竞争性扩增内标终物质的量为0.4fg/μl、1/64原抑制物浓度；肠炎沙门氏菌104CFU/ml、大肠杆菌O157:H7104CFU/ml、竞争性扩增内标终物质的量为0.4fg/μl、1/32原抑制物浓度；肠炎沙门氏菌103CFU/ml、大肠杆菌O157:H7103CFU/ml、竞争性扩增内标终物质的量为0.4fg/μl、1/32原抑制物浓度；肠炎沙门氏菌102CFU/ml、大肠杆菌O157:H7102CFU/ml、竞争性扩增内标终物质的量为0.4fg/μl、1/32原抑制物浓度；肠炎沙门氏菌101CFU/ml、大肠杆菌O157:H7101CFU/ml、竞争性扩增内标终物质的量为0.4fg/μl、1/32原抑制物浓度；阴性对照。
(1)提取待检测样品的基因组DNA，制得DNA溶液；
取待检测样品，室温8000r/m离心5min，弃上清，沉淀重悬于TE(Tris-EDTA溶液，pH8.0)中，加入6μL 50mg/mL溶菌酶，37℃作用2h，再加2mol/L NaCl 150μL，10wt％SDS(十二烷基硫酸钠)110μL，20mg/mL蛋白酶K 3μL，50℃作用3h或37℃过夜；
然后加等体积的混合液，混合液为酚：氯仿：异戊醇按体积比25:24:1的比例混合，颠倒混匀，室温放置10min，12000r/min离心10min，抽提，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min，12000r/min离心10min。晾干后溶于ddH2O中备用。
(2)以步骤(1)制得的基因组DNA为模板，PCR扩增体系中加入上述浓度为0.4fg/μl的扩增内标使扩增内标的质量浓度为8fg/ml，进行PCR扩增；PCR扩增体系中分别加入上述1/32抑制物浓度或1/64抑制物浓度的抑制物1μL，制得PCR产物；
所述PCR扩增引物，核苷酸序列如下：
沙门氏菌invA基因引物：
F-5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAAC-3’；SEQ ID NO.5
R-5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG-3’；SEQ ID NO.6
大肠杆菌fliC基因引物：
F-5’-CTGCGAAGTCTTATGTGGAT-3’；SEQ ID NO.7
R-5’-CAGGTTGGTAGTGGTGTTGT-3’；SEQ ID NO.8
PCR扩增体系：
5×PCR Buffer 5μL，2.5mM dNTP 4μL，25mM MgCl2 3μL，5U/μl Taq酶0.5μL、10uM的肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7引物各1μL，扩增内标1μL，抑制物1μL，ddH2O，31.5μL。
PCR扩增程序：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
(3)将步骤(2)制得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，如图3A、图3B所示，加入1/64原抑制物浓度时，均可见竞争性扩增内标174bp条带及大肠杆菌的287bp条带、肠炎沙门氏菌344bp条带，竞争性扩增内标-PCR扩增体系未受影响；加入1/32原抑制物浓度时，竞争性扩增内标条带在肠炎沙门氏菌102CFU/ml、大肠杆菌O157:H7102CFU/ml、竞争性扩增内标质量浓度为8fg/ml组中消失，而大肠杆菌的287bp条带、肠炎沙门氏菌344bp条带还可见，在肠炎沙门氏菌101CFU/ml、大肠杆菌O157:H7101CFU/ml、竞争性扩增内标质量浓度为8fg/ml组中，所有条带均消失。
结果表明，加入1/64原抑制物浓度时，竞争性扩增内标-PCR扩增体系未受影响，加入1/32原抑制物浓度时，竞争性扩增内标较两目的条带在较高浓度先消失，即抑制物对竞争性扩增内标的影响大于对两目的条带的影响，证明了竞争性扩增内标可以有效指示假阴性。
实施例4
用传统培养方法(国标检验方法)、PCR法、实施例3所述的检测方法同时检测20份污染样本，对比分析试验结果。
三种方法肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、肠炎沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的阳性率分别为8/20、9/20、6/20，7/20、9/20、7/20，8/20、9/20、8/20，其中本发明所述检测方法中3个样本未扩出或条带极其微弱，可能出现假阴性，复测样本，又检出一份样本肠炎沙门氏菌阳性，这与传统培养方法结果一致，一份肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7阳性，一份结果阴性，证明了IAC-PCR法可有效指示假阴性，具有检测优势。
实施例5
在青岛市不同地区，不同超市，不同零售商处采集禽肉样本96份，每份取25g，均质，加入275mL的碱性蛋白胨水(含3％NaCl)液体培养基当中，于37℃摇床(转速100r/min)中增菌10小时，取1mL放入1.5mL离心管中，在沸水浴中煮30min，取出后在-20℃放置30min，，在37℃解冻，3000r/min离心2min，取上清液12000r/min离心5min，上清液即为DNA模板，取1μL进行检测，同时以无菌水做阴性对照。
检测方法同实施例3。
检测结果为肠炎沙门氏菌共检出29份，检出率为30.2％，大肠杆菌O157:H7共检出4份，检出率为4.17％，其中有效指示肠炎沙门氏菌假阴性3份，大肠杆菌O157:H7假阴性1份，肠炎沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7假阴性1份。可见本实施例涉及的竞争性内标在大量检测样品当中可以有效的指示假阴性，提高了检测的准确率。

Claims (1)

1.一种扩增内标，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
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