CN110407939A - 一种人源化抗psma单链抗体及其应用 - Google Patents

一种人源化抗psma单链抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种人源化抗PSMA单链抗体，包括由linker连接的重链和轻链，编码重链的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，编码轻链的核苷酸序列为：SEQ ID NO.2。为前列腺癌诊断、治疗和预后判断提供有效的抗体制剂。本发明与现有技术的PSMA鼠源单克隆抗体相比来源不同，避免了异源抗体用于人体的毒副作用。

Description

一种人源化抗PSMA单链抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种人源化抗前列腺癌特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)的单链抗体及其在前列腺癌的治疗和诊断中应用。
背景技术
单链抗体是一种新型的基因工程抗体，由抗体的重链可变区和轻链可变区通过一段短肽连接而成，其优点在于：(1)单链抗体的大小只有完整抗体的1/6，但是却完全保持了与抗原特异性结合的能力；(2)单链抗体的分子量小，其免疫原性更低，半衰期更短，更易于穿透肿瘤组织到达靴部位；(3)由于单链抗体缺少完整抗体的Fc段，因此其不易于含有Fc受体的靶细胞结合，从而提高了利用率；(4)易于基因操作和基因工程大量生产，故单链抗体在恶性肿瘤治疗和诊断中应用越来越受到重视。
单克隆抗体一般为鼠源性，鼠源性的单克隆抗体应用于人体治疗中存在诸多问题：(1) 不能有效地激活人体的补体和Fc受体相关的效应系统；(2)被人体免疫系统所识别产生人抗鼠抗体；(3)在人体循环系统中被很快清除掉；(4)完整的抗体分子，即Ig的相对分子量过大，难以穿透实体瘤组织，达不到有效的治疗浓度。以上原因导致使其介导的靶向治疗尚存在一些困难。因此，人源化单链抗体的研究是目前抗体研究的热点之一。人们利用基因工程技术制备的全人抗体能够克服鼠源性抗体带来的不便。
我国前列腺癌(prostate cancer,PCa)发病人数逐年增加，且以中晚期为主。雄激素阻断疗法(androgen deprivation therapy,ADT)是中晚期PCa主要治疗手段。然而，绝大多数患者在接受ADT治疗2～3年内由雄激素依赖性前列腺癌(androgen-dependentprostate cancer, ADPC)转化为生存期短、易转移和侵袭的去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)。目前国际上对CRPC还缺少有效的治疗手段。PSMA在前列腺肿瘤上皮细胞尤其是CRPC及其转移灶中有最高的表达，明显高于正常前列腺上皮细胞内的表达，但在前列腺外的正常组织中不表达。目前PSMA单克隆抗体已经开始用于PCa靶向治疗的研究。但是其鼠源性使其介导的靶向治疗尚存在一些困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种人源化抗PSMA单链抗体，解决了在治疗前列腺癌症的过程中动物源性抗体容易引起免疫损伤的问题，为前列腺癌靶向诊断及治疗奠定基础。
本发明是通过如下技术方案实现：
一种人源化抗PSMA单链抗体，包括由linker连接的重链和轻链，编码重链的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，编码轻链的核苷酸序列为：SEQ ID NO.2。
所述的人源化抗PSMA单链抗体的重链的氨基酸序列为：SEQ ID NO.3，轻链的氨基酸序列为：SEQ ID NO.4。
本发明的目的是提供一种人源化抗PSMA单链抗体的基因SEQ ID NO.5及氨基酸序列 SEQ ID NO.6，制备PSMA单链抗体，为前列腺癌诊断、治疗和预后判断提供有效的抗体制剂。
本发明一种编码人源化抗PSMA单链抗体通过如下方法得到：以人PSMA重组蛋白对全人源单链抗体噬菌体库进行4轮富集筛选。第4轮富集后的噬菌体抗体，以PSMA重组蛋白包被96孔板，用ELISA法对噬菌体培养上清进行筛选。共筛选克隆30个，以大于阴性对照A值的2倍作为阳性标准。其中有3个克隆呈阳性，阳性率为10％。抗体可变区基因扩增后由苏州金唯智公司测序获取序列。
本发明具有如下的有益效果：利用抗体库筛选技术获得与PSMA特异性结合的人源化单链抗体，重链核苷酸序列与人免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列同源性为94.68％，轻链核苷酸序列与人免疫球蛋白轻链核苷酸序列同源性为97.22％。3个阳性克隆测序结果显示核酸序列基本一致。Western Blot鉴定结果显示筛选出的单链抗体能与PSMA天然蛋白特异性结合。与现有技术的PSMA鼠源单克隆抗体相比来源不同，避免了异源抗体用于人体的毒副作用。单链抗体是小分子的抗体，具有分子量小、免疫原性低等优点，克服了以往用于治疗前列腺癌单克隆抗体的分子量大，免疫原性高的缺点。利用该抗体进行前列腺癌的靶向治疗，可提高治疗的有效性。
附图说明
图1是噬菌体单链抗体Western Blot鉴定；其中1,2:PSMA阳性单克隆抗体；3,4:单链噬菌体抗体。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明提供的人源化抗PSMA单链抗体的结构、制备工艺和应用进行详细的说明。本发明的实施例涉及的材料：全人源单链抗体噬菌体库，VCSM13 辅助噬菌体，OMNImax细菌(胡川闽教授馈赠)；PSMA重组蛋白(北京义翘神州生物技术有限公司)；HRP标记抗M13抗体,(sino公司)；胰化蛋白胨和酵母提取物(Oxoid公司)，氨苄青霉素(Amp)、四环素(Tet)、卡那霉素(Kan)、Tween20和PEG(Sigma公司)；PSMA 单克隆抗体(CST公司)，辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)， ECL显色剂(碧云天生物科技公司)，免疫管(Nunc公司)，质粒小量提取试剂盒(Tiangen)。
本发明的具体实施方式主要流程是：以PSMA重组蛋白对全人源单链抗体噬菌体库进行4轮富集筛选；以PSMA重组蛋白包被96孔板，用ELISA法对第4轮富集后的噬菌体培养上清进行筛选。阳性克隆通过抗体可变区基因扩增后送苏州金唯智公司测序获得核苷酸序列。利用NCBI中的Nucleotide Blast分析软件进行同源性比较。进一步通过Western Blot的方法对阳性克隆进行鉴定。下面结合具体的单链抗体筛选方法对本发明做详细说明，所述的是对本发明的解释而不是限定。本发明具体按照以下步骤实施。
实施例1：利用PSMA抗原对噬菌体库进行富集筛选
0.05mol/L碳酸盐缓冲液将PSMA重组蛋白稀释成10μg/mL抗原包被液。1mL抗原包被液包被免疫管,4℃过夜。次日弃取包被液，2.5％的脱脂奶粉TBST溶液，加满免疫管， 37℃封闭2h。封闭结束后，弃取封闭液，PBST漂洗10次。向免疫管中加入已经测定滴度的噬菌体单链抗体库1mL(库容量约1011CFU),37℃孵育2h。抗体库孵育结束后，吸去噬菌体抗体液,以PBST漂洗10次。向免疫管中加入0.05mol/L的Gly-HCl溶液1mL，室温5min，将于抗原结合的噬菌体洗脱下来，向洗脱液中加125μL 2mol/L Tris溶液，使洗脱液pH值变成中性。洗脱液全部加入10mL OD600在0.6～0.8之间的工程菌OMNImax中，37℃静置30min，洗脱液中的噬菌体感染工程菌。静置结束后，留部分菌液，测定筛选出库量。静置结束后，向剩余菌液中加入10μL VCSM13辅助噬菌体37℃孵育30min。静置结束后，全部菌液转接到40mL含Amp，Kan抗性的2YT培养基中37℃，200转/分钟震荡培养过夜。次日离心取上清加入1/5体积的PEG冰浴1h，12000转/分钟弃掉上清，PBS重悬沉淀，作为下一次筛选的工作库。继续重复以上筛选过程4轮。计算每次筛选出库入库比。第四轮筛选的洗脱感染菌液涂布Amp平皿用于诱导单克隆噬菌体。
以PSMA重组蛋白对全人源scfv噬菌体抗体库进行了4轮富集筛选，四轮出库量分别为1.5×106cfu/mL，6.7×106cfu/mL，4.5×107cfu/mL，1.8×108cfu/mL。入库量分别为1.6×1011cfu/mL，1.4×1011cfu/mL，1.8×1011cfu/mL，2×1011cfu/mL。结果显示，通过4轮富集，阳性克隆得到选择扩增，每轮富集洗脱下来的噬菌体抗体量逐渐增加。
实施例2 Phage ELISA鉴定scFv特异性
从第4轮富集筛选后的平板上随机挑选30个克隆过夜培养。次日保留菌种，并重新震荡活化，待活化菌液生长至对数期，感染辅助噬菌体，补充Kan抗性过夜诱导噬菌体。酶标板过夜包被重组PSMA抗原。次日以诱导噬菌体作为一抗，HRP标记抗M13抗体进行ELISA 检测。
第4轮富集后的噬菌体抗体，以PSMA重组蛋白包被96孔板，用ELISA法对噬菌体培养上清进行筛选。共筛选克隆30个，以大于阴性对照A值的2倍作为阳性标准。其中有3个克隆呈阳性，阳性率为10％。
实施例3核酸序列的测定及同源性分析。
上述3个阳性 克隆经抗体可变区基因扩增后由苏州金唯智公司测序获取序列。用NCBI 中的Nucleotide Blast分析软件进行同源性比较。结果显示：
重链核苷酸序列与人免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列同源性为94.68％，
轻链核苷酸序列与人免疫球蛋白轻链核苷酸序列同源性为97.22％。
3个阳性克隆测序结果显示核酸序列基本一致。编码重链的核苷酸序列如SEQ IDNO.1 所示，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
用NCBI中的Nucleotide Blast分析软件进行同源性比较。结果显示：
重链氨基酸序列与人免疫球蛋白重链可变区氨基酸序列同源性为88.33％。
轻链氨基酸序列与人免疫球蛋白轻链氨基酸序列同源性为92.86％。
编码重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.4 所示。
同源性分析表明编码人源化抗PSMA单链抗体的核苷酸及氨基酸序列尽管与其他基因序列有一定的同源性，但未发现与本发明完全相同的基因序列，表明本发明在基因和氨基酸序列上具有唯一性。
实施例4人源化抗PSMA单链抗体与抗原结合活性的检测。
RIPA提取表达PSMA抗原的LNCaP细胞蛋白(阳性对照组)及不表达PSMA抗原的 PC-3细胞蛋白(阴性对照组)，测蛋白浓度。取40μg蛋白上样，经10％SDS-PAGE电泳分离后，将蛋白转至PVDF膜，5％脱脂牛奶封闭液中，室温摇床上轻轻摇动1h。分别加入噬菌体抗体及PSMA阳性单克隆抗体4℃过夜孵育，用TBST洗膜3次。分别加入HRP标记的抗M13单抗及HRP标记羊抗兔二抗室温孵育1h，TBS洗膜3次。采用ECL发光液显色。
Western Blot的结果显示：噬菌体单链抗体与抗PSMA单克隆抗体与阳性对照组均有结合带(见图1)，阴性对照组无结合条带。结果表明，所筛选到的噬菌体单链抗体能与PSMA抗原结合，具有特异性。
实施例5基于人源化抗PSMA单链抗体的序列分析和活性检测，设计构建以下生物制品
1)本发明的人源化抗PSMA单链抗体可与放射性核素连接用于前列腺癌的显像定位诊断，由于单链抗体廓清速度快，穿透力强，在放射显像时，放射性核素排除较快，对身体危害小，因此是较为理想的显像定位诊断载体。
2)本发明的人源化抗PSMA单链抗体与抗肿瘤药物连接，利用单链抗体分子量小，穿透力强的特点，将药物带入肿瘤细胞，发挥而抑制肿瘤细胞生长。
3)可根据本发明的基因序列及其编码的氨基酸序列，制备针对PSMA功能表位的其它生物制品。
本发明的内容不限于实施例中所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林医药学院
<120> 一种人源化抗PSMA单链抗体
<130> 2019
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 451
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cgaggctgct gcaattctat ttcaggagac agtcataatg aaatacctat tgcctacggc 60
agccgctgga ttgttattac tcgcggccca gccggccatg gccgaggtgc agctgttgga 120
gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg 180
attcaccttt agcagctatg ccatgagctg ggtccgccag gctccaggga aggggctgga 240
gtgggtctca tctattaatg taaagggtct ggtaacagcg tacgcagact ccgtgaaggg 300
ccggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct 360
gagagccgag gacacggccg tatattactg tgcgaaaggt ccgctgcttt ttgactactg 420
gggccaggga accctggtca ccgtctcgag c 451
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<212> DNA
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cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcaa cagtctagta tgtttcctat tacgttcggc 300
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
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20 25 30
Pro Ala Met Glu Thr Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
50 55 60
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Glu Thr Ser Trp Val Arg Gln Ala
65 70 75 80
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Val Lys Gly Leu
85 90 95
Val Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
100 105 110
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115 120 125
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Pro Leu Leu
130 135 140
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 4
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
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1 5 10 15
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Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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180 185 190
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210 215 220
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225 230 235 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
245 250 255
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Met Glu Thr Phe
260 265 270
Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala
275 280 285

Claims (4)

1.一种人源化抗PSMA单链抗体，包括由linker连接的重链和轻链，其特征在于：编码重链的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1，编码轻链的核苷酸序列为：SEQ ID NO.2。
2.如权利要求1所述的人源化抗PSMA单链抗体，其特征在于：重链的氨基酸序列为：SEQID NO.3，轻链的氨基酸序列为：SEQ ID NO.4。
3.如权利要求1或2所述的一种人源化抗PSMA单链抗体用于前列腺癌诊断、治疗和预后判断。
4.如权利要求1所述的一种编码人源化抗PSMA单链抗体通过如下方法得到：其特征在于，以人PSMA重组蛋白对全人源单链抗体噬菌体库进行4轮富集筛选，第4轮富集后的噬菌体抗体，以PSMA重组蛋白包被96孔板，用ELISA法对噬菌体培养上清进行筛选，共筛选克隆30个，以大于阴性对照A值的2倍作为阳性标准，其中有3个克隆呈阳性，阳性率为10％，抗体可变区基因扩增后测序获取基因序列SEQ ID NO.5。
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