CN111748020B

CN111748020B - FimHEd在制备基于枯草芽孢杆菌芽孢载体的鱼类靶向口服疫苗中的应用

Info

Publication number: CN111748020B
Application number: CN202010630949.5A
Authority: CN
Inventors: 宁德刚; 师忠港; 张淼
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2021-09-14
Anticipated expiration: 2040-07-03
Also published as: CN111748020A

Abstract

本发明涉及爱德华氏菌(Edwardsiella)的I型纤毛蛋白FimH(FimH_Ed)的应用，具体是FimH_Ed在制备基于枯草芽孢杆菌芽孢传递载体的鱼类靶向口服疫苗中的应用。本发明以FimH_Ed作为鱼类口服疫苗靶向肠道粘膜上皮细胞的配体，以枯草芽孢杆菌芽孢为靶向配体和特异抗原蛋白的传递载体，利用新一代芽孢表面展示技术构建表面展示靶向配体和特异抗原的重组芽孢，制备靶向口服疫苗。以颗粒饲料包被靶向口服疫苗，通过传递载体表面的靶向配体FimH_Ed介导肠道粘膜上皮细胞提取特异抗原。本发明优点在于利用FimH_Ed的靶向作用促进芽孢载体传递的特异抗原突破肠道粘膜上皮屏障，提高了鱼类口服疫苗的免疫保护效果。

Description

FimHEd在制备基于枯草芽孢杆菌芽孢载体的鱼类靶向口服疫苗中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及利用爱德华氏菌(Edwardsiella)的I型纤毛蛋白FimH(FimH_Ed)作为特异抗原的靶向配体，以枯草芽孢杆菌芽孢作为靶向配体和特异抗原在鱼类消化道中的运送载体，通过新一代芽孢表面展示技术制备鱼类的靶向口服疫苗。

背景技术

口服疫苗是通过口服途径将特异抗原传递到肠道粘膜免疫器官，诱导包括细胞免疫和体液免疫的粘膜免疫反应[1,2]。口服疫苗操作方便，适合鱼类规模化接种。但鱼类消化道中蛋白酶、粘膜表面粘液、以及致密的粘膜上皮，构成消化道生理屏障[3]，使口服疫苗不能顺利到达粘膜免疫诱导位点和突破粘膜上皮进入粘膜免疫器官，导致口服疫苗免疫保护效果不佳。因此，口服疫苗不仅需要特异的抗原，还需要能将抗原运送到粘膜免疫诱导位点、并能介导特异抗原突破粘膜上皮进入粘膜免疫器官的传递载体。

哺乳动物小肠中的派尔斑和淋巴结是重要的肠道粘膜免疫器官，是抗原诱导肠道粘膜免疫的重要位点[4]。抗原主要通过粘膜免疫器官相关上皮层中的上皮细胞或M细胞表面受体，介导肠腔内抗原的提取，通过不同的转运机制，突破粘膜上皮进入粘膜免疫器官内[5]。尽管鱼类消化道没有派尔斑和淋巴结，但消化道的第二段中有分化程度较低的分散肠道相关淋巴组织[6,7]。这些粘膜免疫器官上皮层细胞也能以类似哺乳动物的机制，提取肠腔内的抗原或病原体，启动粘膜免疫反应。减毒的肠道病原体细菌或病毒[8]、以及一些具有低免疫原性、高生物相溶性脂质体、聚合物等可作为口服疫苗传递载体[9,10]。但这些载体在安全性、自身稳定性、抗原荷载和粘膜吸附能力等方面存在不同程度的缺陷，难以规模化应用[11-13]。

安全且具有独特抗逆性的枯草芽孢杆菌芽胞，被认为是一种潜在的口服疫苗传递载体。利用传统的芽孢表面展示技术将特异抗原展示于芽孢表面，特异抗原可通过动物胃肠道，并能诱导特异性免疫反应[14-17]。但由于传统芽孢表面展示技术以非必须基因作为整合位点，制备的重组芽孢能在小肠前端萌发成营养细胞[18]，导致展示在芽孢表面的异源抗原丢失[19]，影响免疫保护效果。新一代的芽孢表面展示技术，以控制芽孢萌发的关键基因作为重组基因在染色体上的整合位点，制备的表面展示外源抗原蛋白的芽孢萌发抑制，可提高芽孢载体在肠道中的稳定性[22]。但由于芽孢难以突破粘膜上皮屏障，基于芽孢载体的口服疫苗仍难产生理想的免疫效果。

广泛存在于水体环境中一些种类的爱德华氏菌(Edwardsiella)具有I型纤毛[23]，是一种广谱的鱼类病原体，导致鱼类严重的感染性疾病[24,25]。I型纤毛是爱德华氏菌重要的致病因子之一，通过其顶端的蛋白亚基FimH_Ed中的N末端保守结构域与粘膜上皮层细胞表面受体结合，吸附于粘膜表面，并介导爱德华氏菌细菌突破上皮屏障进入体内[23]。因此，FimH_Ed是鱼类口服疫苗传送载体潜在的靶向配体。

本发明的目的是利用FimH_Ed与鱼类肠道粘膜上皮中的细胞表面受体特异结合的特征，以FimH_Ed作为靶向配体，以枯草芽孢杆菌芽孢作为靶向配体和特异抗原在鱼类消化道中的运送载体，通过新一代芽孢表面展示技术制备表面展示特异抗原和靶向配体的重组芽孢，作为鱼类的靶向口服疫苗。

参考文献

1.Holmgren J,Czerkinsky C(2005)Mucosal immunity and vaccines.Nat Med11:45-53.

2.Shakya AK,Chowdhury MYE,Tao W,Gill HS(2016)Mucosal vaccinedelivery:Current state and a pediatric perspective.J Control Release 240:394-413.

3.Shalaby WS(1995)Development of oral vaccines to stimulate mucosaland systemic immunity:barriers and novel strategies.Clin Immunol Immunopathol74:127-134.

4.Cesta MF(2006)Normal Structure function and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue.Toxicologic Pathology 34:599-608.

5.Hase K,Kawano K,Nochi T,Pontes GS,Fukuda S,et al.(2009)Uptakethrough glycoprotein 2of FimH(+)bacteria by M cells initiates mucosal immuneresponse.Nature 462:226-230.

6.Rombout JH,Abelli L,Picchietti S,Scapigliati G,Kiron V(2011)Teleostintestinal immunology.Fish Shellfish Immunol 31:616-626.

7.Inami M,Taverne-Thiele AJ,

MB,Kiron V,Rombout JHWM(2009)Immunological differences in intestine and rectum of Atlantic cod(Gadusmorhua L.).Fish Shellfish Immunol 26:751-759.

8.Singh B,Maharjan S,Jiang T,Kang SK,Choi YJ,et al.(2015)Combinatorial approach of antigen delivery using M cell-homing peptide andmucoadhesive vehicle to enhance the efficacy of oral vaccine.Mol Pharm 12(11):3816-28.

9.Irvine DJ,Hanson MC,Rakhra K,Tokatlian T(2015)Syntheticnanoparticles for vaccines and immunotherapy.Chem Rev 115:11109-11146.

10.Liau JJ,Hook S,Prestidge CA,Barnes TJ(2015)A lipid based multi-compartmental system:Liposomes-in-double emulsion for oral vaccinedelivery.Eur J Pharm Biopharm 97(Pt A):15-21.

11.Azizi A,Kumar A,Diaz-Mitoma F,Mestecky J(2010)Enhancing oralvaccine potency by targeting intestinal M cells.PLoS Pathog 6:e1001147.

12.Tucker SN,Tingley DW,Scallan CD(2008)Oral adenoviral-basedvaccines:historical perspective and future opportunity.Expert Rev Vaccines 7:25-31.

13.Kotton CN,Lankowski AJ,Scott N,Sisul D,Chen LM,et al.(2006)Safetyand immunogenicity of attenuated Salmonella enterica serovar Typhimuriumdelivering an HIV-1 Gag antigen via the Salmonella Type III secretion systemVaccine 24:6216-6224.

14.Lee S,Belitsky BR,Brown DW,Brinker JP,Kerstein KO,et al.(2010)Efficacy,heat stability and safety of intranasally administered Bacillussubtilis spore or vegetative cell vaccines expressing tetanus toxin fragmentC.Vaccine 28:6658-6665.

15.Hoang TH,Hong HA,Clark GC,Titball RW,Cutting SM(2008)RecombinantBacillus subtilis expressing the Clostridium perfringens alpha toxoid is acandidate orally delivered vaccine against necrotic enteritis.Infect Immun76:5257-5265.

16.Permpoonpattana P,Hong HA,Phetcharaburanin J,Huang JM,Cook J,etal.(2011)Immunization with Bacillus spores expressing toxin A peptide repeatsprotects against infection with Clostridium difficile strains producingtoxins A and B.Infect Immun 79:2295-2302.

17.Hong HA,Hitri K,Hosseini S,Kotowicz N,Bryan D,et al.(2017)Mucosalantibodies to the C terminus of toxin A prevent colonization of Clostridiumdifficile.Infect Immun 85(4):e01060-16.

18.Tam NK,Uyen NQ,Hong HA,Duc le H,Hoa TT,et al.(2006)The intestinallife cycle of Bacillus subtilis and close relatives.J Bacteriol 188:2692-2700.

19.Hoelzer K,Bielke L,Blake DP,Cox E,Cutting SM,et al.(2018)Vaccinesas alternatives to antibiotics for food producing animals.Part 2:newapproaches and potential solutions.Vet Res 49:70.

20.Duc le H,Hong HA,Uyen NQ,Cutting SM(2004)Intracellular fate andimmunogenicity of B.subtilis spores.Vaccine 22:1873-1885.

21.Ceragioli M,Cangiano G,Esin S,Ghelardi E,Ricca E,et al.(2009)Phagocytosis,germination and killing of Bacillus subtilis spores presentingheterologous antigens in human macrophages.Microbiology 155:338-346.

22.宁德刚,张磊,费倩,韦瑶(2017)一种表面展示目的蛋白或酶的萌发缺陷和无抗生素抗性基因的重组芽孢制备方法.发明专利ZL201710338769.8.

23.Abbott SL,Janda JM(2006)The Genus Edwardsiella.Prokaryotes 6:72-89.

24.

N,Toranzo AE,

B(2018)Edwardsiella piscicida:Asignificant bacterial pathogen of cultured fish.Dis Aquat Organ 131:59-71.

25.Park SB,Aoki T,Jung TS(2012)Pathogenesis of and strategies forpreventing Edwardsiella tarda infection in fish.Vet Res 43:67.

发明内容

为了解决现有技术存在的不足，本发明提供FimH_Ed作为基于枯草芽孢杆菌芽孢为载体的鱼类口服疫苗靶向肠道粘膜上皮抗原提取细胞配体的应用。

以来源于鱼类病原体的FimH_Ed作为鱼类基于枯草芽孢杆菌芽孢载体的口服疫苗的靶向配体，利用新一代芽孢表面展示技术，构建表面展示FimH_Ed和特异性抗原的重组芽孢。以重组芽孢作为鱼类的靶向口服疫苗，通过鱼类颗粒饲料包被，并按一定剂量和流程口服接种特定鱼类。

本发明提供了爱德华氏菌(Edwardsiella)的I型纤毛蛋白FimH(FimH_Ed)在制备基于枯草芽孢杆菌芽孢传递载体的鱼类靶向口服疫苗中的应用。

本发明所述的应用，具体是以FimH_Ed作为鱼类肠道粘膜上皮细胞的靶向配体，以枯草芽孢杆菌芽孢为特异抗原蛋白和靶向配体的传递载体，通过芽孢表面展示方法制备表面展示靶向配体FimH_Ed和特异抗原的重组芽孢的鱼类靶向口服疫苗。

本发明所述的鱼类口服疫苗靶向配体，是以来源于感染鱼类的爱德华氏菌的FimH_Ed、或FimH_Ed的N末端保守结构域片段。FimH_Ed包括来自E.tarda(piscidida)strainEIB202(GenBanK ID：ACY83878)，E.piscicida strain MS-18-199(QBB11445.1),E.piscicida strain ETW41(ARD17356.1)，E.sp.EA181011(AKM48435.1),E.piscicidastrain CK41(QHR96563.1)，E.piscicida strain S11-285(AOP42464.1)，E.tarda KG8401(BAD00164.1)，E.piscicida C07-087(AGH73111.1)，E.anguillarum ET080813(AIJ09406.1)，E.tarda strain ET-1(WP_012847897.1)等的I型纤毛蛋白。

本发明所述的特异抗原为特定鱼类病原体的免疫保护性抗原。

本发明的应用，是通过芽孢表面展示方法制备表面展示靶向配体FimH_Ed和特异性抗原的无抗生素抗性基因和萌发抑制的重组芽孢。

本发明中，所述的重组芽孢是靶向配体FimH_Ed和特异抗原分别独立展示在芽孢表面，或靶向配体FimH_Ed和特异抗原融合展示在芽孢表面。

本发明还公开了一种鱼类靶向口服疫苗，是表面展示FimH_Ed和特异抗原的重组芽孢，所述特异抗原为鱼类病原体的免疫保护性抗原，因病原体的不同而不同。

本发明还公开了所述鱼类靶向口服疫苗的接种方法，是用鱼类的颗粒饲料包被所述的靶向口服疫苗，并按一定的剂量和流程口服接种。

本发明提供了FimH_Ed作为鱼类口服疫苗靶向配体的应用方法。本应用方法是指以枯草芽孢杆菌芽孢为载体，利用新一代芽孢表面展示技术将靶向配体以及特异抗原展示在载体的表面，制备表面展示靶向配体FimH_Ed和特异性抗原的无抗生素抗性基因、萌发抑制的重组芽孢。

本发明所述FimH_Ed应用方法中所指新一代芽孢表面展示技术，是基于Bacillussubtilis str.168及其衍生菌株的芽孢表面展示技术。如发明专利(宁德刚等，ZL201710338769.8)所描述，以抑制芽孢萌发的关键基因为重组基因在染色体上的整合位点，以两端含Xer重组酶切除位点nif序列的抗性基因为遗传筛选标记，以芽孢衣壳组分为锚定蛋白，用于制备无抗生素抗性基因、萌发抑制的表面展示特异抗原和靶向配体的重组芽孢。利用分别含有不同整合片段、不同抗生素抗性基因和不同锚定蛋白的平台载体，构建芽孢表面展示特异蛋白的整合性重组质粒，含不同抗性基因和整合位点的重组质粒单独转化或共转化枯草芽孢杆菌，通过Xer重组机制剔除抗生素抗性基因，通过控制芽孢萌发关键基因的插入失活抑制芽孢萌发，通过锚定蛋白将目的蛋白固定在芽孢表面。

本发明所述FimH_Ed应用方法中，利用新一代芽孢表面展示技术制备重组芽孢的过程简单概括为：分别将编码FimH_Ed和特异抗原的基因克隆于整合性平台载体pJS1700和pJS1837中(宁德刚等，ZL201710338769.8)，构建FimH_Ed和特异抗原分别独立表达、或FimH_Ed和特异抗原融合表达的整合性重组质粒；整合性重组质粒依次转化枯草芽孢杆菌，构建重组枯草芽孢杆菌菌株；利用负筛选技术筛选无生素抗性基因的重组菌株；诱导重组菌株产生表面展示特异抗原和靶向配体的、无抗生素抗性基因和萌发抑制的重组芽孢。

本发明所述FimH_Ed应用方法中，表面展示FimH_Ed和特异抗原的重组芽孢作为鱼类抗病原体感染的靶向口服疫苗。

本发明所述FimH_Ed应用方法中，所述的特定鱼类抗特定病原体感染的靶向口服疫苗，通过与未经油脂喷涂的颗粒饲料混合、吸附，以一定比例的植物油脂进行包被，并按一定剂量和流程，通过投喂方式接种靶向口服疫苗。

与本领域已知的方法相比，本发明优点在于利用FimH_Ed的靶向鱼类肠道粘膜上皮细胞的功能，促进芽孢载体传递的特异抗原突破肠道粘膜上皮屏障，提高鱼类口服疫苗的免疫保护效果。

附图说明

图1表达特异性抗原和靶向配体的枯草芽孢杆菌重组菌株的构建流程。来源于整合性平台载体pJS1700和pJS1834的重组质粒依次转化B.subtilis str.168，通过同源重组、正筛选、切除重组和负筛选，得到无抗生素抗性基因标记、gerKB和gerAA插入失活的重组菌株。细短箭头表示PCR鉴定重组菌株所用引物gerkB-1/2和gerAA-1/2的相对位置。

图2表达FimH_Ed202和ORF25枯草芽孢杆菌重组菌株的鉴定。1、3和5,以gerKB1和gerKB-2为引物PCR鉴定重组菌株DR2120/2121(Em^rKm^r)、DR2120/2122(Em^rKm^r)和DR2123/2124(Em^rKm^r)，扩增片段分别为gerKB::erm-cotB-orf25(3.5kb)、gerKB::erm-cotB-orf25(3.5kb)和gerKB::erm-cotB-orf25-fimH_Ed202(4.0kb)；2、4和6，以gerAA1和gerAA-2为引物PCR鉴定重组菌株DR2120/2121(Em^rKm^r)、DR2120/2122(Em^rKm^r)和DR2123/2124(Em^rKm^r)，扩增片段分别为gerAA::npt-cotC-orf25(3.1kb)、gerAA::npt-cotC-fimH_Ed202(2.5kb)和gerAA::npt-cotC-orf25-fimH_Ed202(3.6kb)。

图3无抗生素抗性基因的枯草芽孢杆菌重组菌株的鉴定。1、3和5,以gerKB1和gerKB-2为引物，PCR鉴定重组菌株DR2120/2121、DR2120/2122和DR2123/2124，扩增片段分别含有重组片段cotB-orf25(2.5kb)、cotB-orf25(2.5kb)和cotB-orf25-fimH_Ed202(3.0kb)；2、4和6，以gerAA1和gerAA-2为引物，PCR鉴定重组菌株DR2120/2121、DR2120/2122和DR2123/2124，扩增片段分别含有重组片段gerAA::cotC-orf25(2.1kb)、gerAA::cotC-fimH_Ed202(1.5kb)和gerAA::cotC-orf25-fimH_Ed202(2.6kb)。

图4ORF25和FimH_Ed202在重组芽孢衣壳中的表达。分别以ORF25和FimH_Ed202多克隆抗体，利用Western blot检测重组菌株DR2120/2121、DR2120/2122和DR2123/2124芽孢衣壳中的重组蛋白。根据重组蛋白分子量，确定芽孢衣壳中的重组蛋白ORF25和FimH_Ed202。

图5口服接种重组芽孢疫苗的异育银鲫抗ORF25的IgM抗体检测。异育银鲫分别口服接种DR2120/2121、DR2120/2122和DR2123/2124重组芽孢疫，并以口服接种B.subtilis168芽孢和未接种的异育银鲫为对照，通过间接ELISA定量检测口服接种后异育银鲫血清中的抗ORF25抗体IgM。

图6表达FimH_Ed202和Vp7的枯草芽孢杆菌重组菌株的鉴定。1、3和5,以gerKB1和gerKB-2为引物，PCR鉴定重组菌株DR2125/2126(Em^rKm^r)、DR2125/2122(Em^rKm^r)和DR2127/2128(Em^rKm^r)，扩增产物分别含重组片段gerKB::erm-cotB-vp7(3.1kb)、gerKB::erm-cotB-vp7(3.1kb)和gerKB::erm-cotB-vp7-fimH_Ed202(3.6kb)；2、4和6，以gerAA1和gerAA-2为引物，PCR鉴定重组菌株DR2125/2126(Em^rKm^r)、DR2125/2122(Em^rKm^r)和DR2127/2128(Em^rKm^r)，扩增片段分别含有重组片段gerAA::npt-cotC-vp7(2.7kb)、gerAA::npt-cotC-fimH_Ed202(2.5kb)和gerAA::npt-cotC-vp7-fimH_Ed202(3.2kb)。

图7无抗生素抗性基因的枯草芽孢杆菌重组菌株的鉴定。1、3和5,以gerKB1和gerKB-2为引物PCR鉴定重组菌株DR2125/2126、DR2125/2122和DR2127/2128，扩增片段分别为cotB-vp7(2.1kb)、cotB-vp7(2.1kb)和cotB-vp7-fimH_Ed202(2.6kb)；2、4和6，以gerAA1和gerAA-2为引物PCR鉴定重组菌株DR2125/2126、DR2125/2122和DR2127/2128，扩增片段分别为gerAA::cotC-vp7(1.7kb)、gerAA::cotC-fimH_Ed202(1.5kb)和gerAA::cotC-vp7-fimH_Ed202(2.2kb)。

图8Western blot检测VP7和FimH_Ed202在重组芽孢衣壳中的表达。分别以VP7和FimH_Ed202多克隆抗体，通过Western blot检测重组菌株DR2125/2126、DR2125/2122和DR2127/2128芽孢衣壳中的重组蛋白。根据重组蛋白分子量，确定芽孢衣壳中的重组蛋白VP7和FimH_Ed202。

图9口服接种重组芽孢疫苗的异育银鲫抗VP7的IgM抗体检测。异育银鲫分别口服接种DR2125/2126、DR2125/2122和DR2127/2128重组芽孢口服疫苗，并以口服接种B.subtilis 168芽孢和未接种的异育银鲫为对照，通过间接ELISA定量检测口服服接种异育银鲫血清中的抗VP7抗体IgM。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

本发明实施例中涉及的由发明人保存的生物材料，均可向公众提供20年。

本发明实施例中涉及的分子生物学技术按标准方法操作(Sambrook J,et al.2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)。枯草芽孢杆菌染色体的提取、大肠杆菌感受态细胞制备与转化、枯草芽孢杆菌感受态细胞制备和转化、无抗生素抗性基因重组菌株的筛选方法、重组芽孢的诱导与纯化、以及主要试剂的配制，按发明专利(宁德刚等，ZL201710338769.8)所描述方法进行。

本发明实施例中所使用的整合性平台载体pJS1700和pJS1837的结构特征和功能见发明专利(宁德刚等，ZL201710338769.8)。

本发明实施例中所用基因扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见下表1：

本发明实施例中使用的重组质粒、重组菌株、及其结构特征见下表2：

注：erm，红霉素抗性基因；npt，卡那霉素抗性基因。

本发明实施例的靶向配体为来源于Edwardsiella tarda(piscidida)EIB202的I型鞭毛蛋白FimH_Ed(FimH_Ed202,GenBanK ID：ACY83878)，其全长氨基酸序列如下(SED IDNO.11)：MKSLSIKQALAFTLLLLLGLCVSRQASALSCREGSNAGSWSPIGSIYQRIDIGRPIILSAADFTAGNLI WRSQNFTTTFTCWDNWNTGRGEHAYIYWNPKDAFGSLHRSLSVGVSINGIDYDAINLRQSGSRPSGPDLGEGTSNS GGGVARPRTVTVSYSVYIKATGITPPAGNFPALGLPSLFQIDGVGGLDARPNGNFNAYISGLDKIQVIHCNPQISVLANNGNSIDFGTLSAAGARPGVIARQIPFSIKATLRGGECGGQQLQASFSTLRPDVSDRSLILPDTNPGVGIFLTKAGDTSATPIPLQTNVDFGGRLQDKQNEVSENFTANLKWLTNRPTAGRFHATANIDVTFK。

其中斜体字母表示信号肽氨基酸序列，下划线字母表示N末端的凝聚素结构域的氨基酸序列，粗体字母表示C末端结构域。本发明实施例以Edwardsiella tarda EIB202的FimH_Ed的N末端结构域的多肽片段为靶向配体，并在其首个氨基酸前添加连接子(linker)，其序列为QISVLANN。根据枯草芽孢杆菌密码子偏好性，参照Edwardsiella tarda EIB202的FimH_Ed基因(GenBanK ID:NC_013508)，对编码FimH_Ed202的基因密码进行优化。为便于克隆，起始密码子和终止密码子位点分别添加NdeI和BamHI位点。优化后的基因(fimH_Ed202)序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。合成基因fimH_Ed202克隆于pUCK载体中，质粒命名为pJS2119

基因fimH_Ed202合成序列如下(SED ID NO.12)：

ATGCAGATCAGCGTGCTGGCGAATAACTCCGCGCTCTCCTGCCGAGAGGGCAGTAATGCAGGGAGCTGGTCGCCCATCGGGAGTATTTATCAGCGCATCGATATCGGGCGGCCGATTATCCTGTCCGCCGCCGACTTTACCGCCGGTAACCTGATTTGGCGTTCGCAGAACTTTACCACCACCTTTACCTGTTGGGATAACTGGAATACTGGAAGGGGAGAGCACGCCTACATTTACTGGAACCCGAAGGATGCGTTCGGGAGCCTGCACCGTTCGCTGTCGGTTGGGGTTTCGATCAACGGGATCGACTATGATGCGATTAACCTCAGACAGAGCGGCAGCCGGCCCAGTGGCCCCGATCTGGGTGAGGGGACCTCAAACAGCGGCGGCGGCGTCGCCAGACCGCGTACGGTCACCGTCAGCTATTCGGTGTACATCAAGGCCACCGGCATCACGCCGCCGGCGGGTAACTTCCCGGCGCTGGGGCTGCCGTCGCTGTTTCAAATTGACGGCGTGGGCGGCTTGGACGCGCGCCCCAACGGCAACTTTAACGCCTATATCTCCGGGCTGGATAAGATCCAGGTGATCCACTGCTAAGGATCC

本发明实施例中的特异抗原分别为异育银鲫造血器官坏死病原体鲤疱疹病病毒II型(CyHV2)的保护性抗原蛋白ORF25(GenBank ID:14011428)，以及草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的保护性抗原Vp7(GenBank ID:6218809)。据枯草芽孢杆菌密码子偏好性，分别对编码ORF25和Vp7的基因密码子进行优化。优化后基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

基因orf25合成序列如下(SED ID NO.13)：

CATATGGGGTTCCAACGGTGTCTGGTTCTGTTTTCGTGTCTGGCGGTGGTGTGTGACACTCAGAATACAACAACAACCACCACTACAACAACGCGAGCAACCACAACCGTTGGTGGTAATCTTACTACCACTACAGGCGCCTTTCCGATCAATTCTCTGGTCTACACTGTGGACTATAAGACTTCAAAATACTGTGCCGTCAACGGACTGCCCTATGAGATCAAGGCAACGTTTTCTTTTGACCGATATGATATCCGTAACCTTCAATGGCTGGCGTTCGACGCTGTGTTGGCGGCACCCAAGTTTGTATTCACGTTGACACGACCTCCGTCTACTCCATACGGCGCAAACAACCCTATGATCACTACCCTGCGCGTCAATCCCTTTCTCTACACGGATGCCACTGTGGACTATGCCATCAGCGCTGTGGGTCTTTTGCCGACGTTCGACCTGATCAAAATGTACTCGCCGTTACCATCCGGCTCCATCAAGGTGTCTTCGCTCTCGGTGTATACCACGGGCATAGATCCCATAACGTACGGGACAATCCTCACCTGTCAGAGTTCGTGTCAGCTGGACCCCGAGCTCAAGTTTGCCTGGTACAACTACGATCAGTTAGTGGTAGGCGCCGAGACCAACACTCTGACTACCAGTAACCCCGGACTCTACATGTGTACCGTACAAGGATCTCTTCTCTTTTCGACCAAGACGTGGGTGGGGAGACCCGTCTTTGACTGTCCGTTCAACGCAAACGCGTGGTGTACGCCGTCTACCACTCAACGTATACAGAGGTACGAGGACGATTCTCCGAGATCGTTTATCGAGGACGATCTCAAGCAACCCGGGACGGTCCTCGCGTGTCTATCCGCCAACGATACCGTCAAGGACATTGTCTCGCTGAGGGGCAGGTGCTCGGACAGGACCGTGTGTAACATGGAGGTCTCGGACCAGTGCTCCAACTTTATACCCAACGTCTACAACCCGTGCAACGTTACCGTGCACAAGTTTTGTCCCACGCAACTACCATTCACGTGGACGTCCCCTACACCCGAACTCGTCTCTGTGGCTCTGGGCACAAACAACCTGATGTTCAGCTCGGGCATAGTCAACACGTACTGCGGAAACCAAGCCGACATATTCGCAGTGTGCGCTGGACCGGACAAGGTCACGGAGCTGTCCTAAGGTACC

基因vp7合成序列如下(SED ID NO.14)：

CATATGCCACTTCACATGATTCCGCAAGTGGCCCACGCTATGGTGCGTGCAGCCGCTGCAGGACGCCTTACCTTATACACAAGAACTAGAACTGAAACCACCAACTTTGATCACGCTGAATACGTGACCTGCGGACGTTACACCATCTGCGCCTTCTGCCTTACGACTCTGGCTCCTCACGCCAACGTGAAGACCATTCAAGACTCACACGCTTGTTCACGTCAACCAAATGAAGCCATTCGCTCATTAGTGGAAGTGAGCGACAAAGCGCAGACCGCCCTCGTGGGAAGCCGTACTGTAGACTATCACGAATTGGATGTGAAAGCTGGATTCGTGGCCCCAACTGCCGATGAAACAATTGCCCCTTCTAAGGATATCGTGGAACTTCCGTTTCGCACCTGTGACTTGGACGATTCATCTGCTACCGCTTGCGTGCGAAATCACTGCCAGGCCGGACACGACGGAGTTATCCACCTCCCGATCCTTTCTGGAGATTTCAAATTGCCTAACGAACACCCTACCAAACCGTTGGACGATACGCACCCTCACGACAAGGTGCTGACTCGCTGCCCTAAGACTGGACTCCTCCTCGTGCACGACACTCACGCACACGCCACCGCCGTAGTTGCCACCGCTGCTACGAGAGCTATCCTCATGCACGACCTCCTTACATCAGCGAACGCGGATGACGGACACCAAGCACGTTCAGCTTGCTACGGACCAGCGTTTAACAACCTGACCTTCGCTTGCCACTCAACCTGTGCTTCAGATATGGCTCACTTCGACTGCGGACAGATCGTTGGACTCGACTTGCACGTGGAACCATCAGATTAAGGTACC

合成基因orf25和vp7分别克隆于pUCK载体(生工生物工程(上海)股份有限公司)中，分别命名为pJS1608a和pJS1603

实施例1

FimH_Ed202和ORF25分别独立表达的异育银鲫抗CyHV2口服重组芽孢疫苗

1、构建FimH_Ed202和ORF25分别独立表达的整合性质粒

以orf25-1和orf25-2为引物(见本发明表1)，pJS1608a(见本发明表2)为模板，PCR扩增orf25基因片段，以NdeI和BamHI酶切，回收产物分别克隆于整合性平台载体pJS1700和pJS1834中，构建整合性重组质粒pJS2120和pJS2121(见本发明表2)。重组质粒pJS2120和pJS2121分别含有gerKB::erm-cotB-orf25和gerAA::npt-cotC-orf25重组片段。

以NdeI和BamHI酶切质粒pJS2119，回收fimH_Ed202基因片段，克隆于整合性平台载体pJS1834中，构建整合性重组质粒pJS2122(见本发明表2)。重组质粒pJS2122中含有重组片段gerAA::npt-cotC-fimH_Ed202。

2、构建FimH_Ed202和ORF25分别独立表达的枯草芽孢杆菌重组菌株

将整合性重组质粒pJS2120和pJS2121依次转化B.stubtilis168，分别以0.4μg/mL的红霉素和10μg/mL的卡那霉素筛选转化子。分别通过重组载体上的gerKB和gerAA片段与染色体上同源片段双交换重组，重组片段erm-cotB-orf25和npt-cotC-orf25通过插入控制芽孢萌发基因gerKB和gerAA中整合于染色体，并导致gerKB和gerAA插入失活(见本发明附图说明和附图1)。利用特异性引物PCR鉴定的重组菌株，命名为DR2120/2121(Em^rKm^r)(见本发明附图说明和附图2，泳道1和2)。重组菌株染色体含重组基因gerKB::erm-cotB-orf25和gerAA::npt-cotC-orf25。

将整合性重组质粒pJS2120和pJS2122依次转化B.stubtilis168，分别以红霉素和卡那霉素筛选转化子。重组片段erm-cotB-orf25和npt-cotC-fimH_Ed202插入控制芽孢萌发基因gerKB和gerAA中整合于染色体上，导致gerKB和gerAA插入失活(见本发明附图说明和附图1)。利用特异性引物PCR鉴定的重组菌株(见本发明附图说明和附图2，泳道3和4)，并命名为DR2120/2122(Em^rKm^r)。重组菌株DR2120/2122(Em^rKm^r)染色体含重组基因gerKB::erm-cotB-orf25和gerAA::npt-cotC-fimH_Ed202。

3、筛选FimH_Ed202和ORF25分别独立表达的无抗生素抗性基因的重组菌株

根据发明专利(宁德刚等，ZL201710338769.8)所描述方法，以重组菌株DR2120/2121(Em^rKm^r)和DR2120/2122(Em^rKm^r)为出发菌株，依次筛选对红霉素和卡那霉素敏感的重组菌株(见本发明附图说明和附图1)。利用特异性引物鉴定的重组菌株分别命名为DR2120/2121和DR2120/2122(见本发明附图说明和附图3，泳道1和2、以及3和4)。DR2120/2121和DR2120/2122重组菌株染色体含重组基因gerKB::cotB-orf25/gerAA::cotC-orf25和gerKB::cotB-orf25/gerAA::cotC-fimH_Ed202(见本发明表2)。

4、制备FimH_Ed202和ORF25分别独立表达、无抗生素抗性基因和萌发抑制的重组芽孢

根据发明专利(宁德刚等，ZL201710338769.8)所描述方法，诱导重组菌株DR2120/2121和DR2120/2122形成芽孢，纯化后利用细胞计数板在相差显微镜下计数芽孢。取约10¹⁰个芽孢悬于0.3mL SDS-DTT缓冲液(0.1mM磷酸盐(pH7.0)或62.5mM Tris-HCl(pH6.8)，50mMDTT，1.5％SDS)中提取芽孢衣壳层蛋白，65℃处理10min，6000转/分钟离心，取上清中的衣壳蛋白。取1 0μg提取的衣壳蛋白，经过12％的变性聚丙烯酰胺凝胶分离，通过电转移将蛋白转移到PVDF膜上(Millipore，USA)。分别兔抗ORF25、Vp7和FimH_Ed202多克隆抗体为一抗(1：1000)，以辣根过氧化酶标记的山羊抗兔单克隆抗体(1:2500，生工生物工程(上海)股份有限公司)为二抗，以化学发光底物BeyoECL Plus(生工生物工程(上海)股份有限公司)使X光片曝光检测印迹蛋白。DR2120/2121芽孢衣壳中表达重组蛋白CotB-ORF25和CotC-ORF25(见本发明附图说明和附图4，泳道1)，DR2120/2122芽孢衣壳中表达重组蛋白CotB-ORF25和CotC-FimH_Ed202(见本发明附图说明和附图4，泳道2)。

5、颗粒饲料包被FimH_Ed202和ORF25分别独立表达的重组芽孢口服疫苗

分别以DR2120/2121和DR2120/2122制备的FimH_Ed202和ORF25分别独立表达、无抗生素抗性基因标记和萌发抑制的重组芽孢，作为异育银鲫抗CyHV2的重组芽孢口服疫苗。重组芽孢口服疫苗与异育银鲫颗粒饲料按2-3％混合，每克饲料含10¹⁰个芽孢，室温条件下静止吸附12h；按2％比例添加植物调和油，包被重组芽孢口服疫苗。

6、异育银鲫接种FimH_Ed202和ORF25分别独立表达的重组芽孢口服疫苗并采集血清

选择健康的体重为50.0±5.0g的异育银鲫，于室内适应性饲养5天后，筛选健康的异育银鲫用于口服接种抗CyHV2口服疫苗。随机选择15尾异育银鲫于体积为50L的水族箱中，充气泵连续充气，按照饵料系数为2.0的投喂量，早、中、晚各投喂1次。口服接种疫苗前一天停止投喂饲料。接种疫苗时按照2.0的投喂饲料包被口服疫苗，分早、中、晚3次投喂。完成接种口服疫苗后第1天停止投喂饲料，随后正常投喂；完成第一次口服接种疫苗后间隔7天，按第一次口服接种流程加强免疫接种一次。

完成接种重组芽孢口服疫苗后的第7d、21d、28d，采异育银鲫尾静脉采血0.5mL，分离血清，并以生理盐水(0.7％NaCl)将分离血清稀释100倍后于-20℃保存，用于检测抗ORF25的IgM抗体效价。

7、口服接种FimH_Ed202和ORF25分别独立表达的重组芽孢疫苗的异育银鲫抗ORF25抗体IgM效价

用间接酶联免疫法检测口服接种疫苗的异育银鲫血清中抗ORF25抗体IgM效价。用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)将纯化的重组抗原His₆-ORF25稀释至50μg/mL，每孔100μL加入96孔酶标板中，4℃冰箱过夜。以PBST(NaCl 8.0g/L,KCl 0.2g/L,KH₂PO₄ 0.2g/L,Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g/L,pH 7.4，0.05％(V/V)Tween20)洗涤包被板3-4次，每次3-5min；用含8％脱脂奶粉的PBS(NaCl 8.0g/L,KCl 0.2g/L,KH₂PO₄ 0.2g/L,Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g/L,pH 7.4)封闭，200μL/孔，37℃封闭2h，按上述相同方法洗涤。每孔加入稀释血清100μL异育银鲫血清，37℃孵育1h，按上述方法洗涤后，每孔加入100μL 1︰1000稀释的兔抗异育银鲫IgM抗体，37℃孵育1h，按上述方法洗涤。每孔加入50μL 1︰2000稀释的辣根氧化酶(HRP)标记山羊抗兔IgG酶标抗体(生工生物工程(上海)股份有限公司)，37℃孵育1h。按上述方法洗涤后，每孔加50μL磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)配制的邻苯二胺(OPD)底物，37℃避光显色10-l5min。每孔加50μL 2mol/L硫酸终止反应，用全波长酶标仪测定A₄₉₀值。口服接种FimH_Ed202和ORF25分别独立表达的重组芽孢疫苗诱导的抗ORF25IgM抗体水平(见本发明附图说明和附图4，DR2120/2122)，显著高于表达ORF25但不表达FimH _Ed202的重组芽孢疫苗(P<0.001,见本发明附图说明和附图4，DR2120/2121)。

实施例2

FimH_Ed202和ORF25融合表达的异育银鲫抗CyHV2口服重组芽孢疫苗

1、构建FimH_Ed202和ORF25融合表达的整合性质粒

以fimH_Ed202-1和fimH_Ed202-2为引物(见表1)，pJS2119(见表2)为模板，PCR扩增fimH_Ed202基因片段，以BamHI和KpnI酶切扩增产物，回收后分别克隆于整合性质粒pJS2120和pJS2121中，构建整合性重组质粒pJS2123和pJS2124(见本发明表2)。重组质粒pJS2123和pJS2124分别含有gerKB::erm-cotB-orf25-fimH_Ed202和gerAA::npt-cotC-orf25-fimH_Ed202重组片段(见表2)。

2、构建FimH_Ed202和ORF25融合表达的枯草芽孢杆菌重组菌株

根据本发明实施例1中2所述方法，将整合性重组质粒pJS2123和pJS2124依次转化B.stubtilis168，并筛选转化子(见本附图说明和附图1)。利用特异性引物PCR鉴定的重组菌株，并命名为DR2123/2124(Em^rKm^r)(见本附图说明和附图2，泳道5和6)。DR2123/2124(Em^rKm^r)重组菌株染色体含重组基因gerKB::erm-cotB-orf25-fimH_Ed202和gerAA::npt-cotC-orf25-fimH_Ed202。

3、筛选FimH_Ed202和ORF25融合表达的无抗生素抗性基因的枯草芽孢杆菌重组菌株

根据发明专利(宁德刚等，ZL201710338769.8)所描述方法，以重组菌株DR2123/2124(Em^rKm^r)为出发菌株，依次筛选对红霉素和卡那霉素敏感的重组菌株。利用特异性引物鉴定重组菌株，命名为DR2123/2124(见本附图说明和附图3，泳道5和6)。DR2123/2124含重组基因gerKB::cotB-orf25-fimH_Ed202和gerAA::cotC-orf25-fimH_Ed202(见本表2)

4、制备ORF25-FimH_Ed202融合表达的无抗生素抗性基因和萌发抑制的重组芽孢

以本发明实施例1中4所述方法制备DR2123/2124菌株芽孢，并鉴定芽孢衣壳中的重组蛋白。DR2123/2124芽孢衣壳含重组蛋白CotB-ORF25-FimH_Ed202和CotC-ORF25-FimH_Ed202(见本附图说明和附图4，泳道3)。

5、颗粒饲料包被ORF25-FimH_Ed202融合表达的重组芽孢口服疫苗

以DR2123/2124菌株制备的融合表达ORF25-FimH_Ed202、无抗生素抗性基因标记、萌发抑制的重组芽孢，作为异育银鲫抗CyHV2的口服重组芽孢疫苗。以本发明实施例1中5所述方法制备颗粒饲料包被FimH_Ed202和特异抗原ORF25融合表达的重组芽孢口服疫苗。

6、异育银鲫口服接种FimH_Ed202和ORF25融合表达的重组芽孢疫苗并采集血清

以本发明实施例1中6所述方法口服接种FimH_Ed202和ORF25融合表达的异育银鲫重组芽孢疫苗。

7、口服接种FimH_Ed202和ORF25融合表达的重组芽孢疫苗的异育银鲫抗ORF25IgM抗体效价

以His₆-Vp7重组抗原包被酶标板的微孔，以本发明实施例1中7所述间接酶联免疫法，以本发明实施例1中7所述方法检测，检测接种重组芽孢口服疫苗的异育银鲫抗ORF抗体IgM效价。FimH_Ed202和ORF25融合表达的重组芽孢口服疫苗诱导的特异IgM抗体水平(见附图说明和附图5，DR2123/2124)显著高于不表达FimH_Ed202的重组芽孢口服疫苗(P<0.001,见附图说明和附图5，DR2120/2122)，但与FimH_Ed202和ORF25分别独立表达的重组芽孢口服疫苗无显著差异(P>0.05，见附图说明和附图5，DR2120/2122)无明显差异。

实施例3

FimH_Ed202和Vp7分别独立表达的草鱼抗GCRV口服重组芽孢疫苗

1、构建FimH_Ed202和Vp7分别独立表达的整合性质粒

以vp7-1和vp7-2为引物(见表1)，pJS1608a(见表2)为模板，PCR扩增vp7基因片段，NdeI和BamHI酶切后分别克隆于整合性平台载体pJS1700和pJS1834中，构建整合性重组质粒pJS2125和pJS2126(见表2)。重组质粒pJS2125和pJS2126分别含有gerKB::erm-cotB-vp7和gerAA::npt-cotC-vp7重组片段，在cotB和cotC启动子控制下在芽孢中表达重组蛋白CotB-Vp7和CotC-Vp7。

2、构建FimH_Ed202和Vp7分别独立表达的枯草芽孢杆菌重组菌株

将整合性重组质粒pJS2125和pJS2126依次转化B.stubtilis168，分别以0.4μg/mL的红霉素和10μg/mL的卡那霉素筛选转化子。通过重组载体上的gerKB和gerAA片段与染色体上同源片段双交换重组，重组片段erm-cotB-vp7和npt-cotC-vp7通过插入控制芽孢萌发的gerKB和gerAA中整合于染色体上，导致gerKB和gerAA插入失活(见附图说明和附图1，泳道1和2)。利用特异性引物PCR鉴定重组菌株，并命名为DR2125/2126(Em^rKm^r)(见附图说明和附图6，泳道1和2)。重组菌株DR2125/2126(Em^rKm^r)染色体含重组基因gerKB::erm-cotB-vp7和gerAA::npt-cotC-vp7。

将整合性重组质粒pJS2125和pJS2122(见表1)依次转化B.stubtilis168，分别以红霉素和卡那霉素筛选转化子。重组片段erm-cotB-vp7和npt-cotC-fimH_Ed202通过插入控制芽孢萌发基因gerKB和gerAA中整合于染色体上，导致gerKB和gerAA插入失活(见本发明附图说明和附图1)。利用特异性引物PCR鉴定的重组菌株，并命名为DR2125/2122(Em^rKm^r)(见本发明附图说明和附图6，泳道3和4)。DR2125/2122(Em^rKm^r)含重组基因gerKB::erm-cotB-vp7和gerAA::npt-cotC-fimH_Ed202。

3、筛选FimH_Ed202和Vp7分别独立表达的无抗生素抗性基因的重组菌株

根据发明专利(宁德刚等，ZL201710338769.8)所描述方法，以重组菌株DR2125/2126(Em^rKm^r)和DR2125/2122(Em^rKm^r)为出发菌株，依次筛选对红霉素和卡那霉素敏感的重组菌株。利用特异性引物鉴定后的重组菌株，分别命名为DR2125/2126(见附图说明和附图7，泳道1和2)和DR2125/2122(见附图说明和附图7，泳道3和4)。重组菌株DR2125/2126和DR2125/2122分别含重组基因gerKB::cotB-vp7/gerAA::cotC-vp7和gerKB::cotB-vp7/gerAA::cotC-fimH_Ed202。

4、制备FimH_Ed202和Vp7分别独立表达、无抗生素抗性基因和萌发抑制的重组芽孢

以本发明实施例1中4所述方法制备DR2125/2126和DR2125/2122菌株芽孢，并鉴定芽孢衣壳中FimH_Ed202和Vp7。DR2125/2126芽孢衣壳中含重组蛋白CotB-Vp7和CotC-Vp7(见附图说明和附图8，泳道1)，DR2125/2122芽孢衣壳中含重组蛋白CotB-Vp7和CotC-FimH_Ed202(见附图说明和附图8，泳道2)

5、颗粒饲料包被FimH_Ed202和Vp7分别独立表达的重组芽孢口服疫苗

以菌株DR2125/2126和DR2125/2122制备的FimH_Ed202和Vp7分别独立表达、无抗生素抗性基因标记和萌发抑制的重组芽孢作为重组芽孢口服疫苗。以本发明实施例1中5所述方法制备颗粒饲料包被FimH_Ed202和特异抗原Vp7独立表达的重组芽孢口服疫苗。

6、草鱼口服接种FimH_Ed202和Vp7分别独立表达的重组芽孢疫苗并采集血清

选择健康的体重为50.0±5.0g的草鱼用于口服接种FimH_Ed202和Vp7分别独立表达的重组芽孢疫苗。试验草鱼的养殖、口服接种重组芽孢疫苗以及血清的采集见本发明实施例1中6所述方法。

7、口服接种FimH_Ed202和Vp7分别独立表达的重组芽孢疫苗的草鱼抗Vp7的IgM抗体效价

以His₆-Vp7重组抗原包被酶标板的微孔，以本发明实施例1中7所述间接酶联免疫法，检测接种重组芽孢口服疫苗的草鱼抗Vp7IgM抗体效价。FimH_Ed202和Vp7分别独立表达的重组芽孢疫苗DR2125/2122诱导的特异IgM水平(见附图说明和附图9，DR2125/2122)，显著高于表达Vp7但不表达FimH_Ed202的重组芽孢疫苗(P,0.001,见附图说明和附图9，DR2125/2126)。

实施例4

FimH_Ed202和Vp7融合表达的草鱼抗GCRV口服重组芽孢靶向疫苗

1、构建FimH_Ed202和Vp7融合表达的整合性质粒

以fimH_Ed202-1和fimH_Ed202-2为引物(见本发明表1)，pJS2119(见本发明表1)为模板，PCR扩增fimH_Ed202基因片段，以BamHI和KpnI酶切扩增产物，回收后分别克隆于整合性质粒pJS2125和pJS2126中，构建整合性重组质粒pJS2127和pJS2128(见本发明表2)。重组质粒pJS2127和pJS2128分别含有gerKB::erm-cotB-vp7-fimH_Ed202和gerAA::npt-cotC-vp7-fimH_Ed202重组片段，在cotB和cotC启动子控制下在芽孢中表达重组蛋白CotB-Vp7-FimH_Ed202和CotC-Vp7-FimH_Ed202。

2、构建FimH_Ed202和Vp7融合表达的枯草芽孢杆菌重组菌株

将整合性重组质粒pJS2127和pJS2128依次转化B.stubtilis168，分别以0.4μg/mL的红霉素和10μg/mL的卡那霉素筛选转化子。分别通过重组载体上的gerKB和gerAA片段与染色体上同源片段双交换重组，重组片段erm-cotB-vp7-fimH_Ed202和npt-cotC-vp7-fimH_Ed202插入控制芽孢萌发的重要基因gerKB和gerAA的编码序列中整合于染色体上。利用特异性引物PCR鉴定的重组菌株命名为DR2127/2128(Em^rKm^r)(见附图说明和附图6，泳道5和6)。重组菌株染色体含重组基因gerKB::erm-cotB-vp7-fimH_Ed202和gerAA::npt-cotC-vp7-fimH_Ed202。

3、筛选FimH_Ed202和Vp7融合表达的无抗生素抗性基因的重组菌株

根据发明专利(宁德刚等，ZL201710338769.8)所描述方法，以重组菌株DR2127/2128(Em^rKm^r)为出发菌株，依次筛选对红霉素和卡那霉素敏感的重组菌株。利用特异性引物鉴定后的重组菌株，并命名为DR2127/2128(见附图说明和附图7，泳道5和6)，含重组基因gerKB::cotB-Vp7-FimH_Ed202和gerAA::CotC-Vp7-FimH_Ed202。

4、制备FimH_Ed202和Vp7融合表达、无抗生素抗性基因和萌发抑制的重组芽孢

以本发明实施例1中4所述方法制备DR2127/2128菌株芽孢，并鉴定芽孢衣壳中的Vp7-FimH_Ed202融合蛋白。DR2127/2128芽孢衣壳中含重组蛋白CotB-Vp7-FimH_Ed202和CotC-Vp7FimH_Ed202(见附图说明和附图8，泳道3)。

5、颗粒饲料包被FimH_Ed202和Vp7融合表达的重组芽孢口服疫苗

以DR2127/2128菌株制备的融合表达Vp7-FimH_Ed202、无抗生素抗性基因标记、萌发抑制的重组芽孢作为重组芽孢口服疫苗。根据本发明实施例1中5所述方法以颗粒饲料包被FimHEd202和Vp7融合表达的重组芽孢口服疫苗。

6、草鱼口服接种FimH_Ed202和Vp7融合表达的重组芽孢疫苗并采集血清

选择正常健康的体重为50.0±5.0g的草鱼用于口服接种FimH_Ed202和Vp7融合表达的重组芽孢疫苗。试验草鱼的养殖、口服接种重组芽孢疫苗以及血清的采集见本发明实施例1中6所述方法。

7、口服接种FimH_Ed202和Vp7融合表达的重组芽孢疫苗的草鱼抗Vp7的IgM抗体效价

以His₆-Vp7重组抗原包被酶标板的微孔，以本发明实施例1中7所述间接酶联免疫法检测接种抗Vp7重组芽孢口服疫苗的草鱼IgM抗体效价。FimH_Ed202和Vp7融合表达的重组芽孢口服疫苗诱导的抗Vp7IgM水平(见本发明附图说明和附图9，DR2127/2128)显著高于表达Vp7但不表达FimH_Ed202的重组芽孢疫苗(P<0.001，见本发明附图说明和附图9，DR2127/2128)，但与FimH_Ed202和Vp7分别独立表达的重组芽孢口服疫苗诱导的特异IgM水平(P>0.05,见附图说明和附图9，DR2125/2122)无显著差异。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> FimHEd在制备基于枯草芽孢杆菌芽孢载体的鱼类靶向口服疫苗中的应用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

gagagaggat ccatgcagat cagcgtgctg gcg 33

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

gagagaggta ccttatttaa aggtgacgtc gatgttgg 38

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

gagagacata tggggttcca acggtg 26

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

gagagaggat ccggacagct ccgtgacctt gtcc 34

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

gagagacata tgccacttca catgattccg c 31

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

gagagaggat ccgatggttc cacgtgcaag tcg 33

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

gataatcttg accgggacac ag 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

gacgaatgtt gctgttgtcc 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

gtcataaaag aagtgaaggc gc 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

cctcgagcgt tccgctgtcc 20

<210> 11

<211> 356

<212> PRT

<213> 爱德华氏菌（Edwardsiella）

<400> 11

Met Lys Ser Leu Ser Ile Lys Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Gly Leu Cys Val Ser Arg Gln Ala Ser Ala Leu Ser Cys Arg

20 25 30

Glu Gly Ser Asn Ala Gly Ser Trp Ser Pro Ile Gly Ser Ile Tyr Gln

35 40 45

Arg Ile Asp Ile Gly Arg Pro Ile Ile Leu Ser Ala Ala Asp Phe Thr

50 55 60

Ala Gly Asn Leu Ile Trp Arg Ser Gln Asn Phe Thr Thr Thr Phe Thr

65 70 75 80

Cys Trp Asp Asn Trp Asn Thr Gly Arg Gly Glu His Ala Tyr Ile Tyr

85 90 95

Trp Asn Pro Lys Asp Ala Phe Gly Ser Leu His Arg Ser Leu Ser Val

100 105 110

Gly Val Ser Ile Asn Gly Ile Asp Tyr Asp Ala Ile Asn Leu Arg Gln

115 120 125

Ser Gly Ser Arg Pro Ser Gly Pro Asp Leu Gly Glu Gly Thr Ser Asn

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Val Ala Arg Pro Arg Thr Val Thr Val Ser Tyr Ser

145 150 155 160

Val Tyr Ile Lys Ala Thr Gly Ile Thr Pro Pro Ala Gly Asn Phe Pro

165 170 175

Ala Leu Gly Leu Pro Ser Leu Phe Gln Ile Asp Gly Val Gly Gly Leu

180 185 190

Asp Ala Arg Pro Asn Gly Asn Phe Asn Ala Tyr Ile Ser Gly Leu Asp

195 200 205

Lys Ile Gln Val Ile His Cys Asn Pro Gln Ile Ser Val Leu Ala Asn

210 215 220

Asn Gly Asn Ser Ile Asp Phe Gly Thr Leu Ser Ala Ala Gly Ala Arg

225 230 235 240

Pro Gly Val Ile Ala Arg Gln Ile Pro Phe Ser Ile Lys Ala Thr Leu

245 250 255

Arg Gly Gly Glu Cys Gly Gly Gln Gln Leu Gln Ala Ser Phe Ser Thr

260 265 270

Leu Arg Pro Asp Val Ser Asp Arg Ser Leu Ile Leu Pro Asp Thr Asn

275 280 285

Pro Gly Val Gly Ile Phe Leu Thr Lys Ala Gly Asp Thr Ser Ala Thr

290 295 300

Pro Ile Pro Leu Gln Thr Asn Val Asp Phe Gly Gly Arg Leu Gln Asp

305 310 315 320

Lys Gln Asn Glu Val Ser Glu Asn Phe Thr Ala Asn Leu Lys Trp Leu

325 330 335

Thr Asn Arg Pro Thr Ala Gly Arg Phe His Ala Thr Ala Asn Ile Asp

340 345 350

Val Thr Phe Lys

355

<210> 12

<211> 603

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

atgcagatca gcgtgctggc gaataactcc gcgctctcct gccgagaggg cagtaatgca 60

gggagctggt cgcccatcgg gagtatttat cagcgcatcg atatcgggcg gccgattatc 120

ctgtccgccg ccgactttac cgccggtaac ctgatttggc gttcgcagaa ctttaccacc 180

acctttacct gttgggataa ctggaatact ggaaggggag agcacgccta catttactgg 240

aacccgaagg atgcgttcgg gagcctgcac cgttcgctgt cggttggggt ttcgatcaac 300

gggatcgact atgatgcgat taacctcaga cagagcggca gccggcccag tggccccgat 360

ctgggtgagg ggacctcaaa cagcggcggc ggcgtcgcca gaccgcgtac ggtcaccgtc 420

agctattcgg tgtacatcaa ggccaccggc atcacgccgc cggcgggtaa cttcccggcg 480

ctggggctgc cgtcgctgtt tcaaattgac ggcgtgggcg gcttggacgc gcgccccaac 540

ggcaacttta acgcctatat ctccgggctg gataagatcc aggtgatcca ctgctaagga 600

tcc 603

<210> 13

<211> 1188

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 13

catatggggt tccaacggtg tctggttctg ttttcgtgtc tggcggtggt gtgtgacact 60

cagaatacaa caacaaccac cactacaaca acgcgagcaa ccacaaccgt tggtggtaat 120

cttactacca ctacaggcgc ctttccgatc aattctctgg tctacactgt ggactataag 180

acttcaaaat actgtgccgt caacggactg ccctatgaga tcaaggcaac gttttctttt 240

gaccgatatg atatccgtaa ccttcaatgg ctggcgttcg acgctgtgtt ggcggcaccc 300

aagtttgtat tcacgttgac acgacctccg tctactccat acggcgcaaa caaccctatg 360

atcactaccc tgcgcgtcaa tccctttctc tacacggatg ccactgtgga ctatgccatc 420

agcgctgtgg gtcttttgcc gacgttcgac ctgatcaaaa tgtactcgcc gttaccatcc 480

ggctccatca aggtgtcttc gctctcggtg tataccacgg gcatagatcc cataacgtac 540

gggacaatcc tcacctgtca gagttcgtgt cagctggacc ccgagctcaa gtttgcctgg 600

tacaactacg atcagttagt ggtaggcgcc gagaccaaca ctctgactac cagtaacccc 660

ggactctaca tgtgtaccgt acaaggatct cttctctttt cgaccaagac gtgggtgggg 720

agacccgtct ttgactgtcc gttcaacgca aacgcgtggt gtacgccgtc taccactcaa 780

cgtatacaga ggtacgagga cgattctccg agatcgttta tcgaggacga tctcaagcaa 840

cccgggacgg tcctcgcgtg tctatccgcc aacgataccg tcaaggacat tgtctcgctg 900

aggggcaggt gctcggacag gaccgtgtgt aacatggagg tctcggacca gtgctccaac 960

tttataccca acgtctacaa cccgtgcaac gttaccgtgc acaagttttg tcccacgcaa 1020

ctaccattca cgtggacgtc ccctacaccc gaactcgtct ctgtggctct gggcacaaac 1080

aacctgatgt tcagctcggg catagtcaac acgtactgcg gaaaccaagc cgacatattc 1140

gcagtgtgcg ctggaccgga caaggtcacg gagctgtcct aaggtacc 1188

<210> 14

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 14

catatgccac ttcacatgat tccgcaagtg gcccacgcta tggtgcgtgc agccgctgca 60

ggacgcctta ccttatacac aagaactaga actgaaacca ccaactttga tcacgctgaa 120

tacgtgacct gcggacgtta caccatctgc gccttctgcc ttacgactct ggctcctcac 180

gccaacgtga agaccattca agactcacac gcttgttcac gtcaaccaaa tgaagccatt 240

cgctcattag tggaagtgag cgacaaagcg cagaccgccc tcgtgggaag ccgtactgta 300

gactatcacg aattggatgt gaaagctgga ttcgtggccc caactgccga tgaaacaatt 360

gccccttcta aggatatcgt ggaacttccg tttcgcacct gtgacttgga cgattcatct 420

gctaccgctt gcgtgcgaaa tcactgccag gccggacacg acggagttat ccacctcccg 480

atcctttctg gagatttcaa attgcctaac gaacacccta ccaaaccgtt ggacgatacg 540

caccctcacg acaaggtgct gactcgctgc cctaagactg gactcctcct cgtgcacgac 600

actcacgcac acgccaccgc cgtagttgcc accgctgcta cgagagctat cctcatgcac 660

gacctcctta catcagcgaa cgcggatgac ggacaccaag cacgttcagc ttgctacgga 720

ccagcgttta acaacctgac cttcgcttgc cactcaacct gtgcttcaga tatggctcac 780

ttcgactgcg gacagatcgt tggactcgac ttgcacgtgg aaccatcaga ttaaggtacc 840

Claims

1.爱德华氏菌(Edwardsiella)的I型纤毛蛋白FimH_Ed在制备基于枯草芽孢杆菌芽孢传递载体的鱼类靶向口服疫苗中的应用，是以FimH_Ed作为鱼类肠道粘膜上皮细胞的靶向配体，以枯草芽孢杆菌芽孢为特异抗原蛋白和靶向配体的传递载体，通过芽孢表面展示方法制备表面展示靶向配体FimH_Ed和特异抗原的萌发抑制的重组芽孢的鱼类靶向口服疫苗；所述FimH_Ed的氨基酸序列如SED ID NO.11所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过芽孢表面展示方法制备表面展示靶向配体FimH_Ed和特异性抗原的无抗生素抗性基因和萌发抑制的重组芽孢。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的重组芽孢是靶向配体FimH_Ed和特异抗原分别独立展示在芽孢表面，或靶向配体FimH_Ed和特异抗原融合展示在芽孢表面。

4.一种鱼类靶向口服疫苗，其特征在于，是表面展示FimH_Ed和特异抗原的萌发抑制的枯草芽孢杆菌芽孢，所述特异抗原为鱼类病原体的免疫保护性抗原，所述FimH_Ed的氨基酸序列如SED ID NO.11所示。