CN112190703A

CN112190703A - 靶向m细胞的gem颗粒表面展示系统、颗粒疫苗及制备方法与应用

Info

Publication number: CN112190703A
Application number: CN202011088313.9A
Authority: CN
Inventors: 郭乐; 刘昆梅; 王淑娥; 何萌; 李欣; 楚元奎
Original assignee: Ningxia Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University
Priority date: 2020-10-13
Filing date: 2020-10-13
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2040-10-13
Also published as: CN112190703B

Abstract

本申请提供了靶向黏膜M细胞的GEM颗粒表面展示系统、颗粒疫苗及制备方法与应用，属于生物医学及生物工程领域。本申请提供的靶向黏膜M细胞的GEM颗粒表面展示系统，可表达多种来源不同的疫苗抗原，用于制备GEM颗粒疫苗，提高口服类疫苗在胃肠道的免疫效果；用该GEM颗粒表面展示系统制备的幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗具有较好的抗原表面展示和胃肠道M细胞靶向投递的性质，很好的诱导胃肠道系统产生特异性免疫应答，抑制幽门螺旋杆菌对胃肠道的破坏，起到防治幽门螺旋杆菌相关性胃病的目的。

Description

靶向M细胞的GEM颗粒表面展示系统、颗粒疫苗及制备方法与应用

技术领域

本申请涉及生物医学及生物工程领域，具体而言，涉及靶向黏膜M细胞的GEM颗粒表面展示系统、颗粒疫苗及制备方法与应用。

背景技术

胃肠道黏膜是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线。口服类疫苗可刺激胃肠道黏膜下丰富的淋巴组织，诱导黏膜免疫反应和全身免疫反应，直接切断病原微生物入侵机体的途径，非常具有吸引力。然而，口服类疫苗的免疫原性一般较弱，需使用大量抗原多次接种，且免疫应答持续时间较短，容易产生免疫耐受。研制口服类疫苗成功的关键在于“设计一种有效的黏膜投递策略，长期稳定地将抗原投递给黏膜免疫诱导位点，激发高水平免疫应答”。微皱褶细胞（M细胞）是胃肠道黏膜免疫系统中一种特化的抗原转运细胞，散布于黏膜上皮细胞间，能将抗原从胃肠腔内转运到上皮下的淋巴组织，诱导黏膜免疫反应。M细胞是胃肠道黏膜免疫系统的“入口”，其对抗原的摄取是启动胃肠黏膜免疫应答关键的第一步。因此，“抗原能否被M细胞大量摄取”是口服类疫苗免疫成败的关键所在。利用“与M细胞表面受体相结合的M细胞靶向肽”，将抗原靶向递呈给M细胞，增加其对抗原的摄取和转运效率，激发高水平黏膜免疫应答，是一种提高口服类疫苗免疫效果的有效策略。

直接口服疫苗抗原，免疫效果往往甚微，其中主要原因是：胃肠道中的大量酸液，会破坏疫苗抗原。黏膜免疫投递系统可避免胃酸对抗原的降解，且具有良好的黏膜佐剂效应，可协助口服类疫苗诱导长期稳定的黏膜免疫应答，是口服类疫苗研究的一个热点。乳酸菌是在人体肠道内一群常见的益生菌，属于食品级微生物，具有无内毒素、安全性好、遗传背景清楚等优点。利用细菌表面展示技术将抗原展示在乳酸菌表面，更符合黏膜疫苗的免疫要求；因此，乳酸菌表面展示系统是黏膜投递系统研究的一个焦点。锚定蛋白是细菌表面展示技术中的核心组件。N-乙酰胞壁质酶（AcmA）是在乳酸菌表面展示系统中常用的一种锚定蛋白。然而，在胞内表达的AcmA往往跨膜转运活性不强。基于AcmA设计更为有效的乳酸菌细胞表面展示系统，仍是一项亟待研究的工作。

幽门螺旋杆菌（Hp）是胃炎、胃溃疡和胃癌的重要致病因子，世界感染率超过50%，我国Hp感染率高达58.07%，且呈现明显的家庭聚集性，形式更加严峻。目前，临床治疗Hp感染性胃病的方法主要是多联抗生素疗法，但是面临着抗生物导致Hp耐药性、治疗后再感染、抗生素破坏肠道微生态平衡、药物毒副作用和病人依从性差等问题，难以在Hp感染人群中大规模推广使用，研发有效的Hp疫苗具有很好的应用前景。

发明内容

本申请的第一方面，公开了靶向黏膜M细胞的GEM颗粒表面展示系统，其特征在于，所述GEM颗粒表面展示系统包括核心组件SAM^E，所述核心组件SAM^E包括His标签、N-乙酰胞壁质酶C末端肽聚糖结合区cA、多克隆位点MCS和M细胞杂合肽Mtp构成；核心组件SAM^E的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述核心组件SAM^E的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本申请的第二方面，公开了前述靶向黏膜M细胞的GEM颗粒表面展示系统在制备GEM颗粒疫苗中的应用。

在实施例中，上述GEM颗粒表面展示系统可以用于多种疫苗抗原的表达，获得的重组抗原可有效地表面展示在食品级乳酸菌表面，且可赋予重组抗原靶向投递M细胞的性质，增强疫苗抗原的黏膜免疫效果。

GEM颗粒表面展示技术是一种基于革兰氏阳性增强基质颗粒（即GEM颗粒）的非活性、非遗传修饰的新型乳酸菌表面展示技术，称之为GEM颗粒表面展示技术，又叫细菌样颗粒表面展示技术。GEM颗粒表面展示技术主要利用热酸处理乳酸菌，去除蛋白质和核酸等大分子物质，制备仅含有细胞壁肽聚糖骨架的空心颗粒，叫革兰氏阳性菌增强基质颗粒（GEM颗粒）；将高纯度疫苗抗原与GEM颗粒混合，疫苗抗原通过与其偶联的锚定蛋白展示在GEM颗粒表面，制备的疫苗叫GEM颗粒疫苗，又叫细菌样颗粒疫苗。

本申请的第三方面，公开了一种幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE，幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗GEM-SAME-WAE包括在GEM颗粒表面展示的重组抗原SAM^E-WAE；重组抗原SAM^E-WAE含有核心组件SAM^E和幽门螺旋杆菌多表位肽WAE。

幽门螺旋杆菌关键毒力和黏附因子主要有尿素酶、黏附素HpaA、热休克蛋白HSP60、中性粒细胞激活蛋白NAP等。目前国内外尚无上市可用的Hp疫苗，全菌疫苗或亚单位疫苗，存在毒副作用、免疫特异性不高、保护性较低等问题。表位疫苗是一种新型疫苗，较之传统疫苗具有高安全性、高特异性和设计灵活等优势，是发展Hp疫苗尤其治疗性Hp疫苗的新策略。Hp多价表位疫苗CWAE主要含有来自Hp关键黏附和毒力因子（尿素酶、HpaA和HSP60）的优势抗原表位或区段、中性粒细胞激活蛋白NAP和霍乱毒素B亚基（CTB），研究已证实Hp多价表位疫苗CWAE具有很好的防治Hp感染的免疫效果。

幽门螺旋杆菌多表位肽WAE是来自Hp多价表位疫苗CWAE中除去CTB的多表位肽部分，主要包含来自Hp关键黏附和毒力因子（尿素酶、HpaA和HSP60）的优势抗原表位或区段，可刺激机体产生针对幽门螺旋杆菌关键黏附和毒力因子的T细胞免疫应答和特异性体液免疫应答。在实施例中，幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE具有以下特点：（1）在GEM颗粒表面展示有重组抗原SAM^E-WAE；重组抗原SAM^E-WAE含有核心组件SAM^E和幽门螺旋杆菌多表位肽WAE。（2）GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE表面展示的重组抗原SAM^E-WAE具有M细胞靶向的性质，可增加M细胞对重组抗原SAM^E-WAE的摄取量和转运效率，增强了重组抗原SAM^E-WAE的胃肠道黏膜免疫效果。（3）GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE可激发机体产生针对幽门螺旋杆菌多种关键毒力和黏附因子的特异性黏膜免疫应答。

在前述的第三方面的一些实施例中，幽门螺旋杆菌多表位肽WAE的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；幽门螺旋杆菌多表位肽WAE的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在前述的第三方面的一些实施例中，重组抗原SAM^E-WAE的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述重组抗原SAM^E-WAE的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本申请的第四方面，公开了上述的幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗在制备防治幽门螺旋杆菌相关性疾病的药物的用途。

在实施例中，将上述的疫苗制备成相应的疫苗制剂等，可以应用于防治幽门螺旋杆菌相关性胃病。

本申请的第五方面，公开了幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗的制备方法，制备方法包括以下步骤：

合成如序列SEQ ID NO.2所示的SAM^E片段，将SAM^E片段通过酶切和连接，克隆到pCzn1载体上，得到peSAM^E重组载体；

合成如序列SEQ ID NO.4所示的WAE片段，双酶切WAE片段和peSAM^E重组载体；回收得到peSAM^E重组载体线性化片段，与WAE片段连接得到peSAM^E-WAE重组载体；

将peSAM^E-WAE重组载体转化进表达宿主细胞，通过培养和诱导剂诱导表达，纯化得到重组抗原SAM^E-WAE；

通过三氯乙酸制备乳酸菌的GEM颗粒，将制备的GEM颗粒和重组抗原SAM^E-WAE混合重悬，得到GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE。

在实施例中，通过基因合成，然后酶切连接的方式，将表达重组抗原SAM^E-WAE的基因序列依次连接到克隆到pCzn1载体上，然后通过转化进宿主细胞，进行诱导表达；最后与乳酸菌的GEM颗粒混合制备得到GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE。制备得到靶向效率更高的疫苗颗粒。

在前述第五方面的一些实施例中，SAM^E片段和pCzn1载体选择的双酶切位点为NdeI/Hind III，WAE片段和peSAM^E重组载体选择的双酶切位点为KpnⅠ和XbaⅠ。

在实施例中，通过不同的酶切位点的选择和组合，就能将相应基因按照设计的顺序连接整合。

在前述第五方面的一些实施例中，表达宿主细胞为大肠杆菌；

优选地，大肠杆菌选自ArcticExpress (DE3)，DH5α，TOP10，BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS或Rosetta；

进一步优选地，大肠杆菌为ArcticExpress (DE3)。

在实施例中，蛋白表达的宿主细胞有多种，本实施例中优选大肠杆菌中的ArcticExpress (DE3)菌株进行表达。

通过大肠杆菌的表达系统，能快速高效的表达出目的蛋白，提高重组蛋白的收率和质量。

在前述第五方面的一些实施例中，纯化重组蛋白包括柱层析和透析；柱层析选用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；透析的透析液为20 mM Tris-HCl，0.10 M NaCl，pH8.0的透析液。

在实施例中，通过亲和层析和透析的处理，不仅能提高重组蛋白的浓度和质量，还能通过透析等方法，除去蛋白中的一些毒素。提高了蛋白的浓度，能提高蛋白的免疫效果，透析除去毒素，能提高的蛋白的安全性。

与现有技术相比，本申请的有益效果为：本申请提供的靶向黏膜M细胞的GEM颗粒表面展示系统，可表达多种来源不同的疫苗抗原，用于制备GEM颗粒疫苗，提高口服类疫苗在胃肠道的免疫效果；用该GEM颗粒表面展示系统制备的幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗具有较好的抗原表面展示性质和胃肠道M细胞靶向投递的性质，很好的诱导胃肠道系统产生特异性免疫应答，抑制幽门螺旋杆菌对胃肠道的破坏，起到防治幽门螺旋杆菌相关性胃病的目的。

附图说明

图1是实施例1中大肠杆菌质粒peSAM^E的示意图。

图2是实施例1中大肠杆菌质粒peSAM^E的双酶切电泳图。

图3是实验例2中大肠杆菌质粒peSAM^E-WAE的双酶切电泳图。

图4是实验例3中大肠杆菌E. coli-peSAM^E-WAE的诱导表达结果图。

图5是实验例4中对GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE的抗原表面展示性质鉴定图。

图6是实验例5中GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE的M细胞靶向性鉴定图。

图7是实验例6中GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE免疫治疗幽门螺旋杆菌感染效果图。

图8是实验例7中GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE免疫治疗后诱导小鼠产生抗体的示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

材料

1. IPTG溶液：称取1.2g IPTG置于50mL离心管中，加入40mL无菌水，充分混匀溶解后，定容至50mL。用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装，-20℃保存。

2. 氨苄青霉素（Amp）贮液（100 mg/mL）：称取100mg 氨苄青霉素（Amp）溶于1mL无菌水，制得浓度为100mg/mL 的贮存液，通过0.22µm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。

3. LB培养基：（1）LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl，加蒸馏水至1000mL，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。（2）LB固体培养基：1.5g琼脂粉/100ml LB培养液，高压灭菌后，倾倒平板。

4. DNA电泳缓冲液（50×TAE）：称取242g Tris、37.2g Na2EDTA·2H2O和57.1mL冰乙酸，加水至1000mL，使用时稀释50倍。

5. SDS-PAGE电泳缓冲液（5×）：称取Tris粉末15.1g、甘氨酸 94g、SDS 5.0g；加入约800mL的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1L，室温保存；注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。

6. 考马斯亮蓝蛋白染色试剂：（1）考马斯亮蓝R-250染液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250ml脱色液中。（2）固定液：500mL乙醇、100mL冰醋酸用蒸馏水稀释至1000mL。（3）脱色液：250mL乙醇、80mL冰醋酸用蒸馏水稀释至1000mL。（4）保存液：25mL 87%甘油溶于225mL脱色液中。

7. 实验动物：BALB/c小鼠为SPF级，雄性，8～10周龄，购自宁夏医科大学实验动物中心。

8. ELISA试剂：（1）包被液：1.6g Na₂CO₃，2.9g NaHCO₃，0.2g NaN₃，加双蒸水至1L，调pH值至9.6。（2）洗涤液：分别称取0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄∙12H₂O，8.0g NaCl，0.2gKCl，0.5mL Tween-20，加入ddH₂O定容至1000 mL（PBST）。（3）封闭液：称取3.0g BSA溶解于100mL洗涤缓冲液中，过滤除菌后4℃保存。（4）底物液：可溶性单组份TMB底物溶液。（5）终止液：量取蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7mL（1M H₂SO₄）。

9. BHI血平板：称取3.5g BHI干粉，加蒸馏水93mL，1.5g 琼脂粉，121℃灭菌13min，待冷却至60℃以下，加入7mL脱纤维羊血，多粘菌素B(终浓度5μg/mL)，万古霉素（终浓度10μg/mL）和甲氧苄氨嘧啶（终浓度5μg/mL），分装至培养皿，冷却后备用。

以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1：大肠杆菌质粒peSAM^E的构建

根据核心组件SAM^E的氨基酸序列SEQ ID NO.1，设计优化其编码基因并合成核心组件SAM^E的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

提取pCzn1载体质粒，并用Nde I/Hind III双酶切pCzn1载体质粒和核心组件SAM^E； 37℃，2 h；利用DNA回收试剂盒回收SAM基因和pCzn1双酶切产物。将回收的pCzn1线性化载体和SAM^E基因盘点通过互补的粘性末端，在T4 DNA 连接酶的作用下连接成闭合环状的DNA分子，即形成大肠杆菌质粒peSAM^E。

大肠杆菌质粒peSAM^E的结构如图1所示，将连接完成的的质粒检测，通过双酶切并进行电泳检测，结果如图2所示，图中泳道1为大肠杆菌质粒peSAM^E，泳道2为双酶切的结果；双酶切结果与实际一致。送样进行测序，测序结果准确，且无移码突变。

实施例2：大肠杆菌重组质粒peSAM^E-WAE的构建

将得到的大肠杆菌重组质粒peSAM^E和合成的WAE基因片段分别用Kpn Ⅰ和Xbal双酶切；37℃，2 h；利用DNA回收试剂盒回收WAE基因和peSAM双酶切产物。将回收的peSAM^E线性化载体和WAE基因通过互补的粘性末端，在T4 DNA 连接酶的作用下连接成闭合环状的DNA分子，即形成大肠杆菌重组质粒peSAM^E-WAE。

将大肠杆菌重组质粒peSAM^E-WAE通过双酶切后进行电泳，结果如图3所示，图中泳道1为大肠杆菌重组质粒peSAM^E-WAE；泳道2为Nde Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后的大肠杆菌重组质粒peSAM^E-WAE；与实际一致。将获得的重组大肠杆菌重组质粒peSAM^E-WAE进行测序验证，结果显示构建的大肠杆菌重组质粒peSAM^E-WAE序列准确且无移码突变。

实施例3：重组抗原蛋白SAM^E-WAE的表达、纯化和检测

将大肠杆菌重组质粒peSAM^E-WAE转化进宿主细胞进行蛋白表达和纯化。

（1）E.coli-peSAM^E-WAE的诱导表达：将验证正确的重组表达质粒peSAM^E-WAE转化进大肠杆菌ArcticExpress (DE3)中。将阳性克隆子接种于含50μg/mL AMP的3 mL LB培养液的试管中，37℃，220 rpm，振摇过夜；次日，按1：100接种于50 μg/mL AMP的30 mL LB培养液中，37℃，220 rpm，振摇培养约2h，至菌体OD600为0.6-0.8；然后，加入IPTG至终浓度为0.5 mM，11℃，220 rpm，振摇过夜，诱导重组蛋白表达。

（2）SDS-PAGE检测E.coli-peSAM^E-WAE的表达情况：E.coli-peSAM^E-WAE经诱导表达后，取出1 mL培养物，10000g室温离心2 min，弃上清，用100 μL上样缓冲液重悬菌体沉淀；剩余培养物4000g，离心10 min，弃上清，用 PBS重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬，进行SDS-PAGE检测分析。

（3）重组抗原蛋白SAM^E-WAE的纯化：利用低压层析系统，包涵体溶液以0.5 mL/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDAWashing-Buffer以1 mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用Ni-IDA Elution-Buffer以1 mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20 mM Tris-HCl，0.10 M NaCl，pH8.0进行透析过夜，进行12% SDS-PAGE和Western Blot鉴定分析。

SDS-PAGE检测结果如图4a所示，在约81 KD处出现目的蛋白条带，与重组蛋白SAM^E-WAE的理论值大小相符合。通过亲和柱层析纯化后，重组蛋白SAM^E-WAE的纯度可以达到97.63%，从图4b可以看出，纯化的效果较好。通过Western Blot检测的结果如图4c所示，Mouse anti-WAE可识别SAM^E-WAE，但正常血清不能识别SAM^E-WAE。

实施例4：GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE的制备及抗原表面展示性质的鉴定

通过三氯乙酸制备乳酸菌的GEM颗粒，将制备的GEM颗粒与纯化的重组抗原SAM^E-WAE混合重悬，制备GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE。

将GEM-SAM^E-WAE、GEM-SAM^E、SAM^E-WAE和GEM分别包被至ELSIA板，4℃过夜。洗4次后，加封闭液，300 μL/孔，37℃，2h。洗4次后，加Mouse anti-WAE（1:3000），100μL/孔，37℃，60 min。洗4次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1:10000），100μL/孔，37 ℃，60 min。洗4次后，加入TMB显色液，室温，10min，加100μL终止液，测定OD450值。

结果如图5所示，GEM-SAM^E-WAE和重组抗原SAM^E-WAE能够与Mouse anti-WAE发生特异性反应，但GEM-SAM^E和GEM不能与Mouse anti-WAE发生特异性反应，说明GEM-SAM^E-WAE表面展示有SAM^E-WAE抗原，GEM-SAM^E表面无SAM^E-WAE抗原。

实施例5：GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE的M细胞靶向性的鉴定

BALB/c小鼠禁食一晚（约12h），麻醉，打开腹部，将回肠中区约2cm长度结扎形成一个封闭的回肠袢，将100μL GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE和GEM颗粒注入回肠袢，约1h后，切除回肠袢，PBS反复冲洗三次后，用4%多聚甲醛固定。组织切片经3%山羊血清封闭后，接着分别与Rabbit anti-FVpE多克隆抗体和Goat anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 647)孵育。派氏淋巴结上的M细胞由Mouse anti-GP2 mAb (Alexa Fluor® 488)进行标记；细胞核由DAPI进行染色。

结果如图6所示，与对照GEM颗粒相比，GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE能结合到靶细胞，具有良好的M细胞靶向性质；而对照中均没有靶向结果。

实施例6：GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE治疗Hp感染效果的鉴定

（1）小鼠实验流程

实验分组： GEM-SAM^E-WAE免疫组、GEM-SAM^E免疫组、GEM颗粒免疫组；每组10只小鼠，共30只。

Hp感染小鼠模型的制备：各组小鼠分别于1、3、5、7天灌胃幽门螺旋杆菌，共计4次，每次300 μL /只，浓度为1×10¹⁰CFU/mL。

小鼠免疫：分别于15，22，29，36天免疫GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE、GEM-SAM^E和GEM，共计4次，每次300μL /只，浓度为1×10¹⁰ CFU/mL（即3×10⁹CFU）。

小鼠处死：在第50天将小鼠处死，取样进行检验。

（2）小鼠胃部Hp的定量培养检测

称取一定重量的小鼠胃组织，用生理盐水冲去内容物，在0.5 mL生理盐水中制备组织均浆液，吸取20 μL均浆液，按照1:10、1:100和1:1000倍稀释。每个稀释度各取100 μL均匀涂布在BHI血平板上，37 ℃，微需氧培养3~5天。用细菌革兰氏染色和过氧化氢触酶等方法鉴定Hp菌落。对鉴定为阳性的Hp菌落进行计数，菌落计数换算成每克胃组织菌落形成单位数（CFU/g），计算公式为：Hp定植密度=Hp菌落数×稀释度/胃重量。

（3）小鼠胃部组织病理学检测：

HE染色：用石蜡包埋经10%甲醛固定的小鼠胃组织，切成约6 μm厚的组织切片，HE染色观察胃组织炎症情况，并进行组织病理学评分。

评分标准如下：

无明显可见白细胞（淋巴细胞和中性粒细胞）浸润为0分；

在胃粘膜固有层深部有少许散在白细胞浸润为1分；

在胃粘膜深部至中部固有层有中等程度白细胞浸润为2分；

在胃粘膜深部至中部固有层有大量白细胞浸润，少量微脓肿为3分；

在胃粘膜固有层全层至黏膜下层有严重弥散性白细胞浸润，微脓肿较多为4分。

免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡后，经正常山羊血清封闭，室温，10min；滴加适当比例稀释的Rabbit anti-Hp，37℃，1h；经洗涤后，滴加羊抗兔IgG-HRP，37℃，10min；DAB显色，冲洗，复染，封片。

结果如图7所示，经GEM-SAM^E-WAE免疫治疗Hp感染的小鼠后，Hp定量培养和尿素酶活性检测，结果表明：GEM-SAM^E-WAE免疫组小鼠胃部的Hp定植数显著减少，尿素酶活性降低（图7a和图7b）；胃组织病理学实验结果表明：GEM-SAM^E和GEM免疫组小鼠的胃黏膜和胃黏膜下层有大量白细胞浸润，胃部炎症比较明显，有明显Hp定植；而GEM-SAM^E-WAE免疫组小鼠的胃部炎症显著减轻，无明显Hp定植（图7c、图7d和图7e）。

实施例7：GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE免疫治疗后小鼠特异性抗体的检测

Hp感染的小鼠经GEM-SAM^E-WAE免疫治疗后，处死，取血清1:1000稀释，取胃黏液和肠液1:5倍稀释。按100 μL/孔加入已包被Hp裂解液的ELISA板，37 ℃，60 min。洗4次后，加入HRP标记羊抗鼠IgG或IgA（1:10000），100 μL/孔，37 ℃，60 min。洗4次后，加入TMB显色液，室温避光10 min，加100 μL终止液，测定OD₄₅₀值。

结果如图8所示，其中图8a为血清IgG抗体检测，图8b为血清IgA抗体检测，图8c为黏膜sIgA抗体检测。Elisa实验结果表明GEM-SAM^E-WAE免疫组小鼠能产生Hp特异性IgG、IgA和sIgA；然而，GEM-SAM^E和GEM免疫组小鼠不能够产生Hp特异性IgG、IgA和sIgA（图8a、图8b和图8c）。

综上可以看出，本发明提供的GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE能通过投递系统将表位肽投送到靶标位置，并诱导机体产生相应的抗体，并治疗有幽门螺旋杆菌感染引起的疾病；具有较强的特异性。

以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁夏医科大学

<120> 靶向黏膜M细胞的GEM颗粒表面展示系统、颗粒疫苗及制备方法与应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asn His Lys Val His His His His His His Met Thr Thr Tyr Thr

1 5 10 15

Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Trp Gly Ile Ser Gln Arg Tyr Gly Ile

20 25 30

Ser Val Ala Gln Ile Gln Ser Ala Asn Asn Leu Lys Ser Thr Ile Ile

35 40 45

Tyr Ile Gly Gln Lys Leu Val Leu Thr Gly Ser Ala Ser Ser Thr Asn

50 55 60

Ser Gly Gly Ser Asn Asn Ser Ala Ser Thr Thr Pro Thr Thr Ser Val

65 70 75 80

Thr Pro Ala Lys Pro Thr Ser Gln Thr Thr Val Lys Val Lys Ser Gly

85 90 95

Asp Thr Leu Trp Ala Leu Ser Val Lys Tyr Lys Thr Ser Ile Ala Gln

100 105 110

Leu Lys Ser Trp Asn His Leu Ser Ser Asp Thr Ile Tyr Ile Gly Gln

115 120 125

Asn Leu Ile Val Ser Gln Ser Ala Ala Ala Ser Asn Pro Ser Thr Gly

130 135 140

Ser Gly Ser Thr Ala Thr Asn Asn Ser Asn Ser Thr Ser Ser Asn Ser

145 150 155 160

Asn Ala Ser Ile His Lys Val Val Lys Gly Asp Thr Leu Trp Gly Leu

165 170 175

Ser Gln Lys Ser Gly Ser Pro Ile Ala Ser Ile Lys Ala Trp Asn His

180 185 190

Leu Ser Ser Asp Thr Ile Leu Ile Gly Gln Tyr Leu Arg Ile Lys Gly

195 200 205

Thr Thr Ser Ser Arg Cys Lys Ser Thr His Pro Leu Ser Cys Ser Phe

210 215 220

His Gln Leu Pro Ala Arg Ser Pro Leu Pro Ser Leu Asp Ala Gly Gln

225 230 235 240

Tyr Val Leu Val Met Lys Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Gly Asn Tyr Pro

245 250 255

Tyr Ser Ile Leu Phe Gln Lys Phe

260

<210> 2

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaatcaca aagtgcatca tcatcatcat catatgacta cttataccgt caaatctggt 60

gatactcttt ggggaatctc acaaagatat ggaattagtg tcgctcaaat tcaaagtgcg 120

aataatctta aaagtaccat tatctacatt ggtcaaaaac ttgtactgac aggttcagct 180

tcttctacaa attcaggtgg ttcaaacaat tccgcaagca ctactccaac cacttctgtg 240

acacctgcaa aaccaacttc acaaacaact gttaaggtta aatccggaga taccctttgg 300

gcgctatcag taaaatataa aactagtatt gctcaattga aaagttggaa tcatttaagt 360

tcagatacca tttatattgg tcaaaatctt attgtttcac aatctgctgc tgcttcaaat 420

ccttcgacag gttcaggctc aactgctacc aataactcaa actcgacttc ttctaactca 480

aatgcctcaa ttcataaggt cgttaaagga gatactctct ggggactttc gcaaaaatct 540

ggcagcccaa ttgcttcaat caaggcttgg aatcatttat ctagcgatac tattttaatt 600

ggtcagtatc tacgaataaa aggtaccact agttctagat gtaaatcaac acatccatta 660

tcatgttcat ttcatcaatt accagctcgt tcaccattac catcattaga tgctggtcaa 720

tatgttttag ttatgaaagc taattcatca tattcaggta attatccata ttcaatttta 780

tttcaaaaat tttga 795

<210> 3

<211> 480

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Lys Thr Phe Glu Ile Leu Lys His Leu Gln Ala Asp Ala Ile Val

1 5 10 15

Leu Phe Met Lys Val His Asn Phe His Trp Asn Val Lys Gly Thr Asp

20 25 30

Phe Phe Asn Val His Lys Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Glu Glu Phe Ala

35 40 45

Asp Met Phe Asp Asp Leu Ala Glu Arg Ile Val Gln Leu Gly His His

50 55 60

Pro Leu Val Thr Leu Ser Glu Ala Ile Lys Leu Thr Arg Val Lys Glu

65 70 75 80

Glu Thr Lys Thr Ser Phe His Ser Lys Asp Ile Phe Lys Glu Ile Leu

85 90 95

Glu Asp Tyr Lys Tyr Leu Glu Lys Glu Phe Lys Glu Leu Ser Asn Thr

100 105 110

Ala Glu Lys Glu Gly Asp Lys Val Thr Val Thr Tyr Ala Asp Asp Gln

115 120 125

Leu Ala Lys Leu Gln Lys Ser Ile Trp Met Leu Gln Ala His Leu Ala

130 135 140

Asp Pro Arg Val Pro Ser Ser Gly Ile Lys Leu Asn Tyr Val Glu Ala

145 150 155 160

Val Ala Leu Ile Ser Ala His Ile Met Glu Glu Ala Arg Ala Gly Lys

165 170 175

Lys Thr Gly Ile Lys Leu Asn Tyr Val Glu Ala Val Ala Leu Ile Ser

180 185 190

Ala His Ile Met Glu Glu Ala Arg Ala Gly Lys Lys Thr Ser Val Glu

195 200 205

Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn Arg Arg Ile Phe Gly Phe Asn Ala Leu

210 215 220

Val Asp Gly Ser Ser Val Glu Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn Arg Arg

225 230 235 240

Ile Phe Gly Phe Asn Ala Leu Val Asp Gly Ser Asp Pro Lys Arg Thr

245 250 255

Ile Gln Lys Lys Ser Gly Ser Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys Lys

260 265 270

Ser Gly Ser Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys Lys Ser Gly Ser Val

275 280 285

Glu Gly Met Gln Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Gly Ser

290 295 300

Val Glu Gly Met Gln Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Gly

305 310 315 320

Gly Gly Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr Ile Thr Pro

325 330 335

Gly Arg Arg Asn Leu Lys Trp Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ser

340 345 350

Met Asn Leu Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Ala Ser Asn Asp Ala Ser

355 360 365

Leu Ala Asp Gln Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu

370 375 380

Asp Trp Gly Thr Thr Pro Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala

385 390 395 400

Asp Lys Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Gly Ser Cys

405 410 415

His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp Ser

420 425 430

Arg Ile Arg Pro Gln Thr Ile Ala Ala Glu Asp Thr Leu His Asp Met

435 440 445

Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg Val

450 455 460

Gly Glu Val Ile Thr Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Asn Lys Lys

465 470 475 480

<210> 4

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaagacct ttgaaatcct gaaacacctg caagccgacg ccattgtcct gtttatgaaa 60

gtccacaact tccattggaa cgtgaaaggt acggactttt tcaacgtgca taaagccacc 120

gaagaaatct acgaagaatt cgctgatatg ttcgatgacc tggcggaacg cattgttcag 180

ctgggccatc acccgctggt cacgctgagc gaagcgatca aactgacccg tgttaaagaa 240

gaaaccaaga cgagctttca ctctaaagac atcttcaagg aaatcctgga agattacaag 300

tacctggaaa aggaattcaa ggaactgagc aataccgccg aaaaagaagg tgataaggtg 360

accgttacgt atgctgatga ccagctggcg aaactgcaaa agtctatttg gatgctgcag 420

gcacatctgg ctgatccgcg cgtgccgagc tctggtatca aactgaacta tgttgaagcg 480

gtcgccctga ttagtgccca catcatggaa gaagcacgtg ctggtaaaaa gaccggcatt 540

aaactgaatt acgtggaagc ggttgccctg atttcagcgc atatcatgga agaagcacgc 600

gctggtaaaa agacctcggt tgaactgatt gatatcggcg gtaaccgtcg catttttggt 660

ttcaatgctc tggtcgacgg cagttccgtg gaactgatcg acatcggcgg taatcgtcgc 720

atctttggtt tcaatgcact ggtcgatggc tctgacccga aacgtacgat tcagaaaaag 780

agcggttctg acccgaagcg caccatccag aaaaaatctg gctccgatcc gaaacgtacc 840

attcagaaaa agtcaggttc ggtggaaggc atgcaatttg atcgcggtta tctgtcaccg 900

tactttggtt cggttgaagg catgcagttc gaccgtggct atctgagtcc gtactttggc 960

ggtggcaccg gtccggcaga tggcacgaac gcaaccacga ttaccccggg tcgtcgcaat 1020

ctgaaatgga tgctgcgtgc ggccgaagaa tattccatga acctgggttt tctggcaaaa 1080

ggcaacgcta gtaatgacgc gtccctggcc gatcagattg aagcgggtgc cattggcttc 1140

aaaatccatg aagattgggg caccacgccg agcgcgatca atcacgccct ggatgtcgca 1200

gacaaatacg atgtccaagt ggccatccat accgacacgg gcagttgcca tcacctggat 1260

aaatccatta aggaagacgt gcagtttgca gattcacgta ttcgcccgca aacgatcgca 1320

gctgaagaca ccctgcacga tatgggcatt ttcagcatca cctcatcgga ttctcaggcg 1380

atgggtcgtg tcggcgaagt cattacgcgc acctggcaga cggcggataa aaacaagaag 1440

<210> 5

<211> 742

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Asn His Lys Val His His His His His His Met Thr Thr Tyr Thr

1 5 10 15

Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Trp Gly Ile Ser Gln Arg Tyr Gly Ile

20 25 30

Ser Val Ala Gln Ile Gln Ser Ala Asn Asn Leu Lys Ser Thr Ile Ile

35 40 45

Tyr Ile Gly Gln Lys Leu Val Leu Thr Gly Ser Ala Ser Ser Thr Asn

50 55 60

Ser Gly Gly Ser Asn Asn Ser Ala Ser Thr Thr Pro Thr Thr Ser Val

65 70 75 80

Thr Pro Ala Lys Pro Thr Ser Gln Thr Thr Val Lys Val Lys Ser Gly

85 90 95

Asp Thr Leu Trp Ala Leu Ser Val Lys Tyr Lys Thr Ser Ile Ala Gln

100 105 110

Leu Lys Ser Trp Asn His Leu Ser Ser Asp Thr Ile Tyr Ile Gly Gln

115 120 125

Asn Leu Ile Val Ser Gln Ser Ala Ala Ala Ser Asn Pro Ser Thr Gly

130 135 140

Ser Gly Ser Thr Ala Thr Asn Asn Ser Asn Ser Thr Ser Ser Asn Ser

145 150 155 160

Asn Ala Ser Ile His Lys Val Val Lys Gly Asp Thr Leu Trp Gly Leu

165 170 175

Ser Gln Lys Ser Gly Ser Pro Ile Ala Ser Ile Lys Ala Trp Asn His

180 185 190

Leu Ser Ser Asp Thr Ile Leu Ile Gly Gln Tyr Leu Arg Ile Lys Gly

195 200 205

Thr Met Lys Thr Phe Glu Ile Leu Lys His Leu Gln Ala Asp Ala Ile

210 215 220

Val Leu Phe Met Lys Val His Asn Phe His Trp Asn Val Lys Gly Thr

225 230 235 240

Asp Phe Phe Asn Val His Lys Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Glu Glu Phe

245 250 255

Ala Asp Met Phe Asp Asp Leu Ala Glu Arg Ile Val Gln Leu Gly His

260 265 270

His Pro Leu Val Thr Leu Ser Glu Ala Ile Lys Leu Thr Arg Val Lys

275 280 285

Glu Glu Thr Lys Thr Ser Phe His Ser Lys Asp Ile Phe Lys Glu Ile

290 295 300

Leu Glu Asp Tyr Lys Tyr Leu Glu Lys Glu Phe Lys Glu Leu Ser Asn

305 310 315 320

Thr Ala Glu Lys Glu Gly Asp Lys Val Thr Val Thr Tyr Ala Asp Asp

325 330 335

Gln Leu Ala Lys Leu Gln Lys Ser Ile Trp Met Leu Gln Ala His Leu

340 345 350

Ala Asp Pro Arg Val Pro Ser Ser Gly Ile Lys Leu Asn Tyr Val Glu

355 360 365

Ala Val Ala Leu Ile Ser Ala His Ile Met Glu Glu Ala Arg Ala Gly

370 375 380

Lys Lys Thr Gly Ile Lys Leu Asn Tyr Val Glu Ala Val Ala Leu Ile

385 390 395 400

Ser Ala His Ile Met Glu Glu Ala Arg Ala Gly Lys Lys Thr Ser Val

405 410 415

Glu Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn Arg Arg Ile Phe Gly Phe Asn Ala

420 425 430

Leu Val Asp Gly Ser Ser Val Glu Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn Arg

435 440 445

Arg Ile Phe Gly Phe Asn Ala Leu Val Asp Gly Ser Asp Pro Lys Arg

450 455 460

Thr Ile Gln Lys Lys Ser Gly Ser Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys

465 470 475 480

Lys Ser Gly Ser Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys Lys Ser Gly Ser

485 490 495

Val Glu Gly Met Gln Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Gly

500 505 510

Ser Val Glu Gly Met Gln Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe

515 520 525

Gly Gly Gly Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr Ile Thr

530 535 540

Pro Gly Arg Arg Asn Leu Lys Trp Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr

545 550 555 560

Ser Met Asn Leu Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Ala Ser Asn Asp Ala

565 570 575

Ser Leu Ala Asp Gln Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His

580 585 590

Glu Asp Trp Gly Thr Thr Pro Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val

595 600 605

Ala Asp Lys Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Gly Ser

610 615 620

Cys His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp

625 630 635 640

Ser Arg Ile Arg Pro Gln Thr Ile Ala Ala Glu Asp Thr Leu His Asp

645 650 655

Met Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg

660 665 670

Val Gly Glu Val Ile Thr Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Asn Lys

675 680 685

Lys Ser Arg Cys Lys Ser Thr His Pro Leu Ser Cys Ser Phe His Gln

690 695 700

Leu Pro Ala Arg Ser Pro Leu Pro Ser Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Val

705 710 715 720

Leu Val Met Lys Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Gly Asn Tyr Pro Tyr Ser

725 730 735

Ile Leu Phe Gln Lys Phe

740

<210> 6

<211> 2229

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaatcaca aagtgcatca tcatcatcat catatgacta cttataccgt caaatctggt 60

gatactcttt ggggaatctc acaaagatat ggaattagtg tcgctcaaat tcaaagtgcg 120

aataatctta aaagtaccat tatctacatt ggtcaaaaac ttgtactgac aggttcagct 180

tcttctacaa attcaggtgg ttcaaacaat tccgcaagca ctactccaac cacttctgtg 240

acacctgcaa aaccaacttc acaaacaact gttaaggtta aatccggaga taccctttgg 300

gcgctatcag taaaatataa aactagtatt gctcaattga aaagttggaa tcatttaagt 360

tcagatacca tttatattgg tcaaaatctt attgtttcac aatctgctgc tgcttcaaat 420

ccttcgacag gttcaggctc aactgctacc aataactcaa actcgacttc ttctaactca 480

aatgcctcaa ttcataaggt cgttaaagga gatactctct ggggactttc gcaaaaatct 540

ggcagcccaa ttgcttcaat caaggcttgg aatcatttat ctagcgatac tattttaatt 600

ggtcagtatc tacgaataaa aggtaccatg aagacctttg aaatcctgaa acacctgcaa 660

gccgacgcca ttgtcctgtt tatgaaagtc cacaacttcc attggaacgt gaaaggtacg 720

gactttttca acgtgcataa agccaccgaa gaaatctacg aagaattcgc tgatatgttc 780

gatgacctgg cggaacgcat tgttcagctg ggccatcacc cgctggtcac gctgagcgaa 840

gcgatcaaac tgacccgtgt taaagaagaa accaagacga gctttcactc taaagacatc 900

ttcaaggaaa tcctggaaga ttacaagtac ctggaaaagg aattcaagga actgagcaat 960

accgccgaaa aagaaggtga taaggtgacc gttacgtatg ctgatgacca gctggcgaaa 1020

ctgcaaaagt ctatttggat gctgcaggca catctggctg atccgcgcgt gccgagctct 1080

ggtatcaaac tgaactatgt tgaagcggtc gccctgatta gtgcccacat catggaagaa 1140

gcacgtgctg gtaaaaagac cggcattaaa ctgaattacg tggaagcggt tgccctgatt 1200

tcagcgcata tcatggaaga agcacgcgct ggtaaaaaga cctcggttga actgattgat 1260

atcggcggta accgtcgcat ttttggtttc aatgctctgg tcgacggcag ttccgtggaa 1320

ctgatcgaca tcggcggtaa tcgtcgcatc tttggtttca atgcactggt cgatggctct 1380

gacccgaaac gtacgattca gaaaaagagc ggttctgacc cgaagcgcac catccagaaa 1440

aaatctggct ccgatccgaa acgtaccatt cagaaaaagt caggttcggt ggaaggcatg 1500

caatttgatc gcggttatct gtcaccgtac tttggttcgg ttgaaggcat gcagttcgac 1560

cgtggctatc tgagtccgta ctttggcggt ggcaccggtc cggcagatgg cacgaacgca 1620

accacgatta ccccgggtcg tcgcaatctg aaatggatgc tgcgtgcggc cgaagaatat 1680

tccatgaacc tgggttttct ggcaaaaggc aacgctagta atgacgcgtc cctggccgat 1740

cagattgaag cgggtgccat tggcttcaaa atccatgaag attggggcac cacgccgagc 1800

gcgatcaatc acgccctgga tgtcgcagac aaatacgatg tccaagtggc catccatacc 1860

gacacgggca gttgccatca cctggataaa tccattaagg aagacgtgca gtttgcagat 1920

tcacgtattc gcccgcaaac gatcgcagct gaagacaccc tgcacgatat gggcattttc 1980

agcatcacct catcggattc tcaggcgatg ggtcgtgtcg gcgaagtcat tacgcgcacc 2040

tggcagacgg cggataaaaa caagaagtct agatgtaaat caacacatcc attatcatgt 2100

tcatttcatc aattaccagc tcgttcacca ttaccatcat tagatgctgg tcaatatgtt 2160

ttagttatga aagctaattc atcatattca ggtaattatc catattcaat tttatttcaa 2220

aaattttga 2229

Claims

1.一种靶向黏膜M细胞的GEM颗粒表面展示系统，其特征在于，所述GEM颗粒表面展示系统包括核心组件SAM^E，所述核心组件SAM^E包括His标签、N-乙酰胞壁质酶C末端肽聚糖结合区cA、多克隆位点MCS和M细胞杂合肽Mtp构成；核心组件SAM^E的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述核心组件SAME的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的靶向黏膜M细胞的GEM颗粒表面展示系统在制备GEM颗粒疫苗的应用。

3.幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE，其特征在于，所述幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗GEM-SAME-WAE包括在GEM颗粒表面展示的重组抗原SAM^E-WAE；所述重组抗原SAM^E-WAE含有核心组件SAM^E和幽门螺旋杆菌多表位肽WAE。

4.根据权利要求3所述的幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE，所述幽门螺旋杆菌多表位肽WAE的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述幽门螺旋杆菌多表位肽WAE的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求3所述的幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE，其特征在于，重组抗原SAM^E-WAE的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述重组抗原SAM^E-WAE的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。

6.如权利要求3-5任一项所述的幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗在制备防治幽门螺旋杆菌感染相关性胃病的药物的用途。

7.幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

合成如序列SEQ ID NO.2所示的SAM^E片段，将所述SAM^E片段通过酶切和连接，克隆到pCzn1载体上，得到peSAM^E重组载体；

合成如序列SEQ ID NO.4所示的WAE片段，双酶切所述WAE片段和所述peSAM^E重组载体；回收得到peSAM^E重组载体线性化片段，与所述WAE片段连接得到peSAM^E-WAE重组载体；

将所述peSAM^E-WAE重组载体转化进表达宿主细胞，通过培养和诱导剂诱导表达，纯化得到重组抗原SAM^E-WAE；

通过三氯乙酸制备乳酸菌的GEM颗粒，将制备的所述GEM颗粒和所述重组抗原SAM^E-WAE混合重悬，得到GEM颗粒疫苗GEM-SAM^E-WAE。

8.根据权利要求7所述幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述SAM^E片段和所述pCzn1载体选择的双酶切位点为Nde I/Hind III，所述WAE片段和所述peSAM^E重组载体选择的双酶切位点为KpnⅠ和XbaⅠ。

9.根据权利要求7所述幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述表达宿主细胞为大肠杆菌；

优选地，所述大肠杆菌选自ArcticExpress (DE3)，DH5α，TOP10，BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS或Rosetta；

进一步优选地，所述大肠杆菌为ArcticExpress (DE3)。

10.根据权利要求7所述幽门螺旋杆菌GEM颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，纯化重组蛋白包括柱层析和透析；所述柱层析选用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；所述透析的透析液为20 mM Tris-HCl，0.10 M NaCl，pH8.0的透析液。