CN112190704B

CN112190704B - M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗及制备方法与应用

Info

Publication number: CN112190704B
Application number: CN202011088823.6A
Authority: CN
Inventors: 郭乐; 刘昆梅; 王淑娥; 何萌; 李欣; 杨华
Original assignee: Ningxia Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University
Priority date: 2020-10-13
Filing date: 2020-10-13
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2040-10-13
Also published as: CN112190704A

Abstract

本申请提供了M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗及制备方法与应用，属于生物医学及生物工程领域。本申请提供的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗LL‑plSAM‑FVpE，是一种可分泌表达含有核心组件SAM和幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE的重组抗原SAM‑FVpE，并将其展示在菌体表面的重组乳酸菌。重组乳酸菌疫苗LL‑plSAM‑FVpE不仅具有良好的抗原表面展示性能，而且具有胃肠道M细胞靶向性质，可高效地将重组抗原SAM‑FVpE靶向递送给胃肠道M细胞，诱导胃肠道产生针对幽门螺旋杆菌多种毒力因子的特异性黏膜免疫应答，起到防治幽门螺旋杆菌感染相关性胃病的目的。

Description

M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗及制备方法与应用

技术领域

本申请涉及生物医学及生物工程领域，具体而言，涉及M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗及制备方法与应用。

背景技术

幽门螺旋杆菌（Hp）是胃炎、胃溃疡和胃癌的重要致病因子，世界感染率超过50%，我国Hp感染率高达58.07%，且呈现明显的家庭聚集性，形式更加严峻。目前，临床治疗Hp感染性胃病的方法主要是多联抗生素疗法，但是面临着抗生物导致Hp耐药性、治疗后再感染、抗生素破坏肠道微生态平衡、药物毒副作用和病人依从性差等问题，难以在Hp感染人群中大规模推广使用，研发有效的Hp疫苗具有很好的应用前景。

口服类疫苗的免疫原性一般较弱，需使用大量抗原多次接种，且免疫应答持续时间较短，容易产生免疫耐受。研制口服类疫苗成功的关键在于“设计一种有效的黏膜投递策略，长期稳定地将抗原投递给黏膜免疫诱导位点，激发高水平免疫应答”。微皱褶细胞（M细胞）是胃肠道黏膜免疫系统中一种特化的抗原转运细胞，散布于黏膜上皮细胞间，能将抗原从胃肠腔内转运到上皮下的淋巴组织，诱导黏膜免疫反应。M细胞是胃肠道黏膜免疫系统的“入口”，其对抗原的摄取是启动胃肠黏膜免疫应答关键的第一步。因此，“抗原能否被M细胞大量摄取”是口服类疫苗免疫成败的关键所在。利用“与M细胞表面受体相结合的M细胞靶向肽”，将抗原靶向递呈给M细胞，增加其对抗原的摄取和转运效率，激发高水平黏膜免疫应答，是一种提高口服类疫苗免疫效果的有效策略。

疫苗抗原直接口服给药，疫苗效果往往甚微，其中主要原因是：胃肠道中存在大量的酸和蛋白水解酶，会破坏疫苗抗原。因此，研究安全有效的黏膜免疫投递系统是口服类疫苗研究领域的一个热点。乳酸菌是一群在人体肠道内的常见益生细菌，作为口服类疫苗的黏膜免疫投递系统，具安全性高等独特优势。另外，将抗原展示在乳酸菌表面更符合黏膜疫苗的要求。锚定蛋白是细菌表面展示技术中的核心组件。N-乙酰胞壁质酶（AcmA）是在乳酸菌表面展示系统中常用的一种锚定蛋白。然而，在胞内表达的AcmA往往跨膜转运活性不强。基于AcmA设计更为有效的乳酸菌细胞表面展示系统，仍是一项亟待研究的工作。

发明内容

本申请的第一方面，公开了M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗，M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗包括将重组抗原展示到表面的可靶向M细胞的重组乳酸菌；重组抗原包括幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE，幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

重组乳酸菌表面展示系统主要是将乳酸菌作为一种工程菌，分泌表达疫苗抗原；疫苗抗原通过与其偶联的锚定蛋白，展示在乳酸菌表面，称之为重组乳酸菌疫苗。大量实验研究报道，多种病原体抗原已成功在乳酸菌中分泌表达并展示在乳酸菌表面，经胃肠道黏膜途径免疫可激发特异性黏膜免疫应答。

幽门螺旋杆菌关键毒力因子主要有尿素酶、细胞毒素相关蛋白A（CagA）、空泡毒素相关蛋白A（VacA）、中性粒细胞激活蛋白NAP等。Hp毒力因子多表位疫苗FVpE主要含有来自Hp关键毒力因子（尿素酶、CagA和VacA）的优势抗原表位或区段和中性粒细胞激活蛋白NAP，研究已证实FVpE具有很好的防治Hp感染的免疫效果。

在实施例中，M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗可表达出含有核心组件SAM和幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE的重组抗原，可刺激M细胞产生针对幽门螺旋杆菌的特异性免疫应答。

在前述的第一方面的一些实施例中，编码幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE主要含有来自Hp关键毒力因子（尿素酶、CagA和VacA）的优势抗原表位或区段和中性粒细胞激活蛋白NAP。

编码幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE是刺激靶细胞产生免疫反应的抗原物质，需要保证多表位肽的抗原性，保证多表位肽的序列表达翻译的准确；由于密码子的简并性，编码一个氨基酸可能是有几个密码子，因此编码一条多肽链的核苷酸序列有许多种的可能性。本实施例中优选编码幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在前述的第一方面的一些实施例中，M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗编码的重组抗原还包括核心组件SAM；核心组件SAM的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

核心组件SAM主要是通过生物信息学对筛选的M细胞靶向杂合肽Mtp、锚定蛋白AcmA的C末端肽聚糖结合区、多克隆位点MCS、信号肽SPusp45和前导肽Ps等元件的连接顺序而成，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在前述的第一方面的一些实施例中，编码核心组件SAM的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

由于密码子的简并性，编码一个氨基酸可能是有几个密码子，因此编码一条多肽链的核苷酸序列可能许多种的可能性，本实施例中优选采用核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的序列编码靶向M细胞的重组乳酸菌表面展示系统的核心组件SAM。

在前述的第一方面的一些实施例中，重组抗原为重组抗原SAM-FVpE，重组抗原SAM-FVpE的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在前述的第一方面的一些实施例中，编码靶向黏膜M细胞的重组抗原SAM-FVpE的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示

本申请的第二方面，公开了前述M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗在制备防治幽门螺旋杆菌相关性胃病的药物中的应用。

M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗可以表达出核心组件和幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE的重组抗原，可以实现M细胞的精准投递，刺激胃肠道产生针对幽门螺旋杆菌的特异性免疫应答，实现对幽门螺旋杆菌感染相关性胃病的免疫防治。

本申请的第三方面，公开了M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗的制备方法，制备方法包括以下步骤：

将如序列SEQ ID NO.4所示的核心组件SAM基因片段通过酶切和连接，克隆到pNZ8148载体上，得到plSAM重组载体；

将如序列SEQ ID NO.2所示的幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE基因片段通过一步法克隆技术克隆进的plSAM重组载体中，得到plSAM-FVpE重组载体；

将plSAM-FVpE重组载体转化进表达宿主细胞，通过培养和诱导剂诱导表达，得到表达重组抗原SAM-FVpE 的靶向黏膜M细胞的重组细胞。

在实施例中，通过将核心组件SAM基因片段连接到pNZ8148载体上，得到可靶向M细胞的重组乳酸菌表面展示系统，然后通过将幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE基因片段连接到重组乳酸菌表面展示系统；然后通过将重组载体转化进表达宿主细胞，通过诱导表达重组抗原SAM-FVpE；重组抗原SAM-FVpE可通过核心组件展示到宿主细胞表面，同时通过核心组件实现胃肠道M细胞的靶向投递，产生特异性黏膜免疫应答。

在前述第五方面的一些实施例中，表达宿主细胞为乳酸球菌；

优选地，乳酸球菌为NZ9000菌株。

在实施例中，乳酸菌作为一种肠道益生菌，通过乳酸菌不会引起肠道疾病，能保持肠道菌群的平衡。

在前述第五方面的一些实施例中，诱导剂为Nisin诱导剂，Nisin诱导剂的终浓度为1ng/mL。

Nisin，即乳酸链球菌素（亦称乳链菌肽），是一种天然生物活性抗菌肽，是利用生物技术提取的一种纯天然、高效、安全的多肽活性物质。

与现有技术相比，本申请的有益效果为：本申请提供的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗，主要将幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE连接进靶向M细胞的重组乳酸菌表面展示系统，转化进乳酸菌，制备出可防治幽门螺旋杆菌感染的重组乳酸菌疫苗。重组乳酸菌疫苗可表达含有核心组件SAM和毒力因子多表位肽FVpE的重组抗原，核心组件SAM可将毒力因子多表位肽FVpE展示在乳酸菌表面，且将其靶向投递给胃肠道M细胞，实现精准免疫，提高免疫效率，诱导胃肠道产生针对幽门螺旋杆菌的特异性黏膜免疫应答，起到防治幽门螺旋杆菌感染相关性胃病的目的。

附图说明

图1是实施例1中提供的重组质粒plSAM的示意图。

图2是实施例1中提供的重组质粒plSAM的酶切电泳图。

图3是实验例2中重组质粒plSAM-FVpE的酶切电泳图。

图4是实验例3中重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE的诱导表达结果图。

图5是实验例4中对重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE的抗原表面展示性能检测图。

图6是实验例5中重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE的M细胞靶向特异性鉴定图。

图7是实验例6中重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE免疫预防感染效果图。

图8是实验例6中重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE免疫预防后病理学检测结果图。

图9是实验例7中重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE免疫预防后小鼠产生抗体的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

材料

1. IPTG溶液：称取1.2g IPTG置于50mL离心管中，加入40mL无菌水，充分混匀溶解后，定容至50mL。用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装，-20℃保存。

2. 氨苄青霉素（Amp）贮液（100 mg/mL）：称取100mg 氨苄青霉素（Amp）溶于1mL无菌水，制得浓度为100mg/mL 的贮存液，通过0.22µm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。

3. LB培养基：（1）LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g NaCl，加蒸馏水至1000mL，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。（2）LB固体培养基：1.5g琼脂粉/100mL LB培养液，高压灭菌后，倾倒平板。

4. GM17培养基：称取植物蛋白胨5g，酵母粉5g，聚蛋白胨5g，抗坏血酸0.5g，牛肉膏2.5g，MgSO₄·7H₂O 0.01g，β-甘油磷酸钠19g，加水溶解定容至1000mL。121℃ 灭菌15min。临用前再加入已单独高压灭菌的5mg/mL的葡萄糖。

5. DNA电泳缓冲液（50×TAE）：称取242g Tris、37.2g Na₂EDTA·2H₂O和57.1mL 冰乙酸，加水至1000mL，使用时稀释50倍。

6. SDS-PAGE电泳缓冲液（5×）：称取Tris粉末15.1g、甘氨酸 94g、SDS 5.0g；加入约800mL的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1L，室温保存；注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。

7. 考马斯亮蓝蛋白染色试剂：（1）考马斯亮蓝R-250染液：0.29g考马斯亮蓝R-250溶解在250mL脱色液中。（2）固定液：500mL乙醇、100mL冰醋酸用蒸馏水稀释至1000mL。（3）脱色液：250mL乙醇、80mL冰醋酸用蒸馏水稀释至1000mL。（4）保存液：25mL 87%甘油溶于225mL脱色液中。

8. 实验动物：BALB/c小鼠为SPF级，雄性，8～10周龄，购自宁夏医科大学实验动物中心。

9. ELISA试剂：（1）包被液：1.6g Na₂CO₃，2.9g NaHCO₃，0.2g NaN₃，加双蒸水至1L，调pH值至9.6。（2）洗涤液：分别称取0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄∙12H₂O，8.0g NaCl，0.2gKCl，0.5Ml Tween-20，加入ddH₂O定容至1000 mL（PBST）。（3）封闭液：称取3.0g BSA溶解于100mL洗涤缓冲液中，过滤除菌后4℃保存。（4）底物液：可溶性单组份TMB底物溶液。（5）终止液：量取蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓硫酸21.7mL（1M H₂SO₄）。

10. BHI血平板：称取3.5g BHI干粉，加蒸馏水93mL，1.5g 琼脂粉，121℃灭菌13min，待冷却至60℃以下，加入7mL脱纤维羊血，多粘菌素B(终浓度5μg/mL)，万古霉素（终浓度10μg/mL）和甲氧苄氨嘧啶（终浓度5μg/mL），分装至培养皿，冷却后备用。

以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1：乳酸菌质粒plSAM的构建

根据核心元件SAM的氨基酸序列SEQ ID NO.3，设计优化其编码基因并合成核心元件SAM的基因序列如SEQ ID NO.4所示，并设计相应的酶切位点。

提取pNZ8148载体质粒，并用Nco I/Hind III双酶切pNZ8148载体质粒和核心元件SAM； 37℃，2 h；然后用1% 琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。利用DNA回收试剂盒回收SAM基因片段和pNZ8148载体质粒双酶切产物。将回收的pNZ8148载体质粒线性化片段和SAM基因片段通过互补的粘性末端，在T4 DNA 连接酶的作用下连接成闭合环状的DNA分子，即形成重组质粒plSAM。

重组质粒plSAM结构如图1所示，将连接完成的重组质粒进行检测，通过双酶切并进行电泳检测，结果如图2所示，图中泳道1为重组质粒plSAM，泳道2为重组质粒双酶切的电结果；双酶切结果与实际一致。送样进行测序，测序结果准确，且无移码突变。

实施例2：重组质粒plSAM-FVpE的构建

通过PCR扩增得到FVpE基因片段；将其重组质粒plSAM用Kpn Ⅰ和Xba l双酶切；37℃，2 h；然后用1% 琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。利用DNA回收试剂盒回收FVpE基因片段和plSAM双酶切产物。将回收的plSAM线性化载体和FVpE基因片段混合，利用一步法克隆技术，连接成闭合环状的DNA分子，即形成重组质粒plSAM-FVpE。

将重组质粒plSAM-FVpE通过双酶切后进行电泳，结果如图3所示，图中泳道M表示DNA Marker，泳道1为乳酸菌重组质粒plSAM-FVpE；泳道2为Kpn Ⅰ酶切后的重组质粒plSAM-FVpE；酶切结果与实际一致。将获得的重组质粒plSAM-FVpE进行测序验证，结果显示构建的重组质粒plSAM-FVpE序列准确且无移码突变。

实施例3：重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE的表达及检测

将重组质粒plSAM-FVpE转化乳酸菌进行蛋白表达和检测。

（1）LL-plSAM-FVpE的诱导表达：将验证正确的重组表达质粒plSAM-FVpE电转化进乳酸球菌NZ9000中，得到重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE，将阳性克隆子（LL-plSAM-FVpE）接种于5mLM17 + 0.5%glucose + 10μg/mL chloramphenicol培养液的试管中，30℃过夜培养；次日按1:25接种于M17 + 0.5%glucose + 10μg/mL的chloramphenicol培养液中，30℃培养至菌体OD₆₀₀约为0.4；加入Nisin至终浓度为1 ng/mL，30℃培养4 h，诱导融合蛋白表达。

（2）SDS-PAGE检测LL-plSAM-FVpE的表达情况：LL-plSAM-FVpE经诱导表达后，取出1 mL培养物，10000 r/mim室温离心2 min，取上清至新的离心管中；沉淀用200 μL×上样缓冲液重悬，超声波破碎后，取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬，SDS-PAGE检测分析。

（3）免疫荧光染色检测LL-plSAM-FVpE的表达情况：在500μL LL-plSAM-FVpE悬液中，加500μL 4%多聚甲醛，混匀，静置10min；将细菌悬液滴在载玻片上，分布均匀，静置30min, 待菌液完全干燥后，再1~2滴4%多聚甲醛，固定30min；然后，加入5% BSA封闭液，静置1h后，加入Mouse anti-FVpE，4℃，过夜；洗涤三次后，加入FITC标记的羊抗鼠IgG，避光30min；洗涤三次后，滴加抗荧光淬灭剂1滴，盖上盖玻片，利用荧光显微镜观察。

结果如图4所示，LL-plSAM-FVpE诱导表达后，SDS-PAGE结果表明：LL-plSAM-FVpE在约103KD处出现目的蛋白条带，与重组蛋白SAM-FVpE的理论大小相符合（图4a）。

Mouse Anti-FVpE可识别重组蛋白SAM-FVpE，但正常鼠血清不能识别重组蛋白SAM-FVpE（图4b）。免疫荧光染色检测结果表明：LL-plSAM-FVpE可与一抗（Mouse anti-FVpE）和二抗（FITC标记的羊抗鼠IgG）反应，发出绿色荧光；但LL-plSAM不能与一抗（Mouseanti-FVpE）和二抗（FITC标记的羊抗鼠IgG）反应，无绿色荧光产生（图4c）。

实施例4：重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE的抗原表面展示性能的鉴定

LL-plSAM-FVpE、LL-plSAM和重组蛋白FVpE包被至ELSIA板，4℃过夜。洗涤液洗4次后，每孔加入300μL封闭液，37℃封闭2h。洗涤液洗4次后，将Mouse anti-FVpE抗血清（1:3000）加入ELISA板，100μL /孔，37 ℃放置60 min。洗涤液洗4次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG（1:10000），100μL /孔，37 ℃放置60 min。洗涤液洗4次后，加入TMB底物显色液，室温避光反应10min，加100μL终止液，测定OD450值。

结果如图5所示，用全细胞ELSIA检测LL-plSAM-FVpE能否表面展示重组抗原SAM-FVpE。实验结果表明：LL-plSAM-FVpE和SAM-FVpE能与Mouse anti-FVpE发生反应，但LL-plSAM不能与Mouse anti-FVpE反应，说明LL-plSAM-FVpE能够表面展示重组抗原SAM-FVpE。

实施例5：重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE的M细胞靶向性鉴定

BALB/c小鼠禁食一晚（约12h），麻醉，打开腹部，将回肠中区约2cm长度结扎形成一个封闭的回肠袢，将100 μL重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE、重组抗原SAM-FVpE和FVpE注入回肠袢，约1h后，切除回肠袢，PBS反复冲洗三次后，用4%多聚甲醛固定。组织切片经3%山羊血清封闭后，接着分别与Rabbit anti- FAdE多克隆抗体和Goat anti-Rabbit IgG H&L (AlexaFluor® 647)孵育。派尔淋巴结上的M细胞由Mouse anti-GP2 mAb (Alexa Fluor® 488)进行标记；细胞核由DAPI进行染色。

结果如图6所示，与对照重组抗原FVpE相比，重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE和重组抗原SAM-FVpE均具有良好的M细胞靶性性质。

实施例6：重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE预防幽门螺旋杆菌感染的效果鉴定

（1）小鼠实验流程

实验分组：LL-plSAM-FVpE乳酸菌免疫组、LL-plSAM乳酸菌免疫组、重组抗原SAM-FVpE免疫组和SAM免疫组；每组10只小鼠，共40只。

小鼠免疫：经Nisin诱导培养后的乳酸菌，6000rpm，离心10min，弃上清收集菌体，用PBS缓冲溶液将沉淀洗涤两次，最后重悬调整浓度至1×10¹⁰ CFU/mL（OD₆₀₀=1）备用。分别于1，2，8，9，15，16，22，23天口服各组乳酸菌，共计8次，每次300μL/只，浓度为1×10¹⁰ CFU/mL（即3×10⁹CFU）。

Hp攻毒：分别于29、31、33、35天灌胃幽门螺旋杆菌，共计4次，每次300μL /只，浓度为1×10¹⁰ CFU/mL（即3×10⁹CFU）

小鼠处死：在第50天将小鼠处死，取样进行检验。

（2）小鼠胃部Hp的定量培养检测

称取一定重量的小鼠胃组织，用生理盐水冲去内容物，在0.5 mL生理盐水中制备组织均浆液，吸取20 μL均浆液，按照1:10、1:100和1:1000倍稀释。每个稀释度各取100 μL均匀涂布在BHI血平板上，37 ℃，微需氧培养3~5天。用细菌革兰氏染色和过氧化氢触酶等方法鉴定Hp菌落。对鉴定为阳性的Hp菌落进行计数，菌落计数换算成每克胃组织菌落形成单位数（CFU/g），计算公式为：Hp定植密度=Hp菌落数×稀释度/胃重量。

（3）小鼠胃部组织病理学检测：

HE染色：用石蜡包埋经10% 甲醛固定的小鼠胃组织，切成约6 μm厚的组织切片，通过HE染色法观察胃组织炎症情况，并进行组织病理学评分。

评分标准如下：

无明显可见白细胞（淋巴细胞和中性粒细胞）浸润为0分；

在胃粘膜固有层深部有少许散在白细胞浸润为1分；

在胃粘膜深部至中部固有层有中等程度白细胞浸润为2分；

在胃粘膜深部至中部固有层有大量白细胞浸润，少量微脓肿为3分；

在胃粘膜固有层全层至黏膜下层有严重弥散性白细胞浸润，微脓肿较多为4分。

免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡后，经正常山羊血清封闭，室温，10min；滴加适当比例稀释的Rabbit anti-Hp，37℃，1h；经洗涤后，滴加羊抗兔IgG-HRP，37℃，10min；DAB显色，冲洗，复染，封片。

结果如图7所示，其中图7a为qPCR实验结果，图7b为Hp定量培养试验结果，图7c为快速尿素酶活性检测。LL-plSAM-FVpE免疫小鼠后，灌胃Hp，经qPCR、Hp定量培养和快速尿素酶活性检测，实验结果表明：LL-plSAM-FVpE和SAM-FVpE免疫组小鼠胃部的Hp定植数显著减少，尿素酶活性降低（图7a、图7b和图7c）。

结果如图8所示，图8a为胃组织病理学评分图，图8b为HE染色典型图片，图8c为免疫组化染色图。胃组织病理学实验结果表明LL-plSAM和SAM免疫组小鼠的胃黏膜和胃黏膜下层有大量白细胞浸润，胃部炎症比较明显，有明显Hp定植；LL-plSAM-FVpE和SAM-FVpE免疫组小鼠的胃部炎症显著减轻，无明显Hp定植（图8a、图8b和图8c）。

实施例7：重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE免疫后小鼠特异性抗体的检测

小鼠经重组乳酸菌LL-plSAM-FVpE免疫后，处死，取血清1:1000稀释，取胃黏液和肠液1:5倍稀释。按100 μL/孔加入已包被Hp裂解液的ELISA板，37 ℃，60 min。洗4次后，加入HRP标记羊抗鼠IgG或IgA（1:10000），100 μL/孔，37 ℃，60 min。洗4次后，加入TMB显色液，室温，10 min，加100 μL终止液，测定OD₄₅₀值。

结果如图9所示，图9a是血清学抗体检测，图9b是黏膜sIgA抗体检测。LL-plSAM-FVpE免疫预防小鼠后，灌胃Hp。Elisa实验结果表明：LL-plSAM-FVpE和SAM-FVpE免疫组小鼠能产生Hp特异性IgG和sIgA；然而，LL-plSAM和SAM免疫组小鼠不能够产生Hp特异性IgG和sIgA（图9a和图9b）。

综上可以看出，本发明提供的重组乳酸菌疫苗LL-plSAM-FVpE可将分泌表达重组抗原SAM-FVpE，将其展示在乳酸菌表面，并把重组抗原靶向投递给胃肠道M细胞，提高M细胞对重组抗原的摄取和转运效率，诱导机体产生针对Hp多种关键毒力因子的特异性黏膜免疫应答，具有防治幽门螺旋杆菌感染相关性胃病的潜力。

以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁夏医科大学

<120> M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗及制备方法与应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 671

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Thr Phe Glu Ile Leu Lys His Leu Gln Ala Asp Ala Ile Val

1 5 10 15

Leu Phe Met Lys Val His Asn Phe His Trp Asn Val Lys Gly Thr Asp

20 25 30

Phe Phe Asn Val His Lys Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Glu Glu Phe Ala

35 40 45

Asp Met Phe Asp Asp Leu Ala Glu Arg Ile Val Gln Leu Gly His His

50 55 60

Pro Leu Val Thr Leu Ser Glu Ala Ile Lys Leu Thr Arg Val Lys Glu

65 70 75 80

Glu Thr Lys Thr Ser Phe His Ser Lys Asp Ile Phe Lys Glu Ile Leu

85 90 95

Glu Asp Tyr Lys Tyr Leu Glu Lys Glu Phe Lys Glu Leu Ser Asn Thr

100 105 110

Ala Glu Lys Glu Gly Asp Lys Val Thr Val Thr Tyr Ala Asp Asp Gln

115 120 125

Leu Ala Lys Leu Gln Lys Ser Ile Trp Met Leu Gln Ala His Leu Ala

130 135 140

His Met Ile His Asn Asn Ala Leu Ser Ser Val Leu Met Gly Ser His

145 150 155 160

Asn Gly Ile Glu Pro Glu Lys Val Ser Leu Leu Tyr Gly Gly Asn Gly

165 170 175

Gly Pro Glu Ala Arg His Asp Trp Asn Ala Thr Val Gly Tyr Lys Asn

180 185 190

Gln Gln Gly Asp Asn Val Ala Thr Leu Ile Asn Val His Met Lys Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Leu Val Ile Ala Gly Gly Glu Lys Gly Ile Asn Asn Pro

210 215 220

Ser Phe Tyr Leu Tyr Lys Glu Asp Gln Leu Thr Gly Ser Gln Arg Ala

225 230 235 240

Leu Ser Gln Glu Glu Ile Gln Asn Lys Val Asp Phe Met Glu Phe Leu

245 250 255

Ala Gln Asn Asn Ala Lys Leu Asp Asn Leu Ser Lys Lys Glu Lys Glu

260 265 270

Lys Phe Gln Asn Glu Ile Glu Asp Phe Gly Ser Ala Phe Phe Thr Thr

275 280 285

Val Ile Ile Pro Ala Ile Val Gly Gly Ile Ala Thr Gly Thr Ala Val

290 295 300

Gly Thr Val Ser Gly Leu Leu Gly Trp Gly Leu Lys Gln Ala Glu Glu

305 310 315 320

Ala Asn Lys Thr Pro Asp Lys Pro Asp Asn Ser Thr Gln Lys Thr Glu

325 330 335

Val Gln Pro Thr Gln Val Ile Asp Gly Pro Phe Ala Gly Gly Lys Asp

340 345 350

Thr Val Val Asn Ile Asp Arg Ile Asn Thr Lys Ala Asp Gly Thr Ile

355 360 365

Lys Val Gly Gly Phe Lys Ala Ser Leu Thr Thr Asn Ala Ala His Leu

370 375 380

Asn Ile Gly Lys Gly Gly Val Asn Leu Ser Asn Gln Ala Ser Gly Arg

385 390 395 400

Thr Leu Leu Val Glu Asn Leu Thr Gly Asn Ile Thr Val Asp Gly Pro

405 410 415

Leu Arg Val Asn Asn Gln Val Gly Gly Tyr Ala Leu Ala Gly Ser Ser

420 425 430

Ala Asn Phe Glu Phe Lys Ala Gly Val Asp Thr Lys Asn Gly Thr Ala

435 440 445

Thr Phe Asn Asn Asp Ile Ser Leu Gly Arg Phe Val Asn Leu Lys Val

450 455 460

Asp Ala His Thr Ala Asn Phe Lys Gly Ile Asp Thr Gly Asn Gly Gly

465 470 475 480

Phe Asn Thr Leu Asp Phe Ser Gly Val Thr Asn Lys Lys Leu Asp Pro

485 490 495

Arg Val Pro Ser Ser Val Ala Ser Met Ile His Glu Val Gly Ile Glu

500 505 510

Ala Met Phe Pro Asp Gly Lys Lys Val Ala Ser Met Ile His Glu Val

515 520 525

Gly Ile Glu Ala Met Phe Pro Asp Gly Lys Lys Ser Ala Ile Asn His

530 535 540

Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr

545 550 555 560

Asp Thr Lys Lys Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys

565 570 575

Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Lys Lys Ser Val Glu

580 585 590

Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn Arg Arg Ile Phe Gly Phe Asn Ala Leu

595 600 605

Val Asp Gly Ser Ser Val Glu Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn Arg Arg

610 615 620

Ile Phe Gly Phe Asn Ala Leu Val Asp Gly Ser Ser Ile Lys Glu Asp

625 630 635 640

Val Gln Phe Gly Ser Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Gly Ser Ser

645 650 655

Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Leu Glu His His His His His His

660 665 670

<210> 2

<211> 2013

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggagacct ttgaaatcct gaaacacctg caagccgacg ccattgtcct gtttatgaaa 60

gtccacaact tccattggaa cgtgaaaggt acggactttt tcaacgtgca taaagccacc 120

gaagaaatct acgaagaatt cgctgatatg ttcgatgacc tggcggaacg cattgttcag 180

ctgggccatc acccgctggt cacgctgagc gaagcgatca aactgacccg tgttaaagaa 240

gaaaccaaga cgagctttca ctctaaagac atcttcaagg aaatcctgga agattacaag 300

tacctggaaa aggaattcaa ggaactgagc aataccgccg aaaaagaagg tgataaggtg 360

accgttacgt atgctgatga ccagctggcg aaactgcaaa agtctatttg gatgctgcag 420

gcacatctgg ctcatatgat tcacaacaac gcactgtcct ctgtcctgat gggctctcac 480

aatggtatcg aaccggaaaa agtctccctg ctgtatggtg gcaacggcgg tccggaagca 540

cgtcatgatt ggaacgctac cgtcggctat aaaaaccagc aaggtgacaa tgtggcgacg 600

ctgattaacg ttcacatgaa aaatggcagt ggtctggtga ttgccggcgg tgaaaaaggc 660

atcaacaatc cgtcctttta tctgtacaaa gaagatcagc tgaccggtag ccaacgcgcg 720

ctgtctcagg aagaaatcca aaacaaagtt gatttcatgg aattcctggc gcagaacaat 780

gccaaactgg acaacctgag caaaaaagaa aaagaaaaat tccagaacga aatcgaagac 840

ttcggatccg ccttctttac cacggtaatc atcccagcaa ttgtgggcgg cattgctacc 900

ggcaccgccg tgggcacagt tagtggcctg ttaggatggg gtctgaagca ggcggaagaa 960

gcgaacaaga ccccagataa accggataat tcaacccaga aaacggaagt gcagcccacg 1020

caagtcatcg atggtccgtt tgccggggga aaggataccg tagtcaacat tgatcgcatc 1080

aacacgaaag ccgacggcac cattaaagta ggaggcttca aagcctcact gacaacgaac 1140

gcggcgcatc tgaatatcgg caaaggcgga gtaaaccttt caaatcaggc ctcggggcgt 1200

accttattag tggaaaatct gaccggcaac atcaccgtag acggcccgtt gcgcgttaac 1260

aatcaagtgg gcggttatgc actcgccggt tcgtccgcta acttcgaatt taaagccggc 1320

gtagatacca aaaacggcac cgcgaccttt aataacgata tttcgctggg ccgtttcgtt 1380

aacttgaagg tggacgcgca tactgcaaat tttaaaggca ttgacacggg taacggaggt 1440

ttcaataccc tggatttcag cggtgtgacc aacaaaaagc ttgatccgcg ggtaccgagc 1500

agcgtggcga gcatgattca tgaagtgggc attgaagcga tgtttccgga tggcaaaaaa 1560

gtggcgagca tgattcatga agtgggcatt gaagcgatgt ttccggatgg caaaaaaagc 1620

gcgattaacc atgcgctgga tgtggcggat aaatatgatg tgcaggtggc gattcatacc 1680

gataccaaaa aaagcgcgat taaccatgcg ctggatgtgg cggataaata tgatgtgcag 1740

gtggcgattc ataccgatac caaaaaaagc gtggaactga ttgatattgg cggcaaccgc 1800

cgcatttttg gctttaacgc gctggtggat ggcagcagcg tggaactgat tgatattggc 1860

ggcaaccgcc gcatttttgg ctttaacgcg ctggtggatg gcagcagcat taaagaagat 1920

gtgcagtttg gcagcagcat taaagaagat gtgcagtttg gcagcagcat taaagaagat 1980

gtgcagtttc tcgagcacca ccaccaccac cac 2013

<210> 3

<211> 292

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Glu Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val

1 5 10 15

Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Leu Glu Ile

20 25 30

Ser Ser Thr Cys Asp Ala Ala Cys Thr Thr Tyr Thr Val Lys Ser Gly

35 40 45

Asp Thr Leu Trp Gly Ile Ser Gln Arg Tyr Gly Ile Ser Val Ala Gln

50 55 60

Ile Gln Ser Ala Asn Asn Leu Lys Ser Thr Ile Ile Tyr Ile Gly Gln

65 70 75 80

Lys Leu Val Leu Thr Gly Ser Ala Ser Ser Thr Asn Ser Gly Gly Ser

85 90 95

Asn Asn Ser Ala Ser Thr Thr Pro Thr Thr Ser Val Thr Pro Ala Lys

100 105 110

Pro Thr Ser Gln Thr Thr Val Lys Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Trp

115 120 125

Ala Leu Ser Val Lys Tyr Lys Thr Ser Ile Ala Gln Leu Lys Ser Trp

130 135 140

Asn His Leu Ser Ser Asp Thr Ile Tyr Ile Gly Gln Asn Leu Ile Val

145 150 155 160

Ser Gln Ser Ala Ala Ala Ser Asn Pro Ser Thr Gly Ser Gly Ser Thr

165 170 175

Ala Thr Asn Asn Ser Asn Ser Thr Ser Ser Asn Ser Asn Ala Ser Ile

180 185 190

His Lys Val Val Lys Gly Asp Thr Leu Trp Gly Leu Ser Gln Lys Ser

195 200 205

Gly Ser Pro Ile Ala Ser Ile Lys Ala Trp Asn His Leu Ser Ser Asp

210 215 220

Thr Ile Leu Ile Gly Gln Tyr Leu Arg Ile Lys Gly Thr Thr Ser Ser

225 230 235 240

Arg Cys Lys Ser Thr His Pro Leu Ser Cys Ser Phe His Gln Leu Pro

245 250 255

Ala Arg Ser Pro Leu Pro Ser Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Val Leu Val

260 265 270

Met Lys Ala Asn Ser Ser Tyr Ser Gly Asn Tyr Pro Tyr Ser Ile Leu

275 280 285

Phe Gln Lys Phe

290

<210> 4

<211> 879

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggagatga aaaaaaagat tatctcagct attttaatgt ctacagtgat actttctgct 60

gcagccccgt tgtcaggtgt ttacgcttta gaaatttcat caacatgtga tgctgcatgc 120

actacttata ccgtcaaatc tggtgatact ctttggggaa tctcacaaag atatggaatt 180

agtgtcgctc aaattcaaag tgcgaataat cttaaaagta ccattatcta cattggtcaa 240

aaacttgtac tgacaggttc agcttcttct acaaattcag gtggttcaaa caattccgca 300

agcactactc caaccacttc tgtgacacct gcaaaaccaa cttcacaaac aactgttaag 360

gttaaatccg gagataccct ttgggcgcta tcagtaaaat ataaaactag tattgctcaa 420

ttgaaaagtt ggaatcattt aagttcagat accatttata ttggtcaaaa tcttattgtt 480

tcacaatctg ctgctgcttc aaatccttcg acaggttcag gctcaactgc taccaataac 540

tcaaactcga cttcttctaa ctcaaatgcc tcaattcata aggtcgttaa aggagatact 600

ctctggggac tttcgcaaaa atctggcagc ccaattgctt caatcaaggc ttggaatcat 660

ttatctagcg atactatttt aattggtcag tatctacgaa taaaaggtac cactagttct 720

agatgtaaat caacacatcc attatcatgt tcatttcatc aattaccagc tcgttcacca 780

ttaccatcat tagatgctgg tcaatatgtt ttagttatga aagctaattc atcatattca 840

ggtaattatc catattcaat tttatttcaa aaattttga 879

<210> 5

<211> 961

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Glu Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val

1 5 10 15

Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Leu Glu Ile

20 25 30

Ser Ser Thr Cys Asp Ala Ala Cys Thr Thr Tyr Thr Val Lys Ser Gly

35 40 45

Asp Thr Leu Trp Gly Ile Ser Gln Arg Tyr Gly Ile Ser Val Ala Gln

50 55 60

Ile Gln Ser Ala Asn Asn Leu Lys Ser Thr Ile Ile Tyr Ile Gly Gln

65 70 75 80

Lys Leu Val Leu Thr Gly Ser Ala Ser Ser Thr Asn Ser Gly Gly Ser

85 90 95

Asn Asn Ser Ala Ser Thr Thr Pro Thr Thr Ser Val Thr Pro Ala Lys

100 105 110

Pro Thr Ser Gln Thr Thr Val Lys Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Trp

115 120 125

Ala Leu Ser Val Lys Tyr Lys Thr Ser Ile Ala Gln Leu Lys Ser Trp

130 135 140

Asn His Leu Ser Ser Asp Thr Ile Tyr Ile Gly Gln Asn Leu Ile Val

145 150 155 160

Ser Gln Ser Ala Ala Ala Ser Asn Pro Ser Thr Gly Ser Gly Ser Thr

165 170 175

Ala Thr Asn Asn Ser Asn Ser Thr Ser Ser Asn Ser Asn Ala Ser Ile

180 185 190

His Lys Val Val Lys Gly Asp Thr Leu Trp Gly Leu Ser Gln Lys Ser

195 200 205

Gly Ser Pro Ile Ala Ser Ile Lys Ala Trp Asn His Leu Ser Ser Asp

210 215 220

Thr Ile Leu Ile Gly Gln Tyr Leu Arg Ile Lys Gly Thr Met Glu Thr

225 230 235 240

Phe Glu Ile Leu Lys His Leu Gln Ala Asp Ala Ile Val Leu Phe Met

245 250 255

Lys Val His Asn Phe His Trp Asn Val Lys Gly Thr Asp Phe Phe Asn

260 265 270

Val His Lys Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Glu Glu Phe Ala Asp Met Phe

275 280 285

Asp Asp Leu Ala Glu Arg Ile Val Gln Leu Gly His His Pro Leu Val

290 295 300

Thr Leu Ser Glu Ala Ile Lys Leu Thr Arg Val Lys Glu Glu Thr Lys

305 310 315 320

Thr Ser Phe His Ser Lys Asp Ile Phe Lys Glu Ile Leu Glu Asp Tyr

325 330 335

Lys Tyr Leu Glu Lys Glu Phe Lys Glu Leu Ser Asn Thr Ala Glu Lys

340 345 350

Glu Gly Asp Lys Val Thr Val Thr Tyr Ala Asp Asp Gln Leu Ala Lys

355 360 365

Leu Gln Lys Ser Ile Trp Met Leu Gln Ala His Leu Ala His Met Ile

370 375 380

His Asn Asn Ala Leu Ser Ser Val Leu Met Gly Ser His Asn Gly Ile

385 390 395 400

Glu Pro Glu Lys Val Ser Leu Leu Tyr Gly Gly Asn Gly Gly Pro Glu

405 410 415

Ala Arg His Asp Trp Asn Ala Thr Val Gly Tyr Lys Asn Gln Gln Gly

420 425 430

Asp Asn Val Ala Thr Leu Ile Asn Val His Met Lys Asn Gly Ser Gly

435 440 445

Leu Val Ile Ala Gly Gly Glu Lys Gly Ile Asn Asn Pro Ser Phe Tyr

450 455 460

Leu Tyr Lys Glu Asp Gln Leu Thr Gly Ser Gln Arg Ala Leu Ser Gln

465 470 475 480

Glu Glu Ile Gln Asn Lys Val Asp Phe Met Glu Phe Leu Ala Gln Asn

485 490 495

Asn Ala Lys Leu Asp Asn Leu Ser Lys Lys Glu Lys Glu Lys Phe Gln

500 505 510

Asn Glu Ile Glu Asp Phe Gly Ser Ala Phe Phe Thr Thr Val Ile Ile

515 520 525

Pro Ala Ile Val Gly Gly Ile Ala Thr Gly Thr Ala Val Gly Thr Val

530 535 540

Ser Gly Leu Leu Gly Trp Gly Leu Lys Gln Ala Glu Glu Ala Asn Lys

545 550 555 560

Thr Pro Asp Lys Pro Asp Asn Ser Thr Gln Lys Thr Glu Val Gln Pro

565 570 575

Thr Gln Val Ile Asp Gly Pro Phe Ala Gly Gly Lys Asp Thr Val Val

580 585 590

Asn Ile Asp Arg Ile Asn Thr Lys Ala Asp Gly Thr Ile Lys Val Gly

595 600 605

Gly Phe Lys Ala Ser Leu Thr Thr Asn Ala Ala His Leu Asn Ile Gly

610 615 620

Lys Gly Gly Val Asn Leu Ser Asn Gln Ala Ser Gly Arg Thr Leu Leu

625 630 635 640

Val Glu Asn Leu Thr Gly Asn Ile Thr Val Asp Gly Pro Leu Arg Val

645 650 655

Asn Asn Gln Val Gly Gly Tyr Ala Leu Ala Gly Ser Ser Ala Asn Phe

660 665 670

Glu Phe Lys Ala Gly Val Asp Thr Lys Asn Gly Thr Ala Thr Phe Asn

675 680 685

Asn Asp Ile Ser Leu Gly Arg Phe Val Asn Leu Lys Val Asp Ala His

690 695 700

Thr Ala Asn Phe Lys Gly Ile Asp Thr Gly Asn Gly Gly Phe Asn Thr

705 710 715 720

Leu Asp Phe Ser Gly Val Thr Asn Lys Lys Leu Asp Pro Arg Val Pro

725 730 735

Ser Ser Val Ala Ser Met Ile His Glu Val Gly Ile Glu Ala Met Phe

740 745 750

Pro Asp Gly Lys Lys Val Ala Ser Met Ile His Glu Val Gly Ile Glu

755 760 765

Ala Met Phe Pro Asp Gly Lys Lys Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp

770 775 780

Val Ala Asp Lys Tyr Asp Val Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Lys

785 790 795 800

Lys Ser Ala Ile Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp Lys Tyr Asp Val

805 810 815

Gln Val Ala Ile His Thr Asp Thr Lys Lys Ser Val Glu Leu Ile Asp

820 825 830

Ile Gly Gly Asn Arg Arg Ile Phe Gly Phe Asn Ala Leu Val Asp Gly

835 840 845

Ser Ser Val Glu Leu Ile Asp Ile Gly Gly Asn Arg Arg Ile Phe Gly

850 855 860

Phe Asn Ala Leu Val Asp Gly Ser Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe

865 870 875 880

Gly Ser Ser Ile Lys Glu Asp Val Gln Phe Gly Ser Ser Ile Lys Glu

885 890 895

Asp Val Gln Phe Leu Glu His His His His His His Ser Arg Cys Lys

900 905 910

Ser Thr His Pro Leu Ser Cys Ser Phe His Gln Leu Pro Ala Arg Ser

915 920 925

Pro Leu Pro Ser Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Val Leu Val Met Lys Ala

930 935 940

Asn Ser Ser Tyr Ser Gly Asn Tyr Pro Tyr Ser Ile Leu Phe Gln Lys

945 950 955 960

Phe

<210> 6

<211> 2886

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggagatga aaaaaaagat tatctcagct attttaatgt ctacagtgat actttctgct 60

gcagccccgt tgtcaggtgt ttacgcttta gaaatttcat caacatgtga tgctgcatgc 120

actacttata ccgtcaaatc tggtgatact ctttggggaa tctcacaaag atatggaatt 180

agtgtcgctc aaattcaaag tgcgaataat cttaaaagta ccattatcta cattggtcaa 240

aaacttgtac tgacaggttc agcttcttct acaaattcag gtggttcaaa caattccgca 300

agcactactc caaccacttc tgtgacacct gcaaaaccaa cttcacaaac aactgttaag 360

gttaaatccg gagataccct ttgggcgcta tcagtaaaat ataaaactag tattgctcaa 420

ttgaaaagtt ggaatcattt aagttcagat accatttata ttggtcaaaa tcttattgtt 480

tcacaatctg ctgctgcttc aaatccttcg acaggttcag gctcaactgc taccaataac 540

tcaaactcga cttcttctaa ctcaaatgcc tcaattcata aggtcgttaa aggagatact 600

ctctggggac tttcgcaaaa atctggcagc ccaattgctt caatcaaggc ttggaatcat 660

ttatctagcg atactatttt aattggtcag tatctacgaa taaaaggtac catggagacc 720

tttgaaatcc tgaaacacct gcaagccgac gccattgtcc tgtttatgaa agtccacaac 780

ttccattgga acgtgaaagg tacggacttt ttcaacgtgc ataaagccac cgaagaaatc 840

tacgaagaat tcgctgatat gttcgatgac ctggcggaac gcattgttca gctgggccat 900

cacccgctgg tcacgctgag cgaagcgatc aaactgaccc gtgttaaaga agaaaccaag 960

acgagctttc actctaaaga catcttcaag gaaatcctgg aagattacaa gtacctggaa 1020

aaggaattca aggaactgag caataccgcc gaaaaagaag gtgataaggt gaccgttacg 1080

tatgctgatg accagctggc gaaactgcaa aagtctattt ggatgctgca ggcacatctg 1140

gctcatatga ttcacaacaa cgcactgtcc tctgtcctga tgggctctca caatggtatc 1200

gaaccggaaa aagtctccct gctgtatggt ggcaacggcg gtccggaagc acgtcatgat 1260

tggaacgcta ccgtcggcta taaaaaccag caaggtgaca atgtggcgac gctgattaac 1320

gttcacatga aaaatggcag tggtctggtg attgccggcg gtgaaaaagg catcaacaat 1380

ccgtcctttt atctgtacaa agaagatcag ctgaccggta gccaacgcgc gctgtctcag 1440

gaagaaatcc aaaacaaagt tgatttcatg gaattcctgg cgcagaacaa tgccaaactg 1500

gacaacctga gcaaaaaaga aaaagaaaaa ttccagaacg aaatcgaaga cttcggatcc 1560

gccttcttta ccacggtaat catcccagca attgtgggcg gcattgctac cggcaccgcc 1620

gtgggcacag ttagtggcct gttaggatgg ggtctgaagc aggcggaaga agcgaacaag 1680

accccagata aaccggataa ttcaacccag aaaacggaag tgcagcccac gcaagtcatc 1740

gatggtccgt ttgccggggg aaaggatacc gtagtcaaca ttgatcgcat caacacgaaa 1800

gccgacggca ccattaaagt aggaggcttc aaagcctcac tgacaacgaa cgcggcgcat 1860

ctgaatatcg gcaaaggcgg agtaaacctt tcaaatcagg cctcggggcg taccttatta 1920

gtggaaaatc tgaccggcaa catcaccgta gacggcccgt tgcgcgttaa caatcaagtg 1980

ggcggttatg cactcgccgg ttcgtccgct aacttcgaat ttaaagccgg cgtagatacc 2040

aaaaacggca ccgcgacctt taataacgat atttcgctgg gccgtttcgt taacttgaag 2100

gtggacgcgc atactgcaaa ttttaaaggc attgacacgg gtaacggagg tttcaatacc 2160

ctggatttca gcggtgtgac caacaaaaag cttgatccgc gggtaccgag cagcgtggcg 2220

agcatgattc atgaagtggg cattgaagcg atgtttccgg atggcaaaaa agtggcgagc 2280

atgattcatg aagtgggcat tgaagcgatg tttccggatg gcaaaaaaag cgcgattaac 2340

catgcgctgg atgtggcgga taaatatgat gtgcaggtgg cgattcatac cgataccaaa 2400

aaaagcgcga ttaaccatgc gctggatgtg gcggataaat atgatgtgca ggtggcgatt 2460

cataccgata ccaaaaaaag cgtggaactg attgatattg gcggcaaccg ccgcattttt 2520

ggctttaacg cgctggtgga tggcagcagc gtggaactga ttgatattgg cggcaaccgc 2580

cgcatttttg gctttaacgc gctggtggat ggcagcagca ttaaagaaga tgtgcagttt 2640

ggcagcagca ttaaagaaga tgtgcagttt ggcagcagca ttaaagaaga tgtgcagttt 2700

ctcgagcacc accaccacca ccactctaga tgtaaatcaa cacatccatt atcatgttca 2760

tttcatcaat taccagctcg ttcaccatta ccatcattag atgctggtca atatgtttta 2820

gttatgaaag ctaattcatc atattcaggt aattatccat attcaatttt atttcaaaaa 2880

ttttga 2886

Claims

1.一种M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗，其特征在于，所述M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗包括将重组抗原展示到表面的可靶向M细胞的重组乳酸菌；所述重组抗原包括幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE和核心组件SAM，所述重组抗原为重组抗原SAM-FVpE，所述幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述核心组件SAM的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述重组抗原SAM-FVpE的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2. 如权利要求1所述的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗，其特征在于，编码所述幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3. 根据权利要求1所述的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗，其特征在于，所述核心组件SAM的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗，编码靶向黏膜M细胞的所述重组抗原SAM-FVpE的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.权利要求1-4任一项所述的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗在制备防治幽门螺旋杆菌感染相关性胃病的药物中的应用。

6.根据权利要求1所述的M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

将如序列SEQ ID NO.2所示的幽门螺旋杆菌毒力因子多表位肽FVpE基因片段通过一步法克隆技术克隆进所述的plSAM重组载体中，得到plSAM-FVpE重组载体；

将所述plSAM-FVpE重组载体转化进表达宿主细胞，通过培养和诱导剂诱导表达，得到表达重组抗原SAM-FVpE的靶向黏膜M细胞的重组细胞。

7.根据权利要求6所述M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗的制备方法，其特征在于，所述表达宿主细胞为乳酸球菌。

8.根据权利要求7所述M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗的制备方法，其特征在于，所述乳酸球菌为NZ9000菌株。

9.根据权利要求6所述M细胞靶向性重组乳酸菌疫苗的制备方法，其特征在于，所述诱导剂为Nisin诱导剂，所述Nisin诱导剂的终浓度为1ng/mL。