CN112107682B - M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗及制备方法与应用，属于生物医学及生物工程领域。本申请提供的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗，主要将幽门螺旋杆菌多表位肽WAE连接进靶向M细胞的重组乳酸菌表面展示系统，转化进乳酸菌，制备出可防治幽门螺旋杆菌感染的重组乳酸菌疫苗。重组乳酸菌疫苗可表达含有核心组件SAM和多表位肽WAE的重组抗原SAM‑WAE，核心组件SAM可将重组抗原SAM‑WAE展示在乳酸菌表面，且将其靶向投递给胃肠道的M细胞，实现精准免疫，提高免疫效率，诱导胃肠道产生针对幽门螺旋杆菌的特异性黏膜免疫应答，起到防治幽门螺旋杆菌感染相关性胃病的目的。

Description

M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗及制备方法与应用
技术领域
本申请涉及生物医学及生物工程领域，具体而言，涉及M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗及制备方法与应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌（Hp）是胃炎、胃溃疡和胃癌的重要致病因子，世界感染率超过50%，我国Hp感染率高达58.07%，且呈现明显的家庭聚集性，形式更加严峻。目前，临床治疗Hp感染性胃病的方法主要是多联抗生素疗法，但是面临着抗生物导致Hp耐药性、治疗后再感染、抗生素破坏肠道微生态平衡、药物毒副作用和病人依从性差等问题，难以在Hp感染人群中大规模推广使用，研发有效的Hp疫苗具有很好的应用前景。Hp对人类胃部的感染，关键的第一步是通过黏附因子黏附胃黏膜细胞。幽门螺旋杆菌关键毒力和黏附因子主要有尿素酶、黏附素HpaA、热休克蛋白HSP60、中性粒细胞激活蛋白NAP等。Hp多价表位疫苗CWAE主要含有来自Hp关键黏附和毒力因子（尿素酶、HpaA和HSP60）的优势抗原表位或区段、中性粒细胞激活蛋白NAP和霍乱毒素B亚基（CTB），研究已证实Hp多价表位疫苗CWAE具有很好的防治Hp感染的免疫效果。
口服类疫苗的免疫原性一般较弱，需使用大量抗原多次接种，且免疫应答持续时间较短，容易产生免疫耐受。微皱褶细胞（M细胞）是胃肠道黏膜免疫系统中一种特化的抗原转运细胞，散布于黏膜上皮细胞间，能将抗原从胃肠腔内转运到上皮下的淋巴组织，诱导黏膜免疫反应。M细胞是胃肠道黏膜免疫系统的“入口”，其对抗原的摄取是启动胃肠黏膜免疫应答关键的第一步。因此，“抗原能否被M细胞大量摄取”是口服类疫苗免疫成败的关键所在。利用“与M细胞表面受体相结合的M细胞靶向肽”，将抗原靶向递呈给M细胞，增加其对抗原的摄取和转运效率，激发高水平黏膜免疫应答，是一种提高口服类疫苗免疫效果的有效策略。
口服类疫苗在激发胃肠道黏膜免疫应答和特异性细胞免疫应答具有一定优势，但是直接口服给药，疫苗效果往往甚微，其中主要原因是：胃肠道中存在大量的酸和蛋白水解酶，会破坏疫苗抗原。因此，研究安全有效的黏膜免疫投递系统是口服类疫苗研究领域的一个热点。乳酸菌是一群在人体肠道内的常见益生细菌，作为口服类疫苗的黏膜免疫投递系统，具安全性高等独特优势。另外，将抗原展示在乳酸菌表面更符合黏膜疫苗的要求。锚定蛋白是细菌表面展示技术中的核心组件。N-乙酰胞壁质酶（AcmA）是在乳酸菌表面展示系统中常用的一种锚定蛋白。然而，在胞内表达的AcmA往往跨膜转运活性不强。基于AcmA设计更为有效的乳酸菌细胞表面展示系统，仍是一项亟待研究的工作。
发明内容
本申请的第一方面，公开了M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗， M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗包括能将幽门螺旋杆菌多表位肽WAE展示到表面的、靶向黏膜M细胞的重组乳酸菌，幽门螺旋杆菌多表位肽WAE的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
重组乳酸菌表面展示系统主要是将乳酸菌作为一种工程菌，分泌表达疫苗抗原；疫苗抗原通过与其偶联的锚定蛋白，展示在乳酸菌表面，称之为重组乳酸菌疫苗。大量实验研究报道，多种病原体抗原已成功在乳酸菌中分泌表达并展示在乳酸菌表面，经胃肠道黏膜途径免疫可激发特异性黏膜免疫应答。
在实施例中，M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗可表达出含有核心组件和幽门螺旋杆菌多表位肽WAE的重组抗原，核心组件可将重组抗原靶向投递给胃肠道的M细胞，可刺激M细胞产生针对幽门螺旋杆菌的特异性免疫应答，达到防治幽门螺旋杆菌感染相关性胃病的目的。
在前述的第一方面的一些实施例中，编码幽门螺旋杆菌多表位肽WAE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
幽门螺旋杆菌多表位肽WAE主要含有对Hp关键黏附因子和毒力因子尿素酶A和B双亚基、黏附素HpaA、热休克蛋白HSP60和中性粒细胞激活蛋白NAP。
编码幽门螺旋杆菌多表位肽WAE是刺激靶细胞产生免疫反应的抗原物质，需要保证多表位肽的抗原性，保证多表位肽的序列表达翻译的准确；由于密码子的简并性，编码一个氨基酸可能是有几个密码子，因此编码一条多肽链的核苷酸序列有许多种的可能性。本实施例中优选编码幽门螺旋杆菌多表位肽WAE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在前述的第一方面的一些实施例中，M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗还包括核心组件SAM；核心组件SAM的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
核心组件SAM主要是通过生物信息学对筛选的M细胞靶向杂合肽Mtp、锚定蛋白AcmA的C末端肽聚糖结合区、多克隆位点MCS、信号肽SPusp45和前导肽Ps等元件的连接顺序而成，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在前述的第一方面的一些实施例中，编码核心组件SAM的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
由于编码氨基酸的密码子具有简并性，即编码一个氨基酸的弥漫着可能有几个；因此编码一条多肽链的核苷酸序列有许多种可能性，本实施例中优选采用核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的序列编码疫苗投递系统的核心组件SAM。
在前述的第一方面的一些实施例中，M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗包括靶向M细胞的重组抗原，重组抗原为重组抗原SAM-WAE，重组抗原SAM-WAE的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在实施例中，通过将幽门螺旋杆菌多表位肽WAE序列与核心组件SAM序列连接，表达获得重组抗原，通过重组抗原就能较好的诱导M细胞产生相应的抗体。
在前述的第一方面的一些实施例中，编码重组抗原SAM-WAE的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
本申请的第二方面，公开了前述M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗在制备防治幽门螺旋杆菌感染相关性胃病的药物中的应用。
M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗可以表达含有核心组件和幽门螺旋杆菌多表位肽WAE的重组抗原，可以实现M细胞的精准投递，刺激胃肠道产生针对幽门螺旋杆菌的特异性免疫应答，实现对幽门螺旋杆菌感染相关性胃病的免疫防治。
本申请的第三方面，公开了M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗的制备方法，制备方法包括以下步骤：
将如序列SEQ ID NO.4所示的核心组件SAM基因片段通过酶切和连接，克隆到pNZ8148载体上，得到plSAM重组载体；
将如序列SEQ ID NO.2所示的幽门螺旋杆菌多表位肽WAE基因片段和plSAM重组载体双酶切，回收线性化片段，连接幽门螺旋杆菌多表位肽WAE基因片段和plSAM重组载体线性化片段；得到plSAM-WAE重组载体；
将plSAM-WAE重组载体转化进表达宿主细胞，通过培养和诱导剂诱导表达，得到表达靶向黏膜M细胞的重组抗原SAM-WAE的重组乳酸菌。
在实施例中，通过将核心组件SAM基因片段连接到pNZ8148载体上，得到可靶向M细胞的重组乳酸菌表面展示系统。将幽门螺旋杆菌多表位肽WAE基因片段连接到重组乳酸菌表面展示系统，然后将重组载体转化进表达宿主细胞，经诱导后表达重组抗原SAM-WAE；重组抗原SAM-WAE可通过核心组件展示到宿主细胞表面，同时通过核心组件实现胃肠道M细胞的靶向投递，产生特异性黏膜免疫应答。
在前述第三方面的一些实施例中，表达宿主细胞为乳酸球菌；
优选地，乳酸球菌为NZ9000菌株。
在实施例中，乳酸菌作为一种肠道益生菌，通过乳酸菌不会引起肠道疾病，能保持肠道菌群的平衡。
在前述第三方面的一些实施例中，诱导剂为Nisin诱导剂，Nisin诱导剂的终浓度为1ng/mL。
Nisin，即乳酸链球菌素（亦称乳链菌肽），是一种天然生物活性抗菌肽，是利用生物技术提取的一种纯天然、高效、安全的多肽活性物质。
与现有技术相比，本申请的有益效果为：本申请提供的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗，主要将幽门螺旋杆菌多表位肽WAE连接进靶向M细胞的重组乳酸菌表面展示系统，转化进乳酸菌，制备出可防治幽门螺旋杆菌感染的重组乳酸菌疫苗。重组乳酸菌疫苗可表达含有核心组件SAM和多表位肽WAE的重组抗原，核心组件SAM可将多表位肽WAE展示在乳酸菌表面，且将其靶向投递给胃肠道M细胞，实现精准免疫，提高免疫效率，诱导胃肠道产生针对幽门螺旋杆菌的特异性黏膜免疫应答，起到防治幽门螺旋杆菌感染相关性胃病的目的。
附图说明
图1是实施例1中提供的重组质粒plSAM的示意图。
图2是实施例1中提供的重组质粒plSAM的酶切电泳图。
图3是实验例2中重组质粒测序结果图。
图4是实验例3中重组乳酸菌LL-plSAM-WAE的诱导表达结果图。
图5是实验例4中对重组乳酸菌LL-plSAM-WAE的抗原表面展示性能鉴定图。
图6是实验例5中重组乳酸菌LL-plSAM-WAE的M细胞靶向性鉴定图。
图7是实验例6中重组乳酸菌LL-plSAM-WAE免疫预防感染效果图。
图8是实验例6中重组乳酸菌LL-plSAM-WAE免疫预防后病理学检测示意图。
图9是实验例7中重组乳酸菌LL-plSAM-WAE免疫预防后小鼠产生抗体的示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
材料
1. IPTG溶液：称取1.2g IPTG置于50mL离心管中，加入40mL无菌水，充分混匀溶解后，定容至50mL。用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装，-20℃保存。
2. 氨苄青霉素（Amp）贮液（100 mg/mL）：称取100mg 氨苄青霉素（Amp）溶于1mL无菌水，制得浓度为100mg/mL 的贮存液，通过0.22µm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。
3. LB培养基：（1）LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl，加蒸馏水至1000mL，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。（2）LB固体培养基：1.5g琼脂粉/100mL LB培养液，高压灭菌后，倾倒平板。
4. GM17培养基：称取植物蛋白胨5g，酵母粉5g，聚蛋白胨5g，抗坏血酸0.5g，牛肉膏2.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，β-甘油磷酸钠19g，加水溶解定容至1000mL。121℃ 灭菌15min。临用前再加入已单独高压灭菌的5mg/mL的葡萄糖。
5. DNA电泳缓冲液（50×TAE）：称取242g Tris、37.2g Na2EDTA·2H2O和57.1mL 冰乙酸，加水至1000mL，使用时稀释50倍。
6. SDS-PAGE电泳缓冲液（5×）：称取Tris粉末15.1g、 甘氨酸 94g、SDS 5.0g；加入约800mL的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1L，室温保存；注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。
7. 考马斯亮蓝蛋白染色试剂：（1）考马斯亮蓝R-250染液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250mL脱色液中。（2）固定液：500mL乙醇、100mL冰醋酸用蒸馏水稀释至1000mL。（3）脱色液：250mL乙醇、80mL冰醋酸用蒸馏水稀释至1000mL。（4）保存液：25mL 87%甘油溶于225mL脱色液中。
8. 实验动物：BALB/c小鼠为SPF级，雄性，8～10周龄，购自宁夏医科大学实验动物中心。
9. ELISA试剂：（1）包被液：1.6g Na2CO3，2.9g NaHCO3，0.2g NaN3，加双蒸水至1L，调pH值至9.6。（2）洗涤液：分别称取0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4∙12H2O，8.0g NaCl，0.2gKCl，0.5Ml Tween-20，加入ddH2O定容至1000 mL（PBST）。（3）封闭液：称取3.0g BSA溶解于100mL洗涤缓冲液中，过滤除菌后4℃保存。（4）底物液：可溶性单组份TMB底物溶液。（5）终止液：量取蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓硫酸21.7mL（1M H2SO4）。
10.BHI血平板：称取3.5g BHI干粉，加蒸馏水93mL，1.5g 琼脂粉，121℃灭菌13min，待冷却至60℃以下，加入7mL脱纤维羊血，多粘菌素B(终浓度5μg/mL)，万古霉素（终浓度10μg/mL）和甲氧苄氨嘧啶（终浓度5μg/mL），分装至培养皿，冷却后备用。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1：
构建plSAM质粒系统
根据核心元件SAM的氨基酸序列SEQ ID NO.3，设计优化其编码基因并合成核心元件SAM的基因序列如SEQ ID NO.4所示，并设计相应的酶切位点。
提取pNZ8148载体质粒，并用 Nco I/ Hind III双酶切pNZ8148载体质粒和核心元件SAM； 37℃，2 h；然后用1% 琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。利用DNA回收试剂盒回收SAM基因片段和pNZ8148载体质粒双酶切产物。将回收的pNZ8148载体质粒线性化片段和SAM基因片段通过互补的粘性末端，在T4 DNA 连接酶的作用下连接成闭合环状的DNA分子，即形成重组质粒plSAM。
重组质粒plSAM结构如图1所示，将连接完成的重组质粒进行检测，通过双酶切并进行电泳检测，结果如图2所示，图中泳道1为重组质粒plSAM，泳道2为重组质粒双酶切的电结果；双酶切结果与实际一致。送样进行测序，测序结果准确，且无移码突变。
实施例2
构建重组质粒plSAM-WAE
通过PCR从CWAE中获取融合基因WAE，扩增将得到带酶切位点的WAE基因片段，然后将重组质粒plSAM和带酶切位点的WAE基因片段分别用用 Kpn Ⅰ和 Xba l双酶切；37℃，2 h；然后用1% 琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。利用DNA回收试剂盒回收WAE基因片段和plSAM双酶切产物。将回收的plSAM线性化载体和WAE基因片段通过互补的粘性末端，在T4 DNA 连接酶的作用下连接成闭合环状的DNA分子，即形成重组质粒plSAM-WAE。
将将获得的重组质粒plSAM-WAE进行测序验证，结果如图3所示，显示构建的重组质粒plSAM-WAE序列准确且无移码突变。
实施例3
将重组质粒plSAM-WAE转化乳酸菌并进行蛋白表达和检测
（1）LL-plSAM-WAE的诱导表达：将验证正确的重组表达质粒plSAM-WAE电转化进乳酸球菌NZ9000中，得到重组乳酸菌LL-plSAM-WAE，将阳性克隆子（LL-plSAM-WAE）接种于5mL的M17 + 0.5%glucose + 10μg/mL chloramphenicol培养液的试管中，30℃过夜培养；次日按1:25接种于M17 + 0.5%glucose + 10μg/mL的chloramphenicol培养液中，30℃培养至菌体OD600约为0.4；加入Nisin至终浓度为1 ng/mL，30℃培养4 h，诱导融合蛋白表达。
（2）SDS-PAGE检测LL-plSAM-WAE的表达情况：LL-plSAM-WAE经诱导表达后，取出1ml培养物，10000 r/mim室温离心2 min，取上清至新的离心管中；沉淀用200 μL×上样缓冲液重悬，超声波破碎后，取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬，SDS-PAGE检测分析。
（3）免疫荧光染色检测LL-plSAM-WAE的表达情况：在500μL LL-plSAM-WAE悬液中，加500μL 4%多聚甲醛，混匀，静置10min；将细菌悬液滴在载玻片上，分布均匀，静置30min,待菌液完全干燥后，再1~2滴4%多聚甲醛，固定30min；然后，加入5% BSA封闭液，静置1h后，加入Mouse anti-WAE，4℃，过夜；洗涤三次后，加入FITC标记的羊抗鼠IgG，避光30min；洗涤三次后，滴加抗荧光淬灭剂1滴，盖上盖玻片，利用荧光显微镜观察。
结果如图4所示，LL-plSAM-WAE诱导表达后，SDS-PAGE结果表明：LL-plSAM-WAE在约103KD处出现目的蛋白条带，与重组蛋白SAM-WAE的理论大小相符合（图4a为SDS-PAGE试验结果图）。
Mouse Anti-WAE可识别重组蛋白SAM-WAE，但正常鼠血清不能识别重组蛋白SAM-WAE（图4b）。免疫荧光染色检测结果表明：LL-plSAM-WAE可与一抗（Mouse anti-WAE）和二抗（FITC标记的羊抗鼠IgG）反应，发出绿色荧光；但LL-plSAM不能与一抗（Mouse anti-WAE）和二抗（FITC标记的羊抗鼠IgG）反应，无绿色荧光产生（图4c）。
实施例4
重组乳酸菌LL-plSAM-WAE的抗原表面展示性能的鉴定
LL-plSAM-WAE、LL-plSAM和重组蛋白WAE包被至ELSIA板，4℃过夜。洗涤液洗4次后，每孔加入300μL封闭液，37℃封闭2h。洗涤液洗4次后，将Mouse anti-WAE抗血清（1:3000）加入ELISA板，100μL /孔，37 ℃放置60 min。洗涤液洗4次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1:10000），100μL /孔，37 ℃放置60 min。洗涤液洗4次后，加入TMB底物显色液，室温避光反应10min，加100μL终止液，测定OD450值。
结果如图5所示，用全细胞Elisa检测LL-plSAM-WAE能否表面展示重组抗原SAM-WAE；实验结果表明：LL-plSAM-WAE和SAM-WAE能与Mouse anti-WAE发生反应，但LL-plSAM不能与Mouse anti-WAE反应，说明LL-plSAM-WAE能够表面展示重组抗原SAM-WAE。
实施例5：重组乳酸菌LL-plSAM-WAE的M细胞靶向性鉴定
BALB/c小鼠禁食一晚（约12h），麻醉，打开腹部，将回肠中区约2cm长度结扎形成一个封闭的回肠袢，将100 μL重组乳酸菌LL-plSAM-WAE、重组抗原SAM-WAE和WAE注入回肠袢，约1h后，切除回肠袢，PBS反复冲洗三次后，用4%多聚甲醛固定。组织切片经3%山羊血清封闭后，接着分别与Rabbit anti- FAdE多克隆抗体和Goat anti-Rabbit IgG H&L (AlexaFluor® 647)孵育。派尔淋巴结上的M细胞由Mouse anti-GP2 mAb (Alexa Fluor® 488)进行标记；细胞核由DAPI进行染色。
结果如图6所示，与对照重组抗原WAE相比，重组乳酸菌LL-plSAM-WAE和重组抗原SAM-WAE均具有良好的M细胞靶向性质。
实施例6：LL-plSAM-WAE预防Hp感染的效果鉴定
（1）小鼠实验流程
实验分组：（1）LL-plSAM-WAE乳酸菌免疫组；（2）LL-plSAM乳酸菌免疫组;（3）SAM-WAE免疫组；（4）SAM免疫组；每组10只小鼠，共40只。
小鼠免疫：经Nisin诱导培养后的乳酸菌，6000rpm，离心10min，弃上清收集菌体，用PBS缓冲溶液将沉淀洗涤两次，最后重悬调整浓度至1×1010 CFU/mL（OD600=1）备用。分别于1，2，8，9，15，16，22，23天口服各组乳酸菌，共计8次，每次300μL/只，浓度为1×1010 CFU/mL（即3×109CFU）。
Hp攻毒：分别于29、31、33、35天灌胃幽门螺旋杆菌，共计4次，每次300μL /只，浓度为1×1010 CFU/mL（即3×109CFU）
小鼠处死：在第50天将小鼠处死，取样进行检验。
（2）小鼠胃部Hp的定量培养检测
称取一定重量的小鼠胃组织，用生理盐水冲去内容物，在0.5 mL生理盐水中制备组织均浆液，吸取20 μL均浆液，按照1:10、1:100和1:1000倍稀释。每个稀释度各取100 μL均匀涂布在BHI血平板上，37 ℃，微需氧培养3~5天。用细菌革兰氏染色和过氧化氢触酶等方法鉴定Hp菌落。对鉴定为阳性的Hp菌落进行计数，菌落计数换算成每克胃组织菌落形成单位数（CFU/g），计算公式为：Hp定植密度=Hp菌落数×稀释度/胃重量。
（3）小鼠胃部组织病理学检测：
HE染色：用石蜡包埋经10% 甲醛固定的小鼠胃组织，切成约6 μm厚的组织切片，通过HE染色法观察胃组织炎症情况，并进行组织病理学评分。
评分标准如下：
无明显可见白细胞（淋巴细胞和中性粒细胞）浸润为0分；
在胃粘膜固有层深部有少许散在白细胞浸润为1分；
在胃粘膜深部至中部固有层有中等程度白细胞浸润为2分；
在胃粘膜深部至中部固有层有大量白细胞浸润，少量微脓肿为3分；
在胃粘膜固有层全层至黏膜下层有严重弥散性白细胞浸润，微脓肿较多为4分。
免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡后，经正常山羊血清封闭，室温，10min；滴加适当比例稀释的Rabbit anti-Hp，37℃，1h；经洗涤后，滴加羊抗兔IgG-HRP，37℃，10min；DAB显色，冲洗，复染，封片。
结果如图7所示，其中图7a为qPCR实验结果，图7b为Hp定量培养试验结果，图7c为快速尿素酶活性检测。LL-plSAM-WAE免疫小鼠后，灌胃Hp，经qPCR、Hp定量培养和快速尿素酶活性检测，实验结果表明：LL-plSAM-WAE和SAM-WAE免疫组小鼠胃部的Hp定植数显著减少，尿素酶活性降低（图7a、图7b和图7c）。
结果如图8所示，图8a为胃组织病理学评分图，图8b为HE染色典型图片，图8c为免疫组化染色图。胃组织病理学实验结果表明LL-plSAM和SAM免疫组小鼠的胃黏膜和胃黏膜下层有大量白细胞浸润，胃部炎症比较明显，有明显Hp定植；LL-plSAM-WAE和SAM-WAE免疫组小鼠的胃部炎症显著减轻，无明显Hp定植（图8a、图8b和图8c）。
实施例7：重组乳酸菌LL-plSAM-WAE免疫后小鼠特异性抗体的检测
小鼠经重组乳酸菌LL-plSAM-WAE免疫后，处死，取血清1:1000稀释，取胃黏液和肠液1:5倍稀释。按100 μL/孔加入已包被Hp裂解液的ELISA板，37 ℃，60 min。洗4次后，加入HRP标记羊抗鼠IgG或IgA（1:10000），100 μL/孔，37 ℃，60 min。洗4次后，加入TMB显色液，室温，10 min，加100 μL终止液，测定OD450值。
结果如图9所示，图9a是血清学抗体检测，图9b是黏膜sIgA抗体检测。LL-plSAM-WAE免疫预防小鼠后，灌胃Hp。Elisa实验结果表明：LL-plSAM-WAE和SAM-WAE免疫组小鼠能产生Hp特异性IgG和sIgA；然而，LL-plSAM和SAM免疫组小鼠不能够产生Hp特异性IgG和sIgA（图9a和图9b）。
综上可以看出，本发明提供的疫苗投递系统具有较佳的靶向性，能高效的将幽门螺旋杆菌表位肽WAE靶向到M细胞，通过对M细胞免疫刺激，起到刺激机体产生免疫反应，能产生特异性的抗体，起到预防和治疗由幽门螺旋杆菌引起的胃肠道疾病等。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁夏医科大学
<120> M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗及制备方法与应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Thr Phe Glu Ile Leu Lys His Leu Gln Ala Asp Ala Ile Val
1               5                   10                  15
Leu Phe Met Lys Val His Asn Phe His Trp Asn Val Lys Gly Thr Asp
            20                  25                  30
Phe Phe Asn Val His Lys Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Glu Glu Phe Ala
        35                  40                  45
Asp Met Phe Asp Asp Leu Ala Glu Arg Ile Val Gln Leu Gly His His
    50                  55                  60
Pro Leu Val Thr Leu Ser Glu Ala Ile Lys Leu Thr Arg Val Lys Glu
65                  70                  75                  80
Glu Thr Lys Thr Ser Phe His Ser Lys Asp Ile Phe Lys Glu Ile Leu
                85                  90                  95
Glu Asp Tyr Lys Tyr Leu Glu Lys Glu Phe Lys Glu Leu Ser Asn Thr
            100                 105                 110
Ala Glu Lys Glu Gly Asp Lys Val Thr Val Thr Tyr Ala Asp Asp Gln
        115                 120                 125
Leu Ala Lys Leu Gln Lys Ser Ile Trp Met Leu Gln Ala His Leu Ala
    130                 135                 140
Asp Pro Arg Val Pro Ser Ser Gly Ile Lys Leu Asn Tyr Val Glu Ala
145                 150                 155                 160
Val Ala Leu Ile Ser Ala His Ile Met Glu Glu Ala Arg Ala Gly Lys
                165                 170                 175
Lys Thr Gly Ile Lys Leu Asn Tyr Val Glu Ala Val Ala Leu Ile Ser
            180                 185                 190
Ala His Ile Met Glu Glu Ala Arg Ala Gly Lys Lys Thr Ser Val Glu
        195                 200                 205
Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn Arg Arg Ile Phe Gly Phe Asn Ala Leu
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Val Asp Gly Ser Ser Val Glu Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn Arg Arg
225                 230                 235                 240
Ile Phe Gly Phe Asn Ala Leu Val Asp Gly Ser Asp Pro Lys Arg Thr
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Ile Gln Lys Lys Ser Gly Ser Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys Lys
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Ser Gly Ser Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys Lys Ser Gly Ser Val
        275                 280                 285
Glu Gly Met Gln Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Gly Ser
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Val Glu Gly Met Gln Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Gly
305                 310                 315                 320
Gly Gly Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr Ile Thr Pro
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Gly Arg Arg Asn Leu Lys Trp Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ser
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Met Asn Leu Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Ala Ser Asn Asp Ala Ser
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Leu Ala Asp Gln Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu
    370                 375                 380
Asp Trp Gly Thr Thr Pro Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala
385                 390                 395                 400
Asp Lys Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Gly Ser Cys
                405                 410                 415
His His Leu Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp Ser
            420                 425                 430
Arg Ile Arg Pro Gln Thr Ile Ala Ala Glu Asp Thr Leu His Asp Met
        435                 440                 445
Gly Ile Phe Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg Val
    450                 455                 460
Gly Glu Val Ile Thr Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Asn Lys Lys
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1               5                   10                  15
Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Leu Glu Ile
            20                  25                  30
Ser Ser Thr Cys Asp Ala Ala Cys Thr Thr Tyr Thr Val Lys Ser Gly
        35                  40                  45
Asp Thr Leu Trp Gly Ile Ser Gln Arg Tyr Gly Ile Ser Val Ala Gln
    50                  55                  60
Ile Gln Ser Ala Asn Asn Leu Lys Ser Thr Ile Ile Tyr Ile Gly Gln
65                  70                  75                  80
Lys Leu Val Leu Thr Gly Ser Ala Ser Ser Thr Asn Ser Gly Gly Ser
                85                  90                  95
Asn Asn Ser Ala Ser Thr Thr Pro Thr Thr Ser Val Thr Pro Ala Lys
            100                 105                 110
Pro Thr Ser Gln Thr Thr Val Lys Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Trp
        115                 120                 125
Ala Leu Ser Val Lys Tyr Lys Thr Ser Ile Ala Gln Leu Lys Ser Trp
    130                 135                 140
Asn His Leu Ser Ser Asp Thr Ile Tyr Ile Gly Gln Asn Leu Ile Val
145                 150                 155                 160
Ser Gln Ser Ala Ala Ala Ser Asn Pro Ser Thr Gly Ser Gly Ser Thr
                165                 170                 175
Ala Thr Asn Asn Ser Asn Ser Thr Ser Ser Asn Ser Asn Ala Ser Ile
            180                 185                 190
His Lys Val Val Lys Gly Asp Thr Leu Trp Gly Leu Ser Gln Lys Ser
        195                 200                 205
Gly Ser Pro Ile Ala Ser Ile Lys Ala Trp Asn His Leu Ser Ser Asp
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Thr Ile Leu Ile Gly Gln Tyr Leu Arg Ile Lys Gly Thr Thr Ser Ser
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Ala Arg Ser Pro Leu Pro Ser Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Val Leu Val
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Met Lys Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Gly Asn Tyr Pro Tyr Ser Ile Leu
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Val Pro Ser Ser Gly Ile Lys Leu Asn Tyr Val Glu Ala Val Ala Leu
385                 390                 395                 400
Ile Ser Ala His Ile Met Glu Glu Ala Arg Ala Gly Lys Lys Thr Gly
                405                 410                 415
Ile Lys Leu Asn Tyr Val Glu Ala Val Ala Leu Ile Ser Ala His Ile
            420                 425                 430
Met Glu Glu Ala Arg Ala Gly Lys Lys Thr Ser Val Glu Leu Ile Asp
        435                 440                 445
Ile Gly Gly Asn Arg Arg Ile Phe Gly Phe Asn Ala Leu Val Asp Gly
    450                 455                 460
Ser Ser Val Glu Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn Arg Arg Ile Phe Gly
465                 470                 475                 480
Phe Asn Ala Leu Val Asp Gly Ser Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys
                485                 490                 495
Lys Ser Gly Ser Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys Lys Ser Gly Ser
            500                 505                 510
Asp Pro Lys Arg Thr Ile Gln Lys Lys Ser Gly Ser Val Glu Gly Met
        515                 520                 525
Gln Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Gly Ser Val Glu Gly
    530                 535                 540
Met Gln Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Gly Gly Gly Thr
545                 550                 555                 560
Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr Ile Thr Pro Gly Arg Arg
                565                 570                 575
Asn Leu Lys Trp Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ser Met Asn Leu
            580                 585                 590
Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Ala Ser Asn Asp Ala Ser Leu Ala Asp
        595                 600                 605
Gln Ile Glu Ala Gly Ala Ile Gly Phe Lys Ile His Glu Asp Trp Gly
    610                 615                 620
Thr Thr Pro Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys Tyr
625                 630                 635                 640
Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Gly Ser Cys His His Leu
                645                 650                 655
Asp Lys Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Ala Asp Ser Arg Ile Arg
            660                 665                 670
Pro Gln Thr Ile Ala Ala Glu Asp Thr Leu His Asp Met Gly Ile Phe
        675                 680                 685
Ser Ile Thr Ser Ser Asp Ser Gln Ala Met Gly Arg Val Gly Glu Val
    690                 695                 700
Ile Thr Arg Thr Trp Gln Thr Ala Asp Lys Asn Lys Lys Ser Arg Cys
705                 710                 715                 720
Lys Ser Thr His Pro Leu Ser Cys Ser Phe His Gln Leu Pro Ala Arg
                725                 730                 735
Ser Pro Leu Pro Ser Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Val Leu Val Met Lys
            740                 745                 750
Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Gly Asn Tyr Pro Tyr Ser Ile Leu Phe Gln
        755                 760                 765
Lys Phe
    770
<210> 6
<211> 2313
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggagatga aaaaaaagat tatctcagct attttaatgt ctacagtgat actttctgct 60
gcagccccgt tgtcaggtgt ttacgcttta gaaatttcat caacatgtga tgctgcatgc 120
actacttata ccgtcaaatc tggtgatact ctttggggaa tctcacaaag atatggaatt 180
agtgtcgctc aaattcaaag tgcgaataat cttaaaagta ccattatcta cattggtcaa 240
aaacttgtac tgacaggttc agcttcttct acaaattcag gtggttcaaa caattccgca 300
agcactactc caaccacttc tgtgacacct gcaaaaccaa cttcacaaac aactgttaag 360
gttaaatccg gagataccct ttgggcgcta tcagtaaaat ataaaactag tattgctcaa 420
ttgaaaagtt ggaatcattt aagttcagat accatttata ttggtcaaaa tcttattgtt 480
tcacaatctg ctgctgcttc aaatccttcg acaggttcag gctcaactgc taccaataac 540
tcaaactcga cttcttctaa ctcaaatgcc tcaattcata aggtcgttaa aggagatact 600
ctctggggac tttcgcaaaa atctggcagc ccaattgctt caatcaaggc ttggaatcat 660
ttatctagcg atactatttt aattggtcag tatctacgaa taaaaggtac catgaagacc 720
tttgaaatcc tgaaacacct gcaagccgac gccattgtcc tgtttatgaa agtccacaac 780
ttccattgga acgtgaaagg tacggacttt ttcaacgtgc ataaagccac cgaagaaatc 840
tacgaagaat tcgctgatat gttcgatgac ctggcggaac gcattgttca gctgggccat 900
cacccgctgg tcacgctgag cgaagcgatc aaactgaccc gtgttaaaga agaaaccaag 960
acgagctttc actctaaaga catcttcaag gaaatcctgg aagattacaa gtacctggaa 1020
aaggaattca aggaactgag caataccgcc gaaaaagaag gtgataaggt gaccgttacg 1080
tatgctgatg accagctggc gaaactgcaa aagtctattt ggatgctgca ggcacatctg 1140
gctgatccgc gcgtgccgag ctctggtatc aaactgaact atgttgaagc ggtcgccctg 1200
attagtgccc acatcatgga agaagcacgt gctggtaaaa agaccggcat taaactgaat 1260
tacgtggaag cggttgccct gatttcagcg catatcatgg aagaagcacg cgctggtaaa 1320
aagacctcgg ttgaactgat tgatatcggc ggtaaccgtc gcatttttgg tttcaatgct 1380
ctggtcgacg gcagttccgt ggaactgatc gacatcggcg gtaatcgtcg catctttggt 1440
ttcaatgcac tggtcgatgg ctctgacccg aaacgtacga ttcagaaaaa gagcggttct 1500
gacccgaagc gcaccatcca gaaaaaatct ggctccgatc cgaaacgtac cattcagaaa 1560
aagtcaggtt cggtggaagg catgcaattt gatcgcggtt atctgtcacc gtactttggt 1620
tcggttgaag gcatgcagtt cgaccgtggc tatctgagtc cgtactttgg cggtggcacc 1680
ggtccggcag atggcacgaa cgcaaccacg attaccccgg gtcgtcgcaa tctgaaatgg 1740
atgctgcgtg cggccgaaga atattccatg aacctgggtt ttctggcaaa aggcaacgct 1800
agtaatgacg cgtccctggc cgatcagatt gaagcgggtg ccattggctt caaaatccat 1860
gaagattggg gcaccacgcc gagcgcgatc aatcacgccc tggatgtcgc agacaaatac 1920
gatgtccaag tggccatcca taccgacacg ggcagttgcc atcacctgga taaatccatt 1980
aaggaagacg tgcagtttgc agattcacgt attcgcccgc aaacgatcgc agctgaagac 2040
accctgcacg atatgggcat tttcagcatc acctcatcgg attctcaggc gatgggtcgt 2100
gtcggcgaag tcattacgcg cacctggcag acggcggata aaaacaagaa gtctagatgt 2160
aaatcaacac atccattatc atgttcattt catcaattac cagctcgttc accattacca 2220
tcattagatg ctggtcaata tgttttagtt atgaaagcta attcatcata ttcaggtaat 2280
tatccatatt caattttatt tcaaaaattt tga 2313

Claims (9)

1.一种M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗，其特征在于，所述M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗包括能将幽门螺旋杆菌多表位肽WAE展示到表面的、靶向黏膜M细胞的重组乳酸菌，所述幽门螺旋杆菌多表位肽WAE的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗还包括核心组件SAM；所述核心组件SAM的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗，其特征在于，编码所述幽门螺旋杆菌多表位肽WAE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3. 根据权利要求1所述的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗，其特征在于，所述核心组件SAM的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗，其特征在于，所述M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗包括靶向M细胞的重组抗原，所述重组抗原为重组抗原SAM-WAE，所述重组抗原SAM-WAE的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5. 根据权利要求4所述的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗，其特征在于，编码所述重组抗原SAM-WAE的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.权利要求1-5任一项所述的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗在制备防治幽门螺旋杆菌感染相关性胃病的药物中的应用。
7.权利要求1所述的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将如序列SEQ ID NO.4所示的核心组件SAM基因片段通过酶切和连接，克隆到pNZ8148载体上，得到plSAM重组载体；
将如序列SEQ ID NO.2所示的幽门螺旋杆菌多表位肽WAE基因片段和所述plSAM重组载体双酶切，回收线性化片段，连接幽门螺旋杆菌多表位肽WAE基因片段和plSAM重组载体线性化片段，得到plSAM-WAE重组载体；
将所述plSAM-WAE重组载体转化进表达宿主细胞，通过培养和诱导剂诱导表达，得到表达靶向黏膜M细胞的重组抗原SAM-WAE的重组乳酸菌。
8.根据权利要求7所述M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗的制备方法，其特征在于，所述表达宿主细胞为乳酸球菌；所述乳酸球菌为NZ9000菌株。
9.根据权利要求7所述M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗的制备方法，其特征在于，所述诱导剂为Nisin诱导剂，所述Nisin诱导剂的终浓度为1ng/mL。
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