AT509354B1

AT509354B1 - Chimäre flagelline für vakzine

Info

Publication number: AT509354B1
Application number: ATA9361/2009A
Authority: AT
Original assignee: Kemijski Inst
Priority date: 2008-10-28
Filing date: 2009-10-06
Publication date: 2015-05-15
Also published as: SI22889A; AT509354A1; WO2010050903A1

Abstract

Die Erfindung schafft ein Protein aus einem mit einem Antigen verknüpften chimärem Flagellin, wobei das chimäre Flagellin zusammengesetzt ist aus: (a) mindestens 100 Amino-terminalen Aminosäuren des Flagellins, das den TLR5 Rezeptor aktiviert, (b) dem mittleren, variablen Segment des bakteriellen Flagellins, das unfähig ist, TLR5 zu aktivieren, (c) mindestens 100 Carboxy-terminalen Aminosäuren des Flagellins, das TLR5 aktiviert. Die Erfindung schafft eine Lösung für die schwache Aktivierung des Immunsystems gegen Bakterien, die Flagellin enthalten, das die Aktivierung des angeboren Immunsystems nicht auslöst.

Description

Beschreibung

GEBIET DER ERFINDUNG

[0001] Das Gebiet der Erfindung ist Fusionsprotein, DNA, die Fusionsprotein codiert, Vakzin, das den Code für Antigen umfasst und zusätzlich den Code für Proteine, welche die angeborene Immunantwort und die anschließend erworbene Immunantwort aktivieren. Das Gebiet der Erfindung ist die Zubereitung und Anwendung des Vakzins, mit dem Erkrankungen behandelt oder verhindert werden sollen, die von pathogenen Bakterien verursacht werden, deren Fla-gellin den TLR5 Rezeptor schlecht aktiviert.

STAND DER TECHNIK

[0002] Multizelluläre Organismen schützen sich selbst mit Hilfe des Immunsystems gegen Infektionen durch pathogene Mikroorganismen aus der Umwelt. An diesem Prozess sind Rezeptoren beteiligt, die die Anwesenheit von Molekülen feststellen, welche für pathogene Mikroorganismen und auch pathologisch modifizierte Eigenzellen spezifisch sind.

[0003] Die effektive Immunantwort erfordert sowohl die Aktivierung des angeboren wie auch des erworbenen Immunsystems, einschließlich zellulärer und Antikörper-Antworten. Die Aktivierung der angeborenen Immunantwort ist wichtig für eine effiziente Antigen-Bearbeitung und die anschließende Reifung der erworbenen Immunantwort. Wichtige Komponenten der angeborenen Immunantwort sind Rezeptoren, die Moleküle erkennen, welche spezifisch für pathogene Mikroorganismen sind, sogenannte »Pathogen-assoziierte Molekularmuster« (PAMP). Von besonderer Wichtigkeit für eine wirksame Immunantwort sind die Toll- like Rezeptoren (TLR). Unter diesen spielt der TLR5, der das Flagellin der meisten Bakterien erkennt, eine wichtige Rolle (Hayashi et al., Nature 2001, 410, 1099-1103). Im monomeren Molekül des Flagellins befinden sich die N- und C-terminalen Regionen, die wichtig für die Erkennung und Aktivierung des TLR5 sind, während das mittlere, variable Segment für die Aktivierung des TLR5 nicht wichtig ist (Murthy et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, 5667-5675; Smith et al., 2003, Nature Immunol. 4, 1247-1253). Einige Bakterien schützen sich vor der Erkennung durch das Immunsystem mit der Änderung ihres Flagellins.

[0004] Zu diesen gehört das Bakterium Helicobacter pylori, dessen Flagellin den Signalweg durch TLR5 nicht aktiviert (Gewirtz et al.2004, J. Infect. Dis. 189, 19141920; Andressen-Nissen et al., 2005 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 102, 9247-9252). Ansonsten gehört das Flagellin zu den am meisten immunogenen Proteinen, gegen die wirksam Antikörper produziert werden, was zur Verteidigung gegen bakterielle Infektionen beiträgt. Antikörper-Antworten gegen das Flagellin des Bakteriums Helicobacter pylori ermöglichen jedoch wegen der ungenügenden Aktivierung der angeboren Immunantwort nur teilweise einen Schutz (Yan et al., 2003, World J. Gastroenterol .9, 2240-2250).

[0005] Das Bakterium Helicobacter pylori überlebt in der Magensäure und kolonisiert die Magen- und Dünndarmschleimhaut, wo es zu Entzündungen und Ulcer-Bildungen führt, die kanzerogene Veränderungen hervorrufen können. Dieses Bakterium kann der Hauptauslöser von Magen- und Dünndarmkrebs sein, auch wenn der Infekt nicht in jedem Fall zu kanzerogenen Veränderungen führt. Ein Vakzin gegen Helicobacter pylori wäre eine wirksame Medikation, doch das Bakterium selbst ruft nur eine schwache Immunantwort ab. Im Laufe der Evolution und der Adaptierung an den Wirt hat das Bakterium seine virulenten Faktoren geändert, wie beispielsweise Lipopolysaccharid oder Flagellin, so dass das Immunsystem des Wirts sie nicht erkennt, während Homologe dieser Moleküle von anderen Bakterien die Immunantwort aktivieren. Bisher wurden für das Vakzin gegen Helicobacter pylori bakterielle Proteine verwendet, wie UreB (US-Pat. 5972336), HpaA, CagA (US-Pat. 10487962), die sich entweder auf der Oberfläche des Bakteriums Helicobacter pylori befinden oder Schäden in Wirtsgeweben verursachen, wie CagA (Owen et al., 1994, FEMS Immunol Med Microbiol. 9, 307-315). Die Immunisierung mit den Proteinen selbst ist ungenügend, um eine wirksame Immunantwort und Antikörperproduktion abzurufen, weshalb die Vakzine mit einer Zugabe von Adjuvantien formuliert sind, wel- che schädliche Nebenwirkungen mit sich bringen können.

[0006] Unterschiedliche Vakzin-Typen sind in Gebrauch, (i) Das Vakzin kann isolierte Untereinheiten eines Mikroorganismus enthalten, etwa Proteine, oder (ii) das Vakzin umfasst ganze, getötete Mikroorganismen, die ausgewählte Antigene enthalten, gegen die wir die Ausbildung der Immunantwort wünschen. Die Nachteile dieser zwei Arten von Vakzinen sind die potenzielle Pathogenizität des attenuierten Vakzins, die mangelhaft definierte und variable Zusammensetzung sowie die schlechte Aktivierung der angeborenen Immunität, wie im Fall geänderter Moleküle von Mikroorganismen, beispielsweise Lipopolysaccharid oder Flagellin, die die angeborene Immunantwort aktivieren, (iii) Drittens liegt das Vakzin in einer in der Humanmedizin noch nicht verwendeten Form als DNA vor, wobei das Gen, das für Proteinsubeinheiten des Mikroorganismus codiert, gegen den wir einen Schutz wollen, in eine Wirtszelle eingesetzt ist. In allen drei Arten der Immunisierung müssen wir zusätzlich zu der Subeinheit des Mikroorganismus, gegen den die Immunantwort gebildet wird, ein zusätzliches Signal zur Stimulierung der angeborenen Immunität bereitstellen, das von einem Adjuvans geliefert wird. Der Nachteil einer Verwendung von Adjuvantien ist die Möglichkeit einer exzessiven Immunantwort des Organismus auf das Adjuvans.

[0007] Das immunogene Flagellin, etwa FliC vom Bakterium Salmonella typhymurium, wurde bereits als Adjuvans in Vakzinen verwendet. Fusionsprotein, bei dem ein ausgewähltes Proteinantigen zum Flagellin vom Bakterium Salmonella typhymurium hinzugefügt wurde, ist ebenfalls verwendet worden (Newton et al., 1991, Infect Immun. 59, 2158-2165, US-Pat. 6130082). Der Nachteil dieser Strategie besteht darin, dass sie nicht allgemein für alle bakteriellen Infektionen anwendbar ist, weil bestimmte Bakterien das Immunsystem schwach aktivieren und deshalb den Schutz vermeiden und den Wirt erfolgreich kolonisieren. Ein solches Bakterium ist Helicobacter pylori.

[0008] Bei Immunisierung mit einem Vakzin, das Flagellin als immunogene Verbindung enthält, werden die Antikörper gegen diese Form des Flagellins gebildet. Nach der Reimmunisierung können sich diese Antikörper an antigenische Determinanten des Flagellins binden, die für die TLR5-Aktivierung verantwortlich sind, und machen auf diese Weise die Reaktivierung des TLR5 unmöglich (Saha et al., 2007, J. Immunol. 179, 1147-1154; Nempont et al., 2008, J. Immunol. 181, 2036 - 2043). Darin besteht der Nachteil der Immunisierung mit dem identischen Vakzin, das Flagellin als Adjuvans enthält. Auch nach der Infektion mit dem Bakterium, dessen Flagellin als Adjuvans verwendet wurde, wird eine schwächere Immunantwort initiiert als im Fall eines Bakteriums, dessen Flagellin nicht für die Immunisierung verwendet wurde.

[0009] Die Erfindung schafft eine Lösung für diese oben beschriebenen Nachteile, namentlich (i) die schwache Aktivierung des Immunsystems gegen Bakterien, die Flagellin enthalten, das die Aktivierung des angeboren Immunsystems nicht auslöst, und (ii) die Bildung von Antikörpern gegen Flagelline, die als Adjuvans im Vakzin verwendet werden, und anschließende Reduzierung der Wirksamkeit des Vakzins bei der Neuimpfung.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

[0010] Die Erfindung betrifft ein Fusionsprotein eines Chimären Flagellins und gebundenen Antigensegments. Das chimäre Flagellin ist zusammengesetzt aus (a) den N-und C-terminalen Segmenten des Flagellintyps, der den TLR5 Rezeptor aktiviert, und (b) dem mittleren Segment des Flagellintyps, der zwischen N- und C- terminalen Segmenten angeordnet ist und TLR5 nicht aktiviert. Genauer gesagt, besteht das chimäre Flagellin aus mindestens 100 Amino-terminalen und mindestens 100 Carboxy-terminalen Aminosäuren des Flagellins, das den TLR5 Rezeptor aktiviert, und dem mittleren Segment des Flagellins, das TLR5 nicht aktiviert.

[0011] Die Erfindung betrifft ein Fusionsprotein, das Folgendes umfasst: chimäres Flagellin, welches das Potenzial zur Aktivierung des TLR5 Rezeptors hat und aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Betaproteobakterien, Gammaproteobakterien, Spirochäten oder Firmicutes, wie beispielsweise: die Bakterien Escherichia coli, Salmonella sp., Shigella flexneri, Legionella pneumophila, Serratia marcescens, Listeria monocytogenes, Pseudomonas sp., Vibrio cholera- e, Bordetella sp., Borellia burgdorferi, Clostridium sp., Bacillus cereus, Bacillus subtilis; und dem mittleren Segment des Flagellins, das TLR5 nicht aktiviert und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Flagellinen von den Bakterien: Alphaproteobakterien oder Epsilonproteobakte-rien, wie beispielsweise das Bakterium Helicobacter sp., Campylobacter sp., Bartonella ba-cilliformis, Rhizobium meliloti, Rhizobium sp., Wolnella sp., Brucella sp..

[0012] Die Erfindung betrifft ein Fusionsprotein, das zusätzlich zu einem Chimären Flagellin eine hinzugefügte Sequenz enthält, die für das Antigen-Segment, für ein Protein oder ein Peptidsegment oder für mehrere Proteine oder Proteinsegmente auf der Grundlage der Proteine von dem Organismus codiert, gegen den wir die Immunantwort abrufen wollen. Dieser Organismus ist derselbe, von dem wir die Sequenz für das mittlere Segment des Flagellins auswählten. Die Sequenz, die für das Protein oder Peptidsegment codiert, ist entweder als das C-terminale Segment des Proteins oder innerhalb des mittleren Segments des Flagellins enthalten.

[0013] Die Erfindung betrifft ein Fusionsprotein, das aus dem N-terminalen Segment des Flagellins FliC von E. coli; dem mittleren Segment des Flagellins FlaA von H. pylori und dem C-terminalen Segment des Flagellins FliC von E. coli zusammengesetzt ist. Insbesondere betrifft die Erfindung das Fusionsprotein, das aus den Aminosäuren 1 bis 176 des Flagellins FliC von E. coli; dem mittleren, variablen Segment der Aminosäuren von 178 bis 418 des Flagellins FlaA von H. pylori und den Aminosäuren von 401 bis 498 des Flagellins FliC von E. coli zusammengesetzt ist. In der Erfindung ist zu einem Fusionsprotein optional ein Antigensegment, das aus einem Protein oder mehreren Segmenten von Proteinen besteht, die im Genom Helicobacter pylori codiert sind und gegen die wir die Immunantwort bilden wollen, hinzugefügt.

[0014] Die Erfindung betrifft ein Protein, das das Flagellin FlaA von H. pylori enthält, wo das Amino-terminale Segment und das Carboxy-terminale Segment durch die Sequenz des Flagellins von einem Bakterium ersetzt werden, das TLR5 aktiviert, und ferner optional ein Antigensegment, umfassend ein Protein oder mehrere Proteinsegmente, die im Genom des Helicobacter pylori codiert sind und für die Zubereitung eines prophylaktischen oder therapeutischen Vakzins gegen die Infektion mit dem Bakterium H. pylori verwendet werden.

[0015] Die Erfindung betrifft ein Protein, das optional auch ein oder mehrere Linker- Peptide umfasst, welche einzelne Segmente des Proteins verbinden. Jedes Linker- Peptid hat eine unabhängige Länge von einer bis zu mehreren, vorzugsweise bis zu 50 Aminosäuren. Zusätzlich kann das Protein auch einen oder mehrere Peptidmarker enthalten. Die Linker-Peptide sowie die Marker sind in dem Protein auf eine Weise eingebaut, die die Grundfunktionen des Proteins nicht ändert.

[0016] Die Erfindung betrifft das Protein, das für die Zubereitung des Vakzins zur Stimulation der Immunantwort gegen Bakterien verwendet wird, deren Flagellin TLR5 nicht aktiviert, um Infektionskrankheiten zu verhindern und zu behandeln.

[0017] Insbesondere betrifft die Erfindung das Protein für ein Vakzin gegen die Bakterien von der Gruppe der Alpha- und Epsilon-Proteobakterien, wie beispielsweise, ohne auf diese beschränkt zu sein: die Bakterien Helicobacter sp., Campylobacter sp., Bartonella bacilliformis, Rhizobium meliloti, Rhizobium sp., Wolnella sp., Brucella sp., vorzugsweise Helicobacter pylori.

[0018] Die Erfindung betrifft eine DNA, welche für die oben beschriebenen Fusionsproteine codiert. Insbesondere betrifft die Erfindung die DNA, die einen Code für das Protein der Erfindung enthält. Der Code umfasst eine Signalsequenz, welche eine Sekretion der Proteine oder die Bindung eines Proteins an die Zellmembran im Wirtsorganismus erlaubt, und das Protein der Erfindung, das in funktionaler Verbindung zur Signalisierungssequenz steht. Die Zellen des Wirtsorganismus können Bakterien, Pilze, Pflanzen, Tiere oder Menschen sein. Im Folgenden betrifft die Erfindung eine DNA, die zusätzlich zu dem Code für die Signalisierungssequenz, der operativ mit dem Protein der Erfindung verknüpft ist, regulatorische Elemente als Promotoren und Terminatoren umfasst, die operativ mit dem codierenden DNA-Teil verbunden sind und die Exprimierung des Fusionsproteins in Wirtszellen erlauben.

[0019] Die Erfindung betrifft auch eine DNA, die für das Fusionsprotein der Erfindung codiert und wobei die DNA für die Zubereitung der DNA-Vakzine für die Einführung der DNA in Humanoder Tierzellen benutzt wird, mit der Intention, die Immunantwort auf das Fusionsprotein der Erfindung abzurufen.

[0020] Die Erfindung betrifft DNA, die den Code für das Fusionsprotein der Erfindung zur Zubereitung des Vakzins für die Stimulation der Immunantwort gegen Bakterien enthält, deren Fla-gellin den TLR5 Rezeptor nicht aktiviert, um Infektionskrankheiten zu verhindern oder zu behandeln. Insbesondere gegen Bakterien der Gruppe Alpha- und Epsilon-Proteobakterien, wie beispielsweise: Helicobacter sp., Campylobacter sp., Bartonella bacilliformis, Rhizobium melilo-ti, Rhizobium sp., Wolnella sp., Brucella sp., vorzugsweise Helicobacter pylori.

[0021] Die Erfindung betrifft ein Vakzin, welches das Protein der Erfindung oder die DNA der Erfindung und entsprechende, pharmazeutisch akzeptable Zuschlagstoffe enthält.

[0022] Die Erfindung betrifft einen Wirtsorganismus, der das Fusionsprotein oder die DNA der Erfindung enthält und wo die DNA in Fusionsprotein transkribiert und translated wird und wo der Wirtsorganismus ausgewählt ist aus Bakterien, Hefen oder Pilzen und Säugetierzellen; vorzugsweise ist der Wirtsorganismus ausgewählt aus Organismen, die für Menschen und Tiere harmlos sind, vorzugsweise harmlose Organismen, die normalerweise in menschlicher und tierischer Darmflora vorkommt.

[0023] Die Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Gemisch, das Bakterien mit dem exprimier-ten Protein der Erfindung enthält und wobei das Protein auf der Oberfläche toter Bakterien exprimiert ist und die Bakterien ausgewählt werden aus einer Gruppe von Bakterien, die normalerweise in dem Individuum vorhanden sind.

[0024] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit von Flagellinvarianten zur Aktivierung des TLR5 Rezeptors, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Kultivierung von Zelllinien, die einen funktionalen TLR5 Rezeptor exprimieren; Einführen der DNA mit der Sequenz des Fusionsproteins zwischen der Signalisierungssequenz für die Fla-gellinsekretion und dem untersuchten Flagellin, wobei diese DNA mit den regulatorischen Elementen Promotor und Terminator operativ verknüpft ist, um die Exprimierung eines Fusionsproteins in Wirtszellen zu erlauben, in Zelllinien, welche den TLR5 Rezeptor exprimieren; eine Analyse der Aktivierung des TLR5 Rezeptors in Zelllinien durch Reporterplasmide oder eine Produktion entzündlicher Mediatoren.

[0025] Die Erfindung betrifft im weiteren ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit von Varianten von Flagellin zur Aktivierung des TLR5 Rezeptors, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: Kultivierung von Zelllinien, die einen funktionalen TLR5 Rezeptor exprimieren; Einführung von DNA mit der Sequenz des Fusionsproteins zwischen der Signalisierungssequenz für eine Sekretion der Flagelline und des untersuchten Flagellins, wobei die Sequenz operativ mit den regulatorischen Elementen Promotor und Terminator verknüpft ist, um die Exprimierung des Fusionsproteins in Wirtszellen zu erlauben, in Zelllinien, die keine Zelllinien sind, welche niedrige Mengen des TLR5 Rezeptors exprimieren; gemeinsame Kultivierung eines Gemisches von Zelllinien; Analyse der TLR5 Aktivierung in Zelllinien durch Reporterplasmide oder eine Produktion entzündlicher Mediatoren.

[0026] Die Erfindung betrifft nachstehend ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit von Flagellinvarianten zur Aktivierung des TLR5 Rezeptors, zusammengesetzt aus folgenden Schritten: Kultivierung von Zelllinien, die einen funktionalen TLR5 Rezeptor exprimieren; Zugabe des Überstands von Zellen, die das Protein exprimieren, das von der Sequenz des Fusionsproteins codiert wird, zwischen der Signalsequenz für eine Sekretion der Flagelline und dem untersuchten Flagellin, das operativ mit den regulatorischen Elementen Promotor und Terminator verknüpft ist, welche die Exprimierung des Fusionsproteins in Wirtszellen erlauben, Zelllinien, die den TLR5 Rezeptor exprimieren; Analyse der TLR5-Aktivierung in Zelllinien durch Reporterplasmide oder eine Produktion entzündlicher Mediatoren.

[0027] Die Erfindung betrifft ein Vakzin, welches das Protein der Erfindung oder die DNA der Erfindung enthält, wobei sich die Vakzine für multiple Immunisierung in der Aminosäurezusam mensetzung des Amino-Terminus und des Carboxy-Terminus des Chimären Flagellins, welches den TLR5 Rezeptor aktiviert, unterscheiden, so dass Antikörper, die von früheren Immunisierungen stammen, die Aktivierung des TLR5 Rezeptors bei der folgenden Immunisierung mit einem modifizierten Vakzin nicht verhindern. Das mittlere Segment des Flagellins im Fusionsprotein bleibt unter den Vakzinen unverändert.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

[0028] Figur 1: Schematisches Diagramm der Zusammensetzung des Fusionsproteins, das das chimäre Flagellinsegment und Antigensegment umfasst. Die Figur stellt dar: N, Amino-terminales Segment des Flagellins, das TLR5 aktiviert; V, variables mittleres Segment des Flagellins, das TLR5 nicht aktiviert; C, Carboxy-terminales Segment des Flagellins, das TLR5 aktiviert; A, Antigen-Protein o-der weitere Protein-Segmente.

[0029] Figur 2: Die Feststellung von Fusionsproteinen durch Western-Blot-Analyse. Wir ana lysierten die folgenden Proteine: UreB (HPUreB-Histag); HimFla-UreB (EcNfla-HpVfla-EcCfla-HPUreB-RGD-Histag); HimFla multi-(EcNfla-HpVfla-EcCfla- multiepitop-RGD-Histag).

[0030] Figur 3: Die Wirksamkeit der Internalisierung von Fusionsproteinen in der Zelllinie

CaCo-2. Das Bild umfasst: [A, B] Fluorochrom Alexa555 (MolecularProbe), deaktiviert in Tris buffer pH 8,5, [C] Internalisierung des Proteins HimMulti, markiert mit Alexa555 (0,125 pg/μΙ) [D] Zellen [C], zusätzlich markiert mit LysoTrackerGreen (MolecularProbes) (50 mM) [E] Internalisierung des Proteins HimMulti, markiert mit Alexa555 (0,125 pg/μΙ) [F] Zellen [E], zusätzlich markiert mit SynaptoRed [G] Internalisierung des Proteins FliC von Salmonella, markiert mit Alexa555 (0,1 |pg/pl) [H]; Zellen [G], zusätzlich markiert mit transferrin633 (MolecularProbes) (0,1 mg/ml).

[0031] Figur 4: Die Aktivierung des TLR5 Rezeptors mit Fusionsproteinen. Die Figur zeigt die

Aktivierung des TLR5 Rezeptors bei Zugabe von HimFla (Nr. 4, Tabelle 3) und HimFla-multi (Nr. 7, Tabelle 3) oder 100 ng des FliC als Agonist.

[0032] Figur 5: Die prophylaktische Immunisierung induziert die Produktion von Antikörper gegen die rekombinanten Proteine HimFla-UreB und HimFla-multi (Proteine Nr. 2 und 3, Tabelle 3). Das Histogramm zeigt durchschnittliche OD-Werte bei 450 nm an.

[0033] Figur 6: Western-Blot-Analyse der Fusionsproteine in nicht-flagellierten bakteriellen

Kulturen.

[0034] Figur 7: Die Anwesenheit von Fusionsproteinen auf der Oberfläche nicht- flagellierter

Bakterien, die mit den Konstrukten, welche für das Fusionsprotein codieren, transformiert wurden. In der Figur sind Bakterien, die das Fusionsprotein enthalten, weiß markiert. Das Bild zeigt: [A] HimFla (Nr. 4); [B] HimFla-ureB (Nr. 12); [C] HimFla-ureB (Nr. 9); [D] HimFla-multi (Nr 3); [E] Negative Kontrolle (nur sekundäre Antikörper).

[0035] Figur 8: Motilität nicht-flagellierter Bakterien, die mit dem Fusionsprotein transformiert wurden. Das Bild enthält folgende Samples: 1 bis 10: HimFla in pSB1.AK3 (Nr. 4); 11 und 12: HimFla-ureB (Nr. 12), 13 bis 20: HimFla-ureB (Nr. 9); 21 bis 25: HimFla (Nr. 5), 26 bis 30: HimFla-multi (Nr. 7), 35 bis 38: FliC (Nr. 8), 39 bis 42: HimFla in pSB1 .AK3 (Nr. 4).

[0036] Figur 9: Aktivierung des TLR5 Rezeptors mit nicht-flagellierten Bakterien, welche die

Fusionsproteine auf der Oberfläche des Bakteriums exprimieren. Die Stimulation der Bakterien, welche das transformierte Konstrukt auf der Oberfläche exprimieren. Wir transformierten FliC in E. coli JW1908-1 (Nr. 8), T7-HF-UreB in AK3. Wir setzten Test-Bakterien auf die Zelllinien HEK293, welche TLR5 exprimieren. Wir testeten Bakterien, die wir bei 70°C 20 Minuten inkubierten, und Bakterien, die wir bei 4°C 20 Minuten inkubierten.

[0037] Figur 10: Die Internalisierung nicht-flagellierter Bakterien, welche das FusionsProtein exprimieren, in die Zelllinien CaCo-2. [A] Bakterien mit mCerulean; [B] LysoTracker; [C] Bakterien mit mCerulean; [D] Überlappende Bilder.

[0038] Figur 11: Die Aktivierung des TLR5 Rezeptors mit Fusionsproteinen, exprimiert in der selben Zelllinie oder in den anderen Zellen der Zelllinie. Kontrollzellen wurden durch das Flagellin vom Bakterium Salmonella typhimurium in einer Endkonzentration von 100 ng/ml stimuliert. TLR5-Aktivierung wurde für Fusionsproteine ssHimFla-UreB (Nr. 2) und ssHimFla-multi (Nr. 4) getestet.

[0039] Figur 12: Der Vergleich der Aktivierung mit und ohne Signalisierungssequenzen. TLR5-

Aktivierung wurde für Fusionsproteine HimFla-multi (Nr. 18) und ssHimFla-multi (Nr. 4) getestet. BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Allgemeine Beschreibung [0040] Die Grundlage der Erfindung ist die Entdeckung, dass die Aktivierung der angeborenen Immunität als Aktivator der adaptiven Immunität agiert und die Immunantwort auf ein Antigen verstärkt und dass die Aktivierung der angeborenen Immunität durch die Aktivatoren der TLR-Rezeptoren erreicht werden kann, wie beispielsweise TLR5. Die wesentliche Entdeckung unserer Erfindung besteht in der Erkenntnis, dass einige Bakterien, wie Helicobacter pylori, ein Flagellin aufweisen, welches die Immunantwort nicht aktiviert, weshalb der Körper auf die Infektion mit diesem Bakterientyp schwach reagiert.

[0041] Die Erfinder sind zu einer überraschenden Entdeckung gelangt. Wenn ein Fusionsprotein, das einen Teil von Flagellin enthält, welches geeignet ist, den TLR5 Rezeptor zu aktivieren, verwendet wird, und wenn dieses Flagellin ein spezifisches Segment des Flagellins umfasst, das zur Aktivierung der angeborenen Immunität nicht geeignet ist, so ruft ein solches Fusionsflagellin die Produktion von Antikörpern gegen Flagellin von Bakterien ab, die ansonsten nur eine schwache Immunantwort auslösen würden. Das Fusionsprotein ersetzt die Zugabe von Adjuvantien und verbessert die Aktivierung der adaptiven Immunität gegen die Bakterien, deren Flagellin nicht immunogen ist.

[0042] In der vorliegenden Erfindung entdeckten die Erfinder, dass Flagellin von Bakterien, die ansonsten den TLR5 Rezeptor nicht aktivieren, wie etwa das Flagellin FlaA von dem Bakterium Helicobacter pylori, in dem die N-terminalen und C-terminalen Segmente mit dem Flagellin von Bakterien ersetzt wurden, die TLR5 aktivieren, wie beispielsweise das Flagellin von dem Bakterium Escherichia coli, als wirksames Vakzin verwendet werden kann. Auf dieser Grundlage bereiteten sie das Vakzin zu, das geeignet ist, das angeborene Immunsystem durch die Aktivierung von TLR5 zu aktivieren, und gleichzeitig kann es eine spezifische Immunantwort gegen das mittlere Segment des Flagellins schaffen, das ansonsten die Aktivierung des TLR5 nicht auslöst, und auch gegen andere Protein-Segmente, die in das Fusionsprotein gekoppelt sind.

[0043] Die Erfindung basiert zudem auf der Entdeckung, dass der Schutz des Individuums gegen eine Infektion durch Bakterien, welche Flagellin umfassen, das den TLR5 Rezeptor nicht aktiviert, erhöht ist, wenn andere Antigene, die für den Mikroorganismus charakteristisch sind, von dem das Flagellin, das die Immunantwort nicht aktiviert, ausgewählt ist, in das Fusionsprotein zwischen dem Flagellin, das den TLR5 Rezeptor aktiviert, und dem mittleren Segment des Flagellins, das die angeborene Immunantwort nicht aktiviert, eingeführt werden.

[0044] Die Erfindung besteht auch darin, dass das Vakzin, das die angeborene Immunität erfolgreich aktiviert und eine Produktion von Antikörpern induziert, verwendet werden kann als (a) das Fusionsprotein, (b) Mikroorganismen, vorzugsweise Bakterien, die anstatt ihres eigenen Flagellins das flagellische Protein auf der Zelloberfläche exprimieren, oder (c) DNA, welche für das Fusionsprotein codiert und eine zusätzliche Signalisierungssequenz umfasst, die eine

Sekretion eines exprimierten Fusionsproteins ermöglicht.

[0045] In der Beschreibung der Erfindung hat der Ausdruck "Vakzin" eine allgemeine Bedeutung und bezieht sich auf jede therapeutische, immunogene und immunstimulatorische Komponente, welche die Merkmale der vorliegenden Erfindung umfasst.

[0046] Grundlage der Erfindung ist auch die Entdeckung, dass die Immunisierung in bestimmten Schritten die Immunantwort auf das Vakzin verbessert. Die Erfinder haben festgestellt, dass die Immunantwort verbessert wird, wenn sich das Vakzin der zweiten und jeder folgenden Immunisierung in dem Segment des Fusionsproteins unterscheidet, welches den Teil des Fla-gellins enthält, der den TLR5 Rezeptor aktiviert. So kamen die Erfinder zur Erkenntnis, dass die Verwendung eines Vakzins mit dem Fusionsprotein, welches das Chimäre Flagellin enthält, das TLR5 induziert (z. B.: den Teil des Flagellins von E. coli) in der zweiten Immunisierung den gewünschten Zweck nicht erreicht, weil nach der ersten Immunisierung auch Antikörper gegen das Segment des Chimären Flagellins generiert werden, das den TLR5 induziert (zum Beispiel: den Teil des Flagellins von E. coli). In diesem Fall ist es nicht möglich, den erwünschten Effekt eines Adjuvans zu erzielen. Die Erfinder haben entdeckt, dass dieses Phänomen umgangen werden kann, wenn das Vakzin in der zweiten Vakzination als Teil des Fusionsproteins das Chimäre Flagellin von einem anderen Mikroorganismus enthält (beispielsweise einen Teil des Salmonella Flagellins), der auch den TLR5 Rezeptor induziert, oder wenn Mutationen an den Schlüsselstellen des Flagellins auf eine Art eingeführt werden, in der die Antikörper diese nicht erkennen. Der Ersatz des Teils des Fusionsproteins, des Chimären Flagellins, das die TLR5-Aktivierung induziert, verstärkt die Immunantwort gegen Antigene, die im Fusionsprotein enthalten sind, bei jeder nachfolgenden Immunisierung.

[0047] Die Erfinder haben festgestellt, dass sie durch die Einführung des DNA-Codes für modifizierte Flagelline in Säugetierzellen die Fähigkeit des modifizierten Flagellins zur Aktivierung des TLR5 Rezeptors identifizieren können, was sich als zweckmäßig für das Design und die Selektion wirksamer Vakzine erweist. Die Aktivierung durch das Flagellin initiiert die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren und die Transkription von Mediatoren in den Zellen, die TLR5 Rezeptor exprimieren, was diesen Zellen zu einem selektiven Vorteil in der Zellkultur verhilft. Dieses Verfahren kann auch dazu benutzt werden, die Bibliothek der Flagellin-Varianten zu scree-nen.

[0048] Eine Grundlage der Erfindung ist zudem die Entdeckung, dass die Verwendung einer Kombination von Vakzinen, die sich in den Amino- und den Carboxy-terminalen Segmenten des Flagellins unterscheiden, das den TLR5 Rezeptor aktiviert, während das mittlere Segment des Flagellins und der Antigen-Teil unverändert bleiben, die Effizienz der Antikörperproduktion steigert, wenn eine multiple Immunisierung vonnöten ist. Es ist in der Tat zutage getreten, dass der Organismus Antikörper auch gegen das Amino- und Carboxy-terminale Segment des Flagellins produziert, wodurch sich die Funktion dieses Segments auf dem TLR5 Rezeptor verringert, da es durch Antikörper neutralisiert wird. Durch die Ersetzung des Amino- und des Carboxy-terminalen Segments des Flagellins im Fusionsprotein vermeidet das Fusionsprotein die produzierten Antikörper und aktiviert bei der Impfung effizienter den TLR5 Rezeptor und die angeborene Immunantwort.

[0049] Vorbehaltlich anderer Definitionen haben alle hier benutzten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke dieselbe Bedeutung wie sie bei Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt ist. Die in dieser Beschreibung benutzte Terminologie der Erfindung hat den Zweck, ein bestimmtes Segment der Erfindung zu erklären; sie ist nicht geeignet, die Erfindung zu beschränken. Alle in der Beschreibung der Erfindung genannten Publikationen sind als Referenzen zitiert. In der Beschreibung der Erfindung und in den Ansprüchen sind die Beschreibungen im Singular formuliert, es gilt für diese aber auch der Plural, was aber im Sinne eines leichterten Verständnisses im einzelnen nicht hervorgehoben ist.

FUSIONSPROTEIN/DNA

[0050] Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass das Vakzin, das für das Fusionsprotein codiert zwischen/unter (a) dem Segment eines Chimären Flagellins, das die angeborene Immunantwort durch die Aktivierung des TLR5 Rezeptors stimuliert, und (b) dem Segment des Flagellins, das nicht in der Lage ist, den TLR5 Rezeptor zu stimulieren und insofern nicht immunogen ist, und (c) optional dem Antigen, das von dem selben Organismus wie nicht-immunogenes Flagellin abstammt, die Immunantwort und die Produktion von Antikörpern abruft, weshalb das Vakzin die immunogenen Fähigkeiten wie mit konventionellen Vakzinen erwartet, die Adjuvantien enthalten, demonstriert.

[0051] Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass das Chimäre Flagellin, das zur Aktivierung des TLR5 Rezeptors imstande ist und eine Komponente des Fusionsproteins und des Vakzins ist, die Produktion von Interleukinen über die MyD88-abhängige Bahn in Zellen des Immunsystems abruft. Die Erfinder haben erkannt, dass so ein Vakzin geeignet ist, das angeborene Immunsystem zu aktivieren.

[0052] Der Begriff "Zellaktivierung" bezeichnet die Aktivierung der Immunantwort durch den Toll-like Rezeptor 5, die Aktivierung des angeborenen Immunsystems und die Aktivierung der Produktion von Antikörpern durch die Freisetzung von Interferonalpha. Die Aktivierung der Zellen durch die Aktivierung der TLR5 Rezeptoren erhöht die Wirksamkeit der Synthese der Antikörper gegen das vorhandene Antigen.

[0053] Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass die Immunisierung mit einem Vakzin, welches das Fusionsprotein/DNA der Erfindung umfasst und das Fusionsprotein exprimiert, nur eine kleine Entzündung im Vergleich zu Vakzinen mit einem hinzugefügten Adjuvans auslöst. Trotz der reduzierten Entzündung induziert das Fusionsprotein jedoch eine starke Immunantwort. Die erwähnte Methode reduziert die Nebenwirkungen der Impfung und verstärkt dennoch die Immunantwort.

[0054] Die Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis, dass wenn die wiederholte Immunisierung mit dem Vakzin, welches das Fusionsprotein zwischen (a) dem Segment des Flagellins, das TLR5 aktiviert, und (b) dem Segment des Flagellins, das TLR5 nicht aktiviert und als Antigen dient, umfasst, für jede nachfolgende Immunisierung ein anderes Vakzin benutzt, das sich von dem vorhergehenden im Segment des Flagellins unterscheidet, das TLR5 aktiviert, eine verbesserte Immunantwort erreicht wird. Die Erfinder haben festgestellt, dass durch Ersetzen des Segments des Flagellins, das TLR5 aktiviert, die Immunantwort bei jeder nachfolgenden Neuimpfung abgerufen werden kann, was bei multiplen Impfungen nicht möglich ist, wenn jedes Mal ein identisches Vakzin verwendet wird.

[0055] Die Erfindung betrifft ein Fusionsprotein zwischen (a) Segmenten des Flagellins, die den TLR5 Rezeptor aktivieren, und (b) Segmenten des Flagellins, die den TLR5 nicht aktivieren, aber als Antigen dienen. Das Fusionsprotein umfasst optional (a) eine Signalisierungssequenz, welche die Lokalisierung des exprimierten Proteins bestimmt, (b) Linker-Peptide, welche die einzelnen Segmente des Fusionsproteins verbinden, die von einer bis mehreren Aminosäuren lang sind, (c) eine Marker-Sequenz, welche die Isolierung des Proteins erlaubt.

[0056] Insbesondere betrifft die Erfindung das Fusionsprotein, das optional Linker- Peptide umfasst, welche die einzelnen Protein-Segmente des Fusionsproteins der Erfindung verbinden, und optional ist das Linker-Peptid von einer bis zu mehrere Aminosäuren lang. Insbesondere betrifft die Erfindung das Fusionsprotein der Erfindung, das den Aminosäurecode für das Peptid umfasst, das der Isolation des Proteins dient, das aus dieser Gruppe ausgewählt ist, ohne darauf beschränkt zu sein: his-tag, flag-tag, myc-tag, Hämagglutinations-tag und andere.

Linker-Peptid [0057] Der Begriff "Linker-Peptid" bezeichnet kürzere Aminosäure-Sequenzen, deren Rolle nur darin bestehen könnte, die einzelnen Domänen des Fusionsproteins zu trennen. Die Rolle des Linker-Peptids im Fusionsprotein, dessen Einbeziehung optional ist, kann auch in der Einfüh- rung des Spaltungsortes oder für posttranslationale Modifikationen bestehen, einschließlich der Einführung von Orten für die verbesserte Verarbeitung von Antigenen. Die Länge des Linker-Peptids ist nicht beschränkt, es ist jedoch normalerweise bis zu 30 Aminosäuren lang.

Signalisierungs-Peptid [0058] Der Begriff "Signalisierungssequenz" oder "Signalisierungs-Peptid" bezeichnet die Aminosäure-Sequenz, die für die Ausrichtung des Proteins auf einen bestimmten Ort in der Zelle wichtig ist. Signalisierungs-Sequenzen variieren auch in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus, in dem das Fusionsprotein exprimiert wird. Aminosäure- Sequenzen der Signalisierungssequenzen sind Fachleuten gut bekannt, ebenso wie welche Signalsequenz in einem bestimmten Organismus funktional ist.

Marker-Sequenzen [0059] Der Begriff "Marker-Sequenzen" bezeichnet Sequenzen der Aminosäuren, die dem Protein hinzugefügt werden, um die Reinigung/Isolation/Detektion des Proteins zu ermöglichen.

[0060] Die Positionen der Signalisierungssequenz, der Linker-Peptide und der Marker-Sequenz sind optional, sie müssen indessen die funktionale Exprimierung des Proteins zulassen und die Funktion bewahren, für welche diese Aminosäure- Sequenzen ausgewählt wurden, welche Fachleuten in diesem Gebiet bekannt ist.

[0061] Die Erfindung betrifft die DNA, welche für das Fusionsprotein codiert, die optional die Signalisierungssequenz umfasst, welche optional auf das Fusionsprotein auf der Oberfläche der Membran oder in Organellen innerhalb der Zellen, das Antigen oder Antigenen oder Epitopen zielt, die optional mittels des Linker-Peptids miteinander verbunden sind, wobei das Antigen-Segment mit einer optionalen Dimerisationsregion und der transmembranen Domäne, die gleichzeitig auch die Dimerisationsregion sein kann, und der intrazellulären Domäne der TLR Rezeptoren verknüpft ist. Die DNA der Erfindung ist in einen Vektor eingeführt, der die Exprimierung der DNA im Wirtsorganismus erlaubt. Die DNA der Erfindung wird durch in der Fachwelt gut bekannte Methoden in den Wirtsorganismus eingeführt.

FLAGELLIN

[0062] Humane oder tierische Zellen könnten Flagellin eigenständig nach Einführung der DNA für das Flagellin produzieren. Es ist gezeigt worden, dass ein solcher DNA- Code als Vakzin verwendet werden kann (Applequist et al. 2005, J. Immunol. 175, 3882-3891). Allerdings reicht das Flagellin des Helicobacter pylori selbst nicht aus, um genügend Immunantwort abzurufen, weil es den TLR5 Rezeptor nicht aktiviert. In der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder gezeigt, dass der genetische Code für das Chimäre Flagellin, das den mittleren Teil des Fla-gellins des Helicobacter pylori und das N-terminale sowie das C-terminale Segment des Fla-gellins anderer Bakterien, die TLR5 aktivieren, umfasst, verwendet werden kann. Der genetische Code ist unter der Kontrolle der entsprechenden regulatorischen Elemente, welche die Exprimierung in Zellen von Menschen und Tieren ermöglichen.

[0063] Die Erfinder haben einen solchen Code in Zellen eingeführt, welche mit der Exkretion des Fusionsproteins begonnen haben, was eine starke Immunantwort und Antikörper-Produktion ausgelöst hat. Die Zugabe des Codes für das Protein oder seine Subeinheit löste eine wirksame Immunantwort gegen dieses Protein aus. Die Aktivierung des TLR5 Rezeptors ist im Vergleich mit dem Flagellin selbst noch stärker, wenn das Flagellin mit einem zusätzlichen Protein-Antigen kombiniert wird.

[0064] Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass Flagelline in zwei Subtypen unterteilt werden, je nach ihrer Fähigkeit zur Aktivierung der angeborenen Immunität: (a) Flagelline, die den TLR5 Rezeptor aktivieren, und (b) Flagelline, die den TLR5 Rezeptor nicht aktivieren. Bakterien, die das Flagellin enthalten, welches den TLR5 Rezeptor nicht aktiviert, entkommen dem Verteidigungsmechanismus des Organismus gegen Infektionen mit diesen Bakterien leichter, während die Bakterien, welche das Flagellin enthalten, das die Aktivierung des TLR5 Rezeptor auslöst, eine integrierte Immunantwort und die Abwehr des Körpers gegen diese Bakte rien auslösen. Die Erfinder haben gezeigt, dass eine Immunantwort gegen Bakterien, welche das Flagellin enthalten, das die Immunantwort nicht aktiviert, induziert werden kann, wenn das Vakzin verwendet wird, das beide Flagellin-Typen kombiniert. Auf der Grundlage dieser Entdeckung betrifft diese Erfindung das Fusionsprotein zwischen (a) den N-und C-terminalen Segmenten des Flagellins, die den TLR5 Rezeptor aktivieren, und (b) dem mittleren Segment des Flagellins, das den TLR5 Rezeptor nicht aktiviert und zwischen den N- und C-terminalen Segmenten des Flagellins angeordnet ist, welches den TLR5 Rezeptor aktiviert.

[0065] Die Erfinder haben festgestellt, dass das Fusionsprotein des Chimären Flagellins mit angehängten Proteinen, die von dem Mikroorganismus stammen, der das Flaggelin exprimiert, das nicht TLR5 aktiviert, eine bessere Immunantwort im Wirtsorganismus gegen diesen Mikroorganismus auslöst. Gemäß der Erfindung können zusätzliche Proteine/Antigene als mittleres Segment des Flagellins oder am C-Terminus des Fusionsproteins lokalisiert sein.

[0066] Wie oben erwähnt, betrifft die Erfindung das Fusionsprotein, welches die N- und C-terminalen Segmente des Flagellins enthält, die den TLR5 Rezeptor aktivieren. Gemäß der Erfindung umfasst der N-Terminus des Flagellins das Fragment, das mindestens die Aminosäure-Sequenz von 1 bis 176 des Protein- Flagellins vom Bakterium E. coli K-12 Substamm MG 1655 oder die korrespondierenden Homologe von anderen Bakterien enthält. Gemäß der Erfindung umfasst das C-terminale Segment des Flagellins das Fragment, das mindestens die Aminosäure-Sequenz von 401 bis 498 des Protein-Flagellins von dem Bakterium E. coli K-12 Substamm MG1655 oder die korrespondierenden Homologe von anderen Bakterien enthält.

[0067] Bakterien, welche das Flagellin enthalten, das den TLR5 Rezeptor stimuliert, sind Beta-proteobakterien oder Gammaproteobakterien oder Spirochäten oder Firmicutes, wie die Bakterien Escherichia coli, Salmonella sp., Shigella flexneri, Legionella pneumophila, Serratia marcescens, Listeria monocytogenes, Pseudomonas sp., Vibrio cholerae, Bordetella sp., Borel-lia burgdorferi, Clostridium sp., Bacillus cereus, Bacillus subtilis.

[0068] Wie erwähnt, betrifft die Erfindung das Fusionsprotein, welches das mittlere Segment des Flagellins umfasst, das als Ganzes den TLR5 Rezeptor nicht aktiviert. Gemäß der Erfindung umfasst das mittlere Segment des Flagellins das Fragment, das eine Sequenz mindestens von 178 bis und einschließlich der 418 Aminosäure des Protein-Flagellins A von dem Bakterium Helicobacter pylori J99 oder die korrespondierenden Homologe von anderen Bakterien enthält.

[0069] Bakterien, die das Flagellin enthalten, das den TLR5 Rezeptor nicht stimuliert, sind Alphaproteobakterien oder Epsilonproteobakterien wie die Bakterien Helicobacter sp., Campylobacter sp., Bartonella bacilliformis, Rhizobium meliloti, Rhizobium sp., Wolnella sp., Brucella sp.

[0070] Insbesondere betrifft die Erfindung das Fusionsprotein, das enthält: (a) N- und C-terminale Segmente des Flagellins von E. coli, Salmonella, Seratia, vorzugsweise die Aminosäure-Sequenzen von 1 bis 176 des FliC für das N-terminale Segment des Flagellins und von 401 bis 498 des FliC für das C-terminale Segment des Flagellins oder die korrespondierenden Homolog-Segmente des Flagellins von anderen aufgelisteten Bakterien, (b) das mittlere Segment des Flagellins, das den TLR5 Rezeptor nicht stimuliert, gewonnen aus dem Bakterium Helicobacter pylori (vorzugsweise die Aminosäure-Sequenzen von 178 bis und einschließlich 418 oder die korrespondierenden homologen Segmente des Flagellins von anderen aufgelisteten Bakterien), wo dieses mittlere Segment zwischen dem Amino- und Carboxy-terminalen Segment des Flagellins, das den TLR5 Rezeptor aktiviert, angeordnet ist.

[0071] Der Begriff "homologe Sequenzen/Fragment/Proteine" betrifft die Aminosäure- Sequenzen der Proteine/Fragmente, die dem selben oder einem anderen Organismus entstammen, die in der Ausrichtungsanalyse eine gute Proteinausrichtung zeigen, vorzugsweise über 50% konservierte Struktur, insbesondere 60%, besonders bevorzugt 70%. Der Ausdruck "homolog" bezeichnet auch mutante Proteine, deren Mutationen die Aminosäure-Sequenz minimal verändern.

[0072] Die konservierte Region des Flagellins ist auf dem Stand der Technik gut bekannt (Mimori-Kiyosue et al. 1997, J. Mol. Virol. 270:222-237; Wei, Joys 1985, J. Mol. Biol. 186, 791-803). Es ist bei Fachleuten in diesem Gebiet allgemein bekannt, dass die konservierte Region in der Größe je nach der Quelle des Flagellins variiert. Im allgemeinen umfasst das N-terminale konservierte Segment Aminosäuren von 170 bis 180 am N-terminalen Segment des Proteins, und das C-terminale konservierte Segment umfasst die Aminosäure-Sequenz von 85-100 am C- terminalen Segment des Proteins. Der hypervariable Teil des mittleren Segments variiert in der Größe zwischen den einzelnen Flagellinen, abhängig vom Ursprung des Flagellins. Experten in dem Gebiet können das N- und C-terminale Segment des Flagellins und das mittlere Segment des Flagellins mit Hilfe bekannter Techniken für Aminosäure-Sequenzausrichtungen identifizieren.

[0073] Der Begriff "N-/C-terminales Segment des Flagellins" bezieht sich auf aktive Fragmente des Flagellins und auf Modifikationen aktiver Fragmente, welche die angeborene Immunität via TLR5 Rezeptor aktivieren.

[0074] Der Begriff "Flagellin, das den TLR5 Rezeptor/die angeborene Immunität nicht aktiviert" bezieht sich auf die Gruppe von Flagellinen von Bakterien, die nicht geeignet sind, den TLR5 Rezeptor zu aktivieren. Die Bakterien, welche Flagella besitzen, die aus dem erwähnten Flagellin bestehen, vermeiden die Schutzmechanismen des Wirts. Ein solches Bakterium ist H. pylori.

[0075] Insbesondere betrifft die Erfindung das Fusionsprotein, bestehend aus der Aminosäure-Sequenz von 1 bis einschließlich 176 (K) und von C 401 (A) bis 498 des Flagellins (von der breitesten zu der engsten Option).

[0076] Der Begriff "mittleres Fragment" betrifft den variablen Teil des Flagellins, der in Größe und Zusammensetzung stark variiert, je nach der Quelle des Flagellins. Das mittlere Segment ist jener Teil des Flagellins, der nicht als das N- und (oder) C- terminale Segment betrachtet werden kann, und befindet sich zwischen den N- und C-terminalen Segmenten des Flagellins. Einschlägig bewanderte Fachleute können unter Anwendung der Alignment-Techniken (Ausrichtungstechniken) den Aminosäurebereich identifizieren, der sich auf das mittlere Segment des Flagellins bezieht.

[0077] Die Erfindung betrifft ein Fusionsprotein, das den mittleren Teil des Flagellins enthält, das den TLR5 Rezeptor nicht induziert. Vorzugsweise betrifft die Erfindung das Flagellin von dem Bakterium H. pylori. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Fusionsprotein, das den mittleren Teil des Flagellins mit Aminosäure-Sequenz SEQ ID NR.: 1 enthält.

DAS VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DER AKTIVIERUNGSFÄHIGKEIT DES FLAGELLINS

[0078] Gemäß der Erfindung ist die Bestimmung der TLR5-Rezeptor- Aktivierungsfähigkeit des Flagellins und der Flagellinmutanten entscheidend für die Zubereitung des Proteins. Die Erfinder haben ein Verfahren entwickelt, das eine sehr einfache Detektion der Flagelline erlaubt, die zur Rezeptor-Aktivierung imstande sind. Zellen, die den Rezeptor TLR5 auf der Oberfläche exprimieren, werden präpariert. Die Zellen können aus solchen ausgewählt werden, die den exprimierten, nativen TLR5 enthalten, oder aus Zellen, die nicht den nativen TLR5 exprimieren, aber ein eingefügtes Gen für den nativen oder den mutierten funktionalen TLR5 aufweisen. Zellen mit funktionalem TLR5 Rezeptor auf der Oberfläche werden am Flagellin oder an den Flagellinmutanten exponiert, die wir analysieren wollen. Nach einem bestimmten Zeitraum wird die Rezeptor-Aktivierung analysiert. Die Inkubationszeit des Flagellins mit den Zellen ist vom Detektionsverfahren und vom benutzten Reportersystem abhängig. Wenn das Reportersys-tem/die Antwort mit der Synthese der Reporter-Proteine assoziiert ist, ist die Dauer länger. Eine kürzere Zeitdauer ist für die Detektion der Phosphorylierung erforderlich. Flagellin oder Flagellinmutanten können zu Reporterzellen hinzugefügt werden, die den TLR5 Rezeptor und das Reportersystem bereits enthalten, indem die Zellen mit dem Flagellin-Gen transfiziert werden, dessen Wirkung wir analysieren wollen. Das Flagellin oder die Flagellinmutanten können auch zu Reporterzellen in Form von Überstand hinzugefügt werden, der die exprimierten Flagelline enthält. Die Flagelline oder Flagellinmutanten können zu Reporterzellen auch auf eine Art hinzugefügt werden, bei der die Reporterzellen, welche den exprimierten TLR5 Rezeptor auf der Oberfläche enthalten, zusammen mit Zelllinien inkubiert werden, die mit dem Flagellin-Gen infiziert werden und Flagellin zum Medium exprimieren und sekretieren.

[0079] Reporterzellen sowie Zellen mit dem Flagellin-Gen können von tierischen oder humanen Zelllinien selektiert werden. Reporterzellen müssen TLR5 auf der Oberfläche exprimieren und ein funktionierendes Reportersystem aufweisen. Sie können TLR5 Rezeptor über die DNA eingefügt haben, oder der Rezeptor ist bereits in den Zellen vorhanden. Zellen mit dem Flagellin-Gen sind jene, die Flagellin exprimieren, und können identisch mit oder verschieden von Reporterzellen sein. Es kann sich auch um Zellen von Mikroorganismen handeln, die Flagellin exprimieren.

[0080] Der Ausdruck "Reportersysteme" betrifft die gesteigerte Anwesenheit von Proteinen, deren Exprimierung unter der Kontrolle des Promoters steht, der nach der Aktivierung des TLR5 und nach der Aktivierung der vom TLR5 Rezeptor lancierten Signalbahnen aktiviert wird. Insbesondere bezieht er sich auf die Proteine, deren erhöhte Menge mit einer gesteigerten Aktivität dieser Proteine gemessen werden kann, ob durch die erhöhte Spaltung der Substrate oder die Erscheinung von Produkten, die leicht messbar sein sollten. Insbesondere bezieht sich dies auf die Bildung oder den Abbau leuchtender Substrate, fluoreszierender Substrate oder gefärbter Substrate. Der Ausdruck "Reportersystem" bezieht sich auch auf die Bildung oder den Abbau der eigenen Produkte der Zelle, deren Verarbeitung unter der Kontrolle der TLR5-Rezeptor-Aktivierung erfolgt. Insbesondere bezieht er sich auf das Spektrum der entzündlichen Wirkstoffe, deren Exprimierung unter der Kontrolle von Transkriptionsfaktoren erfolgt, z. B. NFkB, welche durch die TLR5- Rezeptor-Aktivierung aktiviert werden. Die Expression entzündlicher Wirkstoffe wird durch Färbung mit spezifischen Antikörpern in ELISA-Assays oder durch die Detektion der Anwesenheit von mRNA dieser entzündlichen Wirkstoffe unter Verwendung einer quantitativen Umkehrtranskription PCR detektiert. Die Änderung des Phosphorylierungsmusters kann auch als “Reportersystem” betrachtet werden, da die TLR5-Rezeptor-Aktivierung die Aktivierung der TLR5-Proteinkinasen auslösen kann, die je nach der Stärke der Aktivierung das Substrat mehr oder weniger intensiv phosphorylieren. Die Detektion des Phosphorylierungsmusters erfolgt mittels Western-Blot-Analyse mit Antikörpern, die spezifisch gegen das phosphorylierte Substrat wirken.

ANTIGENISCH/IMMUNOGENISCH

[0081] Der Ausdruck "antigen(isch)/immunogen(isch)" bezieht sich auf die Proteine, Fragmente dieser Proteine, Epitope in der nativen oder mutierten Form, welche den Sensibilitätszustand und/oder die Immun-Ansprechbarkeit nach einer bestimmten Dauer nach der Einführung induzieren und zu Demonstrationszwecken mit Antikörpern und/oder Zellen nach der Immunisierung in vivo und in vitro reagieren. Das Antigen ist aus einem oder mehr Proteinen/Fragmenten zusammengesetzt, die in beliebiger Reihenfolge miteinander verbunden sind. Die Antigene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Antigene, die mit Bakterien und Mikroorganismen assoziiert sind, welche Flagelline enthalten, die TLR5 nicht induzieren.

[0082] Insbesondere betrifft die Erfindung das chimäre Flagellin, dessen mittleres Segment von Flagellinen der Alphaproteobakterien oder Epsilonproteobakterien stammt, einschließlich der Bakterien Helicobacter sp, Campylobacter sp., Bartonella sp., Rhizobium meliloti, Rhizobium sp., Wolnella sp., Brucella sp., ohne auf diese beschränkt zu sein. Das Antigen, das optional im Fusionsprotein enthalten ist, wird ebenfalls von diesen Bakterien gewählt.

[0083] Die Verarbeitung und Identifizierung von Peptidantigenen, die durch T-Zellen präsentiert werden, ist weitgehend abhängig von der Antigen-Aminosäure-Sequenz. Das im Vakzin der vorliegenden Erfindung benutzte Antigen kann spezifische Domänen oder Epitope enthalten. Die Antigen-Domäne kann aus mehreren Epitopen bestehen. Das im Vakzin benutzte Antigen der vorliegenden Erfindung kann das gesamte Antigen enthalten, das die dreidimensionale Struktur der Antigen- Determinanten enthält, somit werden von den B-Lymphozyten Antikörper gegen die Struktur des Antigen-Epitops gebildet.

[0084] Antigene, die auf der Oberfläche der Bakterien präsentiert werden, haben normalerweise Kontakt mit den Rezeptoren der Immunzellen, und eine Abwehr gegen diese ist oftmals höchst wirksam. Flagelline, die bakterielle Flagella auf der Oberfläche von Bakterien bilden, gehören zu diesen Molekülen. Zu den wirksamsten Zielen des Immunsystems gehören Proteine, die für das Überleben der Bakterien im Körper erforderlich sind, Virulenzfaktoren und Moleküle, die im Zielorganismus Schäden verursachen, wie der Helicobacter pylori Urease B, CagA, VacA.

PRODUKTION REKOMBINANTER NUKLEINSÄURE / PROTEINE

[0085] Sofern nicht anders beschrieben, wurden in der Erfindung Standardmethoden der Molekularbiologie benutzt, wie beispielsweise das Klonen von Genen, die Polymerase-Kettenreaktion, die Detektion von Nukleinsäuren, die Zubereitung von Fusionskonstrukten, die Exprimierung von Peptiden und Proteinen in Wirtszellen usw. Diese Verfahren sind einschlägig bewanderten Fachleuten bekannt (vgl. Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, NY, Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., NY).

[0086] Der Ausdruck "DNA/Nukleinsäure" bezieht sich auf Polinukleotid-Moleküle wie DNA, RNA, einschließlich cDNA, Genom-DNA, synthetische DNA, Chimäre DNA und RNA. Nukleinsäure kann doppelsträngig oder einsträngig sein. Nukleinsäure kann Nuklein-Analoge oder andere Derivate enthalten.

[0087] Gemäß der Erfindung kann Fusionsprotein in dem Wirtsorganismus synthetisiert werden, der die heterologe Nukleinsäure exprimiert, die für das Fusionsprotein codiert. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein dient der Induzierung der Immunantwort. Es ist eine Priorität, dass ein Fusionsprotein in operativer Verbindung mit der Signalisierungssequenz ist, die in der Nukleinsäure codiert ist.

[0088] Der Ausdruck "natives Protein/Fragment" bezeichnet Proteine/Proteinfragmente, die von einem Organismus ohne vorherige Manipulation des genetischen Materials gewonnen werden können, und das Protein/Proteinfragment ist im Genom dieses Organismus codiert.

[0089] Der Ausdruck "mutantes Protein/Fragment" bezeichnet das Protein/Proteinfragment, das sich in mindestens einer Aminosäure vom nativen Protein/Proteinfragment unterscheidet.

[0090] Die vorliegende Erfindung betrifft Wirtszellen, die mit Nukleinsäure für das Fusionsprotein gemäß den nachstehenden Ansprüchen transformiert wurden. Die Wirtszelle kann prokary-otisch oder eukaryotisch sein. Eukaryotische Zellen, die für die Exprimierung des Fusionsproteins geeignet sind, sind nicht eingeschränkt, solange die Zelllinien mit den Ausbreitungsverfahren des Expressionsvektors und mit der Exprimierung des Fusionsproteins kompatibel sind. Die bevorzugten eukaryotischen Zellen umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Hefe, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Zellen von Wirbeltieren, beispielsweise: Maus, Ratte, Affe oder humane Fibroblasten.

[0091] Für die Exprimierung von DNA /Fusionsprotein kann jeder bakterielle Wirt gemäß der Erfindung benutzt werden. Das bevorzugte prokaryotische Bakterium wird ausgewählt aus E. coli, H. pylori. Die Invention betrifft die Exprimierung des Proteins in Bakterien. Die Erfindung betrifft bakterielle Zellen, die ein Fusionsprotein exprimieren, vorzugsweise die Bakterien E. coli oder H. pylori.

[0092] I m allgemeinen ist die heterologe Nukleinsäure in einen (viralen oder nichtviralen) Expressionsvektor integriert. Geeignete Vektoren umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein: Plasmide, virale Vektoren, usw.. Expression Vektoren, die mit den Zellen des Wirtsorganismus kompatibel sind, sind einschlägig bewanderten Fachleuten gut bekannt und umfassen die entsprechenden Kontrollelemente für die Transkription und Translation von Nukleinsäuresequenz. Typischerweise umfasst ein Expressionsvektor eine Expressionskassette, die in Richtung 5' zu 3' den Promoter umfasst, die Codierungssequenz für das Fusionsprotein, das operativ mit dem

Promoter und Terminator verknüpft ist, einschließlich eines Stoppcodons für RNA- Polymerase und eines Polyadenylationssignals für die Polyadenylase.

[0093] Der Expressionsvektor kann zur Exprimierung in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen präpariert werden. Prokaryotische Zellen sind beispielsweise Bakterien, vornehmlich Escherichia coli. Gemäß der Erfindung werden prokaryotische Zellen dazu benutzt, eine ausreichende Menge Nukleinsäure zu gewinnen. Der Expressionsvektor enthält im allgemeinen die operativ zugeordneten Kontrollelemente, die in Arbeitsverbindung mit der DNA der Erfindung stehen, die für das Fusionsprotein codiert. Die Kontrollelemente werden so ausgewählt, dass sie die effiziente und gewebespezifische Exprimierung auslösen. Der Promoter kann konstitutiv oder induzierbar sein, je nach dem gewünschten Expressionsmuster. Der Promoter kann nativen oder fremden (nicht in den Zellen repräsentiert, wo er verwendet wird) Ursprungs sein, und er kann natürlich oder synthetisch sein. Der Promoter muss so ausgewählt werden, dass er in den Targetzellen des Wirtsorganismus funktioniert. Zusätzlich sind Initiierungssignale für die effiziente Translation des Fusionsproteins enthalten, welches das ATG und die korrespondierenden Sequenzen umfasst. Wenn der in der Erfindung gebrauchte Vektor zwei oder mehr Leserahmen umfasst, sollten die Leserahmen unabhängig operativ mit den Kontrollelementen assoziiert sein, und die Kontrollelemente sollten identisch oder unterschiedlich sein, je nach der gewünschten Protein-Produktion.

[0094] Beispiele bakterieller Expressionsvektoren umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein: pET-Vektoren, pRSET-Vektoren und andere. Wenn Vektoren in den bakteriellen Zellen verwendet werden, sind die Kontrollelemente bakteriellen Ursprungs.

[0095] Beispiele für Säugetier-Expressionsvektoren für Säugetierzellen umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein: pcDNA (Invitrogen), pFLAG (Sigma) und andere. Wenn Vektoren in Säugetierzellen verwendet werden, sind die Kontrollelemente in den meisten Fällen viralen Ursprungs, beispielsweise: Adenovirus 2, Cytomegalovirus, ein Simian Virus 40.

[0096] Die Erfindung umfasst auch Wirtszellen und Organismen, die (transiente oder stabile) Nukleinsäure gemäß der Erfindung umfassen, welche für das Fusionsprotein gemäß der Erfindung codiert. Geeignete Wirtszellen sind in der Fachwelt auf dem Stand der Technik bekannt und umfassen bakterielle und eukaryotische Zellen. Es ist bekannt, dass das Protein in Säugetierzellen folgender Organismen exprimiert werden kann: Mensch, Nagetiere, Rinder, Schweine, Geflügel, Kaninchen und dergleichen. Die Wirtszellen können kultivierte primäre Zelllinien oder immortalisierte Zelllinien sein.

[0097] Der Transfer von Vektoren in Wirtszellen hinein wird anhand konventioneller Methoden durchgeführt, die in der Fachwelt auf dem Stand der Technik bekannt sind, und die Methoden beziehen sich auf Transformation und Transfektion, einschließlich folgender: chemische Übertragung, Elektroporation, Mikroinjektion, DNA-Lipofektion, Zellbeschallung, Teilchenbeschuss, viraler DNA-Transfer und mehr. Im Kontext der Erfindung erfolgt die Einführung der DNA durch Elektroporation und viralen Transfer in die Zellen von Wirbeltieren oder Wirbeltier-Zelllinien.

[0098] Der DNA-Transfer kann transient oder stabil erfolgen. Die transiente Exprimierung betrifft die Einführung der Vektor-DNA, die gemäß der Erfindung nicht im Genom der Zellen integriert ist. Eine stabile Aufnahme wird erreicht durch den Einbau der DNA der Erfindung in das Wirts-Genom. Der Transfer der DNA gemäß der Erfindung, vornehmlich für die Zubereitung des Wirtsorganismus, dem eine stabile DNA integriert ist, kann gemäß der Erfindung durch die Anwesenheit von Markern kontrolliert werden. DNA, die für Marker codiert, bezieht sich auf die Medikamentenresistenz, beispielsweise gegen Antibiotika, und kann in den Vektor mit der DNA gemäß der Erfindung oder auf einem separaten Vektor aufgenommen werden.

VAKZINFORMULIERUNG UND EINFÜHRUNG/IMMUNISIERUNG

[0099] Vakzine, die in der Erfindung präsentiert werden, enthalten eine oder mehr DNA-/ Fusionsproteine, die in Target-Zellen des Wirtsorganismus das oben beschriebene aktive Fusi onsprotein ausdrücken, bestehend aus (a) dem N-und C- terminalen Teil des Flagellins, (b) dem mittleren Segment des Flagellins, (c) Antigen, (d) Linker-Peptiden und den korrespondierenden (e) Signalisierungssequenzen.

[00100] Die Erfindung, d. h. die Vakzine gemäß der Erfindung, kann zum Zwecke der Prävention oder Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, wobei durch die induzierte Synthese von Antikörpern Mikroben Infektionen verhindert/behandelt werden können, vorzugsweise durch Bakterien, die Flagellin enthalten, das schwach TLR5 induziert, vorzugsweise durch Bakterien, die Flagellin enthalten, das TLR5 nicht induziert, vorzugsweise die Bakterien H. pylori.

[00101] Der Ausdruck "Behandlung" bezieht sich auf den medizinischen Zustand eines Individuums, der sich mit Bezug auf einen der klinischen Indikatoren verbessert oder zumindest teilweise verbessert hat. Der Ausdruck bezeichnet auch den verzögerten Fortschritt der Krankheit oder der Dysfunktion. Der Ausdruck umfasst auch die Prävention einer Infektion oder die Prävention des Eintretens eines schlechten Gesundheitszustands, bezieht sich aber nicht auf eine vollständige Verhinderung der Krankheit, sondern vielmehr auf ein verlangsamtes Fortschreiten des schlechten Gesundheitszustands eines Individuums. Das Verfahren einer "Behandlung der gesundheitlichen Störung" umfasst therapeutische Behandlungsmethoden und die Prävention der Krankheit.

[00102] Der Ausdruck "Vakzination (lmpfung)/lmmunisierung" ist in einschlägigen Fachkreisen gut bekannt. Der Ausdruck beschreibt ein Verfahren zur Steigerung der Immunantwort des Organismus auf ein Antigen, die zu einer Resistenz und zu einer Überwindung der Infektion und der Inzidenz der Krankheit führt.

[00103] Der Ausdruck "aktive Immunität" bezieht sich auf die Antwort des Wirtsorganismus nach einem Zusammentreffen mit einem Immunogen. Er umfasst die Differenzierung und Verbreitung immunkompetenter Zellen und führt zur Synthese von Antikörpern oder zur Entwicklung einer Zell-vermittelten Reaktivität. Aktive Immunität kann durch Exponierung des Wirts an Immunogenen initiiert werden, etwa Infektion oder Vakzine.

[00104] Der Ausdruck "protektive Immunantwort" betrifft die Immunantwort im Wirtsorganismus, die eine Schutzfunktion für den Wirt erfüllt.

[00105] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die medizinische und veterinäre Anwendung von Vakzinen gemäß der Erfindung. Individuen, die am Prozess der Immunisierung gemäß der Erfindung beteiligt sind, sind Geflügel und Säugetiere, einschließlich, ohne auf diese beschränkt zu sein: Menschen, Primaten, Hunde, Katzen, Kaninchen, Einhufer, Schweine und andere. Die Subjekte können durch Anheben der protektiven Immunität behandelt oder für die Produktion von Antikörpern (Ausnahme Mensch) benutzt werden, die anschließend isoliert und für Diag-nostika oder die Verabreichung an andere Subjekte zur Auslösung passiver Immunität verwendet werden können.

[00106] Insbesondere betrifft die Erfindung die Vakzination von Subjekten mit dem Vakzin, welches die DNA/das Fusionsprotein gemäß der Erfindung enthält, für die Behandlung und Prävention von Infektionskrankheiten, die von Mikroorganismen verursacht werden, vornehmlich von pathogenen Mikroorganismen wie Bakterien.

[00107] Die Erfindung betrifft ein Vakzin, das das Fusionsprotein/die DNA gemäß der Erfindung enthält, um die Antwort gegen die Bakterien zu stimulieren, deren Flagellin die Signalisierung durch den TLR5 Rezeptor nicht aktiviert. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Vakzin zur Stimulation der Immunantwort gegen Alpha- und Epsilonproteobakterien, wie Helicobacter sp, Campylobacter sp., Bartonella bacilliformis, Rhizobium meliloti, Rhizobium sp., Wolnella sp., Brucella sp. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Vakzin, das die DNA oder das Fusionsprotein gemäß der Erfindung zum Schutz oder zur Behandlung von Infektionen mit dem Bakterium H. pylori enthält.

[00108] Nach der Immunisierung mit einem Vakzin, das das Flagellin enthält, im Körper von Menschen und Tieren beginnen sich Antikörper gegen das Flagellin zu bilden. Diese Antikörper können sich bei der Re-Immunisierung an antigenische Determinanten des Flagellins binden und so eine Re-Aktivierung des TLR5 verhindern (Saha et al., 2007, J. Immunol. 179, 1147-1154; Nempont et al., 2008, J. Immunol. 181,2036-2043). Dies ist ein Nachteil des beschriebenen Immunisierungsverfahrens mit identischem Vakzin, das Flagellin als Adjuvans enthält. In diesem Fall ist die nächste Antwort auf das Vakzin weniger wirksam. Auch nach der Infektion mit dem Bakterium, dessen Flagellin als Adjuvans verwendet wurde, ist die Antwort schwächer als nach der Infektion mit einem Bakterium, dessen Flagellin nicht für die Immunisierung verwendet worden ist.

[00109] Die Erfinder haben entdeckt, dass eine Verwendung des Vakzinationsprotokolls, wo die erste Immunisierung das Vakzin repräsentiert, das zusätzlich zu dem gewählten Antigen eine Fusion mit Flagellin für die TLR5 Aktivierung enthält, sehr effizient ist. Für eine weitere Stimulation der Immunantwort wird das Vakzin verwendet, das dasselbe Antigen wie bei der vorherigen Immunisierung enthält, aber mit einem unterschiedlichen Flagellin verknüpft ist. Dies stimuliert ebenfalls TLR5, allerdings neutralisieren die Antikörper, die von der vorherigen Stimulation kommen, nicht das Flagellin. Dieses andere Flagellin oder sein Segment, welches TLR5 aktiviert, wird aus flagellierten Bakterien ausgewählt, welche TLR5 stimulieren, oder wird mittels Mutationen präpariert.

[00110] Die Erfindung betrifft Vakzine, die in wiederholten Immunisierungen verwendet werden und das Fusionsprotein gemäß der Erfindung enthalten. Für jede Vakzination wird das Fusionsprotein, das sich von vorhergehenden Fusionsproteinen im N-und C-terminalen Teil des Flagellins unterscheidet, verwendet. Aus der vorhandenen Literatur geht hervor, dass die Vakzination mit dem Fusionsprotein oder der DNA, die das Fusionsprotein exprimiert, welches Flagellin zur Induzierung des Rezeptors TLR5 enthält, ebenfalls zur Synthese von Antikörpern gegen den N-und C-terminalen Teil führt. Somit binden sich die gewonnenen Antikörper an das Fusi-ons-Flagellin und hemmen die Induzierung von TLR5 in der darauffolgenden Vakzination und in weiteren Vakzinationen. Auf diese Weise fällt die Wirkung weiterer Vakzinationen schwächer als gewünscht aus. Wie die Erfinder festgestellt haben, löst die Anwendung von Vakzinen mit demselben mittleren Segment und Antigenen, aber mit veränderten N- und C-terminalen Segmenten des Flagellins in darauffolgenden Immunisierungen eine bessere Immunantwort hinsichtlich der oben beschriebenen Situation aus, da die Flagelline noch immer eine Immunantwort im Wirt induzieren können.

[00111] Zur Illustration kann die Vakzination mit mehreren Anwendungen mittels eines Vakzins durchgeführt werden, das das Fusionsprotein von (a) dem N- und C- terminalen Teil des E. coli-Flagellins und (b) dem mittleren Segment von H. pylori- Flagellin enthält, gefolgt von der Vakzination, die die Verwendung eines Vakzins einschließt, das das Fusionsprotein von (a) dem N-und C-terminalen Teil des Salmonella-sp-Flagellins und (b) dem mittleren Segment des H. pylori-Flagellins enthält, und die anschließende Vakzination umfasst die Verwendung eines Vakzins, das das Fusionsprotein von (a) dem N-und C-terminalen Teil des Seratie-Flagellins und (b) dem mittleren Segment des H. pylori-Flagellins enthält, zum Schutz/zur Behandlung des Subjekts (Person oder Tier) vor der Infektion mit dem Bakterium Helicobacter pylori.

[00112] Die Erfindung betrifft auch DNA, die für das Fusionsprotein gemäß der Erfindung codiert, und die DNA wird zur Zubereitung von Vakzinen für die Einführung von DNA in Zellen von Menschen oder Tieren zur Förderung der Immunantwort auf das Fusionsprotein, Antigen oder den ausgewählten Mikroorganismus gemäß der Erfindung verwendet.

[00113] Die Erfindung betrifft auch das Verfahren der Immunantwort-Induzierung mit dem verabreichten Vakzin, das die DNA enthält, mittels Inhalation, oral, intravenös, transdermal, parenteral, subkutan, intradermal, intrapleural, intrazerebral, intraarteriell oder durch direkte Injektion in das Organ oder Gewebe. Vorzugsweise betrifft die Erfindung die Verabreichung von DNA-Vakzinen über die Schleimhaut der Nase, des Mundes, des Halses, des Ösophagus, des Darms, des Auges und der Urogenitalschleimhaut.

[00114] Die Erfindung betrifft die Vakzination mit toten oder abgeschwächten Mikroorganismen, die das Fusionsprotein auf ihrer Oberfläche exprimieren. Diese Mikroorganismen sind selbst nicht schädlich für den Körper und sind vorzugsweise Bakterien, Hefen, vorzugsweise ausgewählt aus: E. coli, Lactobacillus sp., Saccharomyces cerevisiae und anderen.

[00115] Als nächstes werden ausführbare Beispiele gezeigt, die der Illustration der Erfindung dienen. Die Beschreibung ausführbarer Beispiele ist nicht geeignet, die Erfindung einzuschränken, sondern als Demonstration der Funktion der Erfindung zu verstehen.

AUSFÜHRBARE BEISPIELE

Beispiel 1: Zubereitung von DNA-Konstrukten [00116] Für alle Arbeiten haben wir sterile Arbeitstechniken benutzt, die bei Wissenschaftlern in diesem Gebiet allgemein bekannt sind. Alle Plasmide, Endkonstrukte und Teilkonstrukte wurden mittels chemischer Transformation in das Bakterium E. coli DH5a transformiert. Plasmide für die Transfektion der Zelllinien HEK293, HEK293T oder Caco-2-Zellen wurden mittels eines Isolations-Kits UltraMobius 200 (Novagen) isoliert, mit dem Endotoxine entfernt werden.

[00117] Die Endkonstrukte sind in Tabelle 1 ausgewiesen und wurden mit Techniken und Verfahren zubereitet, die in der Wissenschaft gut bekannt sind. Die Eignung der Nukleotid-Sequenz wurde durch Sequenzierung und Restriktionsanalyse festgestellt.

[00118] Tabelle 1: Fusionsproteine, die zur Demonstration der Erfindung verwendet wurden

Nr. Name Konstrukt-Zusammensetzung Rest des

Plasmids Ί ÜreB T7p-HPUreB-Histag-HISt pSB1.AK3 2 HimFla- T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-HPUreB-RGD-Histag- pSB1.AK3

UreB HISt

3 HimFla- T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-Multiepitop-RGD- pET multi Histag-T7t 4 HimFla T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-RGD-Histag-HISt pSB1.AK3

5 HimFla T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-RGD-Histag-T7t pET 6 HimFla- T7p-EcNfliC HpVfla213-Multiepitop-215HpVfla EcCfliC- pSB1.AK3 multi HISt

7 HimFla- T7p-EcNfliC HpVfla213-Multiepitop-215HpVfla EcCfliC-T7t pET multi

8 FliC T7p-EcfliC-T7t pET 9 HimFla- TetRRBSp-EcNfliC HpVfla213-ureB-215HpVfla EcCfliC- pSB1.AK3 ureB HISt 10 HimFla- TetRRBSp-EcNfliC HpVfla213-Multiepitop- 215HpVfla pSB1.AK3 multi EcCfliC- HISt 12 HimFla- T7P-EcNfliC HpVfla213-ureB-215HpVfla EcCfliC-HISt pSB1.AK3

ureB 13 UreB CMVp-sshCD4-HPUreB-Histag-BGHt pSB1.AK3 14 ssHimFla- CMVp-sshCD4-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-HPUreB- pSB1.AK3

UreB RGD-HiStag-BGHt 15 HimFla CMVp-sshCD4-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-RGD-Histag- pSB1.AK3 BGHt 16 ssHimFla- CMVp-sshCD4-EcNfliCHpVfla213-Multiepitop-215HpVfla pSB1.AK3 multi EcCfliC-RGD-Histag- BGHt 17 HimFla- CMVp-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-HPUreB-RGD- pSB1.AK3

UreB Histag-BGHt 18 HimFla- CMVp-EcNfliCHpVfla213-Multiepitop- pSB1.AK3 multi_215HpVflaEcCfliC-RGD-Histaa-BGHt_ [00119] Tabelle 2: Legende von Genen, Funktion und Zahl aus der Datenbank und Aminosäu-re/Nukleotid-Sequenz, die die Grenzen der benutzten Genteile darstellen

Gen- SwissProt Nr.: Aminosäure/Nukleotid Funktion

Bezeich- Sequenz nung_

EcCfliC P04949 AK:401 -498 (SEQ ID E. coli C-terminaler Teil des NO: 2, 3) Flagellins

EcNfliC- P04949- AK:1-176 (SEQ ID NO: 4, 176 N-terminaler Teil des E.coli-

HpVfla21 P0A0S2 5)-AK: 178-213 Flagellins, variabler Teil des H.-

3 pylori-Flagellins zu 213 AA

EcfliC P04949 AK: 1-498 (SEQ ID E. coli Flagellin NO: 6, 7)

EcNfliC P04949 AK: 1-176 (SEQ ID E. coli N-terminaler Teil des NO: 8, 9) Flagellins 215HpVfl a- P0A0S2- AK: 215-418 (SEQ ID NO: Variabler Teil des H.-pylori-

EcCfliC P04949 10, 11)-AK: 401498 Flagellins zu 215 AA mit 99 C- terminalem Teil des E.coli-Flagellins HPUreB H.-pylori-Urease B Antigen (B-

Subeinheit der H.- pylori-Urease) HISt SEQ ID NO: 13 http://partsregistry.org/ Terminator wiki/index.php?title=T e il:BBa_K133044

Hi staq HHHHHH@ Marker

HpVfla P0A0S2 AK: 178- 418 Das mittlere Segment des Fla gellins, variable Region des H. pylori

Multiepit SEQ ID NO: 14, Antigen; Fusionsprotein, kon- op 15,16 struiert aus Epitopen: ureB,

VacA, HpaA H. pylori RGD SEQ ID NO: 17 RGD Peptidmotiv zur Bindung an

Integrine T7P SEQ ID NO: 18 Promoter T7t SEQ ID NO: 19 Terminator ureB/UB SEQ ID NO: 14 ureB-Epitop des H. pylori 33 BGHt SEQ ID NO: 21 Terminator CMVp http://partsregistry.org/ Promoter wiki/index.php?title=T e il:BBa 1712004 sshCD4 P01730 AK 1-25 Signalsequenz

TetRRBS SEQ ID NO: 20 Unterdrückbarer TetR- p Promoter mit einer ribosomalen _Bindungsstelle_

Beispiel 2: Protein-Immundetektion [00120] Die Verfahren der SDS-PAGE Gel-Zubereitung, des Transfers von Proteinen von Gel auf Membran und der Analyse von Western-Blot-Proteinen sind in der Fachwelt gut bekannt und werden hier nur illustrativ beschrieben. 4x reduzierender Sample-Puffer mit SDS wurde den Samples hinzugefügt (Überstände oder partiell gereinigte Proteine), die mit Erhitzen über 5 Min. bei 100°C denaturiert wurden. Dann wurden die Samples auf das Gel appliziert. Als Proteingrößenstandard wurde SeeBluePlus (Fermentas) verwendet. Für die Elektrophorese benutzten wir ein System mit vertikalem Mini-Protean II und 10% Polyacrylamid-Gel. Die Elektrophorese wurde in 1x SDS Elektrophorese-Puffer durchgeführt und dauerte 45-60 Min. bei einer konstanten Spannung von 200 V. Nach Beendigung der Elektrophorese entfernten wir das Eingangsgel, und das Trennungsgel wurde in Western-Transfer benutzt. PAGE-Gel, Filterpapiere und Nitrocellulose-Membranen wurden für die Nassübertragung in Puffer eingeweicht. Wir haben die Nassübertragungsvorrichtung zusammengesetzt. Die Übertragung dauerte eine Stunde bei einem konstanten Strom von 350 mA. Nichtspezifische Bindungsstellen auf der Membran wurden mit 0,2% I-Block-Reagens in 1x PBS/0,1% Tween-20 blockiert. Die Blockierung wurde 1,5 Stunden bei Rühren auf Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C und leichtem Schütteln gehalten. Die Nitrocellulose-Membran wurde in Blockierlösung (0,2% l-Block-Reagens/1x PBS/0,1% Tween-20) mit Maus Anti-His primären, monoklonalen Antikörpern (Qiagen) inkubiert, in einem Verhältnis von 1:2000 verdünnt und 1,5 Stunden bei Raumtemperatur und leichtem Schütteln oder über Nacht bei 4°C und leichtem Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Membran mit Waschpuffer gewaschen (4x5 Min.) (1x PBS/0,1% Tween-20). Dann wurde die Membran 45 Minuten bei Raumtemperatur und leichtem Schütteln in einer Blockierlösung mit sekundären Ziegen-Antimaus-Antikörpern inkubiert, mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert und in einem Verhältnis von 1:3000 verdünnt. Nach dem Waschen der Membran mit Waschpuffer (3 Mal 5 Min.) wurden die Membranen 5 Minuten in Super Signal West Pico Che-milumineszenz-Reagens inkubiert. Das Substrat enthält Luminol, das mit Rettich-Peroxidase auf sekundärem Antikörper oxidiert wird. Das oxidierte Luminol geht in den Erregungszustand über, und beim Übergang in den Grundzustand wird Licht abgegeben, das vom Film erfasst wird.

Beispiel 3 - Zubereitung von Antigen für die ELISA-Analyse [00121] Als Antigene für den ELISA-Test verwendeten wir die Fusionsproteine UreB, HimFla-UreB und multi-HimFla (Proteine Nr. 1,2 und 3, Tabelle 3) und bakterielle Zell-Lysate des H. pylori. Die Fusionsprotein-Antigene wurden in E. coli BL21 (DE3) pLysS exprimiert. Die Kolbenkultur wurde bei 37°C auf eine geeignete Dichte (OD (600) 0,4-0,5) inkubiert, dann senkten wir die Inkubationstemperatur auf 25°C. IPTG wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 mm hinzugefügt, wenn die Zelldichte einen Wert von OD (600) 0,8-1,0 erreichte, und die Kultur wurde über Nacht bei 25°C mit 180 Upm inkubiert. Die Zellen wurden mittels 10-minütiger Zentrifugierung bei 5000 Upm gesammelt. Das Pellet bakterieller Zellen wurde in Zell-Lysepuffer (0,1% Natriumdesoxycholat, 10 mM Tris/HCI, pH = 8,0) mit Proteasehemmern resuspendiert. Die lysierten Zellen wurden beschallt. Das homogene Gemisch wurde 30 Min. bei 12.000 Upm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand, der sich an der Stelle des Proteins befindet, wurde unter nativen Bedingungen an eine Ni-NTA-Säule gebunden. Vor der Bindung wurde die Säule mit Puffer für native Bindung (50 mM Tris/HCI, pH = 8,0) konditioniert, zu dem wir 100 mM NaCI hinzufügten. Die Bindung des Proteins wurde über Nacht bei 4°C mit Schütteln durchgeführt. Verunreinigungen wurden von der Säule mit 5 Säulenfüllvolumen mit Puffer für native Bindung (50 mM Tris/HCI, pH = 8,0), 100 mM NaCI) gewaschen. Nichtspezifisch gebundene Proteine wurden von der Säule mit einem Puffer für native Bindung gewaschen, dem wir Imidazol bis zu einer Konzentration von 20 mM hinzufügten. Die Protein-Eluierung wurde mit Puffer für native Bindung mit hinzugefügtem Imidazol bis zu einer 250-mM- Konzentration durchgeführt. Die Anwesenheit unseres Proteins in Fraktionen mit der höchsten Absorbanz wurde durch SDS-PAGE und Western-Analyse mit primären Antikörpern spezifisch für His-tag geprüft.

[00122] ELISA - Beschichtung mit Antigen, Detektion des Serum IgG. Antigene, so wie oben isoliert, wurden in 50 mM Na2C03 Puffer pH = 9,6 und bis zu einer Konzentration von 10 pg/ml verdünnt. In jedes Loch wurden 50 pl verdünntes Antigen (d. h. rekombinantes Fusionsprotein) eingebracht und über Nacht bei 4°C inkubiert. Für den ELISA-Test, für den ein Lysat von H. pylori als Antigen verwendet wurde, fügten wir 50 μΙ Zell-Lysate in jedem Loch in 50 mM Na2C03, zubereitet aus 5x 107 bakteriellen Zellen, lysiert in einem Wärmebehandlungsprozess, hinzu. Platten mit gebundenem Antigen wurden 3x mit PBS-T (PBS/0,05% Tween-20) gewaschen, 1,5 Stunden in 3% BSA / PBS-T bei 37°C blockiert und dann 3x mit PBS-T neu gewaschen.

[00123] Wir haben dann unterschiedliche Serumverdünnungen gebunden, in Blockier- Puffer (3% BSA/PBS-T) (50 pL/Loch) gelöst und 1,5 h lang bei 37°C inkubiert. Erneut haben wir 3x mit PBS-T gewaschen. Dann applizierten wir sekundäres Anti-Ziegen Maus IgG, markiert mit Meerrettich-Peroxidase, verdünnten mit Blockierungspuffer im Verhältnis 1: 3000 (50 pL/Loch) und inkubiert 1,5 h lang bei 37°C. Dem folgte 3x Waschen mit PBS-T. Schließlich fügten wir 100 pl_ bereits präparierter ABTS (Sigma) zur Detektion des Peroxidase-Substrats hinzu - 0,5 mg in pl_. Die Reaktion wurde nach 20 Min. durch Zugabe eines gleichen Volumens von 1% SDS (100 μΙ_) angehalten. Unmittelbar nach Beendigung der Reaktion haben wir A420 mit einem mikrooptischen Lesegerät (Mithras) gemessen.

Beispiel 4 - Der Mausstamm und Unterbringungsbedingungen [00124] Für das Tierexperiment wählten wir den Mausstamm C57BL/6J, erworben im Zuchtzentrum der medizinischen Fakultät der Universität Ljubljana. Der Stamm C57BL/6J wurde gewählt, weil er zu den am stärksten standardisierten und meistuntersuchten Mausstämmen gehört (Genom, Physiologie) und für ihn nachgewiesen ist, dass er eine gute Antwort auf die Infektion mit H. pylori gibt und eine bessere Kolonisierung und histologische Veränderungen im Magen bringt als andere Standardstämme von Mäusen. Der Flauptgrund für die Wahl dieses Stammes besteht aber in der Tatsache, dass gezeigt wurde, dass dieser Stamm auf die Infektion mit H. pylori hauptsächlich mit einer Th1 Antwort reagiert, die jener in Menschen vergleichbar ist, die mit H. pylori infiziert sind. Deshalb ist dieser Stamm ein geeignetes Modell für solche Studien und für die Extrapolation der Ergebnisse auf Menschen. Damit erfüllen wir die Grundsätze der "3R" in Experimenten mit Tieren - das Prinzip "Reduzieren" mit kluger Auswahl geeigneter Spezies und Stamm, das mit der die kleinstmögliche Anzahl von Versuchstieren statistisch gültige Ergebnisse ermöglicht; das Prinzip "Ersetzen" (replace) durch den Experimentplan, der auf früheren In-vitro-Tests basiert, um die Anzahl von Testprodukten zu verringern, die potenziell unwirksam sind, und das Prinzip "Verfeinern" (refine), anhand dessen wir kleine Mengen Blut während der Experimentperiode vom selben Tier nehmen, um die Anzahl der Tiere zu verringern.

[00125] Die Tiere wurden im Alter von 8-10 Wochen im Institut für Mikrobiologie, Medizinische Fakultät der Universität Ljubljana, untergebracht. Nach der Markierung einzelner Tiere wurden sie 2 Wochen in Quarantäne untergebracht. Während des Experiments wurden die Tiere regelmäßig geprüft und gewogen, so dass das Tier im Fall eines Körpergewichtsverlusts von 15% im Vergleich zum Gewicht am Anfang des Experiments aus dem Experiment ausgeschlossen wurde. In der Versuchsperiode erhielten die Mäuse ein normales Nagetiersubsistenzfutter Altromin 1324 (Lage, Deutschland). Während des Experiments erhielten die Tiere Futter auf Verlangen, ausgenommen an den Tagen orogastrischer Anwendungen, als die Tiere über Nacht ohne Futter blieben, so dass die Anwendung auf leerem Magen durchgeführt wurde. Die Tiere hatten während des Experiments permanent Zugang zu Wasser. Innerhalb jeder Gruppe (Behandlung) wurden jeweils 5 Tiere im selben Käfig untergebracht.

FUSIONSPROTEINE

Beispiel 5 - Die Produktion von Fusionsproteinen [00126] Bakterielle Transformation und Selektion. Die Produktion der Fusionsproteine wurde in einem normalen bakteriellen Stamm durchgeführt, der für die Protein- Produktion optimiert war. Die Transformation des BL21 (DE3 pLysS) Stamms von E. coli wurde in Anlehnung an ein bei Fachleuten bekanntes Protokoll durchgeführt. Kompetente bakterielle Zellen wurden mittels eines chemischen Verfahrens transformiert, und positive Klone wurden auf LB Agarplatten mit hinzugefügtem Ampicillin isoliert. Die einzelnen Bakterienkolonien wurden isoliert und auf die Anwesenheit des Plasmids untersucht, das für das Fusionsprotein codiert. Kolonien, die das Plasmid enthielten, wurden dann für die Produktion von Proteinen in größeren Mengen verwendet.

[00127] Die Produktion von Fusionsproteinen. Ausgewählte Kolonien wurden in 100 ml flüssigem LB-Medium, das Ampicillin enthält, inokuliert und über Nacht bei 37°C und 180 Upm inku- biert. Die Übernacht-Kultur wurde dann verdünnt bis OD6oo von annähernd 0,15 und ferner gemäß dem oben in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren bearbeitet.

[00128] Die Reinigung der Fusionsproteine. Verfahren zur Proteinreinigung sind bei einschlägig bewanderten Fachleuten gut bekannt und nicht Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Hier beschreiben wir nur ein mögliches Protokoll für die Proteinreinigung. Bakterielle Zellen wurden gesammelt, gewaschen und mit 30 ml Zelllyse-Puffer (0,1% Natriumdioxycholat, 10 mM Tris/HCI pH 8,0) mit hinzugefügten Proteasehemmern (Sigma) lysiert. Die lysierten Zellen wurden zusätzlich ultrabeschallt, und eine anschließende Zentrifugierung wurde durchgeführt, um restliche Zelltrümmer vom Überstand zu entfernen. Das Fusionsprotein, das im Überstand vorhanden war, wurde an die Ni-NTA-Säule gebunden, die vorher mit einer nicht-denaturierenden Pufferlösung konditioniert wurde (50 mM Tris/HCI pH 8,0/100 mM NaCI). Nach dem Waschen mit mehreren Säulenvolumina von Waschpufferlösung (50 mM Tris/HCI pH 8,0/100 mM NaCI, 20 mM Imidazol) wurden His-etikettierte Proteine von der Säule mit einem Eluierungspuffer (50 mM Tris/HCI pH 8,0/100 mM NaCI, 250 mM Imidazol) eluiert.

[00129] Tabelle 3: Liste der Plasmid-DNA-Konstrukte, die für die Zubereitung der Fusionsproteine verwendet wurden. Die Bedeutung der einzelnen Fragmente ist in Beispiel 1 erklärt.

Nr. Name Zusammensetzung des Konstrukts Ί ÜreB T7p-HPUreB-Histagtag-HISt 2 HimFla-UreB T7p-EcNfla-HpVfla-EcCfla-HPUreB-RGD-Histag-HISt 3 HimFla-multi T7p-EcNfla-HpVfla-EcCfla-Multiepitop-RGD-Histag-T7t 5 HimFla_T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-RGD-Histag-T7t_ [00130] Die Fusionsproteine aus Tabelle 3 wurden unter Verwendung eines nicht- denaturierenden Puffers mit 50 mM Imidazol (Nr. 1 und 2) und 250 mM Imidazol (Nr. 3) eluiert. Die Proteine wurden mit Hilfe von SDS-PAGE und einer Western-Blot- Technik (Figur 1) festgestellt. Die gesammelten Fraktionen wurden gegen eine Dialyse-Pufferlösung (1x PBS/1 mM EDTA) 4 Stunden lang dialysiert, gefolgt von einer Übernacht-Dialyse gegen 1x PBS Puffer; das Puffervolumen wurde so gewählt, dass die abschließende Imidazolkonzentration in der Proteinfraktion unter 0,05 mM betrug. Den dialysierten Proteinfraktionen wurden vor der Maus-Immunisierung Imject Alumn (Pierce) im Verhältnis 1:2 zugegeben.

[00131] Größere Mengen an Fusionsproteinen, die von Bakterien gewonnen wurden, welche mit Plasmid-DNA-Konstrukten transformiert wurden (Tabelle 3), wurden zum Zweck der Maus-Immunisierung präpariert. Die Proteine wurden mit Western-Blot-Analyse erfasst und identifiziert (vgl. Beispiel 2), wie in Figur 2 dargestellt.

Beispiel 6 - Die Internalisierung der Fusionsproteine in die Zelllinie [00132] Die Internalisierung der Fusionsproteine in die Zelllinien wurde anhand konfokaler Mikroskopie demonstriert. Die Techniken und Arbeitsmethoden mit dem Konfokalmikroskop, Fixierung und Färbung der Zell-Proteine mit Antikörpern für die Proteindarstellung und die Verwendung von Farbstoffen für die Markierung der Organellen sind bei Fachleuten allgemein bekannt und werden hier nur zur Demonstration der vorliegenden Erfindung beschrieben.

[00133] Der Zweck des Experiments bestand darin, festzustellen, ob die Internalisierung der Fusionsproteine in die Zelle von der Anwesenheit des TLR5 Rezeptors abhängig ist. Die Fusionsproteine wurden mit dem aktivierten fluoreszierenden Farbstoff Alexa555 nach Herstellervorgaben (MolecularProbes) gefärbt. Alexa555-gefärbte Fusionsproteine bekannter Konzentrationen (vgl. Ergebnisse) wurden den HEK293-Zelllinien hinzugefügt.

[00134] Kommerzielle Marker für die zelluläre Organell-Visualisierung wurden nach den Herstellerangaben verwendet: ER-Tracker-Farbstoff (MolecularProbes) für endoplasmatisches Retikulum, Lyso-Tracker-Farbstoff (MolecularProbes) für Endosome und Lysosome und Alexa633 (MolecularProbes) für Transferrin.

[00135] Lebend gefärbte Zellen oder fixierte Zellen wurden mit Leica TCS SP5 Konfokalmikro- skop auf einem Leica DMI 6000 CS Ständer untersucht. Das Leica TCS SP5 Konfokalmikro-skop ist für das Laser-Scanning fluoreszierend markierter lebender oder fixierter Zellen ausgelegt. Für diesen Zweck wurde ein 63x Ölimmersionsobjektiv benutzt. Die Bilder wurden mit dem Leica Microsystems Programm LAS AF 1.8.0. angefertigt. Die Verwendung von Lasern erfolgte im Einklang mit den gewünschten Wellenlängen des Anregungsstrahls.

[00136] In Figur 3 sind die Ergebnisse der Internalisierung der Alexa555-markierten Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung dargestellt. Alexa555-markierte Proteine sind wie folgt dargestellt: [A, B] Alexa555 Farbstoff (MolecularProbe), deaktiviert in Tris-Pufferlösung, pH 8,5 [C] Internalisierung des Alexa555-markierten Proteins HimMulti (0,125 pg/μΙ) [D] Weitere gefärbte Zellen (in [C ]) mit LysoTrackerGreen (MolecularProbes) (50 mM) [E] Internalisierung des Alexa555-markierten Proteins HimMulti (0,125 pg/μΙ) [F] Weitere gefärbte Zellen (in [E]) mit SynaptoRed [G] Internalisierung des Salmonella FliC Proteins, markiert mit Alexa555 (0,1 pg/μΙ) [H] Zellen (in [G]) weiter gefärbt mit Transferrin633 (MolecularProbes) (0,1 pg/μΙ). Die Proteine wurden in 200 μΙ PBS Pufferlösung (25 μg) gelöst und zu den Zellen hinzugefügt. Die Zellen mit hinzugefügtem Protein wurden 1 Stunde bei 37°C inkubiert.

Beispiel 7 - TLR5-Rezeptor-Aktivierung in Zelllinien mit hinzugefügten Fusionsproteinen [00137] Züchten der Zelllinien und Transfektion. Für die Aufzucht der Zellen und deren Trans-fektion benutzten die Erfinder Verfahren und Techniken, die bei einschlägig bewanderten Fachleuten allgemein bekannt sind.

[00138] Die Zellkulturen wurden bei 37°C und einem 5% C02 Gehalt in DMEM/10% FBS Medium kultiviert, worin sämtliche erforderliche Nährstoffe und Wachstumsfaktoren enthalten sind. Nachdem eine ausreichende Zelldichte erreicht war, wurden die Zellen verdünnt oder in ein frisches Medium übertragen. Wenn sie für die experimentelle Nutzung vorgesehen waren, wurden die Zellen zunächst mit dem Hämocytometer gezählt, und dann wurde die angemessene Anzahl von Zellen in 96 Well-Platten übertragen, die zur Züchtung von Zellkulturen geeignet sind. Die inokulierten Platten wurden bei 37°C und 5% C02 inkubiert, bis die Zellen die entsprechende Zeilenzahl für die Transfektion erreicht haben. Für die Transfektion der Zellen wurden Transfektions-Reagenzien verwendet (GeneJuice, JetPei oder Lipofectamin). Die Transfektion wurde gemäß Herstellerangaben durchgeführt, allerdings modifiziert für die Transfektion in 96 Well-Platten. Am Tag vor der Transfektion wurden die Zellen in die entsprechend Mikrotiterplatte inokuliert und auf eine angemessene Dichte herangezüchtet. Am Tag der Transfektion wurde eine angemessene Menge Plasmid-DNA bzw. Transfektionsreagens in DMEM-Medium ohne FBS verdünnt. Die zwei Verdünnungen wurden sodann gemischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um Transfektionskomplexe auszubilden. Das Transfektionsgemisch wurde den Zellen hinzugefügt, und die Zellen wurden weiter über mindestens sechzehn Stunden inkubiert.

[00139] Luciferase-Aktivität. Ein Dual-Luciferase-Reportersystem wurde zum Messen der Luci-ferase-Aktivität verwendet: (a) die Glühwürmchen-Luciferase (Fluc) und (b) die Renilla-Luciferase (Rluc). Die Glühwürmchen-Luciferase (Flue), die CoA, ATP und Luciferin als Substrat benutzt, ist funktional verknüpft mit dem Promoter, der die Aktivierung des NFkB Transkriptionsfaktors erfasst. Die Aktivierung des angeborenen Immunsystems über TLR-Rezeptoren und MyD88-abhängige Bahnen führt zur Aktivierung von NFkB, das durch Messen der Aktivität der Glühwürmchen-Luciferase festgestellt werden kann. Ein weiterer Reporter, der gleichzeitig zusammen mit dem Plasmid pFluc und Plasmiden, welche für die untersuchten Fusionsproteine codieren, in die Zellen transfiziert wird, dient als ein Reporter für die Transfektionseffizienz. Das Reporterplasmid codiert für Renillia-Luciferase (Rluc), für die Coelenterazin ein geeignetes Substrat sein kann. Die Rluc-Exprimierung in Zellen ist von den Bedingungen unabhängig.

[00140] Für den Zweck der Reporterproteinexprimierungsanalyse wurden Zellen mit Zelllysepufferlösung gemäß Herstellerangaben (Promega) lysiert. Die Aktivität der Glühwürmchen-Luciferase wurde zuerst gemessen (Fluc-IFNB-FLUC), und die Aktivität der Renilla-Luciferase als zweites (Rluc - http://www.promega.comA/ektoren/prltk.txt). Die Rluc-Aktivität berichtet deshalb von dem Anteil der transfizierten Zellen, während die Fluc-Aktivität die Aktivierung der angeborenen Immunität zeigt. Das Verhältnis Fluc/Rluc (RLA - Relative Luciferase- Aktivität) berichtet also einen normalisierten Wert stimulierter Zellen im Verhältnis zu den transfizierten Zellen. Aus den Ergebnissen in Figur 4 geht hervor, dass ein Fusionsprotein HimFla und Him-Fla-multi (Nr. 5 und 3 in Tabelle 3) den Rezeptor TLR5 im gleichen oder höheren Maß aktivieren als die positive Kontrolle. Als eine positive Kontrolle wurde ein handelsübliches Flagellin des Bakteriums Salmonella typhimurium verwendet, von dem bekannt ist, dass es den Signalweg TLR5 aktiviert. Als negative Kontrolle wurde reines Wasser verwendet. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen klar, dass die Aktivierung des TLR5 Signalwegs sowohl im Fall des Fusionsproteins HimFla, das TLR5 zweimal so stark wie die positive Kontrolle aktiviert, wie im Fall des Fusionsproteins HimFla-multi erreicht wurde, dessen Aktivierung annähernd gleich wie bei der positiven Kontrolle war. Die Messungen wurden 6 Stunden nach der Aktivierung durchgeführt. Die Menge des Proteins war annähernd 1 pg für HimFla und 5 pg/rnl für HimFla-multi.

Beispiel 8 - Antikörper-Vakzination mit dem Protein-Vakzin (Fusionsprotein) [00141] Zwei Protein-Vakzine wurden an Mäusen getestet: HimFla-UreB und HimFlamulti (Nr. 2 und 3 in der Tabelle 3). Als negative Kontrolle wurden das handelsübliche Protein Lysozym (Sigma) und Mäuse, denen nur Reagenzien ohne Proteine verabreicht wurden, verwendet. Proteine (Antigene) in PBS, gemischt mit dem Adjuvans Aluminiumhydroxid (Imject Alum, PIERCE) im Verhältnis 2 (Protein) : 1 (AIOH) wurden intraperitoneal gegeben. Die Abschlussmenge injizierten Antigens war 100 pg Protein in einem Volumen von 300 pl. Eine anschließende 'Auffrischungs-Vakzination wurde 10 Tage nach der ersten Vakzination für alle vier Proteine und negativen Kontrollen gemäß voranstehender Beschreibung durchgeführt. Im Fall des re-kombinanten Chimären Proteins wurde eine 'mit Multiepitop am Ende'-Vakzination zusätzlich zu dem beschriebenen Verfahren auch intranasal durchgeführt (50 pg des rekombinanten Proteins in PBS pro Tier - 5 mg/ml) - den Mäusen wurden mit einer Pipette 5 pl des Vakzins langsam in jedes Nasenloch verabreicht. Eine anschließende 'Auffrischungs'-Vakzination wurde intraperitoneal wie oben beschrieben durchgeführt.

[00142] Blutabnahme während des Experiments. Die Mäuse wurden für 15 Minuten in einen speziell belüfteten und erwärmten (40°C) Käfig transportiert, der eine Vasodilatation und damit ein schnelleres und einfacheres Verfahren zur Blutgewinnung ermöglicht. Das Tier wurde mit einer Spezialvorrichtung fixiert, dann wurde ihm ein Lokalanästhetikum (Ethylchlorid) verabreicht. Nach Abschneiden der Schwanzspitze (1-2 mm) wurde das Blut in Spezialröhren gesammelt. Die Höchstmenge eines gesammelten Samples betrug 100 pl. Nach der Blutabnahme wurde auf der Schwanzwunde ein Silbernitrat aufgebracht, um das Bluten zu stoppen und den Heilprozess zu beschleunigen. Zum Ende des Experiments wurde Blut mittels einer Punktion des Herzens nach C02-lntoxikation abgenommen.

[00143] Die ELISA-Ergebnisse für Antikörperanalyse nach Vakzination mit dem Proteinvakzin: Zur Bestimmung des potenziellen prophylaktischen Effekts der Vakzination mit einem rekombinanten Fusionsprotein HimFla-UreB und HimFla-multi (Nr. 2 und 3, Tabelle 3) wurden Blutseren immunisierter Labormäuse auf die Anwesenheit von IgG-Antikörpern getestet. Die rekombinanten Proteine HimFla- multi, UreB (Nr. 1, Tabelle 3) und Zelllysat von H. pylori wurden als Antigene verwendet. Die Verdünnungsserien der Antikörpertiter gegen die Proteinvakzine HimFla-UreB sind in Figur 5A und gegen HimFla-multi in Figur 5B dargestellt. Das Sample der 4-fachen Verdünnungsserie (Verdünnungen von 62,5-fach bis 16000-fach) zeigt den erwarteten graduellen Rückgang des Titers in Antikörpern in jeder Verdünnung und bestätigt damit die Gültigkeit des Tests. Die in Figur 5A bzw. 5B gezeigten Ergebnisse bestätigen indessen eindeutig, dass beide Fusionsproteine HimFla-UreB und HimFla-multi eine starke Immunantwort induziert hatten, die signifikant von den Werten der negativen Kontrollen abweicht (P> 0,001), auch in der 16 000-fachen Verdünnung. Ein weiteres Argument für eine starke Immunantwort ist die Tatsache, dass die Messungen nur 3 Wochen nach der ersten Vakzination und 11 Tage nach der 'Auffrischungs'-Vakzination vorgenommen wurden. Zudem zeigen die Ergebnisse in Figur 5A und 5B eindeutig, dass Antikörper, die gegen HimFla- UreB und HimFla-multi produziert wurden, auch gegen das Antigen im Zelllysat von H. pylori reagieren, was bedeutet, dass die Serum-Antikörper beide gereinigten rekombinanten Proteine (Histogrammsäulen mit diagonalen

Linien in Figur 5A und 5B) und Temperatur-stabile Epitope in H.-pylori-Lysat (gepunktete Histogrammsäulen in Figur 5A und 5B) erkennen. Diese Ergebnisse implizieren folglich auch, dass die Vakzination mit den oben beschriebenen Fusionsproteinen die Entwicklung von Gedächtnis-Immunzellen im Immunsystem auslösen kann, welche die Fähigkeit verleihen, mobilisiert zu werden und den Organismus bei nachfolgenden Exponierungen gegen Infektionen mit H. pylori zu schützen.

BAKTERIEN MIT DEM FUSIONSPROTEIN

Beispiel 9 - Die Präparierung von Bakterien mit Oberflächen-exponierten Fusionsproteinen für die Vakzination [00144] Die Präparierung nicht-flagellierter Stämme von E. coli. Kompetente Zellen wurden von nicht-flagellierten Escherichia coli, Stamm JW1908-1 (CGSC Stamm #: 9586) (Kanr) präpariert, die mit dem Plasmid transformiert wurden, das für T7- Polymerase codiert, wofür ein handelsübliches Lysogenisierungs-Kit benutzt wurde (ADE3 Lysogenization Kit, Novagen). Die soweit präparierten Zellen wurden sodann für die anschließende Transformation mit den Plasmiden verwendet, welche die folgenden Konstrukte enthalten.

[00145] Aus den soweit präparierten Zellen machten wir kompetente Zellen, die mit folgenden in Tabelle 4 gelisteten Konstrukten transformiert wurden.

[00146] Tabelle 4: Die Konstrukte, welche für die Oberflächen-exprimierten, Chimären Proteine codieren. Die Plasmid-Synthese und die Signifikanz einzelner Fragmente wurden in Beispiel 1 demonstriert.

Nr. Name Konstrukt-Zusammensetzung Ϊ ÜreB T7p-HPUreB-HiStag-HISt 2 HimFla-UreB T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-HPUreB-RGD-Histag-HISt 3 HimFla-multi T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-Multiepitop-RGD-Histag-T7t 4 HimFla T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-RGD-Histag-HISt 5 HimFla T7p-EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-RGD-Histag-T7t 6 HimFla-multi T7p-EcNfliC HpVfla213-Multiepitop-215HpVfla EcCfliC-HISt 7 HimFla-multi T7p-EcNfliC HpVfla213-Multiepitop-215HpVfla EcCfliC-T7t 8 FliC T7p-EcfliC-T7t 9 HimFla-ureB TetRRBSp-EcNfliC HpVfla213-ureB-215HpVfla EcCfliC- HISt 10 HimFla-multi TetRRBSp-EcNfliC HpVfla213-Multiepitop-215HpVfla EcCfliC- HISt 12 HimFla-ureB T7P-EcNfliC HpVfla213-ureB-215HpVfla EcCfliC-HISt_ [00147] Präparierung von Bakterien für Mäuse. Bakterien E. coli JW1908-1 (Kanr), transformiert mit einem Plasmid, das für T7-Polymerase codiert, und auch mit dem Konstrukt HimFla-multi in pET-Vektor und TetRRBS, wurden auf Mäusen getestet. Die Protein-Exprimierung wurde durch die Zugabe von IPTG induziert. Die Lösung wurde verdünnt bis auf 109 CFU/ml; das Ausmaß der Verdünnung basierte auf den Messungen von OD6oo und der Anwendung der Kalibrierkurve. Die Bakterien wurden gespült und in sterilem 1x PBS resuspendiert. Die Mäuse wurden sodann oral und nasal mit einer präparierten bakteriellen Lösung vakziniert. Die Mäuse, welche die Kontrollgruppe bildeten, wurden mit Bakterien vakziniert, die mit einem leeren Plasmid (TetRRBS) transformiert wurden.

[00148] Protein-Exprimierung in Bakterien. Die Konstrukte aus Tabelle 4 (Nr. 4, 5, 9 und 12) wurden mit T7-Polymerase in E. coli JW1908-1 (Kanr) transformiert.

[00149] In Figur 6 ist die Exprimierung der Fusionsproteine in Bakterien dargestellt. Das Verfahren wurde gemäß Beschreibung in Beispiel 2 durchgeführt. Die Proteine wurden sowohl im Überstand (SN) wie auch in der Lösung der gelösten Einschlusskörper (RIT) identifiziert. Wie sich aus den Ergebnissen eindeutig zeigt, sind die Bänder des Proteins HimFla-ureB mit einem

Mw von 57,9 kDa (Nr. 12, Tabelle 4) sowohl im Überstand wie auch in den Einschlusskörpern (SN1 und RIT1) auf der richtigen Höhe. Die Anwesenheit von HimFla (Nr. 4, Tabelle 4) mit einem Mw von 54,8 kDa in SN3 und HimFla-ureB (Nr. 9, Tabelle 4) mit einem Mw von 57,9 kDa in SN8 und RIT8 wurde ebenfalls bestätigt. Das Band für HimFla (Nr. 5, Tabelle 4) in SN9 und RIT9, das ein 54,8 kDa Protein ist, ist auf annähernd derselben Höhe positioniert wie erwartet.

[00150] I n-vivo-ldentifizierung Oberflächen-exponierter Proteine in Bakterien. Die Identifizierung Oberflächen-exponierter Proteine in Bakterien wurde in Bakterien durchgeführt, die eigens für diesen Zweck präpariert wurden (Tabelle 4). Zu den gesammelten Zellen wurde 1x PBS/3% BSA (Rinderserumalbumin) hinzugefügt, nachdem sie zweimal mit 1x PBS gespült wurden, und sie wurden anschließend unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur 60 Minuten lang inkubiert. Danach wurden die Inkubations-Samples zentrifugiert und der Überstand entsorgt. Primäre Antikörper (Ab-TLR3 His), die sich speziell an His tag binden, wurden dem Pellet hinzugefügt, bis eine Endkonzentration von 2,5 ng/μΙ erreicht war. Nach einer anschließenden 60-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln wurden die Antikörper dreimal mit 1xPBS/3% BSA abgewaschen. Nach der Inkubation wurden dem Sample sekundäre Antikörper (Anti-Maus IgG-FITC) hinzugefügt bis zur Endkonzentration von 1,5 ng/μΙ. Sekundäre Antikörper sind mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert und binden sich spezifisch an primäre Antikörper (Ab- TLR3 His). Nach den folgenden 60 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur und in Dunkelheit wurden die sekundären Antikörper dreimal mit 1xPBS/3% BSA abgewaschen. Die Zellen wurden in 1x PBS resuspendiert und dann unter dem Mikroskop beobachtet. Ein Konfo-kal-Mikroskop mit einem Ar-Ionenlaser (Erregung bei 488 nm, Detektion bei 500-530 nm) wurde zur Detektion der markierten Bakterien verwendet. Die Bakterien, die das Fusionsprotein expri-mieren, erscheinen auf dem Bild weiß.

[00151] Die Ergebnisse sind in Figur 7 dargestellt. Die Anwesenheit Oberflächeexprimierter Fusionsproteine wurde gezeigt für: (A) HimFla (Nr. 4), (B) HimFla-ureB (Nr. 12), (C) HimFla-ureB (Nr. 9) und (D) HimFla-multi (Nr. 3, alle aus der Tabelle 4). Bakterien, die mit einem leeren Plasmid transformiert wurden, dienten zur negativen Kontrolle (E).

[00152] Motilitätstest für nicht-flagellierte Bakterien, die mit einer Plasmid-Codierung für ein Fusionsprotein transformiert wurden. Ein Motilitätstest wurde erstellt, um die Funktionalität bakterieller Flagella, bestehend aus rekombinantem Flagellin, zu untersuchen. Plasmidkonstrukte, die für Fusionsproteine codieren (Tabelle 4), wurden mit T7 Polymerase in E. coli JW1908-1 (Kanr) transformiert. Das Transformationsgemisch wurde über eine LB Amp Kan Cm (Ampicillin, Kanamycin, Chloramfenikol) Agarplatte mit hinzugefügtem IPTG verteilt. Die herausgebildeten Kolonien wurden dann auf eine LB Amp Kan Cm Platte für den Mobilitätstest mit 0,35 % Agar übertragen. Die Platte wurde denn bei 30°C 12 Stunden lang inkubiert.

[00153] Die Ergebnisse des Motilitätstests sind in Figur 8 dargestellt. Aus Figur 8 ist evident, dass die negative Kontrolle (nicht-flagellierte E. coli JW1908-1 (Kanr) mit T7 Polymerase) nicht motil ist (die Platte rechts) im Vergleich mit den Bakterien, die mit den Konstrukten HimFla in pSB1.AK3 (Nr. 4) - Sample 1-10; HimFla-ureB (Nr. 12) - Sample 11-12; HimFla-ureB (Nr. 9) -Sample 13-20; HimFla (Nr. 5) - Sample 21 -25; HimFla-multi (Nr. 7) - Sample 26-30; FliC (Nr. 8) - Sample 35-38; HimFla in pSB.AK3 (Nr. 4) - Sample 39-42, transformiert wurden, die unterschiedliche Motilitätsgrade zeigten. Die Samples 43-49 wurden leer gelassen, weshalb sich hier keine Kolonien bildeten. Die Motilität der Bakterien zeigt sich als ein heller Ring rund um die ausgebildeten Kolonien.

Beispiel 10 - Aktivierung der TLR5 Rezeptoren in Zelllinien mit Bakterien, die Fusionsproteine exprimieren [00154] Stimulation von Bakterien, die die Produkte transformierter Konstrukte auf ihrer Oberfläche exprimieren. Die Zubereitung von Zelllinien, die den Rezeptor TLR5 exprimieren und die Aktivierung eines Reportersystems (Luciferase-Aktivität) messen, werden sind in Beispiel 7 beschrieben. Am Tag vor der Transfektion wurden die Zellen auf eine Mikrotiterplatte übertragen und auf eine angemessene Dichte gezüchtet. Die Aktivierung des TLR5 Rezeptors wurde durch die Stimulation mit E. coli JW1908-1 (Kanr) mit T7 Polymerase geprüft, in die die korres pondierenden Konstrukte transformiert wurden. Die zu diesem Zweck benutzten Konstrukte waren FliC (Nr. 8) und HimFla-ureB (Nr. 9) aus der Tabelle 4.

[00155] Die Zellen wurden unter Anwendung desselben Verfahrens präpariert, wie es auch für den Test der Protein-Oberflächen-Exprimierung in Bakterien verwendet wurde. Die präparierten Bakterien wurden gesammelt und dreimal mit 1x PBS gespült. Dann wurde eine Verdünnungs-Serie erreicht. Die Verdünnungen 104 und 108 wurden auf HEK 293 Zelllinien, die mit TLR5 transfiziert waren, getestet. Die Testbakterien wurden in zwei Gruppen geteilt, wobei eine Gruppe Bakterien 20 Minuten lang bei 70°C und die zweite Gruppe 20 Minuten lang bei 4°C inkubiert wurde. Aus den Ergebnissen in Figur 9 ist evident, dass die Bakterien E. coli JW1908-1 (Kanr) mit T7 Polymerase, die ein Plasmid enthielten, das für das Fusionsprotein HimFla-UreB codiert, im Vergleich mit der Kontrolle den Rezeptor TLR5 aktivierte. Der TLR5 Rezeptor wurde auch durch ein rekombinantes Protein FliC aktiviert, das in den Bakterien E. coli JW1908-1 (Kanr) mit T7 Polymerase Oberflächen-exprimiert wurde. Das Protein HimFla-UreB aktivierte den Signalweg TLR5 nur im Fall von Bakterien, die 20 Minuten lang bei 70°C inkubiert wurden, während das rekombinante Protein FliC in den Bakterien E. coli JW1908-1 (Kanr) mit T7 Polymerase den TLR5 Signalweg im Fall lebender Bakterien aktivierte, die 20 Minuten bei 4°C inkubiert wurden.

Beispiel 11 - Die Internalisierung von Bakterien [00156] Die Internalisierung von Bakterien in Zellen wurde durch das Konfokalmikroskop beobachtet.

[00157] Der Zweck des Experiments bestand darin, festzustellen, ob eine Internalisierung der Bakterien, die das Fusionsprotein exprimieren, in der Zelle stattfindet. Die Bakterien wurden so wie in Beispiel 10 beschrieben präpariert mit dem Oberflächen-exprimierten Fusionsprotein, welches das grüne, fluoreszierende Protein enthält. Die Bakterien wurden den Zellen bis zu einer Endkonzentration zwischen 102 und 108 CFU hinzugefügt. Die Internalisierung wurde nach 24 Stunden beobachtet.

[00158] Zelluläre Organellen wurden mit den geeigneten handelsüblichen Markern gekennzeichnet: Endoplasmatisches Retikulum wurde mit ER-Tracker-Farbstoff (MolecularProbes) markiert, während Endosome und Lysosome mit Lyso-Tracker- Farbstoff (MolecularProbes) markiert wurden.

[00159] Lebend gefärbte Zellen oder fixierte Zellen wurden mit Leica TCS SP5 Konfokalmikroskop auf einem Leica DMI 6000 CS Ständer untersucht. Das Leica TCS SP5 Konfokalmikroskop ist für das Laserscanning fluoreszent markierter lebender oder fixierter Zellen konzipiert. Ein 63x Ölimmersionsobjekt wurde für diesen Zweck benutzt. Die Bilder wurden mit dem LAS AF 1.8.0. Leica- Microsystems-Programm produziert.

[00160] In Figur 10 ist die Fähigkeit zur Internalisierung der Bakterien in den CaCO-2- Zellen dargestellt. In diesem Fall wurden Bakterien mit Oberfläche-exprimiertem Konstrukt, mit mCerulean-Marker markiert, für die Internalisierung getestet. [A] Bakterien, die mit mCerulean markiert sind, [B] LysoTracker (MolecularProbes) [C] Bakterien, die mit mCerulean markiert sind, [D] überlappende Bilder [C] und das Hellfeldbild.

DNA DES FUSIONSPROTEINS

Beispiel 12 - Expression des Fusionsproteins in den Zelllinien HEK293, HEK293T

[00161] Zum Zweck der Identifizierung der potenziellen Verwendung von Fusionsproteinen gemäß der vorliegenden Erfindung für das DNA-Vakzin wurde die Fusionsprotein-Exprimierung in Zelllinien verifiziert.

[00162] Das Züchten von Zellen und die Transfektion werden im Kapitel Fusionsproteine -Beispiel 7 - beschrieben. Die Samples (Überstände von HEK293T- Zellen, die mit 250 ng Plasmid, das für die in Tabelle 5 aufgeführten Konstrukte codiert, transfiziert wurden) wurden zuerst 3 Minuten lang bei 10 000 UpM zentrifugiert, um alle restlichen Zellenpartikel zu entfernen. Zum Überstand wurden 4x reduzierender Puffer mit SDS hinzugefügt und durch Erhitzen über 5

Minuten bei 100°C denaturiert. Die Proteine wurden mittels SDS-PAGE-Elektrophorese getrennt, und nach ihrem Transfer auf eine Nylon-Membran wurden die Fusionsproteine durch die Bindung der Antikörper, die His tag erkennen, detektiert.

[00163] Tabelle 5: Plasmid-Konstrukte, die zur Exprimierung in Zelllinien benutzt wurden. Die Bedeutung der einzelnen Fragmente wird in Beispiel 1 erklärt.

Nr. Name Konstrukt-Zusammensetzung 13 UreB CMVp-ss- HPUreB-Histag-HISt 14 ssHimFla-UreB CMVp-ss -EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-HPUreB-RGD-Histag-HISt 15 HimFla CMVp-ss- EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-RGD-Histag-HISt 16 ssHimFla-multi CMVp- ss- EcNfliC HpVfla213-Multiepitop-215HpVfla EcCfliC- RGD-HiStag-HISt 17 HimFla-UreB CMVp - EcNfliC-HpVfla-EcCfliC-HPUreB -RGD-Histag-HISt 18 HimFla-multi CMVp- EcNfliC HpVfla213-Multiepitop-215HpVfla EcCfliC - RGD- _Hi Stag-Hl St_

Beispiel 13 - Aktivierung des Rezeptors TLR5 in Zelllinien mit DNA-Fusion [00164] Der Zweck dieses Experiments besteht in dem Nachweis, dass die Fusionsproteine, die in Zelllinien exprimiert werden, den Rezeptor TLR5 aktivieren. Ein in Beispiel 7 beschriebenes Dual-Luciferase-Reportersystem wurde zur Feststellung der Zellenantwort auf die Anwesenheit des Fusionsproteins verwendet.

[00165] Die nachstehende DNA in den unten aufgeführten Konzentrationen wurde zur Trans-fektion der Zelllinien verwendet: pFluc 0,42 ng/μΙ, pRIuc 0,08 ng/μΙ Target-Plasmide gemäß Auflistung in Tabelle 5 wurden in Mengen von 50 oder 100 ng hinzugefügt.

[00166] In diesem Experiment wurden HEK293-Zellen, die mit einem leeren Plasmid transfiziert wurden (negative Kontrolle für die Aktivierung der TLR5 Signalwege), also ohne Exprimierung des Rezeptors TLR5, und die Zellen, die mit Plasmiden, welche für TLR5 und DNA Fusionsproteine codieren, transfiziert wurden, verwendet. Aus den erbrachten Ergebnissen geht eindeutig hervor, dass die Fusionsproteine HimFla- ss-ss-UreB und HimFla-multi beide den Rezeptor TLR5 verglichen mit der positiven Kontrolle - die in beiden Fällen geringer war - in höherem Maße aktivierten. Die Zellen wurden mit dem Flagellin der Bakterien Salmonella typhimurium stimuliert und nach 6 Stunden Stimulation lysiert. Nichtstimulierte Zellen wurden MQ zur Kontrolle hinzugefügt. Zellen, die mit einem leeren Plasmid transfiziert und mit dem Flagellin der Bakterien Salmonella typhimurium stimuliert wurden, dienten der negativen Kontrolle. Die Aktivierung in diesen Zellen war vernachlässigbar und ist auf die geringe Rezeptor-Exprimierung des TLR5 in HEK293 zurückzuführen.

[00167] Unterschiedliche DNA-Mengen des Fusions-Flagellins (50 und 100 ng DNA) wurden an den Zellen getestet. Wie erwartet, nahm die Aktivierung des Rezeptors TLR5 mit zunehmender Menge transfizierter DNA zu.

[00168] Die TLR5-Aktivierung wurde für die Fusionsproteine ssHimFla-UreB (Nr. 2) und ssHimFla-multi (Nr. 4) getestet. 6 Stunden nach der Stimulation wurden die Zellen lysiert und auf ihre Luciferase-Aktivität gemessen. Antigen/Urease von H. pylori aktivieren alleine nicht den TLR5 Rezeptor, während in Verbindung mit chimärem Flagellin und der Signalsequenz für extrazellulären Transport die Aktivierung stattfindet.

[00169] Die Ergebnisse in Figur 11 zeigen, dass die Aktivierung der TLR5 Signalwege die Anwesenheit von Signalsequenzen erfordert, die den extrazellulären Transport der Proteine erlauben. Zellen, die mit DNA, welche für Fusionsflagellin ohne eine Signalsequenz codiert, transfiziert waren, haben die TLR5 Signalwege nicht aktiviert, während die Aktivierung des TLR5 Signalwegs in jenen Zellen, die mit der DNA für Fusionsflagellin plus der Signalsequenz zur Exkretion transfiziert waren, deutlich erkennbar war. Zunehmende Konzentrationen der Konstrukte ss-HimFla-multi und HimFla-multi wurden in Zellen übertragen. Die Zellen wurden mit dem bakteriellen Flagellin von Salmonella typhimurium stimuliert und 6 Stunden nach der Stimulation lysiert. Nichtstimulierte Zellen wurden MQ zur Kontrolle hinzugefügt. Zellen, die mit einem leeren Plasmid transfiziert und mit dem Flagellin der Bakterien Salmonella typhimurium stimuliert waren, wurden für die negative Kontrolle verwendet. Die Aktivierung in diesen Zellen war vernachlässigbar und ist auf die geringe Rezeptor- Exprimierung von TLR5 in HEK293 zurückführbar.

[00170] Die Stimulation angrenzender Zellen, die das Fusionsprotein mit dem Flagellin nicht alleine produzieren und exkretieren [00171] Der Zweck des Experiments ist es festzustellen, ob die Einführung des Vakzins in Form einer DNA, die für Fusionsproteine mit Flagellin codiert, in Zellen wie Epithel- oder Muskelzellen die Immunantwort in benachbarten Zellen zu stimulieren vermag, die den Rezeptor TLR5 exprimieren. Dieses Ergebnis ist wichtig für die Evaluierung der Anwendbarkeit der DNA-Vakzine.

[00172] Zellen, die Flagellin in Cytosol exprimieren, können zytosolische Rezeptoren - Mitglieder der Familien Ipaf und NAIP5 - aktivieren, die ihrerseits zu Piroptose und lokaler Nekrose führen, welche die Immunantwort stimulieren können.

[00173] DNA, die für das Fusionsprotein-Flagellin mit Multiepitop codiert, wurde in FIEK293-Zellen eingeführt. Zwei Typen von DNA wurden mit und ohne Signalisierungssequenz der Codierungssequenz verwendet. Zu der Zellkultur wurden FIEK293 Zellen, die mit DNA, welche für humanen TLR5 codiert, das Reporterplasmid mit Glühwürmchen-Luciferase unter der Kontrolle des NF-kB Antwort-Promoters und ein konstitutiver Reporter mit Renilla-Luciferase hinzugefügt. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen, die nur mit DNA, welche das Fusionsprotein mit Flagellin codiert, transfiziert waren, mit Zellen gemischt, die mit DNA transfiziert waren, die für TLR5 Rezeptor und Reporterplasmid codiert. 24 Stunden nach der Inokulation wurden sie für die Aktivierung mittels eines Doppel- Luciferase-Tests gemessen. Die Luciferase-Aktivität ist ein Maß für die Fähigkeit zur TLR5 Aktivierung mittels der Bindung des Fusionsflagellins, das von den Zellen exkretiert wurde, und auch des Flagellins, das im Zytosol lysierter Zellen produziert und extrazellulär zusammen mit anderen Zellgehalten abgegeben wurde. In beiden Fällen wurde ein signifikanter Anstieg der Aktivierung von Zellen festgestellt, woraus abzuleiten ist, dass die Einführung eines DNA-Vakzins, das für das Chimäre Flagellin codiert, in einen Organismus zur Stimulierung von Zellen führen kann, die TLR5 auf ihrer Oberfläche exprimieren und damit die Immunantwort aktivieren.

[00174] Die Ergebnisse in Figur 12 zeigen, dass die Zellen, welche das DNA Fusionsflagellin extrazellulär exprimieren, weil sie die Signalsequenz zur Exkretion enthalten, besser zur Mobilisierung der Nachbarzellen geeignet sind, die nur TLR5 exprimieren, als jene, die das zytosolische Fusionsprotein exprimierten. Die Aktivierung von Zellen, die TLR5 exprimieren, in einem Experiment, wo eine Signalsequenz zur Exkretion nicht verwendet wurde, kann mit der Pyrop-tose der Zellen erklärt werden, die auf die zytosolische Exprimierung des Flagellins zurückführbar ist. Folglich wird nach der Zelllyse das zytosolische Flagellin von den Zellen abgegeben, was zur Aktivierung der TLR5 Signalwege in benachbarten Zellen führt, die nur den Rezeptor TLR5 exprimieren. Die Zellen wurden mit 10 ng/ml Flagellin vom Bakterium Salmonella typhimurium stimuliert und wurden 6 Stunden später lysiert. Nichtstimulierte Zellen wurden MQ zur Kontrolle hinzugefügt. Die Zellen wurden mit einem leeren Plasmid transfiziert und mit dem Flagellin vom Bakterium Salmonella typhimurium stimuliert, wodurch sie zur negativen Kontrolle dienten. Die Aktivierung in diesen Zellen war vernachlässigbar und auf die Basislevel-Rezeptor-Exprimierung von TLR5 in HEK293 zurückzuführen.

Beispiel 14 - Immunisierung mit Elektroporation [00175] Die Konstrukte Nr. 2 und 4 aus der Tabelle 5 wurden im Elektroporationsverfahren getestet (Tevz et al. 2008; Gene electrotransfer into murine skeletal muscle: a systematic analysis of parameters for long-term gene expression. Technology in cancer research and treatment, 2008, vol. 7, Nr. 2, p. 91101). DNA-Konstrukte wurden mit den QIAGEN endo-freien

Reagenzien (Qiagen; Hilden, Deutschland) isoliert und in steriler PBS verdünnt bis auf eine Konzentration von 1 pg/μΙ. Die subkutane Anwendung (50 μΙ) mit einer 29G Dünnnadel (Myjec-tor; Terumo, Japan) und eine intramuskuläre Verabreichung in den rechten Beinmuskel - mus-culus tibialis cranialis (20 μΙ DNA-Lösung) wurden für beide Konstrukte angewendet.

[00176] Die Mäuse wurden zuerst durch die Inhalation von Isofluran anästhetisiert. An der Applikationsstelle wurden die Haare geschoren, und der Maus wurde sodann die DNA-Lösung injiziert. Zwei Parallelelektroden aus rostfreiem Stahl (Abmessungen 30 mm x 10 mm) und in einem Abstand von 6 mm (Igea; Carpi, Italien) wurden am Ort des subkutanen Raums und um die Oberschenkel (für intramuskulär) angebracht. Die elektrischen Impulse wurden mit dem Cliniporator (Igea; Carpi, Italien) über die Elektroden abgegeben, die zuvor für bessere Leitfähigkeit mit dem Ultraschall-Gel eingeschmiert wurden. Die subkutane Elektroporation wurde mit einem Impuls von 600 V/cm, der 100 ps dauerte, ausgeführt, dem ein Impuls von 84 V/cm über 400 ms, 1 Hz, folgte. Die intramuskuläre Elektroporation wurde mit einem Impuls von 360 V/cm, der 100 ps dauerte, ausgeführt, dem vier Impulse von 48 V/cm folgten, die 100 ms, 1 Hz, dauerten. Alle Mäuse erhielten eine 'Auffrischungs'-Vakzination 10 Tage nach der ersten Vakzination. Eine angemessene Zeit nach der 'Auffrischungs'- Vakzination wurde das Blut der Tiere entnommen, um die Anwesenheit von Antikörpern zu testen, und die Mäuse wurden mit den Bakterien H. pylori infiziert, um den therapeutischen Effekt auf die Reduzierung der Kolonisierung oder die vollständige Beseitigung der Infektion in ihren Mägen zu testen.

[00177] Wir zeigten eine Erhöhung der Menge der Antikörper IgG gegen die Antigene des Fusionsproteins, das wir zur Immunisierung verwendeten, im Vergleich mit der Menge der Antikörper in Kontrollmäusen, die nur mit dem Plasmid ohne Insert immunisiert wurden. Die Zunahme der Antikörper konnte auch im Vergleich mit der Menge an Antikörpern in Mäusen festgestellt werden, die mit Urease B immunisiert waren.

SEQUEMZUSTE <110> Kemijski Institut <120> Chimäre Fiagelline für Vakzine <130> 301-P21PC/09 <150> P-200800259 <151> 2008-10-28 <16D> 21 <170> Patentin version 3.4

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Ala Leu Ile Ihr Ala Ser G!y Asp lie Ser Leu Thr Phe Lys Gin Val 1 5 10 15

Asp Gly Val Asn Asp Val Thr Leu Glu Ser Val Lys Val Ser Ser Ser 20 ' 25 30

Ala Gly Ihr Gly Ile Gly Val Leu Ala Glu Val Ile Asn Lys Asn Ser 35 40 45

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Val Ala Val Gin Sei Gly Ser Leu Ser Asn Leu Thr Leu Asn Gly Ile 65 70 75 80

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Leu Vai Ala Ala ile Asn Aia Val Thr Ser Glu Thr Gly Val Glu Aia 100 105 110

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Gly Ile Glu Ile Lys Thr Asp Ser Val Ser Asn Gly Pro Ser Ala Leu 130 135 140

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Gly Arg Leu Ser Leu Thr Arg Leu Asp Ala Lys Ser Ile Asn Val Val 165 170 175

Ser Ala Ser Asp Ser Gin His Leu Gly Phe Thr Ala Ife Gly Phe Gly 180 185 190

Glu Ser Gin Val Ala Glu Thr Thr Val Asn Leu Arg Asp Val Thr Gly 195 200 205

Asn Phe Asn Aia Asn Val Lys Ser Ala Ser Gly Ala Asn Tyr Asn Ala 210 215 220

Val lie Ala Ser Gly Asn Gin Ser Leu Gly Ser Gly Val ThrThf Leu 225 230 235 240

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Ala He Ala Ser Val Asp Lys Phe Arg Ser Ser Leu Gly Ala Val G i n 20 25 30

Asn Arg Leu Asp Ser Ala Val Ihr Asn Leu Asn Asn Thr Thr Thr Asn 35 40 45

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Asn Ile Asn Lys Asn Gin Ser Ala Leu Ser Ser Ser He Glu Arg Leu 20 25 30

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Ala Ile Ala Asn Arg Phe Ihr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gin Ala 50 55 60

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Gin Asp Glu He Lys Ser Arg Leu Asp Glu lie Asp Arg Val Ser G!y 115 120 125

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Lys Gin He Asp Aia. Lvs Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Ser Val Lys 165 ' 170 175

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Ala Val Ala Asn Gly Lys Thr Thr Asp Pro Leu Lys Ala Leu Asp Asp 405 410 415

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<212> PRT <213> Escherichia Coll <c20> <221 > mat Peptid <222> (1)..(176} <400> 8

Met Ala Gin Vai He Asn Ihr Asn Ser Leu Ser Leu lie Ihr Gin Asn 1 5 10 15

Asn lie Asn Lys Asn Gin Ser Ala Leu Ser Ser Ser He Giu Arg Leu 20 25 30

Ser Ser Giy Leu Arg He Asn Ser Aia Lys Asp Asp A!a Ala Giy Gin 35 40 45

Aia lie Aia Asn Arg Phe Thr Ser Asn He Lys Giy Leu Thr Gin Aia 50 55 60

Aia Arg Asn Aia Asn Asp Giv He Ser Vai Aia Gin Thr Thr Giu Giy 65 “ 70 75 80

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Gin Asp Giu He Lys Ser Arg Leu Asp Giu lie Asp Arg Vai Ser Giy 115 120 125

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<212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> mat Peptid <222> (1)..(302) <400> 10

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<210> 12 <211> 55S <212> PRT <213> Helicobacter pylori <220> <221 > maLPepild <222> (1)..(569) <400> 12

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Val Phe Vai Asp Giy Lys Giu Val Thr Ser Lys Pro Ala Asn Lys Val 545 550 555 560

Ser Leu Ala Gin Leu Phe Ser Ile Phe 565 <210> 13 <211> 72 <212> DNA <213> sinteticn! <220> <221 > mRNA <222> (1)..(72} <400> 13 tccggcaaaa aaacgggeaa ggtgtcacGa Gcctgcectt tttctttaaa accgaaaaga 60 ttacttcgcg f.t 72

<210> 14 <211> 26 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <220> <221> mat Peptid <222> (1)..(26} <40Q> 14

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<210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <22Q> <221 > mat__Peptid <222> (1)..(120) <400> 15

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Ala. Ala His Leu Asn He Gly Lys Gly Gly Val Asn Leu Ser Asn Gin 50 55 60

Aia Ser Giy Arg Thr Leu Leu Vai Glu Asn Leu Thr Gly Asn lie Thr 65 70 75 80

Val Asp Gly Pro Leu Arg Val Asn Asn Gin Val Gly Gly Tyr Ala Leu 85 90 95

Ala Gly Ser Ser Aia Asn Phe Glu Phe Lys Aia Giy Val Asp Thr Lys 100 105 110

Asn Gly Thr Ala Thr Phe Asn Asn 115 120

<210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Helicobacter pylori <220> <221 > mai_Peptid <222> (1)..(13) <400> 16

Lys Arg Thr lie Gin Lys Lys Ser Glu Pro Gly Leu Leu 1 5 10 <210> 17 <211> 3 <212> PRT <213> sinteiicni <220> <221 > SIGNAL <222> (1)..(3) <:400> 17

Arg Gly Asp 1 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> sinteticm <220> <221 > promoter <222» (1)..(16} <400> 18 taatacgact cactat 16 <210> 19 <211> 46 <212> DMA <213> sinteticni <220> <221 > terminator <222> (1)..(46} <400> 19 tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg tttttt 46 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> sinteticni <220> <221 > promoter <222> (1)..(35) <400.» 20 tccctatcag tgatagagat actgagcaca ggagg 35 <21Q> 21 <211> 238 <212> DNA <213> virus <220> <221» terminator <222» (1)..(238) <400> 21 ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 60 cetcccccgt gccitcctig accctggaag gtgccacicc cactgtcctt tcctaataaa 120 atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg 180 ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatatgca 238

Claims

Patentansprüche 1. Protein, zusammengesetzt aus chimärem Flagellin, das mit Antigen verknüpft ist, wobei das chimäre Flagellin zusammengesetzt ist aus: (a) mindestens 100 Amino-terminalen Aminosäuren des Flagellins, das den TLR5 Rezeptor aktiviert, (b) dem mittleren, variablen Segment des bakteriellen Flagellins, das unfähig ist, TLR5 zu aktivieren, (c) mindestens 100 Carboxy-terminalen Aminosäuren des Flagellins, das TLR5 aktiviert.
2. Protein gemäß Anspruch 1, wobei das chimäre Flagellin zusammengesetzt ist aus: (a) dem mittleren Segment des Flagellins, das nicht TLR5 aktiviert, und ausgewählt ist aus bakteriellen Flagellinen, aus Helicobacter pylory, (b) dem Amino- und Carboxy-terminalen Segment des Flagellins, das TLR5 aktiviert und ausgewählt ist aus bakteriellen Flagellinen ausgewählt aus Escherichia coli.
3. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei zu dem Chimären Flagellin folgende Sequenzen hinzugefügt werden: Sequenz für Antigen, Protein oder Peptidsegment oder mehrere Proteine oder Peptidsegmente, die von Proteinen von den Organismen stammt, gegen die die Immunantwort ausgelöst werden wird und derselbe Organismus sein muss, von dem der Code für das mittlere Segment des Flagellins genommen wurde und die Sequenz des Proteins oder des Peptidsegments am Carboxy-terminalen Teil des Chimären Flagellins oder im mittleren Flagellinsegment eingebaut ist.
4. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Protein zusammengesetzt ist aus: (a) Aminosäuren des Flagellins FliC E. coli mindestens an den Positionen 1 bis 176, (b) dem mittleren variablen Segment der Aminosäuren des Flagellins FlaA des Bakteriums H. pylori mindestens an den Positionen 178 bis 418, (c) Aminosäuren des Flagellins FliC E. coli mindestens von 401 bis 498, und (d) optional das Antigensegment, zusammengesetzt aus Protein oder mehreren Segmenten von Proteinen, die im Genom des Helicobacter pylori codiert sind.
5. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Protein das Flagellin FlaA H. pylori enthält, dessen Amino- und Carboxy-terminale Segmente ersetzt sind durch die Sequenz des bakteriellen Flagellins, das TLR5 aktiviert und optional wird das Antigensegment verwendet, das aus Protein oder mehreren Proteinsegmenten zusammengesetzt ist, die im Genom von Helicobacter pylori codiert sind, und das genannte Protein wird für die Präparation von Vakzinen zum Schutz und zur Behandlung von Infektionen gegen H. pylori verwendet.
6. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Protein optional einen oder mehrere Linker-Peptide enthält, welche die einzelnen Segmente des Proteins verbinden, und jedes Linker-Peptid unabhängig aus einer bis mehreren Aminosäuren zusammengesetzt ist, und das genannte Protein optional ein oder mehrere Tags enthält, und Linker-Peptide und Tags in das genannte Protein so integriert sind, dass die Basisfunktion des Proteins unverändert ist.
7. Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Protein für die Zubereitung des Vakzins zur Stimulation der Immunantwort gegen Bakterien, deren Flagellin TLR5 nicht aktiviert, zur Prävention und Behandlung von Infektionskrankheiten verwendet wird, vorzugsweise gegen Bakterien Helicobacter pylori.
8. DNA, welche das Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert.
9. DNA gemäß Anspruch 8, wobei die DNA für Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert, und die DNA in Richtung des Protein-Leserahmens enthält: (a) Signalisierungssequenz, die entweder die Proteinsekretion oder Protein- Bindung an die Membran des Wirtsorganismus ermöglicht, (b) Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, das funktional mit der Signalisierungssequenz verknüpft ist.
10. DNA gemäß einem der Ansprüche 8 bis 9, wobei die DNA für das Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert, das mit der Signalisierungssequenz verknüpft ist, und die DNA operativ mit den regulatorischen Elementen Promoter und Terminator verknüpft ist, welche die Exprimierung des Fusionsproteins in den Wirtszellen ermöglichen.
11. DNA gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die DNA für die Zubereitung des Vakzins zur Einführung in Human- oder Tierzellen zur Auslösung einer Immunantwort verwendet wird.
12. DNA gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das Protein zur Zubereitung des Vakzins zur Stimulation der Immunantwort gegen Bakterien, deren Flagellin nicht TLR5 aktiviert, zur Prävention und Behandlung von Infektionskrankheiten verwendet wird, vorzugsweise gegen Bakterien ausgewählt aus Helicobacter pylori.
13. Vakzin, das Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder DNA gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12 und geeignete pharmazeutisch akzeptable Zuschlagstoffe enthält.
14. Wirtsorganismus, der Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder DNA gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12 enthält, welche DNA in Fusionsprotein translatiert wird und wobei der Wirtsorganismus aus folgender Gruppe ausgewählt ist: Bakterien, Hefen, Pilze oder Säugetierzellen, vorzugsweise ist der Wirtsorganismus ausgewählt aus einer Gruppe von für Menschen und Tiere nicht-pathogenen Organismen, vorzugsweise ist der Wirtsorganismus ausgewählt aus Organismen, die normalerweise in der menschlichen oder tierischen Darmflora Vorkommen.
15. Vakzin, das einen Wirtsorganismus gemäß Anspruch 14 enthält, wobei das Protein auf der Zelloberfläche des Wirtsorganismus in einem pharmazeutischen Gemisch mit den pharmazeutisch akzeptablen Zuschlagstoffen exprimiert ist. Hierzu 12 Blatt Zeichnungen