CN103881956A - 一种以乳酸乳球菌为载体的抗幽门螺杆菌疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，公开一种以乳酸乳球菌为载体的抗幽门螺杆菌疫苗及其制备方法和应用，利用本实验室的分子生物学技术平台，构建了乳酸乳球菌表达幽门螺杆菌多表位疫苗CTB-UE的工程菌，通过体外Westem Blotting鉴定检测融合蛋白疫苗的正确表达及所含抗原表位的免疫原性，体内动物实验验证本疫苗能诱发特异性的抗幽门螺杆菌感染的免疫反应，并可以显著性抑制幽门螺杆菌尿素酶的活性和减少幽门螺杆菌在小鼠胃部的定植数，对于幽门螺杆菌感染相关疾病具有很好的临床应用前景。

Description

一种以乳酸乳球菌为载体的抗幽门螺杆菌疫苗

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及到一种以乳酸乳球菌为载体的抗幽门螺杆菌疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染可以导致慢性胃炎、十二指肠炎和消化道溃疡，严重的甚至会发展成胃癌等，这些疾病在我国乃至世界范围内发病率高达50％，形势十分严峻。目前治疗Hp感染主要基于抗生素“三联”药物疗法，也即质子泵抑制剂、抗生素和铋剂联合疗法。这种疗法短期内效果可以，但是长期服用会有诸多弊端，如病人体内Hp耐药性越来越强，难以彻底根除，治疗周期长以及费用昂贵等。实验研究表明，疫苗接种可预防甚至治疗Hp感染，使机体获得持久性的免疫力。尿素酶是Hp重要的定植因子和致病因子，因此基于尿素酶抗原研制有效的预防性Hp疫苗是控制Hp感染性疾病的一种切实可行的方法。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.lactis)是乳球菌属中最重要和最典型的一个种，在食品工业中应用广泛，被公认为安全的(GRAS，generally regard assafe)食品级微生物。以乳酸乳球菌作为载体，构建基因工程重组菌用来表达异源蛋白和酶等，逐渐成为生物制药以及疫苗领域的热点。近年来，乳酸乳球菌的分子生物学研究取得了重大进展，一些具有不同用途的乳酸乳球菌基因表达载体已经构建，用来表达抗原蛋白、细胞因子和生物酶等。现有的疫苗一般需要注射，常规注射疫苗会产生应激及疫苗吸收的问题，而通过口服免疫时，免疫原在到达小肠粘膜之前会存在被降解或灭活的可能，虽然以细菌病毒为活载体可达到这一目的，但细菌病毒对人体会有一定的伤害性。总之，用活的乳酸菌直接口服免疫具有很多优点，如生物安全性高，疫苗制备过程简单方便，无需复杂纯化过程，成本低廉以及病人依从性好等等。

利用乳酸菌为传递载体递呈外源蛋白有三种形式：胞内表达，细胞膜锚定表达以及分泌表达。由于分泌表达能使外源蛋白逃避蛋白酶的降解且更快更直接地与消化道黏膜接触激发免疫应答，所以分泌表达的形式更吸引研究者的关注。在疫苗CTB-UE基因上游融合信号肽SP基因以期达到分泌表达该疫苗至细胞外的目的。

本疫苗为抵抗Hp感染的乳酸乳球菌口服活菌疫苗，可针对Hp生存必须的尿素酶诱发特异性免疫反应，产生高滴度的抗尿素酶特异性抗体，这种抗体可分别作用于尿素酶抗原上不同的细胞表位，达到特异性抑制尿素酶活性进而抑制Hp生长繁殖的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组乳酸乳球菌疫苗株及其制备方法和应用。

本发明所提供的重组乳酸乳球菌疫苗株，信号肽SP基因融合幽门螺杆菌多表位疫苗CTB-UE的编码基因后导入乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，L.lactis)得到的重组菌。

本发明所提供的重组乳酸乳球菌可为Lactococcus lactis NZ9000型，也可为其它许可在人体使用的乳酸菌。

本发明所提供的表达载体可为pCYT-NUC，也可为其它许可在人体使用的乳酸菌表达载体。

本发明所提供的重组乳酸乳球菌中，信号肽SP和幽门螺杆菌多表位疫苗CTB-UE的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

序列表中的序列1由309个氨基酸组成，自序列1的氨基末端第-27—-1位为信号肽片段SP，自序列1的氨基末端第1-105位为霍乱毒素亚单位B，自序列1的氨基末端第106-112位为连接肽DPRVPSS(天冬氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-脯氨酸-丝氨酸-丝氨酸)，自序列1的氨基末端第113-282位为来自Hp尿素酶(urease)的五个细胞表位的多拷贝重复串联体Urease Epitopes(UE)。

所述信号肽SP和幽门螺杆菌多表位疫苗CTB-UE的融合蛋白的核苷酸序列具体可如序列表中序列2所示。

所述信号肽SP和幽门螺杆菌多表位疫苗CTB-UE的融合蛋白的编码基因可通过重组质粒pCYT-SP-CTB-UE(pCYT-SCE)导入乳酸乳球菌疫苗株。所述pCYT-SCE是将pCYT-NUC中的NUC基因用所述融合蛋白编码基因替代得到的重组质粒；所述表达载体pCYT-NUC为pWV01衍生载体，启动子为PnisA，携带氯霉素抗性基因以及多克隆位点(MCS)。

附图说明

图1融合蛋白组成结构示意图。

SP代表信号肽，CTB代表霍乱毒素亚单位B，DPRVPSS代表连接肽天冬氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-脯氨酸-丝氨酸-丝氨酸、KK和GS代表连接肽赖氨酸-赖氨酸和谷氨酸-丝氨酸，UE代表五个细胞表位(epitope)的重复串联体，UreA和UreB指尿素酶A和B亚基，6×His代表组氨酸标签序列。

图2三次PCR获得SP-CTB-UE基因的过程示意图。

Pl-P4为融合SP至CTB-UE基因上游所用的四条引物，SP代表信号肽，CUE代表多表位疫苗CTB-UE。1、2和3代表三次PCR步骤。

图3三次PCR获得SP-CTB-UE基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

M为DNA Marker DL2000；1、2和3代表第1、2和3次PCR产物。

图4克隆SP-CTB-UE基因至乳酸菌诱导性表达载体pCYT-NUC示意图。

斜体代表限制性酶切位点，PnisA代表诱导型启动子，RBS代表核糖体结合位点，NUC代表金黄色葡萄球菌核酸酶基因，SP代表信号肽序列，CUE代表多表位疫苗CTB-UE基因。

图5融合蛋白编码基因正向测序图。

图6融合蛋白编码基因反向测序图。

图7Western Blotting检测重组乳酸乳球菌表达融合蛋白抗原结果。

Lane1：未诱导组培养基上清提纯蛋白，Lane2：未诱导组的裂解全菌蛋白，

Lane3：诱导组培养基上清提纯蛋白，Lane4：诱导组的裂解全菌蛋白，M为蛋白预染Marker。

图8以乳球菌为载体的Hp多表位疫苗CTB-UE诱发抗尿素酶抗体的检测。

以乳球菌为载体的Hp多表位疫苗CTB-UE能诱发较高滴度抗尿素酶抗体。OD₄₅₀代表酶标仪测定的免疫小鼠血清与Hp尿素酶反应液在波长450nm处的吸光值，可反映小鼠免疫后血清内产生的尿素酶特异性抗体的水平。

图9以乳球菌为载体的Hp多表位疫苗CTB-UE对小鼠预防性免疫后胃部尿素酶活性测定。

以乳球菌为载体的Hp多表位疫苗CTB-UE预防性免疫后可有效抑制小鼠胃部Hp尿素酶活性。OD₅₅₀代表酶标仪测定的尿素酶反应液在波长550nm处的吸光值，可反映小鼠免疫后胃部Hp尿素酶活性的高低。

图10以乳球菌为载体的Hp多表位疫苗CTB-UE对小鼠预防性免疫后胃部幽门螺杆菌定植数的测定。

以乳球菌为载体的Hp多表位疫苗CTB-UE预防性免疫后能显著减少小鼠胃部幽门螺杆菌定植数。CFU代表菌落形成单位，Ig代表每克胃组织上Hp数目的对数值。

具体实施方式

以下通过附图及实施例对本发明作进一步说明。

本说明书中所提到的材料：

1.菌种，质粒和动物

(1)克隆用大肠杆菌Escherichia coli DH5a和表达质粒pET28a-CTB-UE是本实验室保存；(2)表达用乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000和穿梭表达载体pCYT-NUC；(3)幽门螺杆菌悉尼株Hp SS1为本实验室保存菌种；(4)ICR清洁级小鼠，雄性，6～8周龄，购买自扬州大学比较医学中心，许可证号为SOXR(苏)2012-0004。

2.酶、试剂和主要仪器

(1)分子克隆工具酶为加拿大Fermentas公司产品；(2)质粒抽提试剂盒、PCR胶回收试剂盒、DNA产物纯化试剂盒和DAB显色试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品；(3)诱导剂Nisin为浙江银象生物公司产品；(4)酶标仪、电击转化仪等美国Bio-Rad公司产品；PCR仪为德国Eppendorf公司产品。

3.培养基

(1)LB培养基，配方如下：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化钠，加蒸馏水至1000ml，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌；如是LB固体培养基，高压灭菌前再加入1.5g琼脂粉／100ml LB培养液。(2)GM17培养基，配方如下：称取大豆胨5.0g，蛋白胨2.5g，酪蛋白胨2.5g，酵母浸粉2.5g，牛肉粉5.0g，乳糖5.0g，抗坏血酸钠0.5g，β-甘油磷酸钠19.0g，硫酸镁0.25g，加蒸馏水至1000ml，调整pH值至7.2，灭菌后临用前加入已灭菌的25g／ml的葡萄糖；若是GM17固体培养基高压灭菌前再加入1.5g琼脂粉／100ml GM17培养液。(3)BHI血平板：称取3.5gBHI干粉，加蒸馏水93ml，1.5g琼脂粉，高压灭菌13min，待冷却至60℃以下，加入7ml脱纤维羊血，多粘菌素B(终浓度5μg／ml)，万古霉素(终浓度10μg/ml)和甲氧苄氨嘧啶(终浓度5μg／ml)，分装至培养皿，冷却后备用培养幽门螺杆菌。

本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、限制性内切酶酶切、DNA片段的回收、连接、化学转化大肠杆菌和电击转化乳酸乳球菌，这些都是基因工程研究领域的常规操作方法，具体参见Sambrook J，FristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，PP.16-340。

4.抗体

(1)鼠抗CTB-UE多克隆抗体血清为本实验室制作并保存，用作WesternBlotting一抗；(2)山羊抗鼠HRP标记的二抗为Jackson ImmunoResearch公司产品，用作Western Blotting二抗。

5.酶连免疫吸附实验(ELISA)试剂

(1)包被液：0.05mol／L碳酸盐缓冲液(pH9.6)。称取0.75g碳酸钠，1.46g碳酸氢钠，加去离子水定容至500ml。(2)PBS缓冲液：0.02mol／L磷酸盐缓冲液(pH7.4)。称取0.2g磷酸二氢钾，2.90g磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容到1000ml。(3)抗体稀释液：0.02mol／L PBS(pH7.4)和0.2％BSA。称取0.2g BSA加入配好的0.02mol／L磷酸盐缓冲液溶解定量至100ml。(4)封闭液：0.05mol／L碳酸盐缓冲液(pH9.6)和2.0％BSA。2.0g BSA加配好的0.05mol／L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml。(5)洗涤液：0.02mol／L PBS(pH7.4)和0.05％Tween-20。将50ul Tween-20溶入100ml0.02mol／L磷酸盐缓冲液中，震荡混匀。(6)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液(天根生化)。(7)终止液：2mol／LH₂SO₄溶液。10ml98％浓硫酸加入60ml双蒸水中，定容至100ml，室温保存。

6.快速尿素酶检测试剂

配方：2％尿素，0.04％酚红，0.04％NaH₂PO₄·H₂O，0.1％磷酸氢二钠，pH为6.0，临用前配制。

实施例1SP-CTB-UE基因的克隆

本步利用PCR技术，共涉及4条引物P1、P2、P3和P4，分3次在CTB-UE上游融合信号肽基因SP。首先利用P1和P4为上下游引物从模板质粒pET28a-CTB-UE上扩增获得目的基因CTB-UE，并在其上游延长25bp；然后再利用P2和P4为上下游引物以上次产物为模板再次PCR延长，得到第二次产物；最后利用P3和P4为上下游引物以第二次产物为模板PCR扩增得到产物SP-CTB-UE(SCE)。将SCE基因替换pCYT-NUC表达载体中NUC基因，得到重组表达载体pCYT-SCE。四条引物序列如下，P1：5′-AGCCCCGTTGTCAGGTGTTTACGCTATGGGCACACCTCAAAATATTACTG-3′；P2：5′-ATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCTGCTGCAGCCCCGTTGTCAGGTGTTTACGCT-3′；P3：5′-CCAATGCATATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTT-3′含保护碱基及Nsi I酶切位点(下划线所示)；P4∶5′-CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG-3′含保护碱基，Xho I酶切位点(下划线所示)及6×His tag序列(斜体所示)。

引物由上海生工生物有限公司合成。PCR反应按如下条件进行：每步反应中上下引物都按1∶1比例混合，反应程序设置为94℃，30s；60℃，45s；72℃，1min；共35个循环。2.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物(参见图3)，条带位置与预期的868bp、900bp和930bp一致。

最后一次PCR产物经切胶回收获得的目的基因片段和pCYT-NUC质粒分别经Nsi I和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因片段与载体基因片段后用T₄DNA连接酶4℃连接过夜，转化至Ecoli DH5a感受态细胞后涂布到含10μg／ml氯霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，挑取单菌落，酶切方法初筛阳性克隆，将阳性克隆送至上海生工生物公司进行测序，测序结果经软件比对后完全正确(参见图5和图6)，至此融合蛋白基因在大肠杆菌中构建完成。

实施例2重组质粒pCYT-SCE经电击转化导入乳酸乳球菌感受态细胞

乳酸乳球菌感受态细胞制备的过程大致如下：将保存菌种涂布GM17平板，30℃过夜培养挑单克隆至5ml GM17液体试管静置培养过夜(目的是活化菌种)，次日以1∶100比例接种至含有1.5～3.0％甘氨酸的GM17液体培养基摇瓶中，培养至OD600值约为0.6时，整个摇瓶放置冰浴中1h，之后4℃低速离心，时间为15min，无菌操作弃去上清，用预冷的电转缓冲液洗涤细胞沉淀两次，操作同上。电转化过程如下：将感受态细胞和重组质粒pCYT-SCE混合均匀后加入电击杯，加盖后将电击杯整个放入电转化仪槽子内进行瞬时电击。设置电击参数分为：电压1～3kV，脉冲时间为4～6ms。电击过后，30℃静置恢复培养1～4h，然后涂布适量菌液至含氯霉素的GM17平板上筛选阳性克隆。至此我们成功获得含有目的融合蛋白基因的乳酸乳球菌菌株。

实施例3诱导重组乳酸乳球菌菌株表达融合蛋白CTB-UE

挑选高活性菌株，接种于GM17培养基中，30℃过夜培养；过夜培养液1∶100转接A.GM17培养基，30℃扩大培养，待菌生长至OD值为0.4～0.7时加入诱导剂Nisin，继续培养3h，收菌制备蛋白样品。将乳酸菌培养液在4℃条件下12000rpm离心5min，分为上清组和沉淀组。从上清组中提纯蛋白采用三氯醋酸／丙酮沉淀洗涤法，最后得到的蛋白沉淀用适量1×loading buffer溶解；从沉淀组提取蛋白采用超声波破碎裂解法，裂解后低温离心取上清向其中加入适量5×loadingbuffer。两组样品均冻存至-20℃备上样检测。

实施例4融合蛋白疫苗的Western Blotting鉴定

融合蛋白样品中Hp多表位疫苗CTB-UE的Western Blotting鉴定方法如下：将制备好蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，至溴酚蓝刚跑出胶板停止电泳，剥胶，切胶至合适大小，根据胶的大小裁剪聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，针对约为35kDa的蛋白，稳流转膜1h，蛋白质转移至PVDF膜上后，用5～10％的脱脂牛奶封闭液4℃封闭过夜。将PVDF膜取出后封于孵育袋中，于膜正面加入稀释后的一抗(鼠抗CTB-UE多克隆抗体)，排气泡后封口，4℃孵育过夜，将膜取出，TBST(pH7.6，100mM Tris.HCl，0.9％NaCl，0.1％tween-20)洗三次，每次10min。再用稀释后的二抗(辣根过氧化物酶标记的上羊抗鼠IgG)37℃孵育，TBST洗三次，每次10min，取出NC膜进行DAB显色观察结果(如图7)，蛋白条带位置与预期的分子量约33.6kD和35kD一致。

实施例5用于免疫效果评价的动物实验

动物实验总体流程为预防性免疫，采血，造模和杀鼠。预防性免疫共进行6次，每次按照10μl／g的剂量进行，第一周连续免疫3次，随后3周每周进行一次免疫；在末次免疫多周后进行小鼠眼眶静脉丛采血，每只小鼠取适量全血，室温静置1h后可见有血清析出，然后3000rpm离心10min，吸取上清后分装冻存至-70℃备测抗体IgG；在末次免疫多周后开始造Hp感染模型，隔天进行1次Hp灌胃攻毒，共进行5次，末次攻毒多周后，引颈处死小鼠后无菌操作取胃组织，沿胃大弯纵切将胃等分两份，除去内容物后剪碎备用。

实施例6以乳酸乳球菌为载体的Hp多表位疫苗CTB-UE诱发抗尿素酶特异性抗体的检测

将天然Hp尿素酶用包被液稀释成5～20u g／ml，100μl／孔包被ELISA板，4℃过夜。用洗涤液洗4次后，每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h。用洗涤液洗4次后，将抗血清(含pCYT-SCE重组菌免疫小鼠抗血清、含空载pCYT菌小鼠抗血清)和PBS组小鼠阴性血清倍比稀释后加入ELISA板，100μl／孔，在37℃下孵育60min。用洗涤液洗4次后，加入二抗HRP标记的羊抗鼠IgG，100μl／孔，在37℃下孵育。用洗涤液洗4次后，加入TMB底物显色液，室温避光反应15min，加终止液终止反应。用酶标仪测定各孔OD450值。结果：通过ELISA检测，以乳酸乳球菌为载体的Hp多表位疫苗CTB-UE能够产生较高水平的抗尿素酶抗体，而空载乳酸菌免疫组和PBS组不能产生抗天然尿素酶抗体。

实施例7以乳酸乳球菌为载体的Hp多表位疫苗CTB-UE的药效学评价

预防性免疫和Hp感染造模过后，以乳酸乳球菌为载体的Hp多表位疫苗CTB-UE的药效学评价主要分为两个方面：小鼠胃部尿素酶活性考察和小鼠胃部幽门螺杆菌的定植数考察。(1)尿素酶活性考察：称取相同重量的一份剪碎的胃组织加入到尿素酶快速检测试剂反应液，室温孵育3h待反应完全，Hp尿素酶的活性大小可根据反应液颜色深浅反映，吸取反应液加入96孔板用酶标仪测OD550值。(2)Hp定植数考察：将剪碎后的另一份胃组织加入PBS，用匀浆器匀浆均匀，随后用PBS倍比稀释成多个稀释度，分别吸取100u l涂布BHI血平板，37℃厌氧培养后进行菌落计数，并取平均值。结果：以乳酸乳球菌为载体的Hp多表位疫苗CTB-UE能有效抑制胃部Hp尿素酶活性且能显著减少胃部Hp定植目。

除上述事实外，本发明还可以有其他实施方式，凡采用等同替换或等效变换性的技术方案，均落于本发明要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种重组乳酸乳球菌，是将信号肽SP基因融合至幽门螺杆菌多表位疫苗CTB-UE的编码基因上游后通过重组质粒导入乳酸乳球菌得到的重组菌；所述乳酸乳球菌为Lactococcus lactis NZ9000基因工程疫苗株；所述信号肽SP和幽门螺杆菌多表位疫苗CTB-UE的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

2.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于：所述信号肽SP和幽门螺杆菌多表位疫苗CTB-UE的融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

3.根据权利要求2所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于：所述信号肽SP和幽门螺杆菌多表位疫苗CTB-UE的融合蛋白的编码基因通过重组质粒导入乳酸乳球菌。

4.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于：所述的重组乳酸乳球菌经培养表达后进行全菌蛋白质免疫印迹实验(Western Blotting)，可与鼠源抗CTB-UE多克隆抗体血清等产生阳性反应，表明该融合蛋白在重组乳酸乳球菌中成功表达，并具备免疫原性。

5.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌，其特征在于：所述的重组乳酸乳球菌能激发机体产生较高滴度的尿素酶特异性抗体，并能有效抑制幽门螺杆菌尿素酶活性和显著减少幽门螺杆菌在胃部的定植数目。

6.一种以乳酸乳球菌为载体的抗幽门螺杆菌疫苗，它的活性成分为权利要求1-3中任一所述的重组乳酸乳球菌。

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