CN110763831A - 一种检测乳杆菌在胃肠道内定殖以及分布情况的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测乳杆菌在胃肠道内定殖以及分布情况的方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种以绿色荧光蛋白基因作为标记基因的检测乳杆菌在胃肠道内定殖以及分布情况的方法，此方法利用绿色荧光蛋白对植物乳杆菌进行标记，通过追踪绿色荧光蛋白从而实现对植物乳杆菌的胃肠道示踪，检测方便，易于判别，具有准确度高以及检测效率高的优势。本发明提供了一种以氯霉素抗性基因作为标记基因的检测乳杆菌在胃肠道内定殖以及分布情况的方法，此方法利用氯霉素抗性基因对植物乳杆菌进行标记，通过追踪氯霉素抗性基因从而实现对植物乳杆菌的胃肠道示踪，检测方便，易于判别，具有准确度高以及检测效率高的优势。

Description

一种检测乳杆菌在胃肠道内定殖以及分布情况的方法
技术领域
本发明涉及一种检测乳杆菌在胃肠道内定殖以及分布情况的方法，属于生物技术领域。
背景技术
植物乳杆菌是乳酸菌的一种，广泛分布在动物肠道中。植物乳杆菌可以通过代谢产生有机酸、过氧化氢、双乙酞、细菌素等多种天然的抑菌物质来抑制致病菌的生长繁殖，具有提高机体免疫力，维持肠道内菌群平衡，促进营养物质吸收，降低胆固醇水平，缓解乳糖不耐症及抑制肿瘤细胞的形成等多种功能。这些作用发挥的前提条件是必须能粘附到黏膜的表面或者相关部位，进行生长和繁殖。因此，研究植物乳杆菌在胃肠道的定殖和分布情况，对于评价其益生功能具有非常重要的作用。
目前，常见的用于研究植物乳杆菌在胃肠道中定殖和分布情况的方法主要分为依赖培养过程的方法和不依赖培养过程的方法两种。其中，依赖培养过程的方法普遍为采用YN-6、PSM、BSI、BIM-25和Beerens培养基等含有选择性试剂的选择培养基对胃肠道中植物乳杆菌进行分离和计数。但是，由于选择性试剂并不能准确干扰到某一种菌，因此，这种方法存在准确度低，适用范围窄的缺陷，具有很大的局限性。
不依赖培养过程的方法主要有3种，分别为琼脂糖凝胶电泳法(具体可见参考文献：Kimura KA,Mccartney A,Mcconnell M,et al.Analysis of fecal populations ofBifidobacteria and Lactobacilli and investigation of the immunologicalresponses of their human hosts to the predominant strains[J].Applied andEnvironmental Microbiology,1997,63(9):3394-3398.)、实时荧光PCR图谱分析法(具体可见参考文献：Inglis G D,Kalischuk L D.Direct Quantification ofCampylobacterjejuni and Campylobacter lanienae in Feces of Cattle by Real-Time Quantitative PCR[J].Applied and Environmental Microbiology,2004,70(4):2296-2306.)以及变性梯度凝胶电泳技术(具体可见参考文献：Favier C F,Vaughan E E,Vos W M D,et al.Molecular monitoring of succession of bacterial communitiesin human neonates[J].Appl Environ Microbiol,2002,68(1):219-226.)和16SrDNA测序技术相结合的分子生物学法(具体可见参考文献：Harmsen H J M,Raangs G C,He T,etal.Extensive Set of 16S rRNA-Based Probes for Detection of Bacteria in HumanFeces[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68(6):2982-2990.)。但是，这3种方法中，琼脂糖凝胶电泳法和实时荧光PCR图谱分析法存在抗干扰能力差，无法在构成结构复杂的肠道菌群样品中准确测定植物乳杆菌的缺陷，变性梯度凝胶电泳技术和16SrDNA测序技术相结合的分子生物学法存在操作复杂、效率低、成本高、处理样品量少的缺陷；并且，这三种方法都存在无法区分死植物乳杆菌和活植物乳杆菌的缺陷。
因此，仍需找到一种准确度高且效率高的检测乳杆菌在胃肠道内定殖以及分布情况的方法以解决现有检测技术存在的缺陷。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种准确度高且效率高的检测乳杆菌在胃肠道内定殖以及分布情况的方法。
[技术方案]
为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测乳杆菌在胃肠道内定殖情况的方法，所述方法为以待测乳杆菌为宿主、以标记基因为目的基因构建重组菌；以灌胃重组菌的实验动物为实验组，以不灌胃重组菌的实验动物为空白组，将重组菌灌胃实验动物，持续灌胃两周，两周内每隔2天通过标记基因对粪便中重组菌进行定量；两周后停止灌胃，每隔1天通过标记基因对粪便中重组菌进行定量，直至实验组实验动物粪便内重组菌的定量结果与空白组实验动物粪便内重组菌的定量结果一致，即灌胃的重组菌完全被实验组实验动物排出体外时停止实验；根据实验组每次的定量结果表征待测乳杆菌在胃肠道内的定殖情况；
或者，所述方法为以待测乳杆菌为宿主、以标记基因为目的基因构建重组菌；将重组菌灌胃实验动物，持续灌胃两周，两周后停止灌胃，处死实验动物并取出实验动物胃肠道，通过标记基因对胃肠道不同部位的重组菌进行定量，根据实定量结果表征待测乳杆菌在胃肠道内的定殖情况。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的灌胃量是1.0×1010～3.0×1010CFU/只。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的灌胃量是2.2×1010CFU/只。
在本发明的一种实施方式中，所述标记基因为绿色荧光蛋白基因或氯霉素抗性基因。
在本发明的一种实施方式中，当标记基因为绿色荧光蛋白基因时，所述定量方法为通过成像仪对实验动物胃肠道进行荧光成像以获得实验动物胃肠道不同部位的荧光强度，通过荧光强度表征实验动物胃肠道不同部位的重组菌含量；当标记基因为氯霉素抗性基因时，所述定量方法为使用含有氯霉素的培养基培养实验动物胃肠道不同部位的内容物以获得实验动物胃肠道不同部位的重组菌含量。
在本发明的一种实施方式中，所述绿色荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述氯霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述实验动物为小鼠、大鼠、猴、犬、兔或猫。
在本发明的一种实施方式中，所述实验动物为小鼠。
在本发明的一种实施方式中，所述乳杆菌为植物乳杆菌。
本发明还提供了上述方法在检测乳杆菌在胃肠道内定殖情况中的应用。
本发明还提供了一种检测乳杆菌在胃肠道内分布情况的方法，所述方法为以待测乳杆菌为宿主、以标记基因为目的基因构建重组菌；将重组菌灌胃实验动物，并在灌胃后不同时间处死实验动物，取出实验动物胃肠道，通过标记基因对粪便中重组菌进行定量，以得到灌胃后不同时间时待测乳杆菌在实验动物胃肠道内的分布情况。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的灌胃量是1.0×1010～3.0×1010CFU/只。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的灌胃量是2.2×1010CFU/只。
在本发明的一种实施方式中，所述标记基因为绿色荧光蛋白基因或氯霉素抗性基因。
在本发明的一种实施方式中，当标记基因为绿色荧光蛋白基因时，所述定量方法为通过成像仪对实验动物胃肠道进行荧光成像以获得实验动物胃肠道不同部位的荧光强度，通过荧光强度表征实验动物胃肠道不同部位的重组菌含量；当标记基因为氯霉素抗性基因时，所述定量方法为使用含有氯霉素的培养基培养实验动物胃肠道不同部位的内容物以获得实验动物胃肠道不同部位的重组菌含量。
在本发明的一种实施方式中，所述绿色荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述氯霉素抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述实验动物为小鼠、大鼠、猴、犬、兔或猫。
在本发明的一种实施方式中，所述实验动物为小鼠。
在本发明的一种实施方式中，所述乳杆菌为植物乳杆菌。
本发明还提供了上述方法在检测乳杆菌在胃肠道内分布情况中的应用。
[有益效果]
(1)本发明提供了一种以绿色荧光蛋白基因作为标记基因的检测乳杆菌在胃肠道内定殖以及分布情况的方法，此方法利用绿色荧光蛋白对植物乳杆菌进行标记，通过追踪绿色荧光蛋白从而实现对植物乳杆菌的胃肠道示踪，检测方便，易于判别，具有准确度高以及检测效率高的优势；当灌胃量2.2×1010CFU/只、灌胃时间为5min时，活体成像仪成像分析辐射效率可高达1.88×1010[p/s]/[μW/cm2]。
(2)本发明提供了一种以氯霉素抗性基因作为标记基因的检测乳杆菌在胃肠道内定殖以及分布情况的方法，此方法利用氯霉素抗性基因对植物乳杆菌进行标记，通过追踪氯霉素抗性基因从而实现对植物乳杆菌的胃肠道示踪，检测方便，易于判别，具有准确度高以及检测效率高的优势；当灌胃量为2.2×1010CFU/只时，整个灌胃期间，实验组粪便内以及胃肠道不同部位内植物乳杆菌的计数结果均比空白组粪便内以及胃肠道不同部位内植物乳杆菌计数结果高出3～4个数量级，误差可以忽略不计。
附图说明
图1：重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-GFP的PCR验证结果。
图2：重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-GFP的荧光显微镜观察结果。
图3：以OD600为横坐标、荧光强度为纵坐标绘制得到的曲线。
图4：小鼠胃肠道使用PerkinElmer IVIS Lumina XRMS活体成像分析系统的成像结果。
图5：小鼠胃肠道使用PerkinElmer IVIS Lumina XRMS活体成像分析系统的成像结果.
图6：以时间为横坐标、小鼠粪便中的活菌数为纵坐标绘制得到的曲线。
图7：小鼠胃肠道不同部位的活菌数。
具体实施方式
下述实施例中涉及的SPF级6周龄C57BL/6J雄性小鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司；下述实施例中涉及的植物乳杆菌ST-Ⅲ(Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ)记载于公开号为CN1207382C的专利申请文本中，保藏编号为：CGMCC NO.0847；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自通用生物技术有限公司；下述实施例中涉及的PCD4033质粒的构建方法记载于文献“Zhilan S，Jian K，Wentao K.Characterization ofa cryptic plasmid pD403 from Lactobacillus plantarum and construction ofshuttle vectors based on its replicon[J].Molecular Biotechnology，2010，45(1):24-33.”中。
下述实施例中涉及的生理盐水中均加入0.5g/L的半胱氨酸盐酸盐。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、K2HPO42g/L、柠檬酸二铵2g/L、乙酸钠2g/L、吐温80 1mL/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·4H2O0.25g/L、蒸馏水1000mL/L、氯霉素10μg/mL，pH 6.2～6.4，在115℃灭菌20min。
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、K2HPO42g/L、柠檬酸二铵2g/L、乙酸钠2g/L、吐温80 1mL/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、MnSO4·4H2O0.25g/L、蒸馏水1000mL/L、氯霉素10μg/mL、琼脂粉15g/L，pH 6.2～6.4，在115℃灭菌20min。
TYG液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖2g/L、L-半胱氨酸0.5g/L、1M的磷酸氢二钾溶液100mL/L、TYG盐溶液40mL/L、0.8％(m/m)的氯化钙溶液1mL/L、1mg/mL的VK3溶液1mL/L、0.4mg/mL的硫酸亚铁1mL/L、组氨酸血红素1mL/L，115℃灭菌30min，其中，TYG盐溶液：七水合硫酸镁0.5g/L、碳酸氢钠10g/L、氯化钠2g/L；组氨酸血红素：12mg血红素溶于0.2M、pH调到8的组氨酸溶液中。
TYG固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖2g/L、L-半胱氨酸0.5g/L、1M的磷酸氢二钾溶液100mL/L、TYG盐溶液40mL/L、0.8％(m/m)的氯化钙溶液1mL/L、1mg/mL的VK3溶液1mL/L、0.4mg/mL的硫酸亚铁1mL/L、组氨酸血红素1mL/L，115℃灭菌30min，其中，TYG盐溶液：七水合硫酸镁0.5g/L、碳酸氢钠10g/L、氯化钠2g/L、琼脂粉15g/L；组氨酸血红素：12mg血红素溶于0.2M、pH调到8的组氨酸溶液中。
PBS溶液：Na2HPO42.13 g/L、NaCl 0.8g/L、KCl 0.2g/L、KH2PO40.2 g/L，调pH到7.4，在115℃灭菌20min。
下述实施例中涉及的饲养方法如下：
SPF级6周龄C57BL/6J雄性小鼠饲喂于独立通风笼(IVC)系统，严格控制12h光照/黑夜，湿度设定在40％～70％，温度设定在22～26℃。
下述实施例中涉及的荧光成像方法如下：
使用IVIS Lumina XRMS活体成像分析系统(购自美国PerkinElmer公司)，将放在平皿上的小鼠胃肠道放入成像箱，轻轻关门；IVIS Acquisition Control Panel中选择Imaging Wizard中的Fluorescence；选择470/570nm，470/630nm，500/570nm和500/630nm的激发/发射滤光器，然后选择成像物体(Imaging Subject)和拍照参数，最后在IVISAcquisition Control Panel中点击Acquire Sequence，获得荧光图像。
下述实施例中涉及的光谱分离和荧光强度积分的获得方法如下：
使用
Figure BDA0002251656820000051
4.5.4软件分析荧光成像获得的图像，IVIS AcquisitionControl Panel点击Imaging Wizard，并选择Fluorescence；Fluorescence-SpectralUnmixing/Filter Scan界面内选择探针类型和扫描滤光片组，然后选择成像物体(ImagingSubject)，在IVIS Acquisition Control Panel中点击Acquire Sequence获取序列光谱扫描图像；在Tool Palette-Spectral Unmixing-Analyze中选择Manual；用铅笔图标手动在混合光谱叠加图中画选需要光谱分离的成分：包括背景荧光点(TissueAF)和目标信号点；通过Computer the pure spectrum图标计算出目标信号的纯光谱；点击Unmix，获取光谱分离成像结果。
获取光谱分离图片后，点击Tool Palette中的Image Adjust，选择Tool Palette中的ROI Tools，采用Free Draw的方式进行ROI圈选；点击Measure ROIs，获取ROI区域的定量数值，对于荧光成像，定量单位为Radiant Efficiency。
下述实施例中涉及的胃肠道内容物的收集方法如下：
将胃肠道分割成不同的部位，分别取出内容物计数，具体做法为：分别剪下胃、小肠、盲肠、结肠；用解剖的小剪刀将各个部位的组织样品剪开，小肠的长度太长，可以分为几段来操作；剪开的组织样品放到提前分装好的4.5mL无菌的生理盐水中，旋涡震荡，让内容物充分掉落到生理盐水中；用小镊子取出组织外壁。
下述实施例中涉及的胃肠道内容物中植物乳杆菌活菌数的测定方法如下：
提前配置好MRS固体培养基，灭菌后，放到烘箱中保温备用；配制10mg/mL的氯霉素溶液，过0.22μm的滤膜除菌；对胃肠道内容物进行梯度稀释，所有样品梯度稀释做两个平行；挑取合适的3个梯度，吸取1mL稀释液加到无菌平皿中；吸取过膜后的氯霉素溶液，添加到冷却后的培养基中(添加比例是1mL/L)，混匀；向平皿中倒入15～20mL的MRS固体培养基，立即缓慢的摇匀；待培养基凝固后做好标记，倒置后放入37℃培养箱，培养48h，取出计数，计算植物乳杆菌的活菌数。
下述实施例中涉及的小鼠粪便样品的收集方法如下：
实验期间，每天早上9～12点收集粪便，方法如下：将每组中的小鼠单独放置在铺有干净滤纸的笼盒中，收集每只小鼠的粪便，时刻观察小鼠排便情况，及时清理小鼠尿液防止粪便沾到尿液，每只小鼠至少收集5粒粪便，将收集到的粪便装入无菌的1.5mL离心管中，然后将离心管置于冰盒中保存，收集结束的小鼠再放回原笼盒中。
下述实施例中涉及的粪便样品中植物乳杆菌和总活菌数的计数方法如下：
植物乳杆菌的计数方法：收集到的小鼠粪便需要当天立即计数，计数方法参考胃肠道内容物中植物乳杆菌活菌数的测定方法并稍作修改，称取0.5g粪便加到4.5mL无菌的生理盐水管中，充分震荡，混匀至没有颗粒，吸取500μL溶液到新的4.5mL无菌的生理盐水管中，同样的方法依次梯度稀释至合适的梯度；其它操作与胃肠道内容物中植物乳杆菌活菌数的测定方法相同。
粪便样品中总活菌数的计数方法：总活菌数的计数方法是将上述计数方法中的MRS固体培养基换成TYG固体培养基，且培养基中不添加氯霉素，其它操作相同。
实施例1-1：以绿色荧光蛋白基因作为标记基因的重组植物乳杆菌的构建与验证
1、构建
化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的绿色荧光蛋白基因；将绿色荧光蛋白基因与质粒PCD4033通过PstⅠ、ClaⅠ进行双酶切后连接，连接产物转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞涂布LB固体培养基(含有10μg/mL的氯霉素)，37℃倒置培养24h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒PCD403-GFP；将获得的重组质粒PCD403-GFP导入植物乳杆菌ST-III中，将转化后的植物乳杆菌ST-III感受态细胞涂布MRS固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取转化子，以转化子作为待验证的重组植物乳杆菌Lactobacillusplantarum ST-III/PCD403-GFP。
2、验证
2.1、将获得待验证的重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-GFP的单菌落接种于MRS液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床中培养20h，获得菌液；观察菌液是否浑浊。
观察可知，菌液为浑浊状态，初步判定重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarumST-III/PCD403-GFP构建成功。
2.2、根绿色荧光蛋白基因的核苷酸序列设计一对特异性引物GF和GR，其中，正向引物GF：5’-GAGCAAAGGAGAAGAACT-3’(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)、反向引物GR：5’-CATGCCATGTGTAATCCC-3’(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)；将重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-GFP培养得到的菌液用去离子水清洗两遍以去除培养基，于5000rpm离心5min后用去离子水重悬，得到重悬液；以GF和GR为引物、以重悬液作为模板进行PCR，其中，扩增体系为：20μL：2×Taq Mix 10μL；ddH2O 8μL；上游引物(25μmol/L)0.5μL；下游引物(25μmol/L)0.5μL；模板1μL。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s；50℃退火30s；72℃延伸1min；72℃延伸5min，2-4步进行30个循环；PCR产物通过2％的琼脂糖凝胶电泳验证，电泳条件为：电压110V，电流100mA，出现唯一的目标条带扩增产物，条带大小与目的基因片段比对一致(具体可见图1)。
由图1的结果可进一步判定重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-GFP构建成功。
2.3、将重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-GFP培养得到的菌液用去离子水清洗两遍以去除培养基，于5000rpm离心5min后用去离子水重悬，得到重悬液；将重悬液稀释10～1000倍，用接种环沾取少量液体，在载玻片上均匀涂开盖上盖玻片后，在荧光显微镜下观察，荧光滤片组打到DAPI(蓝)(观察结果见图2)。
由图2可知，植物乳杆菌ST-III中绿色荧光蛋白表达稳定，在荧光显微镜下可以观察到明亮的荧光。
2.4、将重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-GFP培养得到的菌液以1％(v/v)的接种量接种到新鲜的MRS液体培养基中，37℃培养12～14h；以1％(v/v)的接种量继续接种到新鲜的MRS液体培养基中，混匀后分装到提前灭过菌的试管中，于37℃恒温静置培养，每隔1h取出一根试管测定OD600和荧光强度，以培养时间为横坐标，分别以OD600为横坐标、荧光强度为纵坐标，绘制曲线，参见图3。
测定荧光强度的方法如下：吸取1mL试管中的培养液，5000rpm离心2min，去尽上清，然后用PBS洗两遍去除培养基，最后重悬在1mL的PBS中，取200μL重悬液加入96孔酶标板中，测定488nm激发，535nm发射下的荧光值。
由图3可知，植物乳杆菌ST-III中绿色荧光蛋白表达稳定，在紫外灯下可以观察到明亮的荧光。
实施例1-2：以绿色荧光蛋白基因作为标记基因检测植物乳杆菌ST-Ⅲ在小鼠胃肠道中动态分布的情况
具体步骤如下：
将实施例1-1获得的重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-GFP划线于MRS固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于MRS液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化2代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％的接种量接种到新鲜的MRS液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养至光密度OD600达到2.5～3.0，5000g离心10min，弃上清后用PBS洗涤两次菌泥，最后将菌泥重悬于PBS中，获得灌胃液，此灌胃液需通过在含有10μg/mL氯霉素的MRS固体培养基上进行计数，保证灌胃液浓度在1.0×1011CFU/mL，并且，在灌胃前需将灌胃液放在4℃冰箱至少20h以确保稳定的荧光。
取体重18-20g的健康C57BL/6J小鼠21只，在无病原体条件下饲养，根据灌胃后处死小鼠的时间分组，随机分成7组，7组分别命名为：不灌胃空白组(0min组)、5min组、30min组、1.5h组、4h组、8h组、灌胃没有用GFP标记的原始植物乳杆菌对照组(LP组)，每组3只。
实验前7天是适应期，所有小鼠自由饮食。第8天处理，所有灌胃小鼠的灌胃量均为2.2×1010CFU/只。适应期结束后，0min组：小鼠不做灌胃处理，安乐死后取出胃肠道；5min组：灌胃重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-GFP，5min后安乐死小鼠取出胃肠道；30min组：灌胃重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-GFP，30min后安乐死小鼠取出胃肠道；1.5h组：灌胃重组植物乳杆菌Lactobacillusplantarum ST-III/PCD403-GFP，1.5h后安乐死小鼠取出胃肠道；4h组：灌胃重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-GFP，4h后安乐死小鼠取出胃肠道；8h组：灌胃重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-GFP，8h后安乐死小鼠取出胃肠道；LP组：灌胃没有用GFP标记的原始植物乳杆菌，30min后安乐死小鼠取出胃肠道。
使用PerkinElmer IVIS LuminaXRMS活体成像分析系统对每组胃肠道进行成像分析，获得荧光图像(具体可见图4)。
由图4可知，通过取出肠道在活体成像仪上成像分析可以直观地观察到植物乳杆菌在小鼠肠道中的动态分布过程；其中，灌胃5min后，大部分植物乳杆菌已经经过胃到达小肠前端，此时检测到的绿色荧光蛋白的荧光信号最强，可以达到1.88×1010[p/s]/[μW/cm2]；灌胃30min后，植物乳杆菌渐渐向肠道后端推移，主要分布在回肠前端；灌胃1.5h后，部分植物乳杆菌经过盲肠到达结肠；灌胃4h后的分布规律与灌胃1.5h后的分布规律相似，但荧光亮度明显减弱；灌胃8h后几乎检测不到荧光。
实施例1-3：以绿色荧光蛋白基因作为标记基因检测植物乳杆菌ST-Ⅲ在小鼠胃肠道中的定殖情况
具体步骤如下：
将实施例1-1获得的重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-GFP划线于MRS固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于MRS液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化2代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％的接种量接种到新鲜的MRS液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养至光密度OD600达到2.5～3.0，5000g离心10min，弃上清后用PBS洗涤两次菌泥，最后将菌泥重悬于PBS中，获得灌胃液；通过在含有10μg/mL氯霉素的MRS固体培养基上进行计数，保证灌胃液浓度在1.0×1011CFU/mL；在灌胃前将灌胃液放在4℃冰箱至少20h以确保稳定的荧光。
取体重18-20g的健康C57BL/6J小鼠6只，在无病原体条件下饲养，随机分成2组，2组分别命名为：空白组和实验组，每组3只。
实验1～7天是适应期，所有小鼠自由饮食。适应期结束后，第8～21天：空白组小鼠每天灌胃与灌胃液等量的PBS溶液；实验组小鼠每天灌胃重组植物乳杆菌Lactobacillusplantarum ST-III/PCD403-GFP，灌胃量为2.2×1010CFU/只。第22天，所有小鼠停止灌胃，安乐死后取出肠道，使用PerkinElmer IVIS Lumina XRMS活体成像分析系统对每组胃肠道进行成像分析，获得荧光图像(具体可见图5)。
由图5可知，通过取出肠道在活体成像仪上成像分析可以直观地观察到植物乳杆菌ST-III在小鼠肠道中的定殖部位，空白组小鼠的肠道没有检测到绿色荧光蛋白荧光信号；实验组小鼠肠道成像结果表明连续灌胃2周后，植物乳杆菌ST-III在小鼠回肠、盲肠和结肠中均有定殖。
实施例2-1：以氯霉素抗性基因作为标记基因的重组植物乳杆菌的构建
化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的氯霉素抗性基因；将氯霉素抗性基因与质粒PCD4033通过Pst Ⅰ、Cla Ⅰ进行双酶切后连接，连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞涂布LB固体培养基(含有10μg/mL的氯霉素)，37℃倒置培养24h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒PCD403-Cmr；将获得的重组质粒PCD403-Cmr导入植物乳杆菌ST-III中，将转化后的植物乳杆菌ST-III感受态细胞涂布MRS固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取转化子，以转化子作为待验证的重组植物乳杆菌Lactobacillusplantarum ST-III/PCD403-Cmr。
将获得待验证的重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-Cmr的单菌落接种于MRS液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床中培养20h，获得菌液；观察菌液是否浑浊。
观察可知，菌液为浑浊状态，判定重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-Cmr构建成功。
实施例2-2：以氯霉素抗性基因作为标记基因检测植物乳杆菌ST-Ⅲ在小鼠胃肠道中的定殖情况
具体步骤如下：
将实施例2-1获得的重组植物乳杆菌重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarumST-III/PCD403-Cmr划线于MRS固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于MRS液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化2代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％的接种量接种到新鲜的MRS液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养至光密度OD600达到2.5～3.0，5000g离心10min，弃上清后用PBS洗涤两次菌泥，最后将菌泥重悬于PBS中，获得灌胃液，此灌胃液需通过在含有10μg/mL氯霉素的MRS固体培养基上进行计数，保证灌胃液浓度在1.0×1011CFU/mL。
取体重18-20g的健康C57BL/6J小鼠10只，在无病原体条件下饲养，随机分成2组，2组分别命名为：空白组和实验组，每组5只。
实验1～7天是适应期，所有小鼠自由饮食。适应期结束后，第8～21天：空白组小鼠每天灌胃与灌胃液等量的PBS溶液，每隔2天收集一次粪便用于计数，所有样品均对重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-Cmr和总菌数进行计数以研究植物乳杆菌ST-III在小鼠肠道中定殖数量的变化规律以及灌胃植物乳杆菌ST-III后对小鼠肠道总菌数的影响；实验组小鼠每天灌胃重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-Cmr，灌胃量为2.2×1010CFU/只，每隔2天收集一次粪便用于计数。第22～34天，所有小鼠停止灌胃，每隔1天收集一次粪便用于计数(计数结果见图6)。
由图6可知，当灌胃量为2.2×1010CFU/只时，整个灌胃期间，空白组植物乳杆菌计数结果均维持在4×104CFU/mL以下，实验组植物乳杆菌计数结果均在5×107CFU/mL～2×108CFU/mL之间，相对于空白组几乎高出3～4个数量级，所以误差可以不计，并且，两组小鼠粪便中的总活菌数没有显著差异，灌胃前后组内差异也不显著，总活菌数基本维持在1×1011CFU/g。可见，利用实施例2-2的方法可以定量检测植物乳杆菌在小鼠肠道内的定殖。
实施例2-3：以氯霉素抗性基因作为标记基因检测植物乳杆菌ST-Ⅲ在小鼠胃肠道中不同部位的分布情况
具体步骤如下：
将实施例2-1获得的重组植物乳杆菌重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarumST-III/PCD403-Cmr划线于MRS固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于MRS液体培养基中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化2代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％的接种量接种到新鲜的MRS液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养至光密度OD600达到2.5～3.0，5000g离心10min，弃上清后用PBS洗涤两次菌泥，最后将菌泥重悬于PBS中，获得灌胃液，此灌胃液需通过在含有10μg/mL氯霉素的MRS固体培养基上进行计数，保证灌胃液浓度在1.0×1011CFU/mL。
取体重18-20g的健康C57BL/6J小鼠6只，在无病原体条件下饲养，随机分成2组，2组分别命名为：空白组和实验组，每组3只。
实验1～7天是适应期，所有小鼠自由饮食。适应期结束后，第8～21天：空白组小鼠每天灌胃与灌胃液等量的PBS溶液；实验组小鼠每天灌胃重组植物乳杆菌Lactobacillusplantarum ST-III/PCD403-Cmr，灌胃量为2.2×1010CFU/只。第22天，安乐死所有小鼠，分别取出小鼠的小肠、盲肠、结肠的内容物用于计数，所有样品均对重组植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III/PCD403-Cmr和总菌数进行计数以研究植物乳杆菌ST-III在小鼠肠道中定殖数量的变化规律以及灌胃植物乳杆菌ST-III后对小鼠肠道总菌数的影响，参见图7。
由图7可知，当灌胃量为2.2×1010CFU/只时，整个灌胃期间，空白组小鼠小肠、盲肠、结肠内的植物乳杆菌计数结果均维持在2.2×104CFU/mL以下，实验组植物乳杆菌计数结果均在1×108CFU/mL之间，相对于空白组几乎高出3～4个数量级，所以误差可以不计。可见，利用实施例2-2的方法可以定量检测植物乳杆菌在小鼠肠道内不同部位的分布情况。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种检测乳杆菌在胃肠道内定殖以及分布情况的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 734
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atatgagcaa aggagaagaa cttttcactg gagttgtccc aattcttgtt gaattagatg 60
gtgatgttaa tgggcacaaa ttttctgtca gtggagaggg tgaaggtgat gctacatacg 120
gaaaactcac ccttaaattt atttgcacta ctggaaaact acctgttcca tggccaacac 180
ttgtcactac tctgacctat ggtgttcaat gcttttcccg ttatccggat cacatgaaac 240
ggcatgactt tttcaagagt gccatgcccg aaggttatgt acaggaacgc actatatctt 300
tcaaagatga cgggaactac aagacgcgtg ctgaagtcaa gtttgaaggt gatacccttg 360
ttaatcgtat cgagttaaag ggtattgatt ttaaagaaga tggaaacatt ctcggacaca 420
aactcgagta caactacaac tcacacaatg tatacatcac ggcagacaaa caaaagaatg 480
gaatcaaagc taacttcaaa attcgccaca acattgaaga tggttccgtt caactagcag 540
accattatca acaaaatact ccaattggcg atggccctgt ccttttacca gacaaccatt 600
acctgtcgac acaatctgcc ctttcgaaag atcccaacga aaagcgtgac cacatggtcc 660
ttcttgagtt tgtaactgct gctgggatta cacatggcat ggatgagctc tactaagaat 720
tcgatatcaa gctt 734
<210> 2
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa 60
cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt tcagctggat 120
attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc ggcctttatt 180
cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattcc gtatggcaat gaaagacggt 240
gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga gcaaactgaa 300
acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct acacatatat 360
tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg gtttattgag 420
aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga tttaaacgtg 480
gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgg gcaaatatta tacgcaaggc 540
gacaaggtgc tgatgccgct ggcgattcag gttcatcatg ccgtttgtga tggcttccat 600
gtcggcagaa tgcttaatga attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa 660
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gagcaaagga gaagaact 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catgccatgt gtaatccc 18

Claims (10)

1.一种检测乳杆菌在胃肠道内定殖情况的方法，其特征在于，所述方法为以待测乳杆菌为宿主、以标记基因为目的基因构建重组菌；以灌胃重组菌的实验动物为实验组，以不灌胃重组菌的实验动物为空白组，将重组菌灌胃实验动物，持续灌胃两周，两周内每隔2天通过标记基因对粪便中重组菌进行定量；两周后停止灌胃，每隔1天通过标记基因对粪便中重组菌进行定量，直至实验组实验动物粪便内重组菌的定量结果与空白组实验动物粪便内重组菌的定量结果一致，即灌胃的重组菌完全被实验组实验动物排出体外时停止实验；根据实验组每次的定量结果表征待测乳杆菌在胃肠道内的定殖情况；
或者，所述方法为以待测乳杆菌为宿主、以标记基因为目的基因构建重组菌；将重组菌灌胃实验动物，持续灌胃两周，两周后停止灌胃，处死实验动物并取出实验动物胃肠道，通过标记基因对胃肠道不同部位的重组菌进行定量，根据实定量结果表征待测乳杆菌在胃肠道内的定殖情况。
2.如权利要求1所述的一种检测乳杆菌在胃肠道内定殖情况的方法，其特征在于，所述重组菌的灌胃量是1.0×1010～3.0×1010CFU/只。
3.如权利要求1或2所述的一种检测乳杆菌在胃肠道内定殖情况的方法，其特征在于，所述标记基因为绿色荧光蛋白基因或氯霉素抗性基因。
4.如权利要求3所述的一种检测乳杆菌在胃肠道内定殖情况的方法，其特征在于，当标记基因为绿色荧光蛋白基因时，所述定量方法为通过成像仪对实验动物胃肠道进行荧光成像以获得实验动物胃肠道不同部位的荧光强度，通过荧光强度表征实验动物胃肠道不同部位的重组菌含量；当标记基因为氯霉素抗性基因时，所述定量方法为使用含有氯霉素的培养基培养实验动物胃肠道不同部位的内容物以获得实验动物胃肠道不同部位的重组菌含量。
5.权利要求1-4任一所述的方法在检测乳杆菌在胃肠道内定殖情况中的应用。
6.一种检测乳杆菌在胃肠道内分布情况的方法，其特征在于，所述方法为以待测乳杆菌为宿主、以标记基因为目的基因构建重组菌；将重组菌灌胃实验动物，并在灌胃后不同时间处死实验动物，取出实验动物胃肠道，通过标记基因对胃肠道不同部位的重组菌进行定量，以得到灌胃后不同时间时待测乳杆菌在实验动物胃肠道内的分布情况。
7.如权利要求6所述的一种检测乳杆菌在胃肠道内分布情况的方法，其特征在于，所述重组菌的灌胃量是1.0×1010～3.0×1010CFU/只。
8.如权利要求6或7所述的一种检测乳杆菌在胃肠道内分布情况的方法，其特征在于，所述标记基因为绿色荧光蛋白基因或氯霉素抗性基因。
9.如权利要求8所述的一种检测乳杆菌在胃肠道内分布情况的方法，其特征在于，当标记基因为绿色荧光蛋白基因时，所述定量方法为通过成像仪对实验动物胃肠道进行荧光成像以获得实验动物胃肠道不同部位的荧光强度，通过荧光强度表征实验动物胃肠道不同部位的重组菌含量；当标记基因为氯霉素抗性基因时，所述定量方法为使用含有氯霉素的培养基培养实验动物胃肠道不同部位的内容物以获得实验动物胃肠道不同部位的重组菌含量。
10.权利要求6-9任一所述的方法在检测乳杆菌在胃肠道内分布情况中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114703250A (zh) * 2022-05-11 2022-07-05 暨南大学附属第一医院（广州华侨医院） 一种利用细胞核荧光染料定量监测细菌增殖及追踪其在肠内定植的方法
CN114720435A (zh) * 2022-01-06 2022-07-08 昆明理工大学 一种检测外源微生物进入体内后动态分布的方法及其用途

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020102722A1 (en) * 2000-05-26 2002-08-01 Wei-Yu Lo Lac shuttle vectors
CN102604877A (zh) * 2011-01-24 2012-07-25 天津科技大学 基于绿色荧光蛋白检测乳酸菌在胃肠道中定植特性的方法
CN102703600A (zh) * 2012-07-10 2012-10-03 光明乳业股份有限公司 一种植物乳杆菌肠道定殖性的定性、定量测定方法
CN103881956A (zh) * 2014-03-12 2014-06-25 中国药科大学 一种以乳酸乳球菌为载体的抗幽门螺杆菌疫苗
CN105039578A (zh) * 2015-08-31 2015-11-11 江南大学 一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法
CN109939244A (zh) * 2019-02-27 2019-06-28 南开大学 一种食源性益生菌胞内荧光标记方法及其体内应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020102722A1 (en) * 2000-05-26 2002-08-01 Wei-Yu Lo Lac shuttle vectors
CN102604877A (zh) * 2011-01-24 2012-07-25 天津科技大学 基于绿色荧光蛋白检测乳酸菌在胃肠道中定植特性的方法
CN102703600A (zh) * 2012-07-10 2012-10-03 光明乳业股份有限公司 一种植物乳杆菌肠道定殖性的定性、定量测定方法
CN103881956A (zh) * 2014-03-12 2014-06-25 中国药科大学 一种以乳酸乳球菌为载体的抗幽门螺杆菌疫苗
CN105039578A (zh) * 2015-08-31 2015-11-11 江南大学 一种乳杆菌肠道定植能力的测定方法
CN109939244A (zh) * 2019-02-27 2019-06-28 南开大学 一种食源性益生菌胞内荧光标记方法及其体内应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
沈旭丹 等: "具有肠道动力及肠道菌群调节功能乳杆菌的筛选及功能评价", 《食品科学》 *
赵晓雨 等: "荧光标记法定量分析植物乳杆菌RS-09在胃肠道内定植规律", 《世界动物福利科学大会论文集》 *
陈彩玲 等: "绿色荧光蛋白标记植物乳杆菌及其生物学特性分析", 《食品与发酵工业》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114720435A (zh) * 2022-01-06 2022-07-08 昆明理工大学 一种检测外源微生物进入体内后动态分布的方法及其用途
CN114703250A (zh) * 2022-05-11 2022-07-05 暨南大学附属第一医院（广州华侨医院） 一种利用细胞核荧光染料定量监测细菌增殖及追踪其在肠内定植的方法

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