CN112481185B - 一种预防黄颡鱼“裂头病”浸泡疫苗株的构建和应用 - Google Patents

一种预防黄颡鱼“裂头病”浸泡疫苗株的构建和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种预防黄颡鱼“裂头病”浸泡疫苗株的构建和应用，涉及微生物病原学与水产养殖病害防治交叉领域。通过敲除介导粘附/侵袭的I型菌毛fimA基因的负调控区获得高侵袭力菌株，同时敲除介导在宿主细胞内繁殖的鮰爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统eseJ基因，获得一株高侵袭力、低繁殖力缺失突变菌株。该高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌可作为弱毒疫苗株。本发明提供的高侵袭力弱毒疫苗可采用浸泡的方式对易感宿主进行免疫接种，疫苗接种操作简单，成本低廉。

Description

一种预防黄颡鱼“裂头病”浸泡疫苗株的构建和应用
技术领域
本发明涉及微生物病原学与水产养殖病害免疫防治交叉领域，具体而言，涉及一种预防黄颡鱼“裂头病”浸泡疫苗株的构建和应用。
背景技术
鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)是一种革兰氏阴性胞内菌，是引起鮰肠道败血症的病原(刘堂水等，2006；梁万文等，2007；邓显文等，2008)。鮰爱德华氏菌主要感染鲇形目鱼类，是斑点叉尾鮰养殖中的最重要的细菌性病原(Russo et al.,2009)。我国重要鲇形目养殖鱼类，黄颡鱼暴发病“裂头病”亦由鮰爱德华氏菌的感染引起(叶仕根，2008；Liu et al.,2010)。其它重要鲇形目鱼类，如南方大口鲶(Silurus meridionalis)、长吻鮠(Leiocassis longirostris)等也受这种病原的侵害。鮰爱德华氏菌的感染途径有两种，一种为经肠道上皮进入血液，病原菌随血液循环到达全身内脏器官，引起败血症的急性感染；另一种为病原菌经鼻腔侵入嗅球，经由嗅神经感染脑组织，病灶向上发展导致头部皮肤溃烂顶骨漏出，引起“裂头病”的慢性感染。
鮰爱德华氏菌通过菌体表面鞭毛、菌毛等附属结构运动并粘附至宿主细胞表面，经体表及肠上皮细胞入侵机体后会在宿主细胞内大量繁殖、扩散。由于鮰爱德华氏菌是一种胞内菌且感染脑组织，一般药物很难突破鱼体自身的血脑屏障到达病灶，相较于其他病原菌治疗困难。鮰爱德华氏菌的注册和在售的疫苗仅为由美国农业部农业研究服务署(USDA-ARS)水生动物健康研究中心采用传统的化学致弱的方法开发的弱毒活疫苗(AQUAVAC-ESC)，主要针对斑点叉尾鮰的防病养殖。我国尚无针对黄颡鱼“裂头病”的鮰爱德华氏菌疫苗。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防黄颡鱼“裂头病”浸泡疫苗株的构建和应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
一种高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020561。保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年9月29日始，保藏30年，菌株名称为鮰爱德华氏菌HSN-1ΔeseJΔfimA-245--50,Edwardsiellaictaluri HSN-1ΔeseJΔfimA-245--50。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌为双缺失突变株，双缺失突变株同时缺失鮰爱德华氏菌Ⅰ型菌毛操纵子的负调控区和鮰爱德华氏菌毒力岛Ⅲ型分泌系统的一个编码基因；
优选地，双缺失突变株的野生型菌株为鮰爱德华氏菌HSN-1，为中国科学院水生生物研究所李爱华研究员馈赠。
野生型菌株分离自武汉养殖场的患有“裂头病”黄颡鱼脑组织。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述负调控区为鮰爱德华氏菌Ⅰ型菌毛操纵子的负调控区；
优选地，负调控区为鮰爱德华氏菌Ⅰ型菌毛操纵子中fimA基因的﹣245—﹣50bp区域。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述鮰爱德华氏菌毒力岛Ⅲ型分泌系统的一个编码基因为毒力基因eseJ。
鮰爱德华氏菌毒力岛Ⅲ型分泌系统可以将细菌产生的效应分子不经外部环境直接输送至宿主细胞，产生致病效应。鮰爱德华氏菌通过Ⅰ型菌毛操纵子的阻遏区抑制Ⅰ型菌毛的转录，抑制鮰爱德华氏菌对宿主细胞的粘附。
本发明通过敲除鮰爱德华氏菌Ⅰ型菌毛阻遏区(负调控区)增强其对易感鱼类宿主的粘附和侵袭力，同时敲除Ⅲ型分泌系统的eseJ基因，显著降低鮰爱德华氏菌在细胞内繁殖水平。由此获得一种双缺失突变株，该突变株具有高侵袭力弱毒力，可以用于制备减毒活疫苗。通过浸泡途径进行高效免疫接种，使用低剂量的减毒活疫苗即可激发宿主对鮰爱德华氏菌的抵抗力，达到免疫保护效果。
需要说明的是，本发明提供的高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌可以制成液体菌剂这一产品形态。
本发明从提高疫苗浸泡接种效率和效力的角度出发，构建一种高侵袭力的弱毒株。发明人研究证实：将鮰爱德华氏菌Ⅰ型菌毛操纵子的阻遏区缺失后，鮰爱德华氏菌对EPC细胞以及斑马鱼幼鱼的粘附和侵袭能力明显增强，在浸泡接种时可使用低剂量的细菌，所用细菌浓度低至104或105CFU/mL，即可实现较多细菌粘附至鱼体表面并侵袭鱼类宿主的接种目的，提高疫苗的接种效率，且对不同规格的鱼体均具有适用性。
本发明使用的鮰爱德华氏菌HSN-1具备毒力岛Ⅲ型分泌系统，毒力岛Ⅲ型分泌系统可将细菌内部的效应分子直接输送至宿主细胞产生致病效应。发明人研究证实：当鮰爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统的eseJ基因缺失后，突变菌株在鲤肠上皮瘤细胞(EPC)中的繁殖能力较野生型菌株显著下降，故该菌株侵袭宿主刺激机体产生免疫反应后的较短时间内可被机体清除。
一种高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌疫苗，由高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌制得。
本发明提供的高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌疫苗可以用于经济鱼类免疫接种。
上述经济鱼类为鲇形目鱼类；
优选地，鲇形目鱼类为黄颡鱼、斑点叉尾鮰、长吻鮠、革胡子鲶和南方大口鲶中的至少一种；
优选地，免疫接种的途径为浸泡途径。
该弱毒疫苗将针对易感养殖对象黄颡鱼、斑点叉尾鮰、长吻鮠、革胡子鲶、南方大口鲶，以及其他鲇形目易感经济鱼类的使用，这些鱼类体表光滑无鳞，粘液丰富，背部有坚硬的棘刺等特征，故使用浸泡途径对这些易感鱼类进行免疫接种具备操作简单、成本低等特点，且能够避免注射接种麻醉剂的使用，也能避免对接种对象的胁迫以及人工接种潜在危险等。
本发明还提供了一种高侵袭力弱毒力爱德华氏菌的构建方法，其包括如下步骤：先敲除爱德华氏菌的毒力岛Ⅲ型分泌系统的编码基因获得弱毒力爱德华氏菌，再敲除弱毒力爱德华氏菌I型菌毛操纵子的负调控区获得高侵袭力弱毒力爱德华氏菌。
或者先敲除爱德华氏菌I型菌毛操纵子的负调控区，再敲除爱德华氏菌的毒力岛Ⅲ型分泌系统的编码基因获得高侵袭力弱毒力爱德华氏菌。
需要说明的是，上述敲除的先后顺序可对换，可根据需要自适应选择敲除基因的先后顺序。
在一种实施方式中，上述的构建方法包括：
以野生型爱德华氏菌的基因组为模板，分别扩增拟缺失的eseJ基因的上游片段和下游片段，然后将上游片段和下游片段组合连接至自杀质粒中，转化大肠杆菌，获得阳性菌株1，将阳性菌株1与野生型爱德华氏菌共培养，经过两次同源重组，筛选获得爱德华氏菌eseJ缺失突变株；
以野生型爱德华氏菌的基因组为模板，扩增的fimA上游负调控区的上游片段和下游片段，组合连接至自杀质粒中，转化至大肠杆菌，获得阳性菌株2，将筛选获得的大肠杆菌的阳性菌株2与爱德华氏菌eseJ缺失突变株共培养，经过两次同源重组，筛选得到双缺失突变株。
需要说明的是，在其他实施方式中，高侵袭力弱毒力爱德华氏菌的构建方法还同样适用于同属(爱德华氏菌属，Edwardsiella)的杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiellapiscicida)和鳗爱德华氏菌(Edwardsiella anguillarum)的双突变菌株或单突变菌株的构建，包括并不限于本申请中所公开的鮰爱德华氏菌HSN-1。
可选的，高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌的构建方法，包括如下步骤：以鮰爱德华氏菌HSN-1的基因组为模板，分别扩增拟缺失的eseJ基因的上游片段和下游片段，然后将上游片段和下游片段组合连接至自杀质粒中，转化大肠杆菌，获得阳性菌株1，将阳性菌株1与鮰爱德华氏菌HSN-1共培养，经过两次同源重组，筛选获得鮰爱德华氏菌HSN-1eseJ缺失突变株；
以鮰爱德华氏菌野生型基因组为模板，扩增的fimA上游负调控区的上游片段和下游片段，组合连接至自杀质粒中，转化至大肠杆菌，获得阳性菌株2，将筛选获得的大肠杆菌的阳性菌株2与鮰爱德华氏菌HSN-1eseJ基因缺失株共培养，经过两次同源重组，筛选得到双缺失突变株。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述筛选获得eseJ缺失突变株包括：
分别设计引物扩增拟缺失的eseJ基因的上游片段F1和下游片段F2，以F1和F2混合片段为模板，扩增获得eseJ基因的上游片段F1和下游片段F2组合片段F，将组合片段F与自杀质粒连接获得连接产物，转化至大肠杆菌获得阳性菌株，将阳性菌株与鮰爱德华氏菌HSN-1混合培养使得连接产物转移至鮰爱德华氏菌HSN-1发生同源重组，筛选出单交换的一次重组子进行二次同源重组和脱质粒，筛选获得eseJ缺失突变株。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述自杀质粒包括并不限于pRE112。在其他实施方式中，也可选择其他的自杀质粒。
在其他实施方式中，亦可先构建fimA负调控区的缺失突变株，再在此基础上构建eseJ的缺失突变株，从而获得双缺失突变株。
可选的，以鮰爱德华氏菌HSN-1的基因组为模板，扩增的fimA上游负调控区的上游片段和下游片段，组合连接至自杀质粒中，转化至大肠杆菌，获得阳性菌株2，将阳性菌株2与鮰爱德华氏菌HSN-1共培养，经过两次同源重组，筛选获得鮰爱德华氏菌HSN-1fimA缺失上游负调控区的突变株；
以鮰爱德华氏菌HSN-1的基因组为模板，分别扩增拟缺失的eseJ基因的上游片段和下游片段，然后将上游片段和下游片段组合连接至自杀质粒中，转化大肠杆菌，获得阳性菌株1，将阳性菌株1与上述筛选获得的鮰爱德华氏菌HSN-1fimA缺失上游负调控区的突变株共培养，经过两次同源重组，筛选获得双缺失突变株。
本发明采用自杀质粒同源重组的方法构建基因缺失株，同时缺失鮰爱德华氏菌基因组eseJ基因与Ⅰ型菌毛负调控区，在此过程中不引入抗性基因，故在生产应用不会引入抗生素抗性，不会对养殖环境造成影响，具有优良的应用前景。
该弱毒疫苗候选株可采用浸泡方式对易感宿主进行免疫接种，疫苗接种操作简单，成本低廉。由于该疫苗候选株的侵袭力是常规弱毒苗的30倍左右，故可较好地解决在大规模养殖鱼塘中使用浸泡方式免疫易感鱼类时需要较多菌量的问题，以期使用相对较少的弱毒苗量即可使易感水产动物产生较高的免疫保护力。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌，通过敲除介导粘附/侵袭的I型菌毛操纵子的负调控区获得高侵袭力菌株，同时敲除介导在宿主细胞内繁殖的鮰爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统eseJ基因，获得一株高侵袭力、低繁殖力双缺失突变菌株。该高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌可作为疫苗株，通过发酵即可制备高侵袭力弱毒苗。本发明提供的高侵袭力、弱毒力鮰爱德华氏菌具有侵袭力显著高的优势，可使用浸泡方式免疫接种易感经济鱼类，且能解决在大规模养殖鱼塘中时需要较多菌量的问题，使用相对较少的弱毒苗量(104CFU/mL数量级)即可使易感水产动物产生较高的免疫保护力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为鮰爱德华氏菌基因缺失株构建过程示意图；
图2为鮰爱德华氏菌基因缺失株的核酸检测图；(图2中左图核酸检测所用引物为：eseJ-for与eseJ-rev；右图核酸检测所用引物为：fimA-245—-50-for与fimA-245—-50-rev；)
图3为以鮰爱德华氏菌野生株及eseJ基因缺失突变株感染EPC细胞后裂解细胞，涂平板计数感染后不同时间点细菌的数量图；
图4为激光共聚焦显微镜观察鮰爱德华氏菌野生株及突变株(均表达GFP)对EPC细胞粘附力检测图，并进行数据的统计分析图；
图5为以鮰爱德华氏菌野生株或双缺失突变株浸泡感染受精后5天斑马鱼幼鱼，每尾斑马鱼幼鱼上粘附的鮰爱德华氏菌野生株或突变株的数量结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种鮰爱德华氏菌HSN-1的eseJ基因缺失突变株的构建方法，以基因间同源重组和细菌间接合转移为基础，通过Overlap PCR方法和蔗糖负选择构建eseJ基因缺失突变株，基因缺失突变株的构建过程图参照图1所示。
(1)获得E.coli MC1061(携带pRE112-F)菌株和E.coli S17-1λpir(携带pRE112-F)菌株。
本实施例以鮰爱德华氏菌HSN-1基因组为模板，分别设计引物同时引入酶切位点和保护碱基，使用表1所示的引物eseJ-for和eseJ-int-rev扩增拟缺失的eseJ基因的上游片段(eseJ基因的上游片段记作F1)，用表1中的引物eseJ-int-for(斜体为该引物与eseJ-int-rev的反向互补序列重叠部分)和eseJ-rev引物扩增拟缺失的eseJ基因的下游片段(eseJ基因的下游片段记作F2)。然后，以F1和F2的混合PCR产物为模板，通过Overlap PCR扩增得到eseJ基因(全长1368个氨基酸)的上游与下游组合起来的片段F。鮰爱德华氏菌HSN-1的eseJ基因序列及本实施例所使用的引物如表1引物序列表所示。
表1引物序列表。
Figure BDA0002826927630000091
Overlap PCR反应体系如下所示：
Figure BDA0002826927630000092
PCR反应循环参数：
Figure BDA0002826927630000093
Overlap PCR反应获得F片段PCR产物，用KpnI分别酶切F片段PCR产物和pRE112自杀质粒(Edwards等，1998)，37℃酶切50min。
KpnI酶切回收片段F体系(快切酶及buffer均购自Thermo Scientific公司)：
Figure BDA0002826927630000101
KpnI酶切自杀质粒pRE112体系：
Figure BDA0002826927630000102
将酶切后的片段F和pRE112自杀质粒在16℃下过夜连接获得pRE112-F连接产物。
片段F和pRE112质粒连接反应体系如下所示：
Figure BDA0002826927630000103
将pRE112-F连接产物转化至E.coli MC1061，化学转化方法如下：
从-80℃冰箱中取出冻存的E.coli MC1061化学感受态细胞放置冰上，在无菌超净台中将过夜连接产物pRE112-F加入到MC1061感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。将E.coli MC1061感受态细胞置于42℃水浴热激90s，然后迅速放置冰上3-4min。加入800μL无抗LB液体培养基至热激后的感受态细胞中，轻轻混匀后置于37℃摇床培养50min。4000rpm离心5min，弃去800μL上清液，将剩余菌液轻轻混匀，涂布于LB+Cm34平板上，静置于37℃的恒温培养箱中培养18h。从平板上挑取单个克隆到LB+Cm34液体培养基中，37℃摇床培养4h后进行菌液PCR检测。
克隆检测时的PCR反应体系如下：
Figure BDA0002826927630000111
PCR反应循环参数：
Figure BDA0002826927630000112
将克隆检测阳性克隆送至上海生工生物公司测序。
挑选测序正确的E.coli MC1061(pRE112-F)菌株保种，同时接菌提取pRE112-F质粒，并转化至E.coli S17-1λpir接合菌(方法同转化至E.coli MC1061感受态细胞)(该菌株由新加坡国立大学Ka Yin Leung教授馈赠)。挑取单克隆进行PCR检测，阳性菌株E.coliS17-1λpir(pRE112-F)保种。
(2)接合转移。
静置培养鮰爱德华氏菌HSN-1(由中国科学院水生生物研究所李爱华研究员馈赠)和含有pRE112-F质粒的E.coli S17-1λpir至OD值达到0.5(E.coli：OD600 nm，E.ictaluri：OD540 nm)时，分别取160μL(E.coli S17-1λpir)和40μL(E.ictaluri HSN-1)菌液充分混匀，将混合液小心接种于新鲜的BHI无抗平板中央，形成圆型液面，28℃静置培养24h。培养期间pRE112-F质粒会从E.coli S17-1λpir转移至鮰爱德华氏菌野生型菌株中，进而发生同源重组。
(3)单交换。
用1mL无菌PBS冲洗发生第一次同源重组后的BHI无抗细菌平板，系列稀释100、10-1、10-2共3个梯度取100uL涂BHI(Col+Cm34)，每个梯度分别涂3个平板，28℃静置培养至少48h，挑取单克隆28℃静置生长24h，使用特异性引物eseJ-for和eseJ-rev进行PCR检测，使用质粒上的引物pRE112-for和pRE112-rev进行PCR检测，筛选出前者(eseJ-for和eseJ-rev扩增)为阳性后者(pRE112-for和pRE112-rev扩增)为阴性的单克隆(即一次重组子)用于后续试验。
(4)双交换。
选取成功接合的一次重组子，转接至5mL BHI中(不添加任何抗生素)，28℃静止培养48h，将菌液稀释涂布于含有12.5％蔗糖的BHI+Col平板上，84h后挑取蔗糖平板上生长的单克隆，同时分别在BHI+Col和BHI+Col+Cm34两类平板上划线，28℃静置培养24h后，选择只在BHI+Col平板生长而在BHI+Col+Cm34平板上不生长的菌落再划线至BHI+Col和BHI+Col+Cm5平板，选择在BHI+Col平板上生长，BHI+Col+Cm5平板不生长的克隆，使用eseJ-for和eseJ-rev引物做PCR检测以去除回复至野生型的假突变株，即筛选到的ΔeseJ菌株。
检测结果参照图2所示，图2中的左图核酸检测所用引物为：eseJ-for与eseJ-rev，由图2可知，ΔeseJ菌株实现了序列的成功缺失。
将筛选到的ΔeseJ菌株(即为eseJ突变株)测序正确后保种冻存于-80℃。
实施例2
本实施例提供了一种ΔeseJΔfimA-245—-50双缺失菌株的构建方法，其包括如下步骤：
以实施例1构建的ΔeseJ菌株为基础，通过基因间同源重组和细菌间接合转移，构建ΔeseJΔfimA-245—-50双缺失突变株，该双缺失株在保藏时添加野生型背景的菌株号，保藏名称为：鮰爱德华氏菌HSN-1ΔeseJΔfimA-245--50,英文名称为：Edwardsiella ictaluriHSN-1ΔeseJΔfimA-245--50。
鮰爱德华氏菌HSN-1的fimA-245—-50缺失序列引物如表1引物序列表所示。图2中示出了鮰爱德华氏菌基因缺失株的核酸检测图，图2中左图核酸检测所用引物为：eseJ-for与eseJ-rev；右图核酸检测所用引物为：fimA-245—-50-for与fimA-245—-50-rev。由图2可知，本发明构建的ΔeseJΔfimA-245—-50双缺失菌株构建成功。
实施例3
本实施例提供了ΔeseJ+GFP菌株的构建过程。
制备ΔeseJ电转感受态：
过夜培养ΔeseJ菌株后按1：50转接至20mL无抗BHI中，待OD540 nm达到0.5时，将ΔeseJ菌株置冰上冷却10min，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。用10mL冰冷灭菌ddH2O重悬菌体，冰上放置10min，4℃，4000rpm离心10min，弃上清，重复该操作3次后，用10mL冰冷灭菌10％甘油重悬菌体，冰上放置10min，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。用600μL冰冷灭菌10％甘油重悬菌体，分装至无菌的1.5mL EP管中，100μL/管。
电转化方法如下：
将ΔeseJ感受态细胞置冰上，加入2μL的表达GFP质粒pFPV25.1(该质粒由伦敦帝国理工学院David W.Holden教授馈赠)至ΔeseJ电转感受态细胞中，冰浴5min。小心混匀后转移至冰冷无菌的电极杯中(避免产生气泡)，用仪器预设好的大肠杆菌电转程序进行电击。电击后迅速加入800μL无抗BHI，置28℃摇床摇90min，使细胞恢复。取100μL上述菌液涂布至BHI+Col+Amp平板，28℃静置培养24h。挑取单克隆进行菌落PCR检测。测序正确的克隆即为ΔeseJ+GFP菌株，保种并冻存于-80℃。
采用与本实施例相同的方法分别构建了ΔeseJΔfimA-245—-50+GFP菌株和ΔfimA-245—-50+GFP菌株，冻存备用。
实施例4
本实施例提供了EPC细胞的复苏、培养传代和冻存过程。
鲤肠上皮瘤细胞(Epithelioma Papillosum Cyprini，EPC)是由本实验室保存(购自武汉大学典型物保藏中心)，用含10％胎牛血清(FBS)的M199培养基，在28℃且含5％CO2的培养箱中培养。
细胞的复苏，培养传代及冻存均要求无菌操作，具体步骤如下：
复苏：从液氮罐取出冻存的EPC细胞，迅速置于28℃水浴锅中，解冻后加入含10％FBS的M199培养基的T-25细胞培养瓶中，轻轻混匀，28℃，5％CO2静置培养4-6h，待大部分细胞贴壁后去除含DMSO的培养基，加入新鲜的含10％FBS的M199培养基，28℃，5％CO2静置培养；
培养传代：28℃，5％CO2条件下培养3-4天后细胞基本铺满瓶底，去除旧培养基，用灭菌PBS洗细胞1次，加入1mL胰酶，轻轻铺满瓶底，28℃静置消化3min，在显微镜下观察细胞，待细胞变圆分离，拍打细胞瓶使细胞脱落，加入4mL含10％FBS的M199培养基终止消化，反复吹打均匀后按照1:3比例传代；
冻存：细胞连续传代3-5次后，细胞状态良好可考虑冻存。移除旧培养基并用无菌PBS洗一次，1mL胰酶28℃消化3min，拍打脱落后加入4mL含10％FBS的M199培养基，吹匀后转入无菌15mL离心管，4℃，500g离心5min，去上清，加入4mL含10％DMSO的培养基(含10％FBS的M199培养基)重悬细胞，分装至1.8mL的细胞冻存管，封口膜封口后放入-80℃细胞冻存盒，次日放入液氮罐中冻存。
实施例5
本实施例提供了鮰爱德华氏菌野生型及突变株在EPC细胞中的繁殖力比较实验。
用鮰爱德华氏菌的不同菌株(野生型和实施例1获得的eseJ基因缺失突变株)感染EPC细胞，分别在感染过后1h，3h，5h用0.2％的Triton-X100裂解EPC细胞涂平板计数。具体步骤如下：
将细菌划线至BHI平板，并在感染前一天按照6×105/孔的密度将EPC细胞均匀种在24孔细胞培养板中，然后在28℃，5％CO2培养箱培养24h；感染前按照1:20比例转接过夜活化的细菌，28℃静置培养至OD540nm＝0.5(约4h)，根据感染孔数及感染复数(MOI＝5)计算所需菌量，并将细菌加入含10％FBS的M199培养基中，感染细胞(1mL/孔)，细胞板室温以1120rpm离心6min，感染后细胞在25℃，5％CO2培养箱培养30min；用预热M199培养基洗细胞3次(每次1mL/孔)，此时记为感染0h，然后用含100μg/mL庆大霉素的含10％FBS的M199培养基培养细胞1h后再换用含16μg/mL庆大霉素的10％FBS的M199培养基培养细胞。分别在感染过后的1h，3h，5h用0.2％的Triton-X100裂解EPC细胞涂平板计数。
计数结果参照图3所示，由图3可知，eseJ基因缺失突变株感染EPC细胞后，从EPC细胞裂解液中释放的细菌的数量在感染后3h和5h均显著低于野生型，表明eseJ基因缺失突变可以显著降低鮰爱德华氏菌在EPC细胞中的繁殖力。
实施例6
本实施例提供了鮰爱德华氏菌野生型及突变株对EPC细胞粘附实验。
用鮰爱德华氏菌不同菌株(包括WT+GFP菌株、ΔeseJ+GFP菌株、ΔfimA-245—-50+GFP菌株和ΔeseJΔfimA-245—-50+GFP菌株)感染EPC细胞，并对感染后EPC细胞上粘附的细菌进行免疫荧光染色后拍照(图4，上图)，统计粘附细菌数量(图4，下图)。具体步骤如下：
将细菌划线至BHI平板，并在感染前一天按照6×105/孔的密度将EPC细胞均匀种在底部添加盖玻片的24孔细胞培养板中，然后在28℃，5％CO2培养箱培养24h；感染前按照1:20比例转接过夜活化细菌，28℃静置培养至OD540nm＝0.5(约4h)，根据感染孔数及感染复数(MOI＝5)计算所需菌量，并将细菌加入含10％FBS的M199培养基中，感染细胞(1mL/孔)，细胞板室温1120rpm离心6min，感染后细胞在25℃，5％CO2培养箱培养30min；用预热M199培养基洗细胞3次(每次1mL/孔)，然后用4％PFA(多聚甲醛)(500μL/孔)4℃固定过夜；PBS洗EPC细胞2次以去除PFA,然后以抗荧光衰减的封片剂(ProLong Gold antifade reagent，Life Technologies Corporation)封片，在激光共聚焦显微镜下观察，拍照并统计视野中粘附细菌数量。
结果参照图4所示，由图4可知Ⅰ型菌毛操纵子的阻遏区突变后的菌株对EPC细胞的粘附力显著高于野生型菌株或ΔeseJ单缺失菌株(图4的上图为荧光显微镜下拍摄的粘附图，下图为对上图结果的计数统计分析)。
实施例7
本实施例提供了鮰爱德华氏菌野生株(HSN-1菌株)及双缺失突变株(ΔeseJΔfimA-245—-50菌株)对斑马鱼的粘附实验。
随机挑取受精后5天的斑马鱼幼鱼分装至6孔细胞培养板(40尾/孔)，小心吸去孔中的养殖用水，并用5mL ddH2O替换；提前划线鮰爱德华氏菌不同菌株(HSN-1菌株和ΔeseJΔfimA-245—-50菌株)，挑克隆28℃静置培养过夜，1:20转接至5mL新鲜培养基，28℃静置培养至OD540nm＝0.5左右，调整细菌加入含斑马鱼幼鱼ddH2O中(细菌终浓度为105、106和107CFU/mL)，轻轻混匀，28℃浸泡感染30min后，用ddH2O水洗两遍，将孔中的斑马鱼幼鱼放置于1mL的灭菌PBS，转移至匀浆器中充分研磨后涂平板计数。
计数结果参照图5所示，由图5可知，每尾斑马鱼幼鱼上粘附的突变型鮰爱德华氏菌的数量显著远高于粘附的野生型鮰爱德华氏菌的数量。
实施例8
本实施例提供了鮰爱德华氏菌双缺失突变株(实施例2构建的ΔeseJΔfimA-245—-50菌株)作为弱毒疫苗对黄颡鱼免疫保护力测定的实验。
所用黄颡鱼养殖鱼苗为杂交黄颡鱼黄优1号，体长约7cm，体重约7g，循环水室温养殖两周开始感染实验(水温为22±1℃)。
将鮰爱德华氏菌双缺失株划线至BHI平板，28℃培养48h后挑克隆至BHI液体培养基，28℃静置过夜培养后按照1：20比例转接至新鲜的BHI培养基中生长至OD540nm＝0.5，此时细菌浓度为2.5×108CFU/mL。
将菌液加入装有黄颡鱼的养殖水中，使细菌的终浓度为1×105CFU/mL，浸泡感染30min后，轻轻将黄颡鱼(5月龄)捞出在养殖水中清洗两遍后置于新的循环水养殖缸(体积220L)。浸泡免疫接种28天后，开展保护力测定实验。(在其他实施方式中，也可用于鲇形目鱼类苗种阶段的浸泡接种，使用相对较少的弱毒苗量(104CFU/mL数量级)即可使易感水产动物产生较高的免疫保护力。
提前将鮰爱德华氏菌野生型划线至BHI平板，28℃培养48h后挑克隆至BHI液体培养基，28℃静置过夜培养后按照1：20比例转接生长至OD540nm＝0.5，3500rpm室温离心10min后收集细菌，将菌添加入暂养黄颡鱼的水箱中，使细菌的终浓度为5×107CFU/mL(20倍半致死剂量)，浸泡感染30min后，轻轻将黄颡鱼捞出并在四个水箱中依次清洗后转移至循环水养殖缸(220L)。
同时，将未免疫组的黄颡鱼按照同样的方法处理30min后转移至新的循环水养殖缸(220L)。
记录黄颡鱼21天内的每天死亡的数量，获得双缺失突变株免疫过的黄颡鱼相对存活率约为75％。实验结果表明构建的此双缺失菌株有作为黄颡鱼疫苗在生产中使用的前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一株高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M2020561。
2.根据权利要求1所述的高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌，其特征在于，所述高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌为双缺失突变株，所述双缺失突变株同时缺失鮰爱德华氏菌Ⅰ型菌毛fimA基因上游的负调控区和鮰爱德华氏菌毒力岛Ⅲ型分泌系统的编码基因。
3.根据权利要求2所述的高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌，其特征在于，所述双缺失突变株的野生型菌株为鮰爱德华氏菌HSN-1。
4.根据权利要求2所述的高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌，其特征在于，所述负调控区为鮰爱德华氏菌Ⅰ型菌毛操纵子中fimA基因上游区段。
5.根据权利要求4所述的高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌，其特征在于，所述负调控区为鮰爱德华氏菌Ⅰ型菌毛操纵子的fimA基因的﹣245—﹣50 bp区域。
6.根据权利要求2所述的高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌，其特征在于，所述鮰爱德华氏菌毒力岛Ⅲ型分泌系统的编码基因为毒力基因eseJ。
7.一种高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌疫苗，其特征在于，其含有权利要求1-6任一项所述的高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌。
8.根据权利要求7所述的高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌疫苗，其特征在于，所述高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌疫苗为经济鱼类疫苗；
所述经济鱼类为鲇形目鱼类。
9.根据权利要求8所述的高侵袭力弱毒力鮰爱德华氏菌疫苗，其特征在于，所述鲇形目鱼类为黄颡鱼、斑点叉尾鮰、南方大口鲶、革胡子鲶和长吻鮠中的至少一种。
10.一种高侵袭力弱毒力爱德华氏菌的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：
先敲除爱德华氏菌的毒力岛Ⅲ型分泌系统的编码基因获得弱毒力爱德华氏菌，再敲除弱毒力爱德华氏菌I型菌毛操纵子的负调控区获得高侵袭力弱毒力爱德华氏菌；
或者先敲除爱德华氏菌I型菌毛操纵子的负调控区，再敲除爱德华氏菌的毒力岛Ⅲ型分泌系统的编码基因获得高侵袭力弱毒力爱德华氏菌；
所述毒力岛Ⅲ型分泌系统的编码基因为毒力基因eseJ，所述I型菌毛操纵子的负调控区为fimA基因的﹣245—﹣50 bp区域；
所述爱德华氏菌为鮰爱德华氏菌。
11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
以野生型爱德华氏菌的基因组为模板，分别扩增拟缺失的毒力基因eseJ的上游片段和下游片段，然后将上游片段和下游片段组合连接至自杀质粒中，转化大肠杆菌，获得阳性菌株1，将所述阳性菌株1与野生型爱德华氏菌共培养，经过两次同源重组，筛选获得爱德华氏菌eseJ缺失突变株；
以野生型爱德华氏菌的基因组为模板，扩增fimA上游负调控区的上游片段和下游片段，组合连接至自杀质粒中，转化至大肠杆菌，获得阳性菌株2，将筛选获得的大肠杆菌的阳性菌株2与所述爱德华氏菌eseJ缺失突变株共培养，经过两次同源重组，筛选得到双缺失突变株；
所述爱德华氏菌为鮰爱德华氏菌；fimA上游负调控区为fimA基因的﹣245—﹣50 bp区域。
12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，所述筛选获得爱德华氏菌eseJ缺失突变株包括：
分别设计引物扩增拟缺失的毒力基因eseJ的上游片段F1和下游片段F2，以F1和F2混合片段为模板，扩增获得eseJ基因的上游片段F1和下游片段F2组合片段F，将所述组合片段F与自杀质粒连接获得连接产物，转化至大肠杆菌获得阳性菌株，将所述阳性菌株与鮰爱德华氏菌HSN-1混合培养使得连接产物转移至鮰爱德华氏菌HSN-1发生同源重组，筛选出单交换的一次重组子，进行二次同源重组和脱质粒，筛选获得爱德华氏菌eseJ缺失突变株。
13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于，所述自杀质粒为pRE112。
14.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：以鮰爱德华氏菌HSN-1的基因组为模板，分别扩增拟缺失的毒力基因eseJ的上游片段和下游片段，然后将上游片段和下游片段组合连接至自杀质粒中，转化大肠杆菌，获得阳性菌株1，将所述阳性菌株1与鮰爱德华氏菌HSN-1共培养，经过两次同源重组，筛选获得鮰爱德华氏菌HSN-1eseJ缺失突变株；
以鮰爱德华氏菌野生型基因组为模板，扩增fimA上游负调控区的上游片段和下游片段，组合连接至自杀质粒中，转化至大肠杆菌，获得阳性菌株2，将筛选获得的大肠杆菌的阳性菌株2与所述鮰爱德华氏菌HSN-1 eseJ缺失突变株共培养，经过两次同源重组，筛选得到双缺失突变株；所述fimA上游负调控区为fimA基因的﹣245—﹣50 bp区域。
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