SI22889A - Himerni flagelini za cepiva - Google Patents
Himerni flagelini za cepiva Download PDFInfo
- Publication number
- SI22889A SI22889A SI200800259A SI200800259A SI22889A SI 22889 A SI22889 A SI 22889A SI 200800259 A SI200800259 A SI 200800259A SI 200800259 A SI200800259 A SI 200800259A SI 22889 A SI22889 A SI 22889A
- Authority
- SI
- Slovenia
- Prior art keywords
- flagellin
- protein
- tlr5
- fusion protein
- dna
- Prior art date
Links
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 title claims abstract description 272
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 title abstract 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 189
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 188
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 174
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 166
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 121
- 102000008234 Toll-like receptor 5 Human genes 0.000 claims abstract description 102
- 108010060812 Toll-like receptor 5 Proteins 0.000 claims abstract description 102
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 85
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 68
- 101000669460 Homo sapiens Toll-like receptor 5 Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 102100039357 Toll-like receptor 5 Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 40
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 claims abstract description 26
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 claims abstract description 26
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 195
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 52
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 52
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 50
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 49
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 39
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 36
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 33
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 24
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 19
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 17
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- 241000589994 Campylobacter sp. Species 0.000 claims description 9
- 241000589187 Rhizobium sp. Species 0.000 claims description 9
- 241000589196 Sinorhizobium meliloti Species 0.000 claims description 9
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 9
- 241001135756 Alphaproteobacteria Species 0.000 claims description 8
- 241000508772 Brucella sp. Species 0.000 claims description 8
- 241001148568 Epsilonproteobacteria Species 0.000 claims description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 8
- 241000606685 Bartonella bacilliformis Species 0.000 claims description 7
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 claims description 7
- 229940092528 bartonella bacilliformis Drugs 0.000 claims description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 7
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 6
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 241000607149 Salmonella sp. Species 0.000 claims description 4
- 150000003278 haem Chemical group 0.000 claims description 4
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 claims description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 3
- 241001135755 Betaproteobacteria Species 0.000 claims description 3
- 241000193464 Clostridium sp. Species 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 241000192128 Gammaproteobacteria Species 0.000 claims description 3
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 claims description 3
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 claims description 3
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 claims description 3
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 claims description 3
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 claims description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 3
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 claims description 3
- 241000202712 Bartonella sp. Species 0.000 claims description 2
- 241001135529 Bordetella sp. Species 0.000 claims description 2
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 claims description 2
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 claims description 2
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 claims description 2
- 241000192142 Proteobacteria Species 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract description 8
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 abstract description 6
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000011664 signaling Effects 0.000 abstract description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 abstract description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 abstract 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 91
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 32
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 22
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 14
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 13
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 10
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 8
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 7
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 6
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 5
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 101100476480 Mus musculus S100a8 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 101150061086 ureB gene Proteins 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 101710151147 Flagellin E Proteins 0.000 description 2
- 241000590008 Helicobacter sp. Species 0.000 description 2
- 102000010168 Myeloid Differentiation Factor 88 Human genes 0.000 description 2
- 108010077432 Myeloid Differentiation Factor 88 Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N Oplophorus luciferin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC(C(N1C=C(N2)C=3C=CC(O)=CC=3)=O)=NC1=C2CC1=CC=CC=C1 YHIPILPTUVMWQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 2
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 2
- 101900195698 Salmonella typhimurium Flagellin Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 2
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000006010 pyroptosis Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710151190 Flagellin A Proteins 0.000 description 1
- 206010056663 Gastric infection Diseases 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 241001674326 Helicobacter pylori J99 Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186610 Lactobacillus sp. Species 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001421711 Mithras Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100111632 Mus musculus Naip5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 102100023435 NLR family CARD domain-containing protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710182264 NLR family CARD domain-containing protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- HRYZWHHZPQKTII-UHFFFAOYSA-N chloroethane Chemical compound CCCl HRYZWHHZPQKTII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004913 chyme Anatomy 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091007930 cytoplasmic receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 229960003750 ethyl chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009215 host defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 102000045719 human TLR5 Human genes 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 108010027792 poly A hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000012423 response to bacterium Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000002314 small intestine cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/23—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Brucella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Izum predstavlja fuzijski protein, ki vsebuje himerni flagelin sestavljen iz dveh razliŽŤnih tipov flagelina, ki se razlikujeta v jakosti aktivacije receptorja TLR5; cepivo, ki vsebuje fuzijski protein ali DNA z zapisom za fuzijski protein in je cepivo namenjeno za zdravljenje in prepreŽŤevanje infekcije s patogenimi bakterijami, ki vsebujejo flagelin, ki ne aktivira receptor TLR5. Nova cepiva vkljuŽŤujejo fuzijski protein, ki vsebuje flagelin bakterij, ki stimulirajo aktivacijo receptorja TLR5. Segmentflagelina Helicobacter pylori se pri tem zamenja s segmentom flagelina bakterij, ki sproĹľijo stimulacijo TLR5, dodajo pa se proteinski segmenti, proti katerim Ĺľelimo spodbuditi imunski odziv ter opcijsko doda signalna sekvenca, ki omogoŽŤa Ĺľeleno lokalizacijo proteina. Izum se nanaša tudi na metodo uporabe vakcine za imunizacije v veŽŤ stopnjah, ki obsega imunizacijo z razliŽŤnimi fuzijskimi proteini, ki se razlikujejo v delu flagelina, ki stimulira receptor TLR5 in s tem prepreŽŤimo nevtralizacijo aktivnostifuzijskega proteina.
Description
Himerni flagelini za cepiva
Področje izuma
Področje izuma je fuzijski protein, DNA z zapisom za fuzijski protein, vakcina, ki vsebuje poleg zapisa za antigen tudi zapis za proteine, ki aktivirajo naravni imunski odziv in posledično pridobljeni imunski odziv. Področje izuma je priprava in uporaba vakcine namenjena za zdravljenje oziroma preprečevanje bolezni in obolenja, ki jih povzročajo patogene bakterije, katerih flagelin slabo aktivira receptor TLR5.
Stanje tehnike
Večcelični organizmi se zaščitijo pred okužbami s patogenimi mikroorganizmi iz okolja s pomočjo imunskega sistema. Pri tem sodelujejo receptorji, ki zaznavajo prisotnost molekul, ki so značilne za patogene mikroorganizme in tudi patološko spremenjene lastne celice.
Za učinkovito obrambo imunskega sistema je potrebna tako aktivacija naravnega imunskega sistema kot tudi pridobljenega imunskega odziva, ki vključujejo celični in protitelesni odziv. Aktivacija naravnega imunskega odziva je potrebna za učinkovito procesiranje antigenov in zorenje pridobljenega imunskega odziva. Pomemben sestavni del naravnega odziva so receptorji, ki prepoznajo značilne molekule patogenih mikroorganizmov- s patogeni povezane molekularne vzorce. Za učinkovit imunski odziv so pomembni predvsem Tollu-podobni receptorji (TLR). Med njimi igra pomembno vlogo TLR5, ki prepoznava flagelin večine bakterij. (Hayashi et al., Nature 2001, 410, 1099-1103). V monomeru flagelina sta za prepoznavanje in aktivacijo TLR5 potrebna N-končni in C-končni segment, medtem ko sredinski, variabilni del ni pomemben za aktivacijo TLR5 (Murthy et el., 2004, J. Biol.Chem. 279, 5667-5675; Smith et al., 2003, Nature Immunol. 4, 1247-1253). Nekatere bakterije se zaščitijo pred prepoznavanjem s strani imunskega sistema s spremembo flagelina.
Med temi je bakterija Helicobacter pylori, katere flagelin ne aktivira signalizacije preko TLR5 (Gewirtz et al.2004, J.Infect. Dis. 189, 1914-1920; Andressen-Nissen et al., 2005 Proč. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 9247-9252). Flagelin je sicer med bolj imunogenimi proteini, proti katerim učinkovito nastajajo protitelesa, ki pripomorejo k obrambi proti bakterijski okužbi.
-2Protitelesni odziv proti flagelinu bakterije Helicobacter pylori pa omogoči le delno zaščito zaradi nezadostne aktivacije naravnega imunskega odziva (Yan et al., 2003, World J. Gastroenterol.9, 2240-2250).
Bakterija Helicobacter pylori preživi v želodčni kislini in kolonizira sluznico želodca ter tankega črevesa, kjer povzroča vnetje, nastanek razjed, ki lahko vodijo do rakastih sprememb. Omenjena bakterija je med pomembnimi povzročitelji raka na želodcu in tankem črevesu, čeprav okužba ne vodi vedno do rakastih sprememb. Cepivo proti H. pylori bi pomenilo učinkovito zdravilo, vendar sproži bakterija šibak odziv. Tekom evolucije in prilagajanja na gostitelja je spremenila virulenčne dejavnike kot sta lipopolisaharid ali flagelin, tako, da jih imunski sistem gostitelja ne prepozna, medtem ko ga omenjene molekule drugih bakterij aktivirajo. Doslej so za cepiva proti H. pylori uporabljali bakterijske proteine, kot so UreB (US Pat. 5972336), HpaA, CagA (US Pat. 10487962), ki se nahajajo bodisi na površini bakterije Helicobacter pylori ali povzročajo kot npr. CagA poškodbe v tkivu gostitelja (Owen et al., 1994, FEMS Immunol Med Microbiol.9, 307-315). Imunizacija s samimi proteini povzroči tvorbo nezadostno tvorbo protiteles, zato v cepiva dodajajo adjuvanse, ki pa lahko povzročajo škodljive stranske učinke.
Uporablja se več tipov cepiv, (i) Cepivo lahko vsebuje izolirane podenote mikroorganizma, kot so proteini, ali pa (ii) cepivo tvorijo celi, mrtvi mikroorganizmi, ki vsebujejo izbrane antigene, proti kateremu želimo doseči imunski odziv. Slabost teh dveh oblik cepiva je možna patogenost oslabljene vakcine, slabo definirana in variabilna sestava ter slabša aktivacija naravne imunosti, kot v primeru, da ima mikroorganizem spremenjene molekule, ki aktivirajo naravni imunski sistem, kot je na primer lipopolisaharid ali flagelin. (iii) Tretja, v humanem zdravstvu zaenkrat še neuporabljena oblika so cepiva v obliki DNA, kjer v celice gostitelja vnesemo genski zapis za proteinske podenote mikroorganizma proti kateremu želimo zaščito. Pri vse treh načinih imunizacije je poleg podenote mikroorganizma proti kateri se sproži imunski odziv potrebno zagotoviti dodaten signal za stimulacijo naravne imunosti, kar zagotovi adjuvans. Slabost uporabe adjuvansov je, da lahko povzročijo pretiran odziv organizma na adjuvans.
Imunogeni flagelin, kot je na primer FliC bakterije Salmonella typhymurium so doslej že uporabljali kot adjuvans za cepiva. Uporabili so tudi fuzijski protein, kjer so v flagelin bakterije S. typhymurium dodali izbran proteinski antigen (Newton et al., 1991, Infect Immun. 59, 21582165, US Pat. 6130082). Pomanjkljivost omenjene strategije je, da ni splošno uporabna za vse
-3bakterijske infekcije, saj določene bakterije slabo aktivirajo imunski sistem in se s tem izognejo zaščiti in uspešno kolonizirajo gostitelja. En od takih primerov je bakterija Helicobacter pylori.
Po imunizaciji s cepivom, ki vsebuje flagelin pride v telesu človeka in živali do tvorbe protiteles tudi proti flagelinu. Ta telesa se lahko ob ponovni imunizaciji vežejo na antigenske determinante flagelina in tako preprečijo ponovno aktivacijo TLR5 (Šaha et al., 2007, J.Immunol. 179, 1147-1154; Nempont et al., 2008, J.Immunol. 181, 2036-2043), kar je slabost omenjenega postopka imunizacije z identičnim cepivom, ki vsebuje flagelin kot adjuvans. V tem primeru je odziv na cepivo naslednjič manj učinkovit. Tudi ob infekciji z bakterijo, katere flagelin je bil uporabljen kot adjuvans nato sproži šibkejši odziv, kot bakterija, katere flagelin ni bil uporabljen za imunizacijo.
Izum predstavlja rešitev za zgoraj opisane slabosti, kot so (i) slaba aktivacija imunskega sistema proti bakterijam, ki vsebujejo flagelin, ki ne sproži aktivacije naravnega imunskega sistema in (ii) nastanek protiteles na flageline uporabljene v cepivu kot adjuvans in zmanjšanju učinkovitosti cepiva ob ponovnem cepljenju.
Povzetek izuma
Izum se nanaša na fuzijski protein iz himemega flagelina in vezanega antigenskega segmenta. Himemi flagelin je sestavljen iz (a) N- in C- končnega dela flagelina, ki aktivira receptor TLR5 in med njima lociranega (b) sredinskega segmenta flagelina, ki ne aktivira TLR5. Natančneje je himemi flagelin sestavljen iz najmanj 100 amino končnih in najmanj 100 karboksi končnih aminokislin flagelina, ki aktivira receptor TLR5, in sredinskega segmenta flagelina, ki ne aktivira TLR5.
Izum se nanaša na fuzijski protein, ki vsebuje: himemi flagelin, ki ima sposobnost aktivacije receptorja TLR5 in je izbran iz skupine: beta proteobakterij ali gama proteobakterij ali spirohet ali firmucut, kot so: bakterije Escherichia coli, Salmonella sp., Shigella flexneri, Legionella pneumophila, Serratia marcescens, Listeria monocytogenes, Pseudomonas sp., Vibrio cholerae, Bordetella sp., Borellia burgdorferi, Clostridium sp., Bacillus cereus, Bacillus subtilis; in sredinski segment flagelina, ki ne aktivira TLR5 in je izbran iz flagelinov bakterij skupine: alfa proteobakterij ali epsilon proteobakterij, kot so: bakterije Helicobacter sp., Campylobacter sp., Bartonella bacilliformis, Rhizobium meliloti, Rhizobium sp., Wolnella sp., Brucella sp..
-4Izum se nanaša na fuzijski protein, ki poleg himemega flagelina vsebuje dodano zaporedje za antigenski segment, za protein ali peptidni segment ali več proteinov ali proteinskih segmentov, na osnovi proteinov organizma proti kateremu želimo sprožiti imunski odziv in je to isti organizem, iz katerega smo izbrali zapis za sredinski segment flagelina, in je zaporedje za protein ali peptidni segment vključeno ali na C-končnem delu proteina ali znotraj sredinskega segmenta flagelina.
Izum se nanaša na fuzijski protein, ki je sestavljen iz N- terminalnega dela flagelina FliC E. coli', sredinskega segmenta flagelina FlaA H. pylori in C- terminalnega dela flagelina FliC E. coli. Natančneje se izum nanaša na fuzijski protein sestavljen iz aminokislin od 1 do 176 flagelina FliC E. coli', sredinskega variabilnega segmenta aminokislin od 178 do 418 flagelina FlaA H. pylori in aminokislin od 401 do 498 flagelina FliC E. coli. Opcijsko je fuzijskemu proteinu po izumu dodan antigenski segment, ki je sestavljen iz proteina ali več segmentov proteinov, ki so kodirani v genomu Helicobacter pylori in proti katerim želimo sprožiti imunski odziv.
Izum se nanaša na protein, ki vsebuje flagelin FlaA H. pylori, kjer sta amino-terminalni in karboksi- terminalni segment nadomeščena z zaporedjem flagelina bakterije, ki aktivira TLR5 in nadalje opcijsko antigenski segment, kije sestavljen iz proteina ali več segmentov proteinov, ki so kodirani v genomu Helicobacter pylori in se uporablja za pripravo cepiva za zaščito in zdravljenje okužbe z bakterijo H. pylori.
Izum se nanaša na protein, ki opcijsko vsebuje tudi enega ali več linker peptidov, ki povezujejo posamezne segmente proteina in je vsak linker peptid neodvisno dolg od ene do več, preferenčno do 50 aminokislin, dodatno lahko protein vsebuje tudi enega ali več peptidnih označevalcev in so tako linker peptidi kot tudi označevalci v protein vključeni na način, ki ne spremeni osnovne funkcije proteina.
Izum se nanaša na protein, ki se uporablja za pripravo cepiva za stimulacijo imunskega odziva proti bakterijam, katerih flagelin ne aktivira TLR5, za preprečevanje in zdravljenje nalezljivih bolezni. Natančneje, se izum nanaša na protein za cepivo proti bakterijam iz skupine alfa in epsilon proteobakterij, kot so, vendar ne izključno: bakterije Helicobacter sp, Campylobacter sp., Bartonella bacilliformis, Rhizobium meliloti, Rhizobium sp., Wolnella sp, Brucella sp., prednostno Helicobacter pylori.
Izum se nanaša na DNA, ki nosi zapis za fuzijske proteine opisane zgoraj. Natančneje se izum nanaša na DNA, ki vsebuje zapis za protein po izumu in zapis sestavljajo signalna sekvenca, ki
-5omogoča izločanje proteinov ali vezavo proteina na membrano v gostiteljskem organizmu in proteina po izumu, ki je funkcionalno povezan s signalno sekvenco. Celice gostiteljskega organizma so lahko bakterije, glive, rastline, živali ali človek. V nadaljevanju se izuma nanaša na DNA, ki poleg zapisa za signalno sekvenco, operativno povezano s proteinom po izumu, vsebuje regulatome elemente, promotor in terminator, ki so operativno povezani s kodirajočim delom zapisa DNA in omogočajo ekspresijo fuzijskega proteina v gostiteljskih celicah.
Izum se prav tako nanaša na DNA, ki nosi zapis za fuzijski protein po izumu, ter se DNA uporablja za pripravo DNA cepiva za vnos DNA v celice človeka ali živali z namenom vzbuditi imunski odziv na fuzijski protein po izumu.
Izum se nanaša na DNA, ki vsebuje zapis za fuzijski protein po izumu, za pripravo cepiva za stimulacijo imunskega odziva proti bakterijam, katerih flagelin ne aktivira receptorja TLR5, za preprečevanje in zdravljenje nalezljivih bolezni. Natančneje, proti bakterijam iz skupine alfa in epsilon proteobakterij, kot so: bakterije Helicobacter sp, Campylobacter sp., Bartonella bacilliformis, Rhizobium meliloti, Rhizobium sp., Wolnella sp, Brucella sp., prednostno Helicobacter pylori.
Izum se nanaša na cepivo, ki vsebuje protein po izumu ali DNA po izumu in ustrezne farmacevtsko sprejemljive dodatke.
Izum se nanaša na gostiteljski organizem, ki vsebuje fuzijski protein ali DNA po izumu in se DNA prepisuje v fuzijski protein in je gostiteljski organizem izbran iz bakterij, kvasovk ali gliv ter sesalskih celic; prednostno je gostiteljski organizem izbran med človeku in živali neškodljivimi organizmi, prednostno neškodljivimi organizmi, ki se običajno nahajajo v človeški in živalski črevesni flori.
Izum se nanaša na farmacevtsko zmes, ki vsebuje bakterije z izraženim proteinom po izumu in je protein izražen na površini mrtvih bakterij in so bakterije izbrane iz skupine bakterij, ki so običajno prisotne v subjektu.
Izum se nanaša na metodo za določanje sposobnosti variant flagelinov za aktivacijo receptorjev TLR5, ki vsebuje sledeče korake: gojenje celičnih linij, ki izražajo funkcionalen receptor TLR5; vnos DNA z zaporedjem za fuzijski protein med signalno sekvenco za izločanje flagelinov in preiskovanim flagelinom, ki je operativno povezana z regulatomimi elementi, promotorjem in terminatorjem, ki omogočajo ekspresijo fuzijskega proteina v gostiteljskih
-6celicah, v celične linije, ki izražajo receptor TLR5; analiza aktivacije receptorja TLR5 v celičnih linijah s pomočjo reporterskih plazmidov ali produkcije vnetnih posrednikov.
Izum se v nadaljevanju nanaša na metodo za določanje sposobnosti variant flagelinov za aktivacijo receptorjev TLR5, ki vsebuje sledeče korake: gojenje celičnih linij, ki izražajo funkcionalen receptor TLR5; vnos DNA z zaporedjem za fuzijski protein med signalno sekvenco za izločanje flagelinov in preiskovanim flagelinom, ki je operativno povezana z regulatomimi elementi, promotorjem in terminatorjem, ki omogočajo ekspresijo fuzijskega proteina v gostiteljskih celicah, v celične linije, ki niso celične linije, ki izražajo nizke količine receptorja TLR5; skupno gojenje mešanice celičnih linij; analiza aktivacije TLR5 v celičnih linijah s pomočjo reporterskih plazmidov ali produkcije vnetnih posrednikov.
Izum se v nadaljevanju nanaša na metodo za določanje sposobnosti variant flagelinov za aktivacijo receptorjev TLR5, ki vsebuje sledeče korake: gojenje celičnih linij, ki izražajo funkcionalen receptor TLR5; dodatek supematant celic, ki izražajo protein zapisan z zaporedjem za fuzijski protein med signalno sekvenco za izločanje flagelinov in preiskovanim flagelinom, ki je operativno povezana z regulatomimi elementi, promotorjem in terminatorjem, ki omogočajo ekspresijo fuzijskega proteina v gostiteljskih celicah, celičnim linijam, ki izražajo receptor TLR5; analiza aktivacije TLR5 v celičnih linijah s pomočjo reporterskih plazmidov ali produkcije vnetnih posrednikov
Izum se nanaša na cepivo, ki vsebuje protein po izumu ali DNA po izumu in se cepiva za večkratno imunizacijo subjekta razlikujejo po aminokislinski sestavi amino-končnega in karboksi-končnega himemega flagelina, ki aktivira receptor TLR5, tako da protitelesa nastala zaradi predhodne imunizacije ne preprečijo aktivacije TLR5 ob naslednji imunizaciji s spremenjenim cepivom, sredinski segment flagelina v fuzijskem proteinu pa ostane med cepivi nespremenjen.
Opis slik
Slika 1: Shematski prikaz sestave fuzijskega proteina, ki je sestavljen iz himemega flagelinskega in antigenskega segmenta. Slika prikazuje: N, amino končni segment flagelina, ki aktivira TLR5; V, variabilen sredinski segment flagelina, ki ne aktivira TLR5; C, karboksi končni segment flagelina, ki aktivira TLR5; A, antigenski protein ali več proteinskih segmentov.
-Ί Slika 2: Detekcija fuzijskih proteinov z analizo po westem prenosu. Analizirali smo sledeče protein: UreB (HPUreB-Histag); HimFla-UreB (EcNfla-HpVfla-EcCfla-HPUreB-RGD-Histagt); HimFla-multi (EcNfla-HpVfla-EcCfla-multiepitop-RGD-Histag).
Slika 3: Učinkovitost intemalizacije fuzijskih proteinov v celičnih linijah CaCo-2. Slika vsebuje: [Α,Β] Barvilo Alexa555 (MolecularProbe) deaktivirano v Tris pufru pH 8.5; [C] Intemalizacija proteina HimMulti označenega z Alexa555 (0.125 pg/μΐ); [D] Celice [C] dodatno barvane z LysoTrackerGreen (MolecularProbes) (50 mM); [Ε] Intemalizacija proteina HimMulti označenega z Alexa555 (0.125 pg/μΐ) [F] Celice [Ε] dodatno barvane s SynaptoRed; [G] Intemalizacija proteina Salmonella FliC označen z Alexa555 (0.1 pg/μΐ) [H]; Celice [G] dodatno barvane s transferrin633 (MolecularProbes) (0,1 mg/ml).
Slika 4: Aktivacija receptorja TLR5 s fuzijskimi proteini. Slika prikazuje aktivacijo receptorja TLR5 ob dodatku HimFla (št. 4, tabela 3) in HimFla-multi (št. 7, tabela 3) ali 100 ng FliC kot agonista.
Slika 5: Profilaktična imunizacija inducira proizvodnjo protiteles proti rekombinantnima proteinoma HimFla-UreB in HimFla-multi (proteina št 2 in 3, tabela 3). Histogrami prikazujejo poprečne OD vrednosti pri 450 nm.
Slika 6: Analiza po westemu fuzijskih proteinov v brezflagelinskih bakterijskih kulturah.
Slika 7: Prisotnost fuzijskih proteinov na površini brezflagelinskih bakterij transformiranih s konstrukti, ki nosijo zapis za fuzijski protein. Bakterije, ki vsebujejo fuzijski protein so na slik obarvane belo. Slika vsebuje: [Α] HimFla (št. 4); [Β] HimFla-ureB (št. 12); [C] HimFla-ureB (št. 9); [D] HimFla-multi (št. 3); [Ε] Negativna kontrola (samo sekundama protitelesa).
Slika 8: Gibljivost brezflagelinskih bakterij transformiranih s fuzijskim proteinom. Slika vsebuje sledeče vzorce: 1 do 10: HimFla v pSBl.AK3 (št.4); 11 in 12: HimFla-ureB (št.12); 13 do 20: HimFla-ureB (št.9); 21 do 25: HimFla (št. 5); 26 do 30: HimFla-multi (št. 7); 35 do 38: FliC (št. 8); 39 do 42: HimFla v pSBl.AK3 (št.4).
Slika 9: Aktivacija receptorja TLR5 z brezflagelinskimi bakterijami, ki izražajo fuzijske proteina na površini bakterije. Stimulacija bakterij, ki na površini izražajo transformiran konstrukt. V E. coli JW1908-1 smo transformirali FliC (št. 8), T7-HF-UreB v AK3. Testne bakterije smo nanesli na celične linije HEK293, ki izražajo TLR5. Testirali smo bakterije, ki smo jih inkubirali na 70°C 20 min in bakterije, ki smo jih inkubirali na 4°C 20 minut.
-8Slika 10: Intemalizacija brezflagelinskih bakterij, ki izražajo fuzijske proteine v celične linije Caco-2. [Α] Bakterije z mCerulean; [Β] LysoTracker; [C] Bakterija z mCerulean; [D] Prekrivanje slike.
Slika 11: Aktivacija receptorja TLR5 s fuzijskim proteinov , ki ga izražajo iste ali druge celice celične linije. Kontrolne celice smo stimulirali s flagelinom iz bakterije Salmonella typhimurium v končni koncentraciji 100 ng/ml. Aktivacijo TLR5 smo testirali za fuzijska proteina ssHimFla-UreB (št. 2) in ssHimFla-multi (št. 4).
Slika 12: Primerjava aktivacije z in brez signalne sekvence. Aktivacijo TLR5 smo testirali za fuzijska proteina HimFla-multi (št. 18) in ssHimFla-multi (št. 4)
Opis izuma
Splošen opis
Osnova izuma je odkritje, da aktivacija prirojene imunosti deluje kot aktivator adaptivne imunosti in poveča imunski odziv na antigen, ter da aktivacijo prirojene imunosti lahko dosežemo z aktivatorji receptorjev TLR, na primer TLR5. Ključno za izum je odkritje, da nekatere bakterije, kot je Helicobacter pylori vsebujejo flagelin, ki ne aktivira imunskega odziva, zato se subjekt slabo odziva na okužbo s to vrsto bakterij.
Izumitelji so prišli do presenetljivega odkritja. Če uporabijo fuzijski protein, ki vsebuje del flagelina, ki je sposoben aktivirati receptor TLR5 in ta flagelin vsebuje specifičen segment flagelina, ki ni sposoben aktivacije prirojene imunosti, tak fuzijski flagelin sproži nastajanje protiteles proti flagelinu bakterij, ki drugače sproži slab imunski odziv. Fuzijski protein nadomešča dodatek adjuvansov in izboljša aktivacijo adaptivne imunosti proti bakterijam, katerih flagelin ni imunogen.
V pričujočem izumu so izumitelji ugotovili, da lahko za učinkovito cepivo uporabijo flagelin bakterij, ki sicer ne aktivirajo TLR5, kot je flagelin FlaA bakterije Helicobacter pylori, kateremu so zamenjali N- in C-končni segment s flagelinom bakterije, ki aktivira TLR5, kot je na primer flagelin bakterije Escherichia coli. Na ta način so pripravili cepivo, ki aktivira naravni imunski sistem preko aktivacije TLR5, istočasno pa se lahko razvije specifični imunski odziv na sredinski del flagelina, ki sicer ne sproži aktivacije TLR5, ter na druge proteinske segmente, ki so povezani v fuzijski protein.
-9Izum temelji tudi na odkritju, da se zaščita subjekta pred okužbo z bakterijami, ki vsebujejo flagelin, ki ne aktivira receptorja TLR5, poveča, če se fuzijskemu proteinu med flagelinom, ki inducira receptor TLR5 in flagelinom, ki ni sposoben indukcije receptorja TLR5, doda še druge antigene, značilne za mikroorganizem, iz katerega je izbran flagelin, ki ne inducira prirojene imunosti.
Odkritje je tudi, da lahko za cepivo, ki uspešno aktivira prirojeno imunost in nastajanje protiteles, uporabimo (a) fuzijski protein, (b) mikroorganizme, prednostno bakterije, prednostno bakterije, ki namesto lastnega flagelina izražajo na celični površini flagelinski protein ali (c) DNA, ki nosi zapis za fuzijski protein, kateri je dodana signalna sekvenca, ki zagotavlja izločanje izraženega fuzijskega proteina.
Izraz »cepivo« ima v opisu izuma splošen pomen in se nanaša na katerokoli terapevtsko, imunogeno in imunostimulatomo komponento, ki vsebuje značilnosti predstavljenega izuma.
Osnova izuma je tudi odkritje, da imunizacija v določenih korakih izboljša imunski odziv na cepivo. Izumitelji so odkrili, da se imunski odziv poveča, če je cepivo druge in nadaljnjih imunizacij vsakič drugačno v smislu dela fuzijskega proteina, ki vsebuje del flagelina, ki aktivira receptor TLR5. Tako so prišli izumitelji do spoznanja, da uporaba cepiva s fuzijskim proteinom, ki vsebuje himemi flagelin, ki inducira TLR5 (npr.: dela flagelina iz E. coli) v drugi imunizaciji ne doseže želenega namena, ker po prvi imunizaciji nastajajo protitelesa tudi proti delu himemega flagelina, ki inducira TLR5 (npr.: dela flagelina E. coli). V tem primeru ni mogoče doseči želenega učinka adjuvansa. Izumitelji so odkrili, da se ta pojav lahko zaobide z uporabo cepiva v drugi vakcinaciji, ki vsebuje kot del fuzijskega proteina, himerni flagelin, ki inducira receptor TLR5, iz drugega mikroorganizma (npr.: dela flagelina Salmonele) ali z mutacijami na ključnih mestih flagelina, da ga protitelesa ne prepoznajo. Zamenjava dela fuzijskega proteina, himemega flagelina, ki inducira receptor TLR5, v vsaki nadaljnji imunizaciji še poveča odziv na antigene, ki so vključeni v fuzijski protein.
Izumitelji so ugotovili, da lahko z vnosom DNA zapisa za modificirane flageline v sesalske celice ugotavljajo sposobnosti aktivacije modificiranega flagelina za aktivacijo, TLR5 kar je uporabno za načrtovanje in izbor učinkovitih cepiv. Pri tem lahko uporabijo celice, ki izražajo receptor TLR5, katerega aktivacija s flagelinom sproži aktivacijo transkripcijskih faktorjev in prepis mediatorjev, ki tem celicam omogočijo selektivno prednost v kulturi. Omenjena metoda se lahko uporabi tudi za pregledovanje knjižnic flagelinskih variant.
-10Osnova izuma je tudi odkritje, da uporaba kombinacije cepiv, ki se razlikujejo v amino in karboksi končnem segmentu flagelina, ki aktivira receptor TLR5, medtem ko sredinski segment flagelina in antigenski del ostaneta nespremenjena, poveča učinkovitost tvorbe protiteles, kadar je potrebna večkratna imunizacija. Namreč pokazalo se je, da organizem tvori protitelesa tudi proti amino in karboksi končnemu delu flagelina, kar zmanjša delovanje tega segmenta na receptor TLR5, saj je nevtraliziran s protitelesi. Z zamenjavo amino in karboksi končnega dela flagelina v fuzijskem proteinu, pa se le ta izogne nastalim protitelesom in učinkoviteje aktivira receptor TLR5 in preko njega naravni imunski odziv ob ponovnem cepljenju.
Če ni definirano drugače, imajo vsi tukaj uporabljeni tehnični in znanstveni izrazi enak pomen kot je splošno znano strokovnjakom s področja izuma. Terminologija, ki se jo uporablja ob opisu izuma ima namen obrazložitve določenega segmenta izuma in nima namena omejevanja izuma. Vse publikacije omenjene v opisu izuma so navedene kot reference. V opisu izuma in zahtevkih je opis v ednini vendar vključuje tudi množino, kar pa v opisu zaradi lažjega razumevanja ni posebej poudarjeno.
Fuzijski protein/DNA
Predstavljeni izum temelji na odkritju, da cepivo, ki vsebuje zapis za fuzijski protein med (a) delom himemega flagelina, ki stimulira prirojeni imunski odziv preko aktivacije receptorja TLR5 in (b) delom flagelina, ki ni sposoben stimulirati receptorja TLR5 in kot tak ne izkazuje imunogenosti in (c) opcijsko antigenom, ki izhaja iz istega organizma kot neimunogen flagelin, sproži imunski odziv in sintezo protiteles in tako cepivo izkazuje imunogene sposobnosti, ki se pričakujejo s konvencionalnimi cepivi, ki vsebujejo adjuvanse.
Izum sloni na odkritju, da himemi flagelin, ki je sposoben aktivacije receptorja TLR5, in je komponenta fuzijskega proteina in s tem cepiva, sproži sintezo interlevkinov preko MyD88 odvisne poti v celicah imunskega odziva. Izumitelji so prišli do spoznanja, da je taka cepivo sposobna aktivirati prirojeno imunost.
Izraz »aktivacija celic« se nanaša na aktivacijo imunskega odziva preko Tollu podobnega receptorja 5, aktivacijo prirojene imunosti in aktivacijo sinteze protiteles s sproščanjem interferona alfa. Aktivacija celic z aktivacijo receptorjev TLR5 poveča učinkovitost sinteze protiteles na prisoten antigenu.
- 11 Predstavljen izum temelji na odkritju, da imunizacija s cepivom, ki vsebuje fuzijski protein/DNA po izumu in izraža fuzijski protein sproži manjše vnetje v primerjavi s cepivi z dodatkom adjuvansa. Kljub zmanjšanemu vnetju pa fuzijski protein inducira močan imunski odziv. Omenjen pristop zmanjša stranske učinke vakcinacije in kljub temu poveča imunski odziv.
Izum temelji na presenetljivem odkritju, da, če ob večkratni imunizaciji s cepivom, ki vsebuje fuzijski protein med (a) delom flagelina, ki aktivira TLR5 in (b) delom flagelina, ki ne aktivira TLR5 in služi kot antigen, za vsako imunizacijo uporabimo drugo cepivo, ki se od prejšnjih razlikuje v izvoru dela flagelina, ki aktivira TLR5, dosežemo izboljšan imunski odziv. Izumitelji so odkrili, da se z zamenjavo dela flagelina, ki aktivira TLR5, ob vsaki naslednji vakcinaciji ponovno sproži imunski odziv, ki ga v primerjavi ob večkratni vakcinaciji z identično cepivo ni mogoče doseči.
Izum se nanaša na fuzijski protein med (a) deli flagelina, ki aktivira receptor TLR5, (b) deli flagelina, ki ne aktivirajo TLR5 vendar služijo kot antigen. Fuzijski protein opcijsko vsebuje (a) signalno sekvenco, ki določa lokalizacijo izraženega proteina, (b) linker peptide, ki povezujejo posamezne segmente fuzijskega proteina, katerih dolžina je od ene do več aminokislin, (c) označevalna zaporedja, ki omogočajo izolacijo proteina.
Natančneje se izum nanaša na fuzijski protein, ki opcijsko vsebuje linker peptide, ki povezujejo posamezne proteinske segmente fuzijskega proteina po izumu in je opcijsko linker peptid dolg od ene do več aminokislin. Natančneje se izum nanaša na fuzijski protein po izumu, ki vsebuje aminokislinski zapis za peptid, ki služi izolaciji proteina, ki je izbran iz skupine, vendar ni omejen na: his-tag, flag-tag, myc-tag, hemaglutininski-tag in drugo.
Linker peptid
Izraz »linker peptid« se nanaša na krajša aminokislinska zaporedja, katerih vloga je lahko samo ločevati posamezne domene fuzijskega proteina. Vloga linker peptida v fuzijskem proteinu, katerega vključitev je opcijska, pa je lahko tudi vnos mesta za cepitev ali za posttranslacijske modifikacije, vključno z vnosom mest za boljše procesiranje antigenov. Dolžina linker peptida je lahko poljubna in ni omejena, vendar je običajno do 30 aminokislin.
Signalni peptid
Izraz »signalna sekvenca« ali »signalni peptid« se nanaša na aminokislinsko zaporedje, ki je pomembno pri usmerjanju proteina na določeno lokacijo v celici. Signalne sekvence se
- 12razlikujejo tudi glede na gostiteljski organizem, v katerem se fuzijski protein izraža. Aminokislinska zaporedja signalnih sekvenc so dobro poznana strokovnjakom, prav tako katera signalna sekvenca funkcionira v katerem organizmu.
Označevalna zaporedja.
Izraz »označevalna zaporedja« se nanaša na aminokislinska zaporedja, ki se jih proteinu doda za enostavnejše čiščenje/izolacijo/detekcijo proteina.
Položaj signalne sekvence, linker peptidov in označevalnega zaporedja je poljuben, vendar tak, da omogoča funkcionalno izražanje proteina in na položaju, kjer so umeščene, ohranjajo funkcijo, zaradi katere so bila ta aminokislinska zaporedja izbrana, kar je poznano strokovnjakom s področja.
Izum se nanaša na DNA, ki nosi zapis za fuzijski protein, kateri je sestavljen opcijsko s signalno sekvenco, ki opcijsko usmerja fuzijski protein na površino membrane ali v organele znotraj celice, antigen ali antigene ali epitope, med seboj opcijsko povezane z linker peptidom, antigenski segment se povezuje na opcijsko dimerizacijsko regijo in transmembransko domeno, katera je lahko sočasno tudi dimerizacijska regija, ter znotraj celično domeno receptorjev TLR. DNA po izumu je vstavljena v vektor, ki omogoča izražanje DNA v gostiteljskem organizmu. DNA po izumu je v gostiteljski organizem vstavljena z metodami poznanimi strokovnjakom.
Flagelin
Celice v telesu človeka ali živali lahko same proizvajajo flagelin, če vanje vnesemo DNA zapis za kodirajoče zaporedje flagelina. Pokazali so, da se tak DNA zapis lahko uporabi kot cepivo (Applequist et al. 2005, J.Immunol. 175, 3882-3891). Vendar sam flagelin Helicobacter pylori ne bi sprožil zadostnega dobrega odziva, ker ne aktivira TLR5. V pričujočem izumu so izumitelji pokazali, da lahko uporabijo genski zapis za himemi flagelin, ki vsebuje centralni del flagelina Helicobacter pylori ter N- in C-končni segment flagelina bakterije, ki aktivira TLR5. Genski zapis je pod kontrolo ustreznih regulacijskih elementov, ki poskrbijo za izražanje v celicah človeka in živali.
Izumitelji so tak zapis vnesli v celice, ki so začele izločati fuzijski protein, ta pa je povzročil močan imunski odziv in produkcijo protiteles. Dodatek zapisa za protein ali njegovo podenoto je omogočil učinkovit imunski odziv na ta protein. Aktivacija TLR5 je v primeru uporabe flagelina z dodanim proteinskim antigenom celo močnejša kot s samim flagelinom.
- 13 Izum temelji na odkritju, da se flagelini delijo na dva podtipa glede na sposobnost aktivacije prirojene imunosti: (a) flagelini, ki aktivirajo receptor TLR5 in (b) flagelini, ki ne aktivirajo receptorja TLR5. Za bakterije, ki vsebujejo flagelin, ki ne aktivirajo receptorja TLR5, je značilno, da se lažje izognejo obrambnim mehanizmom organizma pred okužbo z bakterijami. Medtem ko bakterije, ki vsebujejo flagelin, ki sproži aktivacijo receptorja TLR5, aktivirajo celosten imunski odziv in obrambo telesa pred bakterijami. Izumitelji so pokazali, da se lahko inducira imunski odziv proti bakterijam, katerih flagelin ne aktivira imunskega odziva s cepivom, ki združuje obe vrsti flagelina. Na podlagi omenjenega odkritja, se izum nanaša na fuzijski protein med (a) N- in C- terminalnim delom flagelina, ki aktivira receptor TLR5 in (b) sredinskim delom flagelina, ki ne aktivira receptor TLR5 in se sredinski del flagelina, ki ne aktivira receptorja TLR5, nahaja med N- in C- terminalnim delom flagelina, ki aktivira receptor TLR5.
Izumitelji so prišli do odkritja, da, če se fuzijskemu proteinu s himemim flagelinom doda proteine, ki izhajajo iz istega mikroorganizma kot flagelin, ki ne aktivira receptorja TLR5, se poveča imunski odziv gostitelj skega organizma, subjekta proti mikroorganizmu. Po izumu se dodatni proteini/antigeni lahko nahajajo za sredinskim segmentom flagelina ali na Cterminalnem koncu fuzijskega proteina.
Iz omenjenega se izum nanaša na fuzijski protein, ki vsebuje N- in C- terminalna dela flagelina, ki aktivirajo receptor TLR5. Po izumu N-končni del flagelina obsega fragment, ki vsebuje minimalno od 1 do 176 aminokisline proteina flagelina E. coli K-12 podsev MG1655 bakterije, oziroma ustrezne homologe iz drugih bakterij. Po izumu C-terminalni del flagelina obsega fragment ki vsebuje minimalno od 401 do 498 aminokisline flagelina E. coli K-12 podsev MG 1655 bakterije, oziroma ustrezne homologe iz drugih bakterij.
Bakterije, katere vsebujejo flagelin, ki stimulira receptor TLR5 so beta proteobakterije ali gama proteobakterije ali spirohete ali firmucute kot so bakterije Escherichia coli, Salmonella sp., Shigella flexneri, Legionella pneumophila, Serratia marcescens, Listeria monocytogenes, Pseudomonas sp., Vibrio cholerae, Bordetella sp., Borellia burgdorferi, Clostridium sp., Bacillus cereus, Bacillus subtilis.
Iz omenjenega se izum nanaša na fuzijski protein, ki vsebuje sredinski del flagelina, kateri celoten ne aktivira receptorja TLR5. Po izumu sredinski fragment flagelina obsega fragment, ki
- 14vsebuje minimalno od 178 do vključno 418 aminokisline proteina flagelina A bakterije Helicobacter pylori J99, oziroma ustrezne homologe iz drugih bakterij
Bakterije, ki vsebujejo flagelin, ki ne stimulira receptorja TLR5 so alfa proteobakterije ali epsilon proteobakterije kot so bakterije Helicobacter sp, Campylobacter sp., Bartonella bacilliformis, Rhizobium meliloti, Rhizobium sp., Wolnella sp., Brucellasp.
Natančneje se izum nanaša na fuzijski protein, ki vsebuje (a) N- in C- končna dela flagelina E. coli, Salmonela, Seratia, prednostno aminokislinske sekvence od 1 do 176 FliC za N-končni del flagelina in od 401 do 498 FliC za C-končni del flagelina, oziroma odgovarjajoči homologni deli flagelina drugih naštetih bakterij; (b) sredinski del flagelina, ki ne stimulira receptorja TLR5 iz Helicobacter pylori, (prednostno aminokislinske sekvence od 178 do vključno 418, oziroma odgovarjajoči homologni deli flagelina drugih naštetih bakterij, kjer je ta sredinski del postavljen med amino in karboksi terminalni del flagelina, ki aktivira TLR5.
Izraz »homologne sekvence/fragmenti/proteini« se nanaša na aminokislinska zaporedja proteinov/fragmentov, ki izhajajo iz istovrstnega ali drugega organizma, ki v analizi prileganja pokažejo dobro medsebojno prileganje, prednostno več kot 50% ohranjenost strukture, prednostno 60%, prednostno 70%. Izraz »homolog« se nanaša tudi na mutante proteina, katerih mutacije spremenijo aminokislinsko sekvenco minimalno.
Ohranjena regija flagelina je dobro poznana v stanju tehnike (Mimori-Kiyosue et al. 1997 J. Mol. Virol. 270:222-237; Wei, Joys 1985, J. Mol.Biol. 186, 791-803). Strokovnjakom s področja je poznano, da se ohranjena regija razlikuje po velikosti glede na izvor flagelina. Na splošno N-terminalni konstantni del vključuje od 170 do 180 aminokislin na N-terminalnem delu proteina in C-terminalni ohranjeni del vključuje 85-100 aminokislin na C-terminalnem delu proteina. Sredinski del/hipervariabilni del se po velikosti zelo razlikuje med posameznimi flagelini glede na izvor flagelina. Strokovnjaki s področja lahko s poznanimi tehnikami prileganja aminokislinskih sekvenc identificirajo N-, C- terminalni del flagelina in sredinski del.
Izraza »N-/C- terminalni del flagelina« se nanaša na aktivne fragmente flagelina in modifikacije aktivnih fragmentov, ki aktivirajo prirojeno imunost preko receptorja TLR5.
Izraz »flagelin, ki ne aktivira receptorja TLR5/prirojene imunosti« se nanaša na skupino flagelinov iz skupine bakterij, ki niso sposobni aktivacije receptorja TLR5. Za bakterije, ki
- 15 imajo flagele sestavljene iz omejenega flagelina je značilno, da se izognejo zaščitnim mehanizmom gostitelja. Ena od takih bakterije je H. pylori.
Natančneje se izum nanaša na fuzijski protein, ki vsebuje 1-vključno 176 (K) in C 401 (A)-498 dela flagelina. (od najširše do naj ožje možnosti)
Izraz »sredinski fragment« se nanaša na variabilen del flagelina, ki se zelo razlikuje po sestavi in velikosti glede na izvor flagelina. Sredinski del je del flagelina, ki se ga ne da označiti kot Nin C- terminalni del in se nahaja med N- in C- terminalnima deloma flagelina. Strokovnjaki s področja s tehnikami prileganja lahko določijo aminokislinsko področje, ki se nanaša na sredinski del flagelina.
Izum se nanaša na fuzijski protein, ki vsebuje sredinski del flagelina, kateri ne inducira receptorja TLR5. Prednostno se izum nanaša na flagelin bakterije H. pylori.
Natančneje se izum nanaša na fuzijski protein, ki vsebuje sredinski del flagelina z aminokislinsko sekvenco SEQ ID NO.: 1.
Metoda za določanje sposobnosti flagelina za aktivacijo.
Določanje sposobnosti aktivacije receptorja TLR5 s flagelinom in mutantami flagelina je ključnega pomena za pripravo proteina po izumu. Izumitelji so pripravili metodo, ki omogoča zelo enostavno določanje, kateri flagelin je sposoben aktivacije receptorja. Priprava celic, ki izražajo receptor TLR5, da se receptor izraža na površini celic. Celice so lahko izbrane izmed celic, ki vsebujejo izražen nativni TLR5 ali med celicami, ki nimajo izraženega nativnega TLR5, vendar jim je gen za nativni ali mutiran, vendar funkcionalen TLR5 vstavljen. Celice s funkcionalnim receptorjem TLR5 na površini izpostavimo flagelinu ali mutanti flagelina, ki ga želimo analizirati, in po določenem času analiziramo aktivacijo receptorja. Čas delovanja flagelina na celice je odvisen od načina detekcije oziroma uporabe reporterskega sistem. Čas je daljši v primeru, daje reporterski sistem/odziv povezan s sintezo reporterskih proteinov. Krajši čas se uporablja pri detekciji fosforilacije. Flagelin ali mutante flagelina lahko reporterskim celicam dodamo tako, da celice, ki že vsebujejo receptor TLR5 in reporterski sistem, transficiramo z genom za flagelin, katerega učinek želimo analizirati. Flagelin ali mutante flagelina lahko reporterskim celicam dodamo v obliki suprenatanta, ki vsebuje izražene flageline. Prav tako lahko flageline ali mutirane flageline reporterskim celicam dodamo na način, da reporterske celice, ki vsebujejo izražen receptor TLR5 na površini, inkubiramo
- 16skupaj s celičnimi linijami, ki so transficirane z genom za flagelin in izražajo flagelin, ki se izloča v medij.
Tako reporterske celice kot celice z genom za flagelin so lahko celične linije živali ali človeka. Reporterske celice morajo vsebovati izražen TLR5 na površini in morajo imeti delujoč reporterski sistem. Reporterske celice imajo lahko receptor TLR5 vstavljen preko DNA ali je receptor prisoten v takih celicah. Celice z genom za flagelin so tiste, ki flagelin izražajo in so lahko enake ali drugačne reporterskim celicam, lahko so tudi celice mikroorganizmov, ki izražajo flagelin.
Izraz »reporterskih sistemov« se nanaša na povečano prisotnost proteinov, katerih ekspresija je pod kontrolo promotorja, ki se aktivira po aktivaciji receptorja TLR5 in signalne poti, ki jo aktivacija receptorja TLR5 sproži. Predvsem se to nanaša izraz na proteine, katerih povečano prisotnost lahko zmerim s povečano aktivnostjo teh proteinov, bodisi povečano cepitvijo substratov in nastankom produktov, ki so lahko merljivi. Predvsem se to nanaša na nastanek ali razgradnjo luminiscenčih substratov, fluorokromnih substratov ali obarvanih substratov. Izraz »reporterski sistem« se nanaša tudi na nastanek ali razpad celici lastnih produktov, katerih procesiranje je pod kontrolo aktivacije receptorja TLR5. Predvsem se to nanaša na spekter vnetnih posrednikov, katerih ekspresija je pod kontrolo transkripcijskih faktorjev, npr: NFkB, ki se aktivirajo z aktivacijo receptorja TLR5. Izražanja vnetnih posrednikov se detektira z barvanjem s specifičnimi protitelesi v ELISA testih ali z detekcijo prisotnosti mRNA teh vnetnih posrednikov z uporabo kvantitativnega PCR z reverzno transkripcijo. Za »reporterski sistem« lahko štejemo tudi spremembo v fosforilacijskem vzorcu, saj aktivacija receptorja TLR5 sproži aktivacijo proteinskih kinaz, ki glede na jakost aktivacije bolj ali manj intenzivno fosforilirajo substrat. Detekcija fosforilacijskega vzorca poteka po westem prenosu s protitelesi, ki so specifična na fosforilacijo substrata.
Antigen/imunogen
Izraz »antigen/imunogen« se nanaša na proteine, dele proteinov, t.i. fragmente proteinov, epitope, v nativni ali mutirani obliki, ki inducirajo stanje občutljivosti in/ali imunske odzivnosti po določenem času vnosa in reagirajo, z namenom demonstracije, s protitelesi in/ali celicami po imunizaciji in vivo in in vitro. Antigen je sestavljen iz enega ali več proteinov/fragmentov med seboj povezanih v poljubnem vrstnem redu. Antigeni vključujejo, vendar niso omejeni na: antigene povezane z bakterijami in mikroorganizmi s flagelini, ki ne inducirajo TLR5.
- 17Natančneje se izum nanaša na himemi flagelin, katerega sredinski segment flagelina izhaja iz flagelinov bakterij skupine alfa proteobakterij ali epsilon proteobakterij, ki vključujejo, vendar ne izključno, bakterije Helicobacter sp, Campylobacter sp., Bartonella sp., Rhizobium meliloti, Rhizobium sp., Wolnella sp., Brucella sp., in je antigen, ki je opcijsko vključen v fuzijski protein, ravno tako izbran iz omenjenih bakterij.
Procesiranje in prepoznavanje antigenov predstavljenih s peptidi z T-limfociti je v veliki meri odvisno od aminokislinskega zapisa antigena. Antigen uporabljen v cepivu predstavljenega izuma lahko vsebuje epitope ali specifične domene. Antigenska domena je lahko sestavljena iz več epitopov. Antigen uporabljen v cepivu predstavljenega izuma lahko vsebuje celoten antigen, ki ohranja tridimenzionalno strukturo antigenskih determinant z namenom tvorbe protiteles z B-limfociti napram strukturi epitopa antigena.
Antigeni, ki so predstavljeni na površini bakterij so najpogosteje v stiku z receptorji imunskih celic in obramba proti njim je pogosto najbolj učinkovita. Med takšnimi molekulami so flagelini, ki tvorijo bakterijske flagele na površini bakterij. Med najbolj učinkovitimi tarčami imunskega sistema so proteini, ki so potrebni za preživetje bakterij v organizmu, virulenčni faktorji in molekule, ki v tarčnem organizmu povzročajo škodljivo delovanje kot so pri Helicobacter pylori ureaza B, CagA, VacA.
Rekombinantna nukleinska kislina/ produkcija proteinov
Razen, če ni zapisano drugače, so bile v izumu uporabljene standardne metode molekularne biologije, kot so: kloniranje genov, pomnoževanje s polimerazo, detekcija nukleinskih kislin, priprava fuzijskih konstruktov, ekspresija peptidov, proteinov v gostiteljskih celicah in podobno. Metode so splošno znane strokovnjakom s področja (glej Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, Inc and John Wiley & Sons, Inc, NY).
Izraz »DNA/nukleinska kislina« se nanaša na polinukleotidne molekule, kot so DNA, RNA, vključno s cDNA, genomska DNA, sintetična DNA, himerna DNA in RNA. Nukleinska kislina je lahko dvoverižna ali eno verižna. Nukleinska kislina je lahko vsebuje nukleinske analoge ali derivate.
Fuzijski protein po izumu je lahko sintetiziran v gostiteljskem organizmu, ki izraža heterologno nukleinsko kislino, ki kodira za fuzijski protein. Fuzijski protein po izumu služi za indukcijo
-18imunskega odziva. Po izumu je prednostno, da je fuzijski protein operativno povezan s signalno sekvenco, kar je zapisano v nukleinski kislini.
Izraz »nativen protein/fragment« se nanaša na protein/proteinski fragment, ki ga je mogoče pridobiti iz organizma brez predhodne manipulacije genskega materiala in je protein/proteinski fragment kodiran v genomu tega organizma.
Izraz »mutiran protein/fragment« se nanaša na protein/proteinski fragment, ki se vsaj v eni aminokislini razlikuje od nativnega proteina/proteinskega fragmenta.
Predstavljeni izum se nanaša na gostitelj ske celice tranformirane z nukleinsko kislino, ki nosi zapis za fuzijski protein po zahtevku. Gostiteljska celica je lahko prokariontska ali evkariontska. Evkariontske celice primerne za izražanje fuzijskega proteina niso omejene v kolikor so celične linije kompatibilne s metodami propagacije ekspresijskega vektorja in ekspresijo fuzijskega proteina. Prednostne evkariontske celice vključujejo, niso pa omejene z, kvasovke, insektne celice, rastlinske celice in celice vretenčarjev, kot so: mišje, podganje, opičje ali človeški fibroblasti.
Katerikoli bakterijski gostitelj se lahko uporabi za izražanje DNA/fuzij skega proteina po izumu. Prednostna prokariontska bakterija je izbrana izmed E. coli, H. pylori. Izum se nanaša na izražanje proteina v bakterijah. Izum se nanaša na bakterijske celic, ki izražajo fuzijski protein, prednostno so to bakterije E. coli ali H. pylori.
Na splošno je heterologna nukleinska kislina vključena v ekspresijski vektor (virusni ali ne virusni). Ustrezni vektorji vključujejo, vendar niso omejeni na: plazmide, virusne vektorje, in drugo. Ekspresijski vektorji, ki so kompatabilni s celicami gostitelj skega organizma, so dobro poznani strokovnjakom s področja in vsebuje ustrezne kontrolne elemente za transkripcijo in translacijo nukleinske kisline. Tipično ekspresijski vektor vključuje ekspresijsko kaseto, ki vključuje v smeri 5' proti 3', promotor, kodirajočo sekvenco za fuzijski protein operativno povezano s promotorjem in terminator vključno s stop kodonom za RNA polimerazo in poliadenilacijski signal za poliadenilazo.
Ekspresijski vektor je lahko pripravljen za izražanje v prokarionskih in evkariontskih celicah. Na primer; prokariontske celice so bakterije predvsem Escherichia coli. Po izumu je uporaba prokariontskih celic namenjena pripravi zadostne količine nukleinske kisline. Ekspresijski vektor na splošno vsebuje operativno povezane kontrolne elemente, ki so operativno povezani z DNA izuma, ki nosi zapis za fuzijski protein. Razumljivo je, da so kontrolni elementi izbrani
- 19na način, da ustrezajo količini izražanja in tkivno specifičnemu izražanju. Promotor je lahko konstitutiven ali inducibilen glede na željen vzorec izražanja. Promotor je lahko nativen ali tujega izvora (ni zastopan v celicah, kjer se ga uporablja) in je lahko naraven ali sintetičen. Promotor je izbran, da funkcionira v tarčnih celicah gostiteljskega organizma. Poleg tega so vključeni iniciacijski signali za učinkovito translacijo fuzijskega proteina, kar vključuje ATG in pripadajoče sekvence. V primeru, da vektor uporabljen v izumu vključuje dva ali več bralnih okvirjev, naj bi bili bralni okvirji operativno povezani z kontrolnimi elementi neodvisno in naj bi bile kontrolni elementi enaki ali različni, glede na želeno produkcijo proteinov.
Primeri bakterijskih ekspresijskih vektorjev, vključujejo, vendar niso omejeni na: pET vektorje, pRSET vektorje, in drugi. Kadar so vektorji uporabljeni v bakterijskih celicah so kontrolni elementi bakterijskega izvora.
Primeri sesalskih ekspresijskih vektorjev za sesalske celice vključujejo, vendar niso omejeni na: pcDNA (Invitrogen), pFLAG (Sigma), in drugi. Kadar so vektorji uporabljeni v sesalskih celicah so kontrolni elementi po večini virusnega izvora, na primer: adenovirus 2, citomegalovirus, simian virus 40.
Izum v nadaljevanju vključuje gostiteljske celice in organizme, ki vsebujejo nukleinsko kislino po izumu (prehodno ali stabilno), ki nosi zapis za fuzijski protein po izumu. Ustrezne gostiteljske celice so poznane v stanju tehnike in vključujejo bakterijske in evkariontske celice. Poznano je, da je protein lahko izražen v sesalskih celicah sledečih organizmov: človek, glodalci, govedo, svinjina, perutnina, zajci in podobno. Gostiteljske celice so lahko gojene celične linije primarnih ali imortaliziranih celičnih linij.
Vnos vektorjev v gostiteljske celice je opravljen s konvencionalnimi metodami poznanimi iz stanja tehnike in se metode nanašajo na transformacijo, transfekcijo, ki vključujejo: kemični vnos, elektroporacijo, mikroinjiciranje, DNA lipofekcija, celična sonikacija, gensko bombardiranje, virusni DNA vnos in drugo. V kontekstu izuma je vnos DNA po izumu z elektroporacijo in virusni vnos v celice vretenčarjev ali celične linije vretenčarjev.
Vnos DNA je lahko prehodnega značaja ali stabilen. Vnos prehodnega značaja se nanaša na vnos DNA z vektorjem, ki DNA po izumu ne vgrajuje v genom celic. Stabilen vnos dosežemo z vgradnjo DNA po izumu v genom gostitelja. Vnos DNA po izumu predvsem za pripravo gostiteljskega organizma, ki ima stabilno vgrajeno DNA po izumu lahko kontroliramo s
-20prisotnostjo markerjev. DNA zapis za markerje se nanaša na odpornost na droge, npr.: antibiotike in je lahko vključen na vektorju z DNA po izumu ali na ločenem vektorju.
Cepivska formulacija in vnos/imunizaeija
Cepiva predstavljena v izumu vsebuje eno ali več DNA/fuzijskih proteinov, ki v tarčnih celicah gostiteljskega organizma izražajo aktiven fuzijski protein opisan zgoraj med (a) N- in Cterminalnim delom flagelina, (b) sredinskim segmentom flagelina (c) antigenom, (d) linker peptidi in z ustreznimi (e) signalnimi sekvencami.
Izum, cepiva po izumu, se lahko uporablja z namenom preprečevanja ali zdravljenja bolezni, katere se lahko preprečujejo/zdravijo z inducirano sintezo protiteles, infekcije z mikroorganizmi, prednostno bakterij, ki vsebujejo flagelin, ki slabo inducira receptor TLR5, opcijsko, bakterij, ki vsebujejo flagelin, ki ne inducira receptor TLR5, opcijsko bakterije H. pylori.
Izraz »zdravljenje« se nanaša na bolezensko stanje subjekta, ki je izboljšano ali delno izboljšano v vsaj enem od kliničnih pokazateljev, izraz se nanaša tudi na upočasnjeno napredovanje bolezni ali motnje. Izraz vključuje tudi preprečevanje infekcije ali nastanka bolezenskega stanja, vendar ni mišljen kot popolna preprečitev bolezenskega stanja, pač pa tudi upočasnjen razvoj bolezenskega stanja subjekta. Metoda »zdravljenja bolezenskega stanja« vključuje terapevtske metode zdravljenja in preprečevanje bolezenskega stanja.
Izraz »vakcinacija/imunizacija« je dobro poznana strokovnjakom s področja. Izraz se razume kot proces za povečan imunski odziv organizma na antigen, kar privede do kljubovanja in premostitve infekcije, pojava bolezni.
Izraz »aktivna imunost« se nanaša na odziv gostiteljskega organizma po srečanju z imunogenom. Vključuje diferenciacijo in proliferacijo imunokompetentnih celic in vodi k sintezi protiteles ali razvoju celično mediirane reaktivnosti. Aktivno imunost lahko sproži izpostavitev gostitelja imunogenom kot so infekcije ali cepivom.
Izraz »zaščitni imunski odziv« se nanaša na imunski odziv v gostitelj skem organizmu, ki ima zaščitno vlogo za gostitelja.
Predstavljeni izum se nanaša na medicinsko in veterinarsko aplikacijo cepiva po izumu. Subjekti, ki so vključeni v proces imunizacije po izumu so perutnina in sesalci, vključno, vendar ne omejujoče: človek, primati, psi, mačke, zajci, kože, kopitarji, pujski, in drugi.
-21 Subjekti so lahko zdravljeni z dvigom zaščitne imunosti, ali uporabljeni za produkcijo protiteles (izjema je človek), katera so kasneje lahko izolirana in uporabljena za diagnostiko ali administracijo v drug subjekt za produkcijo pasivne imunosti.
Podrobneje se izum nanaša na vakcinacijo subjektov s cepivom, ki vsebuje DNA/fuzijski protein po izumu, za zdravljenje in preprečevanje infekcijskih bolezni, ki jih povzročajo mikroorganizmi, prednostno patogeni mikroorganizmi, kot so: bakterije.
Izum se nanaša na cepivo ki vsebuje fuzijski protein/DNA po izumu za stimulacijo odziva proti bakterijam, katerih flagelin ne aktivira signalizacije preko receptorja TLR5. Natančneje se izum nanaša na cepivo za stimulacijo imunskega odziva proti bakterijam iz skupine: alfa in epsilon proteobakterij, kot so: Helicobacter sp, Campylobacter sp., Bartonella bacilliformis, Rhizobium meliloti, Rhizobium sp., Wolnella sp., Brucella sp. Natančneje se izum nanaša na cepivo, ki vsebuje DNA ali fuzijski protein po izumu za zaščito ali zdravljenje okužbe z bakterijo H. pylori.
Po imunizaciji s cepivom, ki vsebuje flagelin pride v telesu človeka in živali do tvorbe protiteles tudi proti flagelinu. Ta telesa se lahko ob ponovni imunizaciji vežejo na antigenske determinante flagelina in tako preprečijo ponovno aktivacijo TLR5 (Šaha et al., 2007, J.Immunol. 179, 1147-1154; Nempont et al., 2008, J.Immunol. 181, 2036-2043), kar je slabost omenjenega postopka imunizacije z identičnim cepivom, ki vsebuje flagelin kot adjuvans. V tem primeru je odziv na cepivo naslednjič manj učinkovito. Tudi ob infekciji z bakterijo, katere flagelin je bil uporabljen kot adjuvans nato sproži šibkejši odziv, kot bakterija, katere flagelin ni bil uporabljen za imunizacijo.
Izumitelji so odkrili, da je zelo učinkovita uporaba protokola cepljenja, kjer se za prvo imunizacijo uporabi vakcina, ki vsebuje poleg izbranega antigena fuzijo s flagelinom za aktivacijo TLR5. Za naslednje ojačitvene stimulacije imunskega odziva se uporabi vakcina, ki vsebuje enak izbrani antigen kot ob predhodni imunizaciji, vendar vezan na drugačen flagelin. Ta prav tako stimulira TLR5, sposobnosti aktivacije TLR5 pa protitelesa, nastala v organizmu zaradi predhodne stimulacije ne nevtralizirajo. Omenjen drugačen flagelin oziroma njegov segment, ki aktivira TLR5, je izbran iz flagelina bakterij, ki stimulirajo TLR5, oziroma je pripravljen s pomočjo mutacij.
Izum se nanaša na cepiva, ki se uporabljajo za večkratne imunizacije, ki vsebuje fuzijski protein po izumu, pri tem se za vsako vakcinacijo uporabi fuzijski protein, ki se od prejšnjih
-Ύ2razlikuje v N- in C- terminalnem delu flagelina. Iz literature je razvidno, da vakcinacija s fuzijskim proteinom, ali DNA, ki izraža fuzijski protein, ki vsebuje flagelin, ki inducira receptor TLR5, privede do sinteze protiteles tudi na N- in C- terminalni del. Tako pridobljena protitelesa vežejo fuzijski flagelin in inhibirajo indukcijo TLR5 v drugi vakcinaciji in naslednjih vakcinacijah. S tem je učinek vseh naslednjih vakcinacij slabši od želenih. Izumitelji so prišli do odkritja, da zamenja cepiva v nadaljnjih imunizacijah s cepivom, ki vsebuje fuzijski protein z identičnim sredinskim segment flagelina in antigeni po izumu, ima pa fuzijski protein v cepivi različne N- in C- terminalne segmente flagelina, sproži boljši imunski odgovor glede na prej opisano situacijo, ker omenjeni flagelini še vedno lahko inducirajo imunski odziv pri gostitelju.
V smislu ilustracije se metoda vakcinacije z.večkratnimi aplikacijami lahko izvrši z uporabo cepiva, ki vsebuje fuzijski protein med (a) N- in C- terminalnim delom flagelina E. coli in (c) sredinskim segmentom flagelina H. pylori, naslednja vakcinacija vključuje uporabo cepiva, ki vsebuje fuzijski protein med (a) N- in C- terminalnim delom flagelina Salmonela sp. in (c) sredinskim segmentom flagelina H. pylori, in naslednja vakcinacija vključuje uporabo cepiva, ki vsebuje fuzijski protein med (a) N- in C- terminalnim delom flagelina Seratie in (c) sredinskim segmentom flagelina H. pylori, za zaščito/zdravljenje subjekta (človeka ali živali) pred infekcijo z bakterijo Helicobacter pylori.
Izum se prav tako nanaša na DNA, ki nosi zapis za fuzijski protein po izumu in se DNA uporablja za pripravo cepiva za vnos DNA v celice človeka ali živali z namenom vzbuditi imunski odziv na fuzijski protein oziroma antigen oziroma izbran mikroorganizem po izumu.
Izum se nanaša tudi na metodo indukcije imunskega odziva z administracijo cepiva, ki vsebuje DNA po izumu, z inhalacijo, oralno, intravenozno, transdermalno, parenteralno, aubkutano, intradermalno, intrapleuralno, intracerebralno, intraarterijsko, oziroma z injiciranjem direktno v organ ali tkivo. Prednostno se izum nanaša na administracijo DNA cepiva preko sluznice nosu, ust, žrela, požiralnika, črevesa, očesa, urološkogenitalne sluznice.
Izum se nanaša na vakcinacijo z mrtvimi ali oslabljenimi mikroorganizmi, ki na površini izražajo fuzijski protein po izumu in so mikroorganizmi sami ne škodljivi za subjekt, prednostno so to bakterije, kvasovke, prednostno izbrane med: E. coli', Lactobacillus sp., Saccharomyces cerevisiae, in druge.
-23Farmacevtska kompozicija
Izum v nadaljevanju zagotavlja farmacevtsko zmes, ki vsebuje fuzijski protein ali DNA po izumu, s farmacevtsko sprejemljivimi nosilci.
Izum se nanaša na farmacevtsko zmes, ki vsebuje cepivo po izumu in cepivo vsebuje fuzijski protein ali DNA z zapisom za fuzijski protein po izumu in farmacevtska zmes predstavlja bakterije. Po izumu bakterije vsebujejo DNA z zapisom za fuzijski protein po izumu, in izražajo fuzijski protein. Bakterije so v farmacevtski zmesi v neaktivnem stanju in so običajno prisotne v subjektu.
Izraz »neaktivno stanje« se nanaša na bakterije, ki se v subjektu niso sposobne razmnoževati in na subjekt ne delujejo škodno, so običajno prisotni v subjektu.
Izum se nanaša na cepivo, ki je v farmacevtski zmesi, v obliki fuzijskega proteina, ki je v telo vnesen po metodah, ki so poznane v stanju tehnike.
Prednostna je farmacevtska zmes formulirana za virusni vnos, vnos preko sluznice, vnos z elektroporacijo ali katerokoli drug vnos DNA poznan strokovnjakom s področja. Izraz »farmacevtsko sprejemljiv« se nanaša na material, ki ni toksičen za gostiteljski organizem.
V okvir izuma je fuzijski protein/DNA po izumu prisoten v farmacevtski zmesi v »imunogeno učinkoviti« količini. Izraz »imunogeno učinkovita« količina se nanaša na količino, ki zadostno sproži aktivni imunski odziv (celični ali humoralni) v subjektu, kateremu je farmacevtska zmes administrirana. Opcijsko je dozirna količina zadostna, ko producira zaščiten imunski odziv (terapevtski ali profilaktičen). Pridobljena zaščita ni nujno, da je popolna, stalna samo, da je korist administracije farmacevtske zmesi večja od neželenih učinkov. Imunološko učinkovita količina je odvisna od načina administracije od vrste fuzijskega proteina ali DNA izuma in za DNA cepivo od učinkovitega izražanja proteina, od subjekta. Učinkovite količine, doze, so določene na način poznan v stanju tehnike.
Farmacevtska zmes po izumu lahko vključuje druge medicinske agense, farmacevtske agense, stabilizacijske spojine, pufre, nosilce, redčila, soli, močila, osmostabilizatorje.
V nadaljevanju so prikazani izvedbeni primeri, katerih namen je ilustrirati izum. Opis izvedbenih primerov nima namena omejevanja izuma ampak naj se razume kot demonstracija delovanja izuma.
-24Izvedbeni primeri
Primer 1. Priprava DNA konstruktov.
Za pripravo DNA konstruktov so izumitelji uporabili metode molekularne biologije, kot so: kemijska transformacija kompetentnih celic E. coli, izolacija plazmidne DNA, pomnoževanje s polimerazo (PCR), reverzna transkripcija - PCR, lepljenje s PCR, določanje koncentracije nukleinskih kislin, elektroforeza DNA na agaroznem gelu, izolacija fragmentov DNA iz agaroznih gelov, rezanje DNA z restrikcijskimi encimi, rezanje plazmidnih vektorjev, ligacija fragmentov DNA, čiščenje plazmidne DNA v večjih količinah. Natančen potek eksperimentalnih tehnik in metode so dobro poznane strokovnjakom s področja in so opisane v priročnikih molekularne biologije.
Za vse delo smo uporabljal sterilne tehnike dela, ki so prav tako dobro poznane strokovnjakom s področja. Vsi plazmidi, zaključeni konstrukti in delni konstrukti, so bili transformirani v bakterijo E. coli DH5a s kemično transformacijo. Plazmidi za transfekcijo v celične linije HEK293 ali HEK293T ali Caco-2 celice so bili izolirani z uporabo izolacijskega seta UltraMobius 200 (Novagen), ki odstrani endotoksine.
Končni konstrukti so našteti v tabeli 1 in so bili vsi pripravljeni s tehnikami po metodah poznanih strokovnjakom Ustreznost nukleotidnega zaporedja so izumitelji potrdili s sekveniranjem in restrikcij skimi analizami.
-25Tabela 1: Fuzijski proteini, ki smo jih uporabili za demonstracijo izuma.
| št. | ime | sestava konstrukta | preostanek plazmida |
| 1 | UreB | T7p-HPUreB-Histag-HISt | pSBl.AK3 |
| 2 | HimFla-UreB | T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-HPUreB-RGD-Histag-HISt | pSBl.AK3 |
| 3 | HimFla-multi | T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-multiepitop-RGD-Histag-T7t | pET |
| 4 | HimFla | T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-RGD-Histag-HISt | pSBl.AK3 |
| 5 | HimFla | T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-RGD-Histag-T7t | pET |
| 6 | HimFla-multi | T7p-EcNfliC HpVfla213-multiepitop-215HpVfla EcCfliC-HIS, | pSBl.AK3 |
| 7 | HimFla-multi | T7p-EcNfliC HpVfla213-multiepitop-215HpVfla EcCfliC-T7t | pET |
| 8 | FliC | T7p-EcfliC-T7t | pET |
| 9 | HimFla-ureB | TetRRBSp-EcNfliC HpVfla213-ureB-215HpVfla EcCfliC- HISt | pSBl.AK3 |
| 10 | HimFla-multi | TetRRBSp-EcNfliC HpVfla213-multiepitop-215HpVfla EcCfliC- HISt | pSBl.AK3 |
| 12 | HimFla-ureB | T7p- EcNfliC HpVfla213-ureB-215HpVfla EcCfliC- HISt | pSBl.AK3 |
| 13 | UreB | CMVp-sshCD4-HPUreB-Histag-BGHt | PSB1.AK3 |
| 14 | ssHimFla-UreB | CMVp-sshCD4-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-HPUreB-RGD- Histag-BGHt t | pSBl.AK3 |
| 15 | HimFla | CMVp-sshCD4-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-RGD-Histag-BGHt | pSBl.AK3 |
| 16 | ssHimFla-multi | CM Vp-sshCD4-EcNfliCHpVfla213 -multiepitop-215Hp V fla EcCfliC-RGD-Histag- BGHt | pSBl.AK3 |
| 17 | HimFla-UreB | CMVp-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-HPUreB-RGD-Histag-BGHt | pSBl.AK3 |
| 18 | HimFla-multi | CMVp-EcNfliCHpVfla213-multiepitop-215HpVflaEcCfliC- RGD-Histag-BGHt | pSBl.AK3 |
-26Tabela 2: Legenda genov, funkcija, številka v bazi in aminokislinsko/nukleotidno sekvenco, ki predstavlja meje uporabljenih delov gena.
| ime gena | SvvissProt št.: | aminokislinska/nukleinska sekvenca | funkcija |
| EcCfliC | P04949 | AK:401-498 (SEQ ID NO: 2, 3) | E. coli C-terminalni del flagelina |
| EcNfliC- | P04949-P0A0S2 | AK:1-176 (SEQ ID NO: 4, 5)-AK: 178- | 176 N-terminalnih del flagelina |
| HpVfla213 | 213 | E.coli z variabilnim delom flagelina H.pylori do 213 AK | |
| EcfliC | P04949 | AK: 1-498 (SEQ ID NO: 6, 7) | E. coli flagelin |
| EcNfliC | P04949 | AK: 1-176 (SEQ ID NO: 8, 9) | E. coli N-terminalni del flagelina |
| 215HpVfla- | P0A0S2-P04949 | AK: 215-418 (SEQ ID NO: 10, 11)-AK: | Variabilni del flagelina H. pylori |
| EcCfliC | 401-498 | od 215 AK z 99 C terminalni delom flagelina E. coli | |
| HPUreB | SEQ ID NO: 12 | H. pylori ureaza B antigen (B podenota ureaze od H. pylori) | |
| HIS, | SEQ ID NO: 13 | http://partsregistry.org/wiki/index.php7tit terminator le=Part:BBa_Kl 33044 | |
| Histag | HHHHHH@ | označevalec | |
| HpVfla | P0A0S2 | AK: 178-418 | sredinski segment flagelina; Variabilna regija flagelijna od H. pylori |
| Multiepitop | SEQ ID NO: 14, 16 | 15, | antigen; fuzijski protein sestavljen iz epitopov: ureB, VacA, HpaA H. pylori |
| RGD | SEQ ID NO: 17 | RGD | Peptidni motiv potreben za vezavo na integrine |
| T7P | SEQ ID NO: 18 | promotor | |
| T7, | SEQ ID NO: 19 | terminator | |
| ureB/UB33 | SEQ ID NO: 14 | ureB epitop H. pylori | |
| BGH, | SEQ ID NO: 21 | terminator | |
| CMVp | http://partsregistry.org/wiki/index.php7tit promotor le=Part:BBa_I712004 | ||
| sshCD4 | P01730 | AK 1-25 | signalna sekvenca |
| TetRRBSp | SEQ ID NO: 20 | represibilni TetR promotor z vezavnim mestom za ribosom |
-27Primer 2 - Imunodetekcija proteina
Postopki priprave gela za SDS-PAGE, prenos proteinov iz gela na membrano in analiza proteinov po Westemu so splošno znani strokovnjakom in jih tukaj opisujemo le v smislu ilustracije. Vzorcem (supematantu ali delno prečiščenim proteinom) smo dodali 4 x reducirajoči vzorčni pufer z SDS in jih denaturirali s segrevanjem 5 min pri 100° C. Nato smo vzorce nanesli na gel. Kot proteinski velikostni standard smo uporabili SeeBluePlus (Fermentas). Za elektroforezo smo uporabili vertikalni sistem Mini-Protean II in 10% poliakrilamidni gel. Elektroforeza je potekala v 1 x SDS elektroforeznem pufru 45-60 min pri konstantni napetosti 200 V. Po končani elektroforezi smo odstranili vstopni gel, ločitveni gel pa uporabili v prenosu Westem. Gel PAGE, filter papirje in nitrocelulozno membrano smo namakali v pufru za mokri prenos. Sestavili smo aparaturo za mokri prenos. Prenos je potekal 1 uro pri konstantnem toku 350 mA. Nespecifična vezalna mesta na membrani smo blokirali z 0,2% I-Block reagentom v lxPBS/0,l% Tween-20.. Blokiranje je potekalo bodisi 1,5 ure med stresanjem pri sobni temperaturi ali pa preko noči pri 4 °C in rahlem stresanju. Nitrocelulozno membrano smo inkubirali v raztopini za blokiranje (0,2% I-Block reagent/lxPBS/0,l% Tween20) z mišjimi monoklonskimi AntiHis primarnimi protitelesi (Qiagen), redčenimi v razmerju 1 : 2000. ter inkubirali 1,5 ure pri sobni temperaturi in rahlem stresanju oziroma preko noči pri 4 °C in rahlem stresanju. Po inkubaciji smo membrano spirali (4x5min) s pufrom za spiranje (lxPBS/0,l% Tween-20). Nato smo membrano inkubirali 45 minut pri sobni temperaturi in rahlem stresanju v raztopini za blokiranje s sekundarnimi kozjimi proti-mišjimi protitelesi, konjugiranimi s hrenovo peroksidazo, redčenimi v razmerju 1 : 3000. Po spiranju membrane s pufrom za spiranje (3-krat 5 min) smo membrano 5 minut inkubirali v Super Signal West Pico kemiluminiscentnem reagentu. Substrat vsebuje luminol, ki ga hrenova peroksidaza na sekundarnih protitelesih oksidira. Oksidiran luminol preide v vzbujeno stanje, pri prehodu v osnovno stanje pa se sprošča svetloba, ki jo zaznamo na filmu.
Primer 3 - Priprava antigena za analizo ELISA
Kot antigene za test ELISA smo uporabili fuzijske proteine UreB, HimFla-UreB in HimFlamulti (proteini št 1, 2 in 3, tabela 3) ter celični lizat bakterij H. pylori. Fuzijski proteini z antigeni so bili izraženi v E. coli BL21 (DE3) pLysS. Erlenmajerice s kulturo smo inkubirali na 37°C do ustrezne gostote (OD(600) 0,4-0,5), nato smo temperaturo inkubacije znižali na 25°C. IPTG do končne koncentracije lmM smo dodali, ko je gostota celic dosegla vrednost OD(600) 0,8-1,0 ter kulturo inkubirali čez noč na 25°C pri 180 obratih/min. Celice smo zbrali z 10 min
-28centrifugiranjem pri 5000 obratih/min. Pelet bakterijskih celic, smo resuspendirali v pufru za lizo celic (0,1% natrijev deoksiholat, 10 mM Tris/HCl, pH=8,0 s proteaznimi inhibitorji. Lizirane celice smo sonicirali. Homogeno zmes smo centrifugirali 30 min pri 12000 obratih/min in 4°C. Supematant, kjer se je nahajal protein, smo pod nativnimi pogoji vezali na Ni-NTA kolono. Pred vezavo smo kolono kondicionirali s pufrom za nativno vezavo (50 mM Tris/HCl, pH=8,0), ki smo mu dodali 100 mM NaCl. Vezavo proteina smo izvedli čez noč na 4°C ob stresanju. S kolone smo spirali nečistoče s 5 volumni polnila kolone s pufrom za nativno vezavo (50 mM Tris/HCl, pH=8,0), 100 mM NaCl). Nespecifično vezane proteine smo s kolone spirali s pufrom za nativno vezavo, ki smo mu dodali imidazol do koncentracije 20 mM. Elucijo proteina smo izvedli s pufrom za nativno vezavo z dodanim imidazolom do koncentracije 250 mM. Prisotnost našega proteina v frakcijah z najvišjo absorbanco smo preverili z SDS-PAGE in westem analizo s primarnimi protitelesi, specifičnimi za His-tag.
ELISA - coat z antigenom, detekcija serumskih IgG. Antigen izoliran po zgoraj opisanem postopku smo razredčili v 50 mM Na2CO3 pufru pH 9.6 in sicer do koncentracije 10 pg/ml. V posamezno luknjico smo dali 50 μΐ razredčenega antigena (velja za fuzijske rekombinantne proteine) in inkubirali preko noči pri 4°C. Za test ELISA, kjer smo uporabili kot antigen lizat H. pylori, smo v posamezno luknjico dodali 50 μΐ celičnega lizata v 50 mM Na2CC>3 pripravljenega iz 5 χ 107 bakterijskih celic liziranih s postopkom toplotne obdelave. Plošče z vezanim antigenom smo 3x spirali s PBS-T (PBS/0,05% Tween-20), blokirali 1,5 h v 3% BSA/PBS-T pri 37°C, nato pa ponovno 3x spirali s PBS-T.
Nato smo vezali različne razredčitve seruma, raztopljenega v blokimem pufru (3% BSA/PBST) (50 pL/luknjo) in inkubirali 1,5 h na 37°C. Ponovno smo 3x spirali s PBS-T. Nato smo vezali s hrenovo peroksidazo označena sekundama kozja proti-mišja protitelesa IgG, redčena z blokimim pufrom v razmerju 1:3000 (50 pL/luknjo) in inkubirali 1,5 h na 37°C. Sledilo je spiranje 3x PBS-T. Na koncu smo dodali 100 pL že pripravljenega substrata za detekcijo peroksidaze ABTS (Sigma)-0.5 mg v 50 pL. Reakcijo smo po 20 min ustavili z dodatkom enakega volumna 1% SDS (100 pL). Takoj po ustavitvi reakcije smo na mikrotitrskem optičnem čitalniku (Mithras) izmerili A42o .
Primer 4 - Linija miši in pogoji nastanitve
Za živalski poskus smo izbrali linijo miši C57BL/6J kupljeno v vzrejnem centru Medicinske fakultete, Univerze v Ljubljani. Linija C57BL/6J je bila izbrana, ker je ena najbolj standardnih in preučenih linij miši (genom, fiziologija) ter ima preverjeno dobro odzivnost na okužbo s H.
-29pylori ter kaže boljšo kolonizacijo in histološke spremembe želodca od drugih standardnih linij miši. Glavni razlog za izbor te linije pa je v tem, daje bilo pokazano, da se ta linija na okužbo s H. pylori odzove pretežno z Thl odzivom, kar je podobno kot pri ljudeh okuženih z H. pylori. Zato je ta linija primeren model za tovrstne študije in ekstrapolacijo rezultatov na človeka. Z zgornjim smo zadostili principom »3R« pri poskusih na živalih - principu »reduce« s premišljenim izborom ustrezne živalske vrste in linije, ki nam z najmanjšim možnim številom poskusnih živali zagotavlja statistično validne rezultate; principu »replace« z načrtom poskusa, ki je osnovan na predhodnih in vitro testih se zmanjša število testiranih pripravkov, ki so potencialno neučinkoviti ter principu »refine«, kjer smo z jemanjem manjših količin krvi skozi obdobje poskusa na isti živali zmanjšali število živali.
Živali so bile nastanjene v starosti med 8-10 tednov na inštitutu za mikrobiologijo Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani. Po individualni označitvi živali so bile za 2 tedna nastanjene v karanteni. Med poskusom smo živali redno pregledovali in tehtali, da bi v primeru izgube telesne mase do 15 % v primerjavi s telesno maso na začetku poskusa žival izločili iz poskusa. V poskusnem obdobju so bile miši hranjene s standardno krmo za vzdrževanje glodalcev Altromin 1324 (Lage, Nemčija). Celoten poskus so bile živali krmljene po volji razen na dneve oro-gastričnih aplikacij , ko smo živalim preko noči odvzeli hrano, da je bila aplikacija izvedena na prazen želodec. Živali so skozi celoten poskus imele stalen dostop do vode. V vsaki skupini (tretma) je bilo po 5 živali nastanjenih v isti kletki.
Fuzijski proteini
Primer 5 - Pridobivanje fuzijskega proteina
Transformacija bakterij in selekcija. Za produkcijo fuzijskih proteinov smo uporabili sev bakterij, ki se običajno uporablja za produkcijo proteinov. Transformacijo seva bakterij E. coli BL21 (DE3 pLysS) smo opravili po protokolu poznanem strokovnjakom s področja. Kompetentne bakterijske celico smo transformilrali po kemičnem postopku in izolirali uspešne transformante na LB ploščah z dodatkom ampicilina. Posamezne bakterijske kolonije smo izolrali in preverili prisotnost plazmida, ki nosi zapis za fuzijski protein. Pozitivne bakterijske kolonije smo uporabili za produkcijo proteina v večjih količinah.
Proizvodnja fuzijskih proteinov. Izbrano kolonijo smo cepili v 100 ml tekočega medija LB z ampicilinom ter inkubirali čez noč pri 37°C in 180 obratih/min. Prekonočno kulturo smo
-30redčili do gostote bakterij, ki ustreza A6oonm —0,15. Nadaljevali smo po protokolu, kot že opisano v primeru 3.
Čiščenje fuzijskih proteinov. Tehnike čiščenja proteinov so dobro poznane strokovnjakom in niso predmet izuma. Tu je opisan eden od možnih postopkov čiščenja proteinov. Bakterijske celice smo zbrali, sprali in lizirali z 30 ml pufra za lizo celic (0,1% natrijev deoksiholat, 10 mM Tris/HCl pH 8,0) z dodanimi proteaznimi inhibitorji (Sigma). Lizirane celice smo dodatno sonicirali in s centrifugiranjem odstranili preostanke celic od supematanta. Fuzijski protein, ki se je nahajal v supematantu smo vezali na Ni-NTA kolono kondicionirano s pufrom za nativno vezavo (50 mM Tris/HCl pH 8,0/100 mM NaCl). Po spiranju nespecifično vezanih proteinov s pufrom za nativno vezavo z 20 mM imidazolom smo specifično vezane fuzijske proteine eluirali s pufrom za nativno vezavo z 250 mM imidazolom.
Tabela 3: Konstrukti plazmidov, ki smo jih uporabili za pripravo fuzijskih proteinov. Pomen posameznih fragmentov je razložena v primeru 1.
| št. | ime | sestava konstrukta |
| 1 | UreB | T7p-HPUreB-His,ag-HISt |
| 2 | HimFla-UreB | T7p-EcNfla-HpVfla-EcCfla-HPUreB-RGD-Histag-HISt |
| 3 | HimFla-multi | T7p-EcNfla-HpVfla-EcCfla-multiepitop-RGD-Histag-T7( |
| 5 | HimFla | T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-RGD-Histag-T7, |
Fuzijska proteina številka 1 in 2 iz Tabele 3 smo eluirali s pufrom za nativno vezavo s 50 mM imidazolom, fuzijski protein številka 3 iz Tabele 3 pa z 250 mM imidazolom. Proteine smo dokazali z SDS-PAGE ter Westem prenosom (Slika 1). Zbrane eluate smo 4 ure dializirali proti dializnem pufru (lxPBS/lmM EDTA) ter čez noč proti lxPBS v takšnem volumnu, daje bila končna koncentracija imidazola v eluatih nižja od 0,05 mM. Za imunizacijo v miših smo dializirane eluate zmešali z Imject Alumom (Pierce) v razmerju 1:2.
Fuzijske proteine pridobljene iz bakterij transformiranih s plazmidi iz tabele 3 smo pripravili v večjih količinah za imunizacijo miši. Prisotnost proteinov smo potrdili z analizo po Westemu (opisana v primeru 2), karje prikazano na sliki 2.
Primer 6 - Internalizacija fuzijskih proteinov v celičnih linijah
Intemalizacijo fuzijskih proteinov v celice smo določili z mikroskopiranjem s konfokalnim mikroskopom. Tehnike in metode dela s konfokalnim mikroskopom, fiksacija in barvanje celičnih proteinov s protitelesi za upodabljanje proteinov in uporaba barvil za označevanje
-31 organel so splošno poznane strokovnjakom in so tukaj opisane samo podrobnosti pomembne za demonstracijo izuma.
Namen eksperimenta je bil določiti ali je intemalizacije fuzijskih proteinov v celico odvisna od prisotnosti receptorja TLR5. Fuzijske proteine smo označili z aktiviranim fluorescenčnim barvilom Alexa555 po navodilih proizvajalca (Molecular Probes). Fuzijske proteine-Alexa55 smo v koncentraciji opisanih v rezultatih dodali celičnim linijam HEK293.
Celične organele smo označevali z ustreznimi označevalci organel: endoplazemski retikulum smo označevali z barvilom ER-tracker (MolecularProbes), endosome in lizosome z barvilom Lyso-Tracker (MolecularProbes), transferin-Alexa633 (MolecularProbes) po navodilih proizvajalca.
Označene žive celice ali fiksirane celice smo pregledovali na konfokalnem mikroskopu Leica TCS SP5 na Leica DMI 6000 CS stojalu. Ta mikroskop je namenjen laserskemu skeniranju fluorescenčno označenih živih ali fiksiranih celic. Uporabljali smo 63χ oljni imerzijski objektiv. Slike smo pridobili s programom LAS AF 1.8.0. Leica Microsystems. Uporaba laserjev je bila odvisna od valovnih dolžin, pri katerih smo želeli vzbujati.
Slika 3 prikazuje rezultate intemalizacije z Alexo555 označenih proteinov po izumu. Na sliki so prikazani sledeči proteini označeni z barvilom Alexa555: [Α,Β] Barvilo Alexa555 (MolecularProbe) deaktivirano v Tris pufru pH 8.5; [C] Intemalizacija proteina HimMulti označenega z Alexa555 (0.125 pg/μΐ); [D] Celice [C] dodatno barvane z LysoTrackerGreen (MolecularProbes) (50 mM); [Ε] Intemalizacija proteina HimMulti označenega z Alexa555 (0.125 pg/μΐ) [F] Celice [Ε] dodatno barvane s SynaptoRed; [G] Intemalizacija proteina Salmonella FliC označen z Alexa555 (0.1 pg/μΐ) [H]; Celice [G] dodatno barvane s transferrin633 (MolecularProbes) (0,1 mg/ml). Proteini so bili raztopljeni v 200 μΐ PBS (25pg) in dodani celicam. Celice smo inkubirali s proteinom lh inkubacije na 37°C.
Primer 7 - Aktivacija receptorja TLR5 v celičnih linijah s fuzijskimi proteini
Gojenje celičnih linij in transfekcija. Za gojenje celic in transfekcijo so izumitelji uporabili postopke in tehnike, ki so dobro poznane strokovnjakom.
Celične kulture smo gojili pri 37° C in 5 % CO2 . Za njihovo gojenje smo uporabili gojišče DMEM z 10 % FBS, ki vsebuje vsa potrebna hranila, rastne faktorje. Ob zadostni gostoti celic smo jih presadili oziroma zredčili. Če smo jih želeli uporabiti pri poskusih, smo celice najprej prešteli s hemocitometrom in jih ustrezno število nacepili na mikrotitrsko ploščo s 96
-32luknjicami, primemo za gojenje celičnih kultur. Nacepljene plošče smo inkubirali v inkubatorju pri 37 °C in 5 % CO2, dokler celice niso dosegle primerne preraščenosti za transfekcijo. Za transfekcijo celic smo uporabili transfekcijske reagente GeneJuice, JetPei ali Lipofectamine. Transfekcijo smo izvedli po navodilih proizvajalca po prilagojenem postopku za transfekcijo v mikrotitrskih ploščah s 96 luknjicami. Dan pred transfekcijo smo celice nacepili v ustrezno mikrotitrsko ploščo in jih gojili do ustrezne gostote. Na dan transfekcije smo najprej redčili ustrezno količino plazmidne DNA v mediju DMEM brez dodanega FBS. Ravno tako smo v DMEM brez FBS redčili transfekcijski reagent. Mešanici smo nato združili in inkubirali 10 minut na sobni temperaturi, da so nastali transfekcijski kompleksi. Transfekcijsko mešanico smo dodali celicam in jih v inkubatorju inkubirali vsaj šestnajst ur.
Luciferazna aktivnost. Za luciferazno aktivnost smo uporabili test z dvema reporterjema: (a) kresničkina luciferaza (Fluc) in (b) Renilla luciferaza (Rluc). Kresničkina luciferaza (Fluc), ki za substrat uporablja CoA, ATP in luciferin, je funkcionalno povezana s promotorjem, ki zaznava aktivacijo NFkB transkripcij skega faktorja. Ob aktivaciji prirojene imunosti preko receptorjev TLR in MyD88 odvisne poti pride do aktivacije NFkB, kar je mogoče detektirati z merjenjem aktivnosti kresničkine luciferaze. Drugi reporter, ki se ga transficira v celice sočasno s plazmidom pFluc in plazmidi, ki nosijo zapis za preiskovane fuzijske proteine, služi kot reporter učinkovitosti transfekcije. Reporterski plazmid nosi zapis za Renillino luciferazo (Rluc), za katero je ustrezen substrat koelenterazin. Rluc se v celicah izraža neodvisno od pogojev.
Za analizo ekspresije reporterskih proteinov smo celice lizirali s pufrom po navodilih proizvajalca (Promega). Najprej smo izmerili aktivnost za kresničkino luciferazo (Fluc-IFNBFLUC) nato še aktivnost Renilla luciferaze (Rluc - http://www.promega.com/vectors/prltk.txt). Aktivnost Rluc nam torej pove delež transficiranih celic, medtem ko nam aktivnost Fluc kaže aktivacijo prirojene imunosti. Razmerje Fluc/Rluc (RLA - relativna luciferazna aktivnost) nam torej pove normalizirano vrednost stimuliranih celic glede na transficirane celice.
Iz rezultatov prikazanih na sliki 4 je razvidno, da fuzijska proteina HimFla in HimFla-multi (številki 5 in 3 v tabeli 3) aktivirata receptor TLR5 v enaki ali večji meri kakor sama pozitivna kontrola. Kot pozitivno kontrolo smo vzeli komercialen flagelin bakterije Salmonella typhimurium, za katerega vemo, da aktivira TLR5 signalno pot. Kot negativno kontrolo smo uporabili vodo. Iz rezultatov je jasno vidno, da je prišlo do aktivacije TLR5 signalne poti v primeru fuzijskega proteina HimFla, ki je aktiviral dvakrat bolje kakor pozitivna kontrola, kot
-33 tudi v primeru fuzijskega proteina HimFla-multi, katerega aktivacija je približno enaka kot za pozitivno kontrolo. Meritve smo opravili 6 ur po aktivaciji. Koncentracije proteinov so bile približno 1 pg za HimFla in 5 pg za HimFla-multi.
Primer 8 - Protitelesa- vakcinacija s proteinsko vakcino (Fuzijski protein)
Testirali smo proteinski vakcini HimFla-UreB in HimFla-multi (številki 2 in 3 v tabeli 3), kot negativna kontrola je služil protein lizocim (Sigma) ter miši, kjer smo aplicirali samo reagente brez proteinov. Proteine smo aplicirali intraperitonealno, kjer je bil antigen v PBS zmešan z adjuvansom aluminijevim hidroksidom (Imject Alum, PIERCE) v razmerju 2 (protein) : 1 (A10H). Končna količina vbrizganega antigena je bila 100 pg proteina v volumnu 300 pl. Ponovna (ojačevalna) vakcinacija je sledila 10 dni po prvi vakcinaciji za vse 4 zgoraj opisane proteine. Rekombinantni protein »himemi z multiepitopom na koncu« smo vakcinirali tudi na tak način, da smo prvo vakcinacijo izvedli intranazalno (50 ug rekombinantnega proteina v PBS, konc. 5 mg/ml) na žival v volumnu 10 ul - mišim smo z mikropipeto vakcino počasi aplicirali po 5 ul na vsako nosnico. Ojačevalno vakcinacijo smo izvedli intraperitonealno, kot je opisano zgoraj.
Odvzem krvi med poskusom. Miši smo za 15 minut prestavili v posebno ventilirano in ogrevano (40° C) kletko, kar omogoča vazodilatacijo in hitrejše in lažje zbiranje krvi. Žival smo fiksirali v posebni napravi in na koncu repa aplicirali lokalni anestetik (Etilni klorid). S škarjami smo odrezali 1-2 mm konca repa in kri zbirali v posebne kivete. Živali smo odvzeli do največ 100 ul krvi. Rano na repu smo potem prevlekli s pasto srebrovega nitrata, da smo zaustavili krvavenje in pospešili celjenje. Na koncu poskusa smo kri zbirali po omamljanju s CO2 s punkcijo srca.
Rezultati analize protiteles po vakcinaciji s proteinsko vakcino s testom ELISA: Da bi ugotovili potencialno profilaktično delovanje vakcinacije z rekombinantnimi fuzijskimi proteini HimFlaUreB in HimFla-multi (proteina št 2 in 3, tabela 3) smo v serumu imuniziranih laboratoriskih miši ugotavljali prisotnost IgG protiteles. Kot antigene smo uporabili sam rekombinanten protein HimFla-multi, rekombinatni protein UreB (protein št. 1, tabela 3) ter celični lizat bakterij H. pylori. Redčitveni niz titrov protiteles proti proteinski vakcini HimFla-UreB so prikazani na sliki 5A in proti vakcini HimFla-multi na sliki 5B. Vzorec 4-kratnih redčitvenih nizov (od redčitve 62,5-krat do 16000-krat) kaže pričakovan postopen padec titra protiteles v vsaki nadaljnji redčitvi, kar potrjuje validnost testa. Rezultati prikazani na obeh slikah (5A in 5B) pa nedvomno potrjujejo, da sta oba naša fuzijska proteina HimFla-UreB in HimFla-multi
-34inducirala močan imunski odziv, ki je statistično značilno odstopa od vrednosti negativnih kontrol (P> 0,001) tudi pri 16.000-kratni redčitvi. Dodaten argument, daje bil imunski odziv močan je podatek, da smo meritev opravili že 3 tedne po prvi vakcinaciji oziroma 11 dni po ojačevalni vakcinaciji. Še več, rezultati na obeh slikah (5A in 5B) kažeta, da so protitelesa proti antigenom HimFla-UreB in HimFla-multi reagirala tudi proti antigenom v celičnem lizatu H. pylori, kar pomeni, da so serumska protitelesa prepoznala tako očiščene rekombinantne proteine (stolpci z diagnonalnimi črtami v histogramih slik 5A in 5B), kot tudi temperatumostabilne epitope v lizatu H. pylori (“pikčasti stolpci v histogramih slik 5A in 5B). Rezultati tako implicirajo, da vakcinacija z našimi fuzijskimi proteini lahko v imunskem sistemu sproži razvoj spominskih imunskih celic, ki se lahko kasneje mobilizirajo in zaščitijo organizem pred okužbo s H. pylori.
Bakterije s fuzijskim proteinom
Primer 9 - Priprava bakterij s fuzijskimi proteini izraženimi na površini za vakcinacijo.
Priprava brezflagelinskih sevov bakterije E. coli. Iz brezflagelinskega seva bakterije Escherichia coli JW1908-1 (CGSC Strain#: 9586) (Kanr) smo najprej pripravili kompetentne celice, v katere smo vnesli zapis za T7 polimerazo s komercialnim kitom za lizogenijo (7DE3 Lysogenization Kit, Novagen). Iz teh celic smo pripravili kompetentne celice v katere smo vnesli spodaj naštete konstrukte.
-35Tabela 4: Uporabljeni konstrukti za izražanje na bakterijski površini. Sinteza plazmidov in pomen posameznih fragmentov je razložena v primeru 1.
| št. | ime | sestava konstrukta |
| 1 | UreB | T7p-HPUreB-Histag-HISt |
| 2 | HimFla-UreB | T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-HPUreB-RGD-Histag-HISt |
| 3 | HimFla-multi | T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-multiepitop-RGD-Histag-T7t |
| 4 | HimFla | T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-RGD-Histag-HISt |
| 5 | HimFla | T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-RGD-Histag-T7t |
| 6 | HimFla-multi | T7p-EcNfliC HpVfla213-muItiepitop- 215HpVfla EcCfliC-HISt |
| 7 | HimFla-multi | T7p-EcNfliC HpVfla213-multiepitop-215HpVfla EcCfliC-T7t |
| 8 | FliC | T7p-EcfliC-T7t |
| 9 | HimFla-ureB | TetRRBSp-EcNfliC HpVfla213-ureB-215HpVfla EcCfliC- HISt |
| 10 | HimFla-multi | TetRRBSp-EcNfliC HpVfla213-multiepitop-215HpVfla EcCfliC- HISt |
| 12 | HimFla-ureB | T7P- EcNfliC HpVfla213-ureB-215HpVfla EcCfliC- HISt |
Priprava bakterij za miške. Na miškah smo testirali bakterije E. coli JW1908-l (Kanr) z vnešeno T7 polimerazo in konstruktoma HimFla-multi v pET vektorju ter TetRRBS . Izražanje proteina smo inducirali z dodatkom IPTG. Nato smo izmerili absorbanco in na podlagi umeritvene krivulje izračunali kakšen volumen kulture moramo odpipetirati, da bo št. celic v 1 ml 109. Bakterije smo sprali in resuspendirali v sterilnem lx PBS. Miške smo cepili oralno in nazalno s pripravljeno bakterijsko raztopino. Kontrolno skupino mišk smo cepili z bakterijami, v katere smo transformirali prazen plazmid (TetRRBS)
Izražanje proteinov v bakterijah. V E. coli JW1908-1 (Kanr) s T7 polimerazo smo transformirali konstrukte iz tabele 4, št. vzorca v tabeli 4: 4, 5, 9 in 12.
Slika 6 prikazuje izražanje fuzijskih proteinov v bakterijah. Postopek smo izvedli kot je opisano v primeru 2. Proteine smo dokazovali v celičnem lizatu v supematantu (SN) in v raztopljenih inkluzijskih telescih (RIT). Iz rezultatov je vidno, da so lise za protein HimFlaureB, (št. 12; tabela 4) (SNI in RITI), ki je velik 57,9 kDa na pravi višini, tako v supematantu, kot v inkluzijskih telescih. Prav tako smo pokazali prisotnost HimFla (št. 4, tabela 4) (SN3), ki je velik 54,8 kDa, ter HimFla-ureB (SN8 in RIT8), (št. 9, tabela 4), ki je velik 57,9 kDa. Na približno enaki višini kot je pričakovano se nahaja tudi lisa za protein HimFla (št. 5, tabela 4) (SN9 in RIT9), ki je velik 54,8 kDa.
Dokaz proteinov na površini bakterij in vivo. Proteine na površini bakterij smo dokazovali na bakterijah, ki smo jih pripravili za dokaz izražanja proteinov (Tabela 4). Zbrane celice smo
-36najprej dvakrat sprali z lx PBS in jim dodali lx PBS/3 % BSA (bovine serum albumin) ter inkubirali 60 min na sobni temperaturi z rahlim stresanjem. Po inkubaciji smo vzorce centrifugirali in zavrgli supematant. Peletu smo dodali primarna protitelesa (Ab-TLR3 His) v končni koncentraciji 2,5 ng/μΐ, ki se specifično vežejo na histidinski ostanek. Sledila je 60 minutna inkubacija na sobni temperaturi in stresanju. Primarna protitelesa smo 3x sprali z lxPBS/ 3 % BSA. Vzorcu smo nato dodali sekundama protitelesa (Anti-mouse IgG-FITC), v končni koncentraciji 1,5 ng/μΐ. Sekundama protitelesa so označena s fluorescenčnim barvilom in se specifično vežejo na primarna protitelesa. Sekundama protitelesa smo inkubirali 60 minut pri sobni temperaturi in v temi. Protitelesa smo 3x sprali z lxPBS/ 3 % BSA. Celice smo resuspendirali v lxPBS in jih pogledali pod mikroskopom. Za detekcijo barvanih bakterij s smo uporabili konfokalni mikroskop (Ar-ion laser, vzbujanje pri 488nm, detekcija pri 500 do 530 nm). Bakterije, ki vsebujejo fuzijski protein so na slik obarvane belo.
Rezultati so prikazani na sliki 7. Prisotnost fuzijskih proteinov na površini bakterij smo določili za fuzijske proteine: (A) HimFla (št. 4), (B) HimFla-ureB (št. 12), (C) HimFla-ureB (št. 9), in (D) HimFla-multi (št. 3, vsi tabela 4). Za negativno kontrol (E) smo vzeli bakterije transformirane z plazmidom brez inserta.
Test gibljivosti brezflagelinskih bakterij s fuzijskim proteinom. Funkcionalnost rekombinantnih flagelinov smo želeli preveriti s testom gibljivosti. V E. coli JW1908-1 (Kanr) s T7 polimerazo smo transformirali plazmidne konstrukte, ki izražajo fuzijske proteine (Tabela 4). Transformacijsko mešanico smo nacepili na ploščo LB Amp Kan Cm (ampicilin kanamicin kloramfenikol) z dodanim IPTG. Zrasle kolonije smo nato precepili na ploščo LB Amp Kan Cm za test gibljivosti z 0,35 % agarjem. Ploščo smo inkubirali na 30°C 12 ur.
Rezultat gibljivosti je prikazan na sliki 8. Iz rezultatov je vidno, da je bila negativna kontrola (bakterije E. coli JW1908-1 (Kanr) s T7 polimerazo brez flagelinov) negibljiva (glej desno ploščo). Medtem ko so bakterije, v katere smo transformirali konstrukte za HimFla v pSBl.AK3 (št.4) Vzorci: 1 do 10; HimFla-ureB (št.12) Vzorci: 11 in 12; HimFla-ureB (št.9) Vzorci: 13 do 20; HimFla (št. 5) Vzorci: 21 do 25; HimFla-multi (št. 7) Vzorci: 26 do 30; FliC (št. 8) Vzorci: 35 do 38, HimFla v pSBl.AK3 (št.4) Vzorci: 39 do 42 bile na plošči gibljive. Vzorce od 43 do 49 smo pustili prazne, zato na plošči ni kolonij. Gibljivost bakterij je opazna kot svetel obroč okoli kolonij.
Primer 10 - Aktivacija receptorja TLR5 v celičnih linijah z bakterijami s fuzijskimi proteini
-37Stimulacija bakterij, ki na površini izražajo transformiran konstrukt.
Priprava celičnih linij z receptorjem TLR5 in merjenje aktivacije reporterskega sistema luciferazne aktivnosti sta opisana v primeru 7. Dan pred transfekcijo smo celice nacepili na mikrotitrsko ploščo in jih gojili do ustrezne gostote celic. Receptor TLR5 smo stimulirali z E. coli JW1908-1 (Kanr) s T7 polimerazo v katero smo transformirali ustrezen konstrukt. Aktivacijo smo preverjali za bakterije E. coli JW1908-1 (Kanr) s T7 polimerazo transformirane s konstrukti za rekombinantne proteine FliC (št. 8); HimFla-ureB (št.9) (vsi tabela 4).
Celice smo pripravili na enak način kot za test izražanja proteinov na površini bakterije. Bakterije, ki smo jih pripravili smo zbrali in jih 3x sprali v lx PBS. Nato smo pripravili redčitveno vrsto. Na celični liniji HEK 293, v katere smo transficirali TLR5, smo testirali redčitvi 108 in 104. . Testne bakterije smo razdelili v dve skupini, pri čemer smo eno skupino bakterij inkubirali 20 minut pri 70°C, drugo skupino pa isti čas pri 4°C.
Iz rezultatov ki so prikazani na sliki 9 je vidno, da so bakterije E. coli JW1908-1 (Kan1) s T7 polimerazo in transformirane s konstruktom za fuzijski protein HimFla-UreB, aktivirale receptor TLR5 v primerjavi s kontrolo. Receptor TLR5 je aktiviral tudi rekombinantni protein FliC, ki smo ga izražali v bakteriji E. coli JW1908-1 (Kan1) s T7 polimerazo. Protein HimFlaUreB je aktiviral le v primeru bakterij, ki so bile inkubirane 20 min pri 70°C, medtem ko je rekombinantni protein FliC v bakteriji E. coli JW1908-1 (Kanr) s T7 polimerazo, aktiviral TLR5 signalno pot v primeru živih bakterij, ki smo jih 20 min inkubirali na 4°C.
Primer 11 - Internalizacija bakterij
Intemalizacijo bakterij v celice smo določili z mikroskopiranjem s konfokalnim mikroskopom.
Namen eksperimenta je bil določiti ali pride do intemalizacije bakterij, ki vsebujejo fuzijski protein v celico. Bakterije smo pripravili na enak način kot v primeru 10, z izraženim fuzijskim proteinom z zelenim fluorescirajočim proteinom, ki smo jih v koncentracijah od 10 do 10 dodali celicam in spremljali intemalizacijo bakterij po 24 urah.
Celične organele smo označevali z ustreznimi označevalci organel: endoplazemski retikulum smo označevali z barvilom ER-tracker (MolecularProbes), endosome in lizosome z barvilom Lyso-Tracker (MolecularProbes).
Označene žive celice ali fiksirane celice smo pregledovali na konfokalnem mikroskopu Leica TCS SP5 na Leica DMI 6000 CS stojalu. Ta mikroskop je namenjen laserskemu skeniranju
-38fluorescenčno označenih živih ali fiksiranih celic. Uporabljali smo 63* oljni imerzijski objektiv. Slike smo pridobili s programom LAS AF 1.8.0. Leica Microsystems.
Na sliki 10 prikazujemo sposobnost intemalizacije bakterij v celicah CaCo-2. Preverili smo intemalizacijo bakterij, ki so na površini izražale proteinske konstrukte z mCeruleaan označevalcem. [Α] bakterije z označevalcem mCerulean; [Β] LysoTracker (MolecularProbes); [C] bakterija z mCerulean; [D] prekrivanje slike [Cj in slike s presevno svetlobo.
DNA fuzijskega protein
Primer 12 - Izražanje fuzijskega proteina v celičnih linijah HEK293, HEK293T
Z namenom ugotavljanja možne uporabe fuzijskih proteinov po izumu za DNA cepivo smo preverili ali se fuzijski proteini izražajo v celičnih linijah.
Gojenje celic, transfekcija so opisani v poglavju Fuzijski proteini-primer 7. Vzorce (supematante celic HEK293T, transficiranih z 250 ng plazmida z zapisom za plazmide iz tabele 5) smo najprej centrifugirali 3 min pri 10000 vrt/min, da smo jim odstranili morebitne ostanke celic. Supematantu smo dodali 4 x reducirajoči vzorčni pufer z SDS in jih denaturirali s segrevanjem 5 min pri 100° C. Proteine smo ločili na SDS-PAGE elektroforezi in fuzijski protein po prenosu na najlonsko membrano detektirali s protitelesi proti heksahistidinskemu repu.
Tabela 5: Konstrukti plazmidov, ki smo jih uporabili za izražanje v celičnih linijah. Pomen posameznih fragmentov je razložen v primeru 1.
| št. ime | sestava konstrukta |
| 13 UreB 14 ssHimFla-UreB 15 HimFla 16 ssHimFla-multi 17 HimFla-UreB 18 HimFla-multi | CMVp-ss- HPUreB-Histag-HIS, CMVp-ss -EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-HPUreB-RGD-Histag-HISt CMVp-ss- EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-RGD-Histag-HISt CMVp- ss- EcNfliC HpVfla213-multiepitop-215HpVfla EcCfliC- RGD-Histag-HISt CMVp - EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-HPUreB -RGD-Histag-HISt CMVp- EcNfliC HpVfla213-multiepitop-215HpVfla EcCfliC - RGD-HiStag-HIS, |
Primer 13 - Aktivacija receptorja TLR5 v celičnih linijah z DNA fuzijskimi proteini
Namen tega eksperimenta je pokazati, da fuzijski proteini, ki se izražajo v celičnih linijah, aktivirajo receptor TLR5. Z metodo z dvojnim reporterjem, ki je opisana v primeru 7 smo določali celični odziv na prisotnost fuzijskega proteina.
-39Za transfekcijo celičnih linij smo uporabili sledečo DNA v naslednjih koncentracijah: pFluc 0,42 ng/ μΐ, pRluc 0,08 ng/ μΐ, tarčne plazmide iz tabele 5 smo dodali v količinah 50 ali 100 ng·
V eksperimentu smo uporabili celice HEK293, ki so bile transficirane s praznim plazmidom, ki služi kot kontrola aktivacije TLR5 signalne poti brez transfekcije receptorja TLR5, ter celice, ki smo jim s transfekcijo vnesli zapis za receptor TLR5 in DNA fuzijske proteine. Iz rezultatov je jasno vidno, da sta fuzijska proteina ss-HimFla-UreB in ss-HimFla-multi aktivirala receptor TLR5 v primerjavi s pozitivno kontrolo, ki je bila v obeh primerih nižja. Celice smo stimulirali s flagelinom bakterije Salmonella typhimurium in jih po 6 urah stimulacije lizirali. Nestimuliranim celicam smo kot kontrolo dodali MQ. Kot negativno kontrolo smo celice transficirali s praznim plazmidom in jih stimulirali s flagelinom bakterije Salmonella typhimurium. Aktivacija na teh celicah je bila zanemarljiva in je posledica nizkega izražanja receptorja TLR5 v HEK293.
Na celicah smo testirali dve različni koncentraciji DNA fuzijskega flagelina (50 in 100 ng DNA), pri čemer po pričakovanjih, aktivacija receptorja TLR5 naraščala z naraščajočo koncentracijo transficirane DNA.
Aktivacijo TLR5 smo testirali za fuzijska proteina ssHimFla-UreB (št. 2) in ssHimFla-multi (št. 4). Celice smo lizirali 6 ur po stimulaciji in izmerili luciferazno aktivnost. Sam antigen/ureaza od H. pylori ne aktivira receptorja TLR5, medtem ko v povezavi s himemim flagelinom in signalno sekvenco za transport iz celice, sproži aktivacijo.
Iz rezultatov na sliki 11 je vidno, da je bila za aktivacijo TLR5 signalne poti potrebna prisotnost signalne sekvence, ki omogoča transport proteinov iz celice. Celice, ki so bile transficirane z DNA fuzijskim flagelinom brez signalne sekvence, niso aktivirale TLR5 signalne poti, medtem ko je aktivacija jasno izražena za DNA fuzijski flagelin, ki je imel zapis za signalno sekvenco. V celice HEK293 smo vnesli naraščajoči koncentraciji konstrukta ssHimFla-multi in HimFla-multi. Celice smo stimulirali s flagelinom bakterije Salmonella typhimurium in jih po 6 urah stimulacije lizirali. Nestimuliranim celicam smo kot kontrolo dodali MQ. Kot negativno kontrolo smo celice transficirali s praznim plazmidom in jih stimulirali s flagelinom bakterije Salmonella typhimurium. Aktivacija na teh celicah je bila zanemarljiva in je posledica nizkega izražanja receptorja TLR5 v HEK293.
Stimulacija sosednjih celic, ki same ne proizvajajo fuzijskega proteina s flagelinom
-40Namen eksperimenta je bi ugotoviti, če vnos vakcine v obliki DNA zapisa za fuzijske proteine s flagelinom, kot so na primer epitelijske ali mišične celice lahko stimulirajo imunski odziv sosednjih celic, ki izražajo receptor TLR5. Ta rezultat je pomemben za ugotovitev uporabnosti DNA vakcine.
Celice, ki izražajo flagelin v citosolu lahko aktivirajo citosolne receptorje družine Ipaf ter NAIP5, ki vodijo do piroptoze ter lokalne nekroze, ki lahko stimulira imunski odziv.
DNA z zapisom za fuzijski protein flagelina in multiepitopa smo vnesli v HEK293 celice in sicer zapis, kije vseboval pred kodirajočim zaporedjem za flagelin tudi zapis za signalni peptid in brez njega. V kulturo celic smo dodali tudi celice HEK293 v katere smo vnesli zapis za človeški TLR5 ter reporterska plazmida s kresničkino luciferazo pod kontrolo NF-kB odzivnega promotorja in konstitutivni reporter z Renilla luciferazo. Osem 24 ur po transfekciji smo celice zmešali v razmerju 1:1 in jih nasadili v mikrotitrsko ploščo ter po 24 urah izmerili aktivacijo celic s pomočjo dvojnega luciferaznega testa. Aktivnost luciferaze je merilo sposobnost aktivacije TLR5 preko fuzijskega flagelina, ki se je izločal iz celic ter flagelina, ki se je izražal v citosolu celic in verjetno povzročil njihov propad ter sprostitev celične vsebine. V obeh primerih smo zaznali značilno povečanje aktivacije celic, kar kaže, da v organizmu lahko vnos DNA cepiva, ki vsebuje zapis za himerni flagelin povzroči stimulacijo celic, ki imajo na svoji površini receptor TLR5 ter sprožijo imunski odziv.
Iz rezultatov na sliki 12 je vidno, da so celice, ki so izražale DNA fuzijski flagelin s signalno sekvenco bolje aktivirale sosednje celice, ki so izražale le TLR5 od tistih, ki so se izražali v citosolu. Aktivacijo v celicah brez signalne sekvence lahko razložimo s piroptozo, ki je posledica izražanja flagelina v citosolu celice. Posledično pride do propada celice in sproščanja citosolnega flagelina iz celice, kar povzroči aktivacijo TLR5 signalne poti v sosednjih celicah, ki izražajo le receptor TLR5. Celice smo stimulirali z 10 ng/ml flagelina bakterije Salmonella typhimurium in jih po 6 urah stimulacije lizirali. Nestimuliranim celicam smo kot kontrolo dodali MQ. Kot negativno kontrolo smo celice transficirali s praznim plazmidom in jih stimulirali s flagelinom bakterije Salmonella typhimurium. Aktivacija na teh celicah je bila zanemarljiva in je posledica nizkega izražanja receptorja TLR5 v HEK293.
Primer 14. Imunizacija z elektroporacijo
Z metodo elektroporacije (Tevž s sod. 2008; Gene electrotransfer into murine skeletal muscle : a systematic analysis of parameters for long-term gene expression. Technology in cancer
-41 research and treatment, 2008, vol. 7, no. 2, p. 91-101) smo testirali konstrukte št. 2 in 4 iz tabele 5. DNA konstrukti so bili izolirani s QIAGEN endo free reagenti (Qiagen, Hilden Nemčija) in razredčeni v sterilnem PBS do koncentracije 1 ug / ul. Pri obeh konstruktih smo uporabili subkutano aplikacijo (50 ul) s tanko iglo 29G (Myjector, Terumo Japonska) ter intramuskulamo aplikacijo v mišico desne noge musculus tibialis cranialis , kjer smo injicirali 20 ul DNA raztopine.
Miši smo najprej anestezirali z vdihavanjem izoflurana, na mestu aplikacije smo odstranili dlake in injicirali DNA raztopino. Na mesto podkožnega mehurčka (pri subkutani) ter okrog stegna (pri intramuskulami) smo namestili dve paralelni elektrodi iz nerjavečega jekla (dimenzije 30 mm x 10 mm), ki sta si bili oddaljeni 6 mm (IGEA, Carpi, Italija). Električne pulze smo sprožili z napravo Cliniporator (IGEA, Carpi Italija) preko elektrod, katere smo predhodno namazali z gelom za ultrazvok za boljšo prevodnost. Subkutano elektroporacijo smo izvedli z enim pulzom 600 V/cm, 100 us kateremu je sledil en pulz 84 V/cm 400 ms, 1 Hz. Intramuskulamo elektropracijo pa z enim pulzom 360 V/cm, 100 us kateremu so sledili štirje pulzi 48 V/cm, 100 ms, 1 Hz. Vse miši so dobile ojačevalno vakcinacijo 10 dni po prvi vakcinaciji. Po primernem obdobju po zadnji ojačevalni vakcinaciji smo živalim zbirali kri za testiranje prisotnosti protiteles ter jih okužili z bakterijam H. pylori za evalvacijo terapevtskega učinka na zmanjšanje kolonizacije ali popolno eradikacijo okužbe iz želodcev.
Pokazali smo povečanje količine protiteles IgG proti antigenom fuzijskega proteina uporabljenim v imunizacij v primerjavi s količino protiteles kontrolnih mišk, ki so bile imunizirane samo s plazmidom brez inserta. Povečanje protiteles je bilo mogoče zaznati tudi v primerjavi s količino protiteles pri miškah imuniziranih samo z ureazo B.
-42SEQ ID NO: 1
Izvor: Flagelin sredinski del
Organizem: Helicobacter pylori
PRT
ALITASGDIS LTFKQVDGVN DVTLESVKVS SSAGTGIGVL AEVINKNSNR TGVKAYASVI 60
TTSDVAVQSG SLSNLTLNGI HLGNIADIKK NDSDGRLVAA INAVTSETGV EAYTDQKGRL 120
NLRSIDGRGI EIKTDSVSNG PSALTMVNGG QDLTKGSTNY GRLSLTRLDA KSINVVSASD 180
SQHLGFTAIG FGESQVAETT VNLRDVTGNF NANVKSASGA NYNAVIASGN QSLGSGVTTL 240
R 241
SEQ ID NO: 2
Izvor: Flagelin sredinski del EcCfliC
Organizem: Escherichia coli
PRT
AVANGKTTDP LKALDDAIAS VDKFRSSLGA VQNRLDSAVT NLNNTTTNLS EAQSRIQDAD 60
YATEVSNMSK AQIIQQAGNS VLAKANQVPQ QVLSLLQG 98
SEQ ID NO: 3
Izvor: Flagelin sredinski del EcCfliC
Organizem: Escherichia coli
DNA gctgttgcaa atggtaaaac cacggatccg ctgaaagcgc tggacgatgc tatcgcatct 60 gtagacaaat tccgttcttc cctcggtgcg gtgcaaaacc gtctggattc cgcggttacc 120 aacctgaaca acaccactac caacctgtct gaagcgcagt cccgtattca ggacgccgac 180 tatgcgaccg aagtgtccaa tatgtcgaaa gcgcagatca tccagcaggc cggtaactcc 240 gtgttggcaa aagctaacca ggtaccgcag caggttctgt ctctgctgca gggttaa 297
SEQ ID NO: 4
Izvor: Flagelin sredinski del EcNfliC213
Organizem: Escherichia coli
PRT
MAQVINTNSL SLITQNNINK NQSALSSSIE RLSSGLRINS AKDDAAGQAI ANRFTSNIKG 60
LTQAARNAND GISVAQTTEG ALSEINNNLQ RVRELTVQAT TGTNSESDLS SIQDEIKSRL 120
DEIDRVSGQT QFNGVNVLAK NGSMKIQVGA NDNQTITIDL KQIDAKTLGL DGFSVKALIT 180
ASGDISLTFK QVDGVNDVTL ESVKVSSSAG TG 212
-43 SEQ ID NO: 5
Izvor: Flagelin sredinski del EcNfliC213
Organizem: Escherichia coli
DNA atggcacaag tcattaatac caacagcctc tcgctgatca ctcaaaataa tatcaacaag 60 aaccagtctg cgctgtcgag ttctatcgag cgtctgtctt ctggcttgcg tattaacagc 120 gcgaaggatg acgcagcggg tcaggcgatt gctaaccgtt tcacctctaa cattaaaggc 180 ctgactcagg cggcccgtaa cgccaacgac ggtatctccg ttgcgcagac caccgaaggc 240 gcgctgtccg aaatcaacaa caacttacag cgtgtgcgtg aactgacggt acaggccact 300 accggtacta actctgagtc tgatctgtct tctatccagg acgaaattaa atcccgtctg 360 gatgaaattg accgcgtatc tggtcagacc cagttcaacg gcgtgaacgt gctggcaaaa 420 aatggctcca tgaaaatcca ggttggcgca aatgataacc agactatcac tatcgatctg 480 aagcagattg atgctaaaac tcttggcctt gatggtttta gcgttaaagc gttaatcacg 540 gcttctgggg atattagctt gacttttaaa caagtggatg gcgtgaatga tgtaacttta 600 gagagcgtaa aagtttctag ttcagcaggc acaggg 636
SEQ ID NO: 6
Izvor: Flagelin sredinski del EcfliC
Organizem: Escherichia coli
PRT
MAQVINTNSL SLITQNNINK NQSALSSSIE RLSSGLRINS AKDDAAGQAI ANRFTSNIKG 60
LTQAARNAND GISVAQTTEG ALSEINNNLQ RVRELTVQAT TGTNSESDLS SIQDEIKSRL 120
DEIDRVSGQT QFNGVNVLAK NGSMKIQVGA NDNQTITIDL KQIDAKTLGL DGFSVKNNDT 180
VTTSAPVTAF GATTTNNIKL TGITLSTEAA TDTGGTNPAS IEGVYTDNGN DYYAKITGGD 240
NDGKYYAVTV ANDGTVTMAT GATANATVTD ANTTKATTIT SGGTPVQIDN TAGSATANLG 300
AVSLVKLQDS KGNDTDTYAL KDTNGNLYAA DVNETTGAVS VKTITYTDSS GAASSPTAVK 360
LGGDDGKTEV VDIDGKTYDS ADLNGGNLQT GLTAGGEALT AVANGKTTDP LKALDDAIAS 420
VDKFRSSLGA VQNRLDSAVT NLNNTTTNLS EAQSRIQDAD YATEVSNMSK AQIIQQAGNS 480
VLAKANQVPQ QVLSLLQG 498
SEQ ID NO: 7
Izvor: Flagelin sredinski del EcfliC
Organizem: Escherichia coli
DNA atggcacaag tcattaatac caacagcctc tcgctgatca ctcaaaataa tatcaacaag 60 aaccagtctg cgctgtcgag ttctatcgag cgtctgtctt ctggcttgcg tattaacagc 120 gcgaaggatg acgcagcggg tcaggcgatt gctaaccgtt tcacctctaa cattaaaggc 180
-44ctgactcagg cggcccgtaa cgccaacgac ggtatctccg ttgcgcagac caccgaaggc 240 gcgctgtccg aaatcaacaa caacttacag cgtgtgcgtg aactgacggt acaggccact 300 accggtacta actctgagtc tgatctgtct tctatccagg acgaaattaa atcccgtctg 360 gatgaaattg accgcgtatc tggtcagacc cagttcaacg gcgtgaacgt gctggcaaaa 420 aatggctcca tgaaaatcca ggttggcgca aatgataacc agactatcac tatcgatctg 480 aagcagattg atgctaaaac tcttggcctt gatggtttta gcgttaaaaa taacgataca 540 gttaccacta gtgctccagt aactgctttt ggtgctacca ccacaaacaa tattaaactt 600 actggaatta ccctttctac ggaagcagcc actgatactg gcggaactaa cccagcttca 660 attgagggtg tttatactga taatggtaat gattactatg cgaaaatcac cggtggtgat 720 aacgatggga agtattacgc agtaacagtt gctaatgatg gtacagtgac aatggcgact 780 ggagcaacgg caaatgcaac tgtaactgat gcaaatacta ctaaagctac aactatcact 840 tcaggcggta cacctgttca gattgataat actgcaggtt ccgcaactgc caaccttggt 900 gctgttagct tagtaaaact gcaggattcc aagggtaatg ataccgatac atatgcgctt 960 aaagatacaa atggcaatct ttacgctgcg gatgtgaatg aaactactgg tgctgtttct 1020 gttaaaacta ttacctatac tgactcttcc ggtgccgcca gttctccaac cgcggtcaaa 1080 ctgggcggag atgatggcaa aacagaagtg gtcgatattg atggtaaaac atacgattct 1140 gccgatttaa atggcggtaa tctgcaaaca ggtttgactg ctggtggtga ggctctgact 1200 gctgttgcaa atggtaaaac cacggatccg ctgaaagcgc tggacgatgc tatcgcatct 1260 gtagacaaat tccgttcttc cctcggtgcg gtgcaaaacc gtctggattc cgcggttacc 1320 aacctgaaca acaccactac caacctgtct gaagcgcagt cccgtattca ggacgccgac 1380 tatgcgaccg aagtgtccaa tatgtcgaaa gcgcagatca tccagcaggc cggtaactcc 1440 gtgttggcaa aagctaacca ggtaccgcag caggttctgt ctctgctgca gggttaa 1497
SEQ ID NO: 8
Izvor: Flagelin sredinski del EcNfliC
Organizem: Escherichia coli
PRT
MAQVINTNSL SLITQNNINK NQSALSSSIE RLSSGLRINS AKDDAAGQAI ANRFTSNIKG 60
LTQAARNAND GISVAQTTEG ALSEINNNLQ RVRELTVQAT TGTNSESDLS SIQDEIKSRL 120
DEIDRVSGQT QFNGVNVLAK NGSMKIQVGA NDNQTITIDL KQIDAKTLGL DGFSVK 176
SEQ ID NO: 9
Izvor: Flagelin sredinski del EcNfliC
Organizem: Escherichia coli
DNA atggcacaag tcattaatac caacagcctc tcgctgatca ctcaaaataa tatcaacaag 60 aaccagtctg cgctgtcgag ttctatcgag cgtctgtctt ctggcttgcg tattaacagc 120 gcgaaggatg acgcagcggg tcaggcgatt gctaaccgtt tcacctctaa cattaaaggc 180
-45ctgactcagg cggcccgtaa cgccaacgac ggtatctccg ttgcgcagac caccgaaggc 240 gcgctgtccg aaatcaacaa caacttacag cgtgtgcgtg aactgacggt acaggccact 300 accggtacta actctgagtc tgatctgtct tctatccagg acgaaattaa atcccgtctg 360 gatgaaattg accgcgtatc tggtcagacc cagttcaacg gcgtgaacgt gctggcaaaa 420 aatggctcca tgaaaatcca ggttggcgca aatgataacc agactatcac tatcgatctg 480 aagcagattg atgctaaaac tcttggcctt gatggtttta gcgttaaa 528
SEQ ID NO: 10
Izvor: Flagelin sredinski del EcCfliC215
Organizem: Escherichia coli
PRT
GVLAEVINKN SNRTGVKAYA SVITTSDVAV QSGSLSNLTL NGIHLGNIAD IKKNDSDGRL 60
VAAINAVTSE TGVEAYTDQK GRLNLRSIDG RGIEIKTDSV SNGPSALTMV NGGQDLTKGS 120
TNYGRLSLTR LDAKSINVVS ASDSQHLGFT AIGFGESQVA ETTVNLRDVT GNFNANVKSA 180
SGANYNAVIA SGNQSLGSGV TTLRAVANGK TTDPLKALDD AIASVDKFRS SLGAVQNRLD 240
SAVTNLNNTT TNLSEAQSRI QDADYATEVS NMSKAQIIQQ AGNSVLAKAN QVPQQVLSLL 300
QG 302
SEQ ID NO: 11
Izvor: Flagelin sredinski del EcCfliC215
Organizem: Escherichia coli
DNA ggcgtgttag cagaagtgat caataaaaac tctaaccgaa caggggttaa agcttatgcg 60 agcgttatca ccacgagcga tgtggcggtc cagtcaggaa gtttgagtaa tttaacctta 120 aatgggattc atttgggtaa tatcgcagat attaagaaaa acgactcaga cggaaggtta 180 gtcgcagcga tcaatgcggt cacttcagaa accggtgtgg aagcttatac ggatcaaaaa 240 gggcgcttga atttgcgcag tatagatggt cgtgggattg aaatcaaaac cgacagcgtc 300 agtaacgggc ctagcgcttt aacgatggtc aatggcggtc aggatttaac aaaaggctct 360 actaactacg gaaggctttc tctcacacga ttagacgcta agagcatcaa tgtcgtttcg 420 gcttctgact cacagcattt aggcttcacg gcgattggtt ttggggaatc tcaagtggca 480 gaaaccacgg tgaatttgcg cgatgttact gggaatttta acgctaatgt caaatcagcc 540 agtggcgcga actataacgc cgtgatcgct agcggtaacc aaagcttggg atctggggtt 600 acaaccttaa gagctgttgc aaatggtaaa accacggatc cgctgaaagc gctggacgat 660 gctatcgcat ctgtagacaa attccgttct tccctcggtg cggtgcaaaa ccgtctggat 720 tccgcggtta ccaacctgaa caacaccact accaacctgt ctgaagcgca gtcccgtatt 780 caggacgccg actatgcgac cgaagtgtcc aatatgtcga aagcgcagat catccagcag 840 gccggtaact ccgtgttggc aaaagctaac caggtaccgc agcaggttct gtctctgctg 900 cagggttaa 909
-46SEQ ID NO: 12
Izvor: UreazeB
Organizem: Helicobacter pylori
PRT
MKKISRKEYV SMYGPTTGDK VRLGDTDLIA EVEHDYTIYG EELKFGGGKT LREGMSQSNN 60
PSKEELDLII TNALIVDYTG IYKADIGIKD GKIAGIGKGG NKDMQDGVKN NLSVGPATEA 120
LAGEGLIVTA GGIDTHIHFI SPQQIPTAFA SGVTTMIGGG TGPADGTNAT TITPGRRNLK 180
FMLRAAEEYS MNFGFLAKGN VSNDASLADQ IEAGAIGFKI HEDWGTTPSA INHALDVADK 240
YDVQVAIHTD TLNEAGCVED TMAAIAGRTM HTFHTEGAGG GHAPDIIKVA GEHNILPAST 300
NPTIPFTVNT EAEHMDMLMV CHHLDKSIKE DVQFADSRIR PQTIAAEDTL HDMGIFSITS 360
SDSQAMGRVG EVITRTWQTA DKNKKEFGRL KEEKGDNDNF RIKRYLSKYT INPAIAHGIS 420
EYVGSVEVGK VADLVLWSPA FFGVKPNMII KGGFIALSQM GDANASIPTP QPVYYREMFA 480
HHGKAKYDAN ITFVSQAAYD KGIKEELGLE RQVLPVKNCR NITKKDMQFN DTTAHIEVNP 540
ETYHVFVDGK EVTSKPANKV SLAQLFSIF 569
SEQ ID NO: 13
Izvor: Hist (E. coli his terminator)
Organizem: Escherichia coli
DNA tccggcaaaa aaacgggcaa ggtgtcacca ccctgccctt tttctttaaa accgaaaaga 60 ttacttcgcg tt 72
SEQ ID NO: 14
Izvor: Multiepitop: UreB epitop; Swiss prot P69997 AK: 314-339
Organizem: Helicobacter pylori
PRT
HMDMLMVCHH LDKSIKEDVQ FADSRI 26
SEQ ID NO: 15
Izvor: Multiepitop: VacA epitop; Swiss prot Q48245 AK 368-487
Organizem: Helicobacter pylori
PRT
QKTEVQPTQV IDGPFAGGKD TVVNIDRINT KADGTIKVGG FKASLTTNAA HLNIGKGGVN 60
LSNQASGRTL LVENLTGNIT VDGPLRVNNQ VGGYALAGSS ANFEFKAGVD TKNGTATFNN 120
-47SEQ ID NO: 16
Izvor: Multiepitop: HpaA epitop; Swiss prot Q48264 134-146
Organizem: Helicobacter pylori
PRT
KRTIQKKSEP GLL 13
SEQ ID NO: 17
Izvor: RGD
Organizem: sintetičen
PRT
RGD
SEQ ID NO: 18
Izvor: T7 promotor
Organizem: pET19b vector
DNA taatacgact cactat 16
SEQ ID NO: 19
Izvor: T7 terminator
Organizem: pET19b vector
DNA tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg tttttt 46
SEQ ID NO: 20
Izvor: TetR(RBS)
Organizem: sintetični nukleotid
DNA tccctatcag tgatagagat actgagcaca ggagg 35
SEQ ID NO: 21
Izvor Terminator BHGt
Organizem: virus
DNA
-48ctagagctcg cctcccccgt atgaggaaat ggcaggacag ctgatcagcc gccttccttg tgcatcgcat caagggggag tcgactgtgc accctggaag tgtctgagta gattgggaag cttctagttg gtgccactcc ggtgtcattc acaatagcag ccagccatct cactgtcctt tattctgggg gcatgctggg gttgtttgcc tcctaataaa ggtggggtgg gatatgca
Claims (19)
- Zahtevki1. Protein sestavljen iz himemega flagelina in vezanega antigenskega segmenta, pri čemer je himemi flagelin sestavljen iz:(a) najmanj 100 amino končnih aminokislin flagelina, ki aktivira receptor TLR5;(b) sredinskega variabilnega segmenta flagelina bakterije, ki ne aktivira TLR5;(c) najmanj 100 karboksi končnih aminokislin flagelina, ki aktivira receptor TLR5.
- 2. Protein po zahtevku 1, označen s tem, daje fuzijski flagelin sestavljen iz:(a) sredinskega segmenta flagelina, ki ne aktivira TLR5, ki je izbran iz flagelinov bakterij skupine alfa proteobakterij ali epsilon proteobakterij, ki vključujejo, vendar ne izključno, bakterije Helicobacter sp, Campylobacter sp., Bartonella sp., Rhizobium meliloti, Rhizobium sp., Wolnella sp., Brucella sp.;(b) amino- in karboksi- končnega segmenta flagelina, ki aktivira TLR5 in je izbran izmed flagelinov bakterij iz skupine beta proteobakterij ali gama proteobakterij ali spirohet ali firmukut, ki vključujejo, vendar ne izključno, bakterije Escherichia coli, Salmonella sp., Shigella flexneri, Legionella pneumophila, Serratia marcescens, Listeria monocytogenes, Pseudomonas sp., Vibrio cholerae, Bordetella sp., Borellia burgdorferi, Clostridium sp., Bacillus cereus, Bacillus subtilis.
- 3. Protein po katerem koli zahtevku od 1 do 2, označen s tem, da je himememu flagelinu dodano zaporedje za antigen, protein ali peptidni segment ali več proteinov ali proteinskih segmentov, na osnovi proteinov organizma proti kateremu želimo sprožiti imunski odziv in je to isti organizem, iz katerega smo izbrali zapis za sredinski segment flagelina, in je zaporedje za protein ali peptidni segment vključeno ali na C-končnem delu proteina ali znotraj sredinskega segmenta flagelina.
- 4. Protein po katerem koli zahtevku od 1 do 3, označen s tem, da je protein sestavljen iz (a) aminokislin vsaj od 1 do 176 flagelina FliC E. coli;(b) sredinskega variabilnega segmenta aminokislin vsaj od 178 do 418 flagelina FlaA bakterije H. pylori;(c) aminokislin vsaj od 401 do 498 flagelina FliC E. coli; in (d) opcijsko antigenskega segmenta, ki je sestavljen iz proteina ali več segmentov proteinov, ki so kodirani v genomu Helicobacter pylori.-505. Protein po katerem koli zahtevku od 1 do 4, označen s tem, da protein vsebuje flagelin FlaA H. pylori, kjer sta amino-terminalni in karboksi- terminalni segment nadomeščena z zaporedjem flagelina bakterije, ki aktivira TLR
- 5 in nadalje opcijsko antigenski segment, ki je sestavljen iz proteina ali več segmentov proteinov, ki so kodirani v genomu Helicobacter pylori in se uporablja za pripravo cepiva za zaščito in zdravljenje okužbe z bakterijo H. pylori.
- 6. Protein po katerem koli zahtevku od 1 do 5, označen s tem, da opcijsko vsebuje tudi enega ali več linker peptidov, ki povezujejo posamezne segmente proteina in je vsak linker peptid neodvisno dolg od ene do več aminokislin, dodatno lahko protein vsebuje tudi enega ali več označevalcev in so tako linker peptidi kot tudi označevalci v protein vključeni na način, ki ne spremeni osnovne funkcije proteina.
- 7. Protein po katerem koli zahtevku od 1 do 6, označen s tem, da se uporablja za pripravo cepiva za stimulacijo imunskega odziva proti bakterijam, katerih flagelin ne aktivira TLR5, za preprečevanje in zdravljenje nalezljivih bolezni, prednostno proti bakterijam iz skupine alfa in epsilon proteobakterij, kot so, vendar ne izključno: bakterije Helicobacter sp, Campylobacter sp., Bartonella bacilliformis, Rhizobium meliloti, Rhizobium sp., Wolnella sp, Brucella sp., prednostno Helicobacter pylori.
- 8. DNA, ki vsebuje zapis za protein po katerem koli zahtevku od 1 do 7.
- 9. DNA po zahtevku 8, označena s tem, da vsebuje zapis za protein po katerem koli zahtevku od 1 do 6, ki zapis sestavljajo, v smeri bralnega okvirja:(a) signalna sekvenca, ki omogoča izločanje proteinov ali vezavo proteina na membrano v gostiteljskem organizmu;(b) protein po katerem koli zahtevku od 1 do 7, ki je funkcionalno povezan s signalno sekvenco.
- 10. DNA po katerem koli zahtevku od 8 do 9, označena s tem, da vsebuje zapis za protein po katerem koli zahtevku od 1 do 7, s signalno sekvenco in je operativno povezana z regulatomimi elementi, promotorjem in terminatorjem, ki omogočajo ekspresijo fuzijskega proteina v gostitelj skih celicah.
- 11. DNA po katerem koli zahtevku od 8 do 10, označena s tem, da se DNA uporabi za pripravo cepiva za vnos v celice človeka ali živali z namenom vzbuditi imunski odziv.-51
- 12. DNA po katerem koli zahtevku od 8 do 11 za pripravo cepiva za stimulacijo imunskega odziva proti bakterijam, katerih flagelin ne aktivira receptorja TLR5, za preprečevanje in zdravljenje nalezljivih bolezni, prednostno proti bakterijam iz skupine alfa in epsilon proteobakterij, kot so: bakterije Helicobacter sp, Campylobacter sp., Bartonella bacilliformis, Rhizobium meliloti, Rhizobium sp., Wolnella sp, Brucella sp., prednostno Helicobacter pylori.
- 13. Cepivo, ki vsebuje protein po katerem koli zahtevku od 1 do 7 ali DNA po katerem koli zahtevku od 8 do 12 in ustrezne farmacevtsko sprejemljive dodatke.
- 14. Gostiteljski organizem, ki vsebuje fuzijski protein po katerem koli zahtevku od 1 do 7 ali DNA po katerem koli zahtevku od 8 do 12 in se DNA prepisuje v fuzijski protein in je gostiteljski organizem izbran iz bakterij, kvasovk ali gliv ter sesalskih celic; prednostno je gostiteljski organizem izbran med človeku in živali neškodljivimi organizmi, prednostno neškodljivimi organizmi, ki se običajno nahajajo v človeški ali živalski črevesni flori.
- 15. Cepivo, ki vsebuje gostiteljski organizem po zahtevku 14, in je protein izražen na površini gostiteljskega organizma v farmacevtski zmesi s farmacevtsko sprejemljivimi dodatki.
- 16. Metoda za določanje sposobnosti variant flagelinov za aktivacijo receptorjev TLR5, ki vsebuje sledeče korake:(a) gojenje celičnih linij, ki izražajo funkcionalen receptor TLR5;(b) vnos DNA z zaporedjem za fuzijski protein med signalno sekvenco za izločanje flagelinov in preiskovanim flagelinom, ki je operativno povezana z regulatomimi elementi, promotorjem in terminatorjem, ki omogočajo ekspresijo fuzijskega proteina v gostiteljskih celicah, v celične linije, ki izražajo receptor TLR5 pod točko (a);(c) analiza aktivacije receptorja TLR5 v celičnih linijah pod točko (a) s pomočjo reporterskih plazmidov ali produkcije vnetnih posrednikov.
- 17. Metoda za določanje sposobnosti variant flagelinov za aktivacijo receptorjev TLR5, ki vsebuje sledeče korake:(a) gojenje celične linije, ki izražajo funkcionalen receptor TLR5;(b) vnos DNA z zaporedjem za fuzijski protein med signalno sekvenco za izločanje flagelinov in preiskovanim flagelinom, ki je operativno povezana z regulatomimi elementi, promotorjem in terminatorjem, ki omogočajo ekspresijo fuzijskega proteina v gostiteljskih celicah, v celične linije, ki niso celične linije pod točko (a);-52(d) skupno gojenje mešanice celičnih linij pod točko (a) in (b);(c) analiza aktivacije receptorja TLR5 v celičnih linijah pod točko (a) s pomočjo reporterskih plazmidov ali produkcije vnetnih posrednikov.
- 18. Metoda za določanje sposobnosti variant flagelinov za aktivacijo receptorjev TLR5, ki vsebuje sledeče korake:(a) celične linije, ki izražajo funkcionalen receptor TLR5;(b) dodatek supematant celic, ki izražajo protein zapisan z zaporedjem za fuzijski protein med signalno sekvenco za izločanje flagelinov in preiskovanim flagelinom, ki je operativno povezana z regulatomimi elementi, promotorjem in terminatorjem, ki omogočajo ekspresijo fuzijskega proteina v gostiteljskih celicah, celičnim linijam pod točko (a);(c) analiza aktivacije receptorja TLR5 v celičnih linijah pod točko (a) s pomočjo reporterskih plazmidov ali produkcije vnetnih posrednikov.
- 19. Cepivo po katerem koli zahtevku 13 ali 15, ki vsebuje protein po katerem koli zahtevku od1 do 7 ali DNA po katerem koli zahtevku od 8 do 12 ali gostiteljski organizem po zahtevku 14, označena s tem, da se cepiva za večkratno imunizacijo subjekta razlikujejo po aminokislinski sestavi amino-končnega in karboksi-končnega himemega flagelina, ki aktivira receptor TLR5, tako da protitelesa nastala zaradi predhodne imunizacije ne preprečijo aktivacije TLR5 ob naslednji imunizaciji s spremenjenim cepivom, sredinski segment flagelina v fuzijskem proteinu pa ostane med cepivi nespremenjen.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SI200800259A SI22889A (sl) | 2008-10-28 | 2008-10-28 | Himerni flagelini za cepiva |
| PCT/SI2009/000044 WO2010050903A1 (en) | 2008-10-28 | 2009-10-06 | Chimeric flagellins for vaccines |
| ATA9361/2009A AT509354B1 (de) | 2008-10-28 | 2009-10-06 | Chimäre flagelline für vakzine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SI200800259A SI22889A (sl) | 2008-10-28 | 2008-10-28 | Himerni flagelini za cepiva |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SI22889A true SI22889A (sl) | 2010-04-30 |
Family
ID=41667803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SI200800259A SI22889A (sl) | 2008-10-28 | 2008-10-28 | Himerni flagelini za cepiva |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AT (1) | AT509354B1 (sl) |
| SI (1) | SI22889A (sl) |
| WO (1) | WO2010050903A1 (sl) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010141312A2 (en) * | 2009-06-01 | 2010-12-09 | Wake Forest University Health Sciences | Flagellin fusion proteins and conjugates comprising pneumococcus antigens and methods of using the same |
| FR2969657B1 (fr) | 2010-12-22 | 2014-02-07 | Fabre Pierre Dermo Cosmetique | Nouvelle bacterie et extraits de ladite bacterie et leur utilisation en dermatologie |
| FR2969658B1 (fr) * | 2010-12-22 | 2014-10-17 | Fabre Pierre Dermo Cosmetique | Nouvelle bacterie et extraits de ladite bacterie et leur utilisation therapeutique |
| WO2016014899A1 (en) * | 2014-07-25 | 2016-01-28 | Cleveland Biolabs, Inc. | Flagellin derivatives and uses |
| CN107207614B (zh) * | 2014-10-09 | 2022-01-11 | 利普泰克有限公司 | 嵌合蛋白 |
| EP3390653B1 (en) | 2015-12-16 | 2022-08-10 | F. Hoffmann-La Roche AG | Improved recombinant production method |
| EP3272354A1 (en) | 2016-07-20 | 2018-01-24 | Technische Universität München | Agents and methods for the prevention or treatment of h. pylori infections |
| WO2018074884A1 (ko) * | 2016-10-20 | 2018-04-26 | 연세대학교 원주산학협력단 | 재조합 단백질 및 그의 용도 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MY157941A (en) * | 2005-01-19 | 2016-08-15 | Vaxinnate Corp | Compositions of pathogen-associated molecular patterns and methods of use |
-
2008
- 2008-10-28 SI SI200800259A patent/SI22889A/sl not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-10-06 WO PCT/SI2009/000044 patent/WO2010050903A1/en active Application Filing
- 2009-10-06 AT ATA9361/2009A patent/AT509354B1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010050903A1 (en) | 2010-05-06 |
| AT509354A1 (de) | 2011-08-15 |
| AT509354B1 (de) | 2015-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SI22889A (sl) | Himerni flagelini za cepiva | |
| KR101541383B1 (ko) | 면역원성 조성물 | |
| CN101743016B (zh) | 预防、治疗和诊断利什曼病的利什曼原虫固醇24-c-甲基转移酶组合物 | |
| US20090081725A1 (en) | Compositions of pamps and Listeria monocytogenes and methods of use | |
| JP2008530245A (ja) | 尿路病原性菌株由来の抗原 | |
| Yu et al. | A DNA vaccine encoding VP22 of herpes simplex virus type I (HSV-1) and OprF confers enhanced protection from Pseudomonas aeruginosa in mice | |
| Clow et al. | PilVax, a novel Lactococcus lactis‐based mucosal vaccine platform, stimulates systemic and mucosal immune responses to Staphylococcus aureus | |
| US12115215B2 (en) | Composition and method for generating immunity to borrelia burgdorferi | |
| Sharma et al. | Immune response characterization and vaccine potential of a recombinant chimera comprising B-cell epitope of Aeromonas hydrophila outer membrane protein C and LTB | |
| Park et al. | Nasal immunization with M cell-targeting ligand-conjugated ApxIIA toxin fragment induces protective immunity against Actinobacillus pleuropneumoniae infection in a murine model | |
| US20210205430A1 (en) | Virb10 for vaccination against gram negative bacteria | |
| US20220288183A1 (en) | Vaccine constructs and uses thereof against staphylococcus infections | |
| WO2019204460A1 (en) | Chimeric vaccine antigens for anaplasmosis | |
| Cheng et al. | Assessment of the role in protection and pathogenesis of the Chlamydia muridarum V-type ATP synthase subunit A (AtpA)(TC0582) | |
| CN111748020B (zh) | FimHEd在制备基于枯草芽孢杆菌芽孢载体的鱼类靶向口服疫苗中的应用 | |
| AU772356B2 (en) | Two-step immunization procedure against chlamydia infection | |
| WO2010050902A1 (en) | Vaccines, which combine the antigen and toll-like receptors | |
| JP2021524485A (ja) | パラ結核症のための免疫原性組成物 | |
| He et al. | Evaluation of immunogenicity and protective efficacy of the outer membrane porin F (OprF) against Pseudomonas plecoglossicida in large yellow croaker (Larimichthys crocea) | |
| KR100207289B1 (ko) | 헬리코박터 파이로리 유래의 항원단백질을 함유하는 리포좀 | |
| BRPI0609847A2 (pt) | composição imunogênica, polipeptìdeo, polipeptìdeo variante, molécula de ácido nucléico, vacina, vetor de expressão e plasmìdeos | |
| KR20230075625A (ko) | 스트렙토코커스 수이스의 면역원성 재조합 단백질 및 이를 포함하는 면역원성 조성물 | |
| ES2967368A1 (es) | Vacuna para la prevencion de la infeccion de anaplasma phagocytophilum (rickettsiales: anaplasmataceae) | |
| US20040071703A1 (en) | Multicomponent mscramm vaccine | |
| WO2002020046A1 (en) | Multicomponent mscramm vaccine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OO00 | Grant of patent |
Effective date: 20100510 |
|
| KO00 | Lapse of patent |
Effective date: 20150610 |