CN101233236A - 抗细胞表面前列腺特异性膜抗原的单克隆抗体和单链抗体片段 - Google Patents

抗细胞表面前列腺特异性膜抗原的单克隆抗体和单链抗体片段 Download PDF

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Abstract

分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合肿瘤细胞表面的天然形式的前列腺特异性膜抗原，特征在于，其与标记物或细胞毒剂连接，或被构建为双特异性抗体或重组双抗体的一部分。

Description

抗细胞表面前列腺特异性膜抗原的单克隆抗体和单链抗体片段
前列腺癌是男人最常被诊断出的癌症，也是西方社会第二大常见死因。前列腺癌进展超过可切除范围时，目前没有治愈性的治疗。由于与疾病的进展相关的显著病死率和发病率，所以迫切需要新的靶向治疗。与其它器官系统的癌症相比，前列腺癌是抗体治疗的极好靶，原因包括：i)前列腺表达组织特异性抗原，ii)前列腺是一个非必需器官，它的破坏不会伤害到宿主，iii)转移的部位是接受高水平循环抗体的淋巴结和骨，iv)前列腺特异性抗原(PSA)的血清水平提供了一种指标(means)来监测治疗反应。
几个已鉴定的前列腺癌候选标记物中，前列腺特异性膜抗原(PSMA)似乎是最突出的。这种大约100KD的II型跨膜糖蛋白由胞内短片段(氨基酸1-18)，跨膜区(氨基酸19-43)，和大胞外域(氨基酸44-750)组成。PSMA可以作为免疫治疗的有用靶，因为它符合以下标准：i)表达主要局限于前列腺，ii)PSMA是在疾病的所有阶段大量都表达的蛋白，iii)它位于细胞表面，但不会脱落进入循环，iv)表达与酶活性或信号传导活性相关。PSMA也在大多数其它实体瘤的新生血管系统中表达，因此可以作为特异性抗血管生成给药的靶。
由于它们的靶向特异性，主要重点在于开发癌症医学的诊断和治疗应用中的单克隆抗体(mAb)。然而，体内使用单克隆抗体因其大小和免疫原性而伴有严重问题。因此，研究集中在研发更小、副作用更少、更易接近肿瘤、清除率更快的治疗性抗体。基因工程使构建单链抗体片段(scFv)变成可能，它是癌症治疗的潜在强大工具。这些小的抗体由轻链可变区(VL)和重链的可变区(VH)通过连接肽连接而构成。它的免疫原性很小，几乎没有毒性，清除率增加，肿瘤摄取率增加，并且对肿瘤细胞的穿透更好。重组鼠scFv可以用特异性免疫的小鼠的杂交瘤或脾细胞制得的表达文库按照标准方法来构建[Chowdhury等，Mol.Immunol.4(1997)，p.9-20]。
首个被公开的抗PSMA mAb(7E11-C5)靶向该蛋白的胞内区，且具有高度的前列腺特异性[Horoszewicz等，Anticancer Res.7(1987)，p.927-935]。抗PSMA胞外域的单克隆抗体也已在用该抗原免疫后产生。然而，这种抗原对固相细胞和组织切片的结合与其对肿瘤活细胞的结合还是有不同的。
前列腺特异性膜抗原(PSMA)是一种在正常前列腺和前列腺癌中都高水平表达的前列腺标记物。其表达在前列腺癌中增加、且主要见于前列腺。
前列腺特异性膜抗原(PSMA)是一种独特的膜结合细胞蛋白，它在前列腺癌以及在多种其它实体瘤的新生血管系统中过表达，但不在正常组织的脉管系统(vasculature)中过表达。PSMA的这种独特表达使其成为一种重要的标记物，而且成为多种显像剂的胞外大靶点。
PSMA可以作为递送细胞毒素或放射性核素等治疗剂的靶点。PSMA有叶酸水解酶和N-乙酰基化α-连接的酸性二肽酶(NAALADase)的特有功能，还发现它象其它膜结合受体一样通过网格蛋白包被的小窝来循环。
从市场上购买到的“”是抗PSMA单克隆抗体(mAb)7E11的一种放射-免疫偶联形式，现在用来诊断前列腺癌的转移和复发。单克隆抗体7E11-C5.3识别的PSMA表位位于前列腺特异性膜抗原的胞浆区。
然而也有关于PSMA在非前列腺组织包括肾，肝和脑中表达的报道。对此的一种可能解释由O′Keefe等，(Prostate，2004，February 1；58(2)200-10)提出，即有一种PSMA样基因与PSMA基因在核酸水平有98％的同一性，它在肾和肝中受不同于PSMA基因的启动子控制而表达。
WO 01/009192描述了抗前列腺特异性膜抗原的人单克隆抗体的开发。人抗PSMA单克隆抗体通过用纯化的PSMA或富含PSMA的制剂免疫小鼠来制得。这样的纯化抗原是变性的PSMA，因为它是在用离子型表面活性剂裂解细胞后经免疫吸附纯化得到的。
WO 97/35616描述了特异针对前列腺特异性膜抗原胞外域的单克隆抗体。免疫是用C末端肽或表达PSMA的肿瘤膜制剂进行的。这些mAb并不与PSMA表达细胞特异性结合，因此不能用于诊断或治疗目的。
Bander等，Seminars in Oncology，2003，pp 667-677和US 2004/0213791各自公开了针对前列腺特异性膜抗原的单克隆抗体。因为免疫是用纯化的抗原完成的，因此这些单克隆抗体不具有高水平的细胞结合，也无法从这些单克隆抗体获得ScFv。
WO 98/03873描述了与US 2004/0213791相同的抗体或其识别前列腺特异性膜抗原胞外域的结合部分。但看不出这些抗体的这些结合部分确实与该抗原发生结合。
Fracasso等，The Prostate，2002，pp 9-23描述了与蓖麻毒蛋白A链化学偶联的抗PSMA单克隆抗体。其中所述构建体并不与所述靶特异性结合，它们有通常所述的由免疫毒素制备所带来的缺点。
本发明一个目的是提供有效工具(superior means)和构建体，它们有助于以较高可靠性将表达PSMA或相似蛋白的肿瘤细胞和健康细胞与PSMA-阴性细胞区分开来。这种构建体可用于更特异性地靶向前列腺癌。
另一个目的是提供破坏表达PSMA的前列腺癌细胞的构建体。
前列腺-特异性膜抗原(PSMA)是前列腺癌免疫疗法的引人注目的靶。然而，在前列腺细胞上表达的PSMA具有特定的三级和四级结构，用分离的变性PSMA产生的抗体并不能有效识别表达PSMA的肿瘤细胞。结合变性PSMA的抗体和scFv可以用分离的纯化抗原免疫获得。然而，本发明可用另一种免疫方法产生抗天然细胞性PSMA的高亲和力抗体和scFv，该方法仅得到低产量的阳性克隆。只有后一种用天然PSMA产生的抗体可以与细胞表面的PSMA反应，并可用作诊断和治疗的工具。
本发明的单克隆抗体(mAb)、单链抗体片段(scFv)和双抗体(diabody)用常规方法从小鼠脾细胞制备。但所述小鼠已经用含全长天然PSMA的LNCaP细胞和LNCaP细胞裂解物免疫。在本发明优选实施方案中，用称为M-PER的裂解缓冲液处理细胞(优选LNCaP细胞)，获得称为全长天然PSMA的抗原，所述M-PER是从Pierce，Roquefort，Illinois购买的哺乳动物蛋白提取试剂。M-PER缓冲液利用的是溶于25mM N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)缓冲液(pH 7.6)中的专有去污剂(proprietory detergent)。用PSMA-阴性DU 145前列腺细胞进行吸附，之后对PSMA-阳性LNCaP细胞进行流式细胞术，结果筛选出杂交瘤和scFv。另外，测试它们对纯化PSMA的反应性。用LNCaP和PSMA-转染的DU 145进行流式细胞术，并用糖基化和去糖基化的纯化PSMA进行western印迹，来鉴定所得的单克隆抗体和scFv。另外，用LNCaP细胞进行免疫细胞学检查(immunocytology)，对前列腺癌样品的石蜡切片进行免疫组化分析。
在本发明中，可获得三种mAb(3/F11，3/A12和3/E7)，它们与活LNCaP细胞和PSMA-转染的DU 145细胞有反应，但与其它不表达PSMA的细胞系无反应。与LNCaP细胞的结合很强。在饱和浓度(100nM)的PE平均荧光强度(MFI)介于1000到1600之间。天然形式(ELISA)比变性、去糖基化的蛋白(western印迹)对纯化PSMA的反应性更强。用mAb E7对石蜡切片进行免疫组化分析表明，上皮细胞是特异性阳性的。
通过基于LNCaP细胞和纯化PSMA筛选重组噬菌体，从mAb 3/A12获得两种scFv，称为E8和A5。scFv E8的序列等同于scFv A4，后者从同一小鼠的B细胞文库获得。ScFv E8对LNCaP细胞有强反应性，在饱和浓度显示约100的MFI，而scFv A5的MFI在相同浓度为约40。用其它缺乏PSMA表达的细胞系未发现结合或仅有最低结合。这两种scFv与纯化、变性的糖基化和去糖基化PSMA的结合都很弱。进一步地，从mAb 3/F11获得称为D7的scFv，从mAb 3/E7获得称为H12的scFv。
本申请描述了三种mAb，它们与其他作者公开的那些mAb不同在于高结合亲和力以及对表达PSMA的前列腺癌细胞的强染色。免疫荧光细胞学检查，以及共焦激光扫描显微镜检(confocal laser scanning microscopy)都表明，抗体3/F11、3/A12和3/E7不仅有高结合活性，而且内化到LNCaP细胞中。这些mAb用全长天然PSMA免疫获得，这与公开的多种免疫方法不同。
用纯化且变性的PSMA免疫也获得了mAb，它们高度特异于该抗原，但仅有限度地结合表达PSMA的LNCaP细胞，并且不被内化到细胞中。这些对照数据未在本申请中显示。文献中还描述了一些抗-PSMA mAb。然而，它们的平均荧光强度值比本发明抗体低得多。
与mAb的情况类似，用变性和天然的PSMA免疫也产生抗-PSMA scFv。用变性PSMA获得的scFv高度特异于该抗原，但不结合LNCaP细胞(本申请中没显示数据)。与此相比，用天然PSMA获得的scFv，其细胞结合活性高、但与分离的变性抗原的结合差。
然而，在本试验和其它试验中，用化学连接的免疫毒素发现的问题在于，产生抗这些免疫毒素的抗体、肝毒性和血管渗漏综合征，以及难于大量产生指定物质。用重组DNA技术克服了(至少部分克服了)这些问题，这种技术使得有可能构建免疫原性较低、分子量较小的免疫毒素，且更容易大量制备免疫毒素。据信，小分子蛋白比大偶联物更容易穿透肿瘤。因此，通过将scFvE8、H12、D7和A5的编码序列与毒素PE40融合，构建了重组免疫毒素。重要的发现是，所有重组免疫毒素以剂量依赖性方式有效杀死培养的前列腺癌细胞。强力杀伤作用不仅可见于高结合性E8-融合蛋白(IC50为约0.05nM)，还见于低结合性A5-融合蛋白(IC50为约0.09nM)。对不表达PSMA的前列腺癌细胞的杀死作用差2000多倍。这可能是由于免疫毒素制剂中残余的细菌蛋白质或其它毒性制剂，因为相同的背景仅见于同样高浓度的scFv。术语IC50是指，毒素使细胞增殖降低到不加毒素时细胞增殖的50％所需的nM浓度。
本申请所述抗体和scFv特异性结合天然细胞表面的PSMA，因此对于用PSMA作为前列腺癌的靶抗原进行诊断和治疗具有意义。
因为PSMA以特定的三级和四级结构表达在前列腺癌细胞上，只有抗这种细胞构象的抗体会识别并强力结合前列腺癌活细胞和表达PSMA的组织。因此，本研究的目的是产生这种可用于治疗性和诊断性靶定前列腺癌的mAb和scFv。
因此，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，它们与肿瘤细胞表面的天然形式的前列腺特异性膜抗原结合，并且它们与标记物或细胞毒剂连接。
术语“分离的单克隆抗体”指包含由二硫键连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(简称VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链区可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可以进一步分为高变区，也称互补决定区(CDR)，其间插有更保守的区，也称框架区(FR)。每个VH和VL区由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端到羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区包括与抗原相互作用的结合区。
图13，14和20，21中，用灰色方框标记CDR。这些区域对于单克隆抗体或其抗原结合部分的结合是重要的。其它区域是框架区，它们可被其它序列置换，条件是，结合所需的三维结构不受干扰。如果该构建体的结构改变，与抗原的结合将不足。小鼠来源的单克隆抗体可引起不良免疫副作用，因为它们包含另一个物种的蛋白，所述蛋白可能诱发抗体。为克服这个问题，可以将所述单克隆抗体或其抗原结合部分人源化。单克隆抗体的人源化方法是本领域公知的。小鼠mAb的框架区被对应的人框架区替换。为维持优选的结合特性，CDR的序列应尽可能保留。然而，可能需要进行一些氨基酸改变来使结合特性最优化。本领域技术人员可以用标准做法来达到此目的。另外，由于引入人框架，可能需要进行氨基酸改变和/或缺失来改进构建体的性质。
术语单克隆抗体的“抗原结合部分”指所述抗体的一或多个片段，所述片段保留特异性结合天然形式的前列腺特异性膜抗原的能力。抗体的抗原结合部分的例子包括，Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，F(ab′)2片段，包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段，由VH和CH1结构域组成的Fd片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成的FV片段，由VH结构域组成的dAb片段，和分离的互补决定区(CDR)。
本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分在用于治疗目的时优选被肿瘤细胞内化。用于诊断目的时，可不必内化。
本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分强力结合LNCaP细胞，而不是未表达前列腺特异性膜抗原的细胞。
分离的单克隆抗体或其抗原结合部分的结合用PE荧光强度(MFI)来计量，具体是，在饱和浓度时，scFv的MFI优选等于或高于40，mAb优选高于1000。
分离的单克隆抗体或其抗原结合部分与天然PSMA的结合特性如下进行比较：LNCaP细胞先用浓度递增的抗-PSMA Ab处理，再与PE-标记的抗体一起温育。从所得的饱和曲线可读出达到PSMA位点50％饱和度的抗体浓度。三种mAb 3/F11、3/A12和3/E7在约16nM(3/F11)、2nM(3/A12)和30nM(3/E7)显示了达到PSMA位点50％饱和度的高结合活性。scFv达到PSMA位点50％饱和度的浓度是10nM(E8)和60nM(A5)。
为确定结合强度，测量PE(藻红蛋白)荧光强度(MFI)。将MFI值相对抗体(或其结合片段)浓度作图，其中MFI的平台值对应于抗原100％饱和。在确定上限值(对应于100％抗原饱和的平台)后，可以很容易地确定对应于50％饱和度的值。用该图表可找出所述抗体或其结合片段的相应nM浓度。
分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含标记物(label)，其可以是发射放射性辐射(radioactive radiation)的粒子。这种粒子可以是放射性元素，它可以与构建体连接、优选形成复合物。例如，标记了111铟的mAb在检测前列腺癌患者的远端转移性肿瘤时可以用作放免液闪剂(radioimmunoscintigraphyagent)。当然，可以使用其它合适的放射性元素，如35S或131I。
或者，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可包含细胞毒剂(cytotoxicagent)，其为选自如下的细胞毒性物质，毒素(toxin)，例如紫杉醇(taxol)，松胞菌素(cytocalasin)B，短杆菌肽(gramicidin)D，溴化乙锭(ethidium bromide)，依米丁(emetine)，丝裂霉素(mitomycin)，依托泊苷(etopside)，替尼泊苷(tenopside)，长春花新碱(vincristine)，长春花碱(vinblastine)，秋水仙素(colchicin)，阿霉素(doxorubicin)，柔红霉素(daunorubicin)，二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy antracin dione)，米托蒽醌(mitoxantrone)，光辉霉素(mithramycin)，放线菌素D(actinomycin D)，1-脱氢睾酮(1-dehydrotestosteron)，糖皮质激素类(glycocorticoids)，普鲁卡因(procain)，丁卡因(tetracaine)，利多卡因(lidokaine)，普萘洛尔(propranolol)和/或嘌呤霉素(puromycin)。
在本发明优选实施方案中，分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含，来自SEQ ID NO：1(scFv E8)、SEQ ID NO：10(scFv A5)、SEQ ID NO：20(scFvH12)和/或SEQ ID NO：22(scFv D7)的至少10个连续氨基酸的部分氨基酸序列。在优选实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合部分分别包含，来自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20和/或SEQ ID NO：22的至少25个、或更优选至少35个、最优选至少50个连续氨基酸。
在优选实施方案中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含，SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：7和/或SEQ ID NO：11-16所示CDR中的至少一个。更优选所述构建体包含这些CDR序列中的至少3个、更优选至少5个。类似地，可以从指明了CDR序列的图20和21得出CDR。
本发明另一方面提供了可用于制备单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。SEQ ID NO：8和9涉及scFv E8，SEQ ID NO：17和18涉及scFv A5。SEQID NO：19和23涉及scFv H12，SEQ ID NO：21和24涉及scFv D7。所述序列报导了编码链及其互补链。SEQ ID NO：9和18以5′→3′方向显示。本发明多核苷酸包含选自SEQ ID NO：8，9，17，18，19，21，23和24的至少20个、优选50个、更优选75个、最优选至少100个连续核苷酸的序列。尤其优选编码所述CDR的序列。
本发明一方面提供了药物组合物，其包含本申请所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。本发明药物组合物包含单克隆抗体或其抗原结合部分，以及可药用添加剂。优选将这种组合物制成用于肌肉或静脉注射。或者，可提供包含所述抗体的储库制剂(depot formulation)，其允许在一段时间(优选1-6个月)内缓释(sustained release)生物活性剂。这样的缓释配制剂可包含生物可降解的聚合物，如聚乳酸，或聚乳酸/聚乙醇酸交酯共聚物，其在人体内经过长(prolonged)时间被降解，从而使所述抗体或其抗原结合部分(优选具有toxine)以可控方式在一段时间内释放。
分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可用于制备治疗癌症、尤其是前列腺癌的药物。
或者，本发明提供用于检测肿瘤细胞的诊断试剂盒，其包含分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。在这样的实施方案中，使用标记物以便可以通过合适的检测装置来检测构建体。
本发明也提供体外鉴定肿瘤细胞的方法，在所述方法中，待鉴定的肿瘤细胞与携带标记物的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分接触，所述标记物可用合适的分析装置来检测。所述标记物允许对肿瘤细胞进行诊断性鉴定，所述细胞例如是手术或活检所得人体组织的切片中的细胞。
附图说明
图1：mAb 3/F11、3/A12和3/E7的FACS分析，所述mAb在饱和浓度与表达PSMA的LNCaP细胞的表面结合。
图1a-c：mAb 3/F11(a)、3/A12(b)、3/E7(c)的抗原饱和曲线。
图2：免疫荧光细胞学：a)mAb 3/F11、b)mAb 3A/12、c)3E7与LNCaP细胞的结合。左图显示用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行的对照染色。
图3：免疫荧光细胞学：a)mAb 3/F11、b)mAb 3A/12、c)3E7在LNCaP细胞中的内化。左图显示用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行的对照染色。
图4：用纯化的PSMA和mAbs 3/E7、3/A12、3/F11进行的Western印迹。
图5：用糖基化和去糖基化的PSMA以及mAb 3/A12进行的Western印迹。
图6：前列腺癌石蜡切片上的mAb 3/E7的免疫组织化学。
图7a/b：表达PSMA的LNCaP细胞上饱和浓度的scFv E8(a)和A5(b)的FACS分析。
图7c/d：scFv E8(c)和A5(d)的抗原饱和曲线。
图8：用纯化的PSMA以及scFv A5和E8进行的Western印迹。
图9：在LNCaP细胞上的scFv E8的免疫细胞学检查。
图10：免疫毒素E8-P40的构建。
图11：重组免疫毒素E8-P40对LNCaP细胞的细胞毒效应。
图12：重组融合蛋白A5-P40对LNCaP细胞的细胞毒效应。
图13：scFv E8的DNA序列和氨基酸序列，其中标出了CDW区。
图14：scFv A5的DNA序列和氨基酸序列，其中标出了CDW区。
图15：此图显示scFv A5、H12和D7与PSMA-阴性的DU145细胞(A)以及与PSMA-阳性的LNCaP细胞的结合(A5＝B，H12＝C，D7＝D)。细胞用这些mAb以及PE-偶联型抗小鼠IgG mAb染色。频率分布图(histogramms)显示了流式细胞仪上的PE荧光的对数。阴性对照仅使用了第二抗体。
图16：scFv A5、H12和D7与PSMA-阴性的BOSC细胞(A)以及与转染了PSMA的BOSC细胞的结合(A5＝B，H12＝C，D7＝D)。细胞用scFv抗c-myc mAb和PE-偶联型抗小鼠Ig染色。频率分布图显示了流式细胞仪上的PE荧光的对数。阴性对照仅使用了第二抗体。
图17：显示了重组免疫毒素HE12-PE40对LNCaP细胞(黑)和DU细胞(白)的细胞毒效应。
图18：示意了A5-CD3双抗体的构建方案。
图19：显示了从scFv A5构建的不同浓度的双抗体(A5/CD3)和外周血淋巴细胞(效靶比10∶1)在与LNCaP细胞温育48h后对LNCaP细胞的细胞毒效应。
图20：显示scFv H12的序列。氨基酸序列以单字母代码示于第一排(对应于SEQ ID NO：20)。编码链在第二排(SEQ ID NO：19)，互补链在第三排，此序列对应于SEQ ID NO：23。各个CDR具体是CDR H1、H2、H3、L1、L2和L3。编码这些CDR区的核酸序列用灰底表示。
图21：显示scFv D7的序列。氨基酸序列以单字母代码示于第一排。此序列对应于SEQ ID NO：22。核酸链显示在第二排，此序列对应于SEQ IDNO：21，其互补链显示在第三排，此序列对应于SEQ ID NO：24。CDR区H1、H2、H3、L1和L2都在该序列中示出。编码这些区的核酸序列用灰底表示。
本发明进一步通过如下实施例来进行说明。
实施例1
a)制备PSMA
从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，Rockville，MD，USA购买人前列腺癌细胞系LNCaP，DU 145，PC-3和HeLa以及杂交瘤7E11-C5.3(IgG1-k，PSMA)。在37℃、5％CO2的潮湿环境将LNCaP、DU 145和HeLa培养在RPMI 1640培养基中，PC-3培养在F12Nutrimix培养基中，两种培养基都补充了青霉素(100000U/l)，链霉素(100mg/l)和10％胎牛血清(FCS)。为了产生在表面表达未糖基化的PSMA的LNCaP细胞，将2μg/ml衣霉素(ICN Biomedicals)加入培养基维持48h。
通过用4％多聚甲醛(paraformaldehyd)室温(RT)处理10分钟获得固定的LNCaP细胞，然后用PBS充分洗涤。
为制备纯化的PSMA，用PBS洗涤108个LNCaP细胞，然后，在含1％IGEPAL的PBS中室温裂解20分钟。在10,000g离心后，将上清加入7E11-C5亲和层析柱(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，用含有1％TritonX-100的pH 2.5的100mM甘氨酸缓冲液洗脱PSMA。中和后，该蛋白用PBS进行充分透析(extensively dialyzed)。
为制备去糖基化的PSMA，将1/10体积的糖蛋白-变性缓冲液(BioLabs)加入含纯化PSMA的溶液，在100℃加热10分钟。然后加入1/10体积的10％NP-40(10％)和50U PNGase/μgPSMA，并在37℃温育1小时。
为了制备含全长天然PSMA的LNCaP细胞裂解物，用M-PER试剂(Pierce)裂解细胞10分钟，然后在4℃以15,000rpm离心30分钟。收集含天然全长PSMA的上清(M-PER-裂解物)。此裂解物的高分子级分(100-600KD)在Biosil 250大小排阻柱上通过HPLC分离。
b)将全长PSMA转染到DU 145和PC3细胞中
将全长PSMA克隆为载体pCR3.1(Invitrogen)中的两个片段(片段1从bp262到位于bp 1573的唯一EcoRI酶切位点；片段2从位置1574到2512)。根据生产商的说明，通过将含4μg DNA和10μl Lipofectamine(Invitrogen)的500μl RPMI培养基加入106个细胞进行瞬时转染。温育48小时后，用这些瞬时转染的细胞进行测试。
实施例2
对小鼠进行免疫
用来自LNCaP细胞的300μg M-PER裂解物、或该裂解物的高分子HPLC级分、或用106个固定在2％多聚甲醛中的LNCaP细胞，腹腔免疫四月龄雌性Balb/c小鼠。将这些制备物与完全弗氏佐剂以1∶1混合。每只小鼠每2周免疫一次，共免疫4或5次。最后一次免疫的4天后，收集脾细胞，用于制备杂交瘤或者B细胞文库。
实施例3
制备B细胞文库
小鼠脾脏在磷酸缓冲盐水(PBS)中洗涤，切成小片，在PBS中再次洗涤，然后在“松配合(loose-fitting)”手动匀浆器中温和匀浆。于室温将所得的单细胞悬液覆盖于Ficoll(Pharmacia，Freiburg，Germany)上，并在400g离心20分钟。用CD 19微球(microbead)按生产商(Miltenyi，Bergisch Gladbach，Germany)建议分离分裂间期的B细胞。在350μl由4M硫氰酸胍(guanidinethiocyanate)，25mM柠檬酸钠，0.5％N-月桂基肌氨酸钠(sodium N-laurosylsarcosinate)和100mM 2-巯基乙醇组成的溶液中，裂解106个B细胞。
实施例4
a)制备杂交瘤
无菌取脾，在无血清RPMI-1640培养基中制备单细胞悬液。将脾细胞以10∶1的比例加入SP2/0骨髓瘤细胞，用已有方法[Galfre等，Nature(1979)，p.131-133]进行融合和筛选。
杂交瘤上清在LNCaP和DU145细胞上通过FACS进行检验，也用纯化PSMA作为固相进行ELISA试验。单克隆抗体用蛋白G柱(Pharmacia)纯化。
b)确定这些mAb的同种型
用未标记(固相)、或经过氧化物酶标记(示踪)的抗同种型特异性抗体(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)进行ELISA，确定这些抗PSMA mAb的Ig-同种型。
c)分离并鉴定抗PSMA构象性单克隆抗体
Balb/c小鼠用LNCaP细胞的M-PER-裂解物免疫5次，取其脾细胞与SP2/0细胞根据现有方法融合。通过用LNCaP细胞进行流式细胞术、以及通过针对纯化的PSMA进行ELISA，来筛选阳性杂交瘤。由此获得三株阳性克隆。相应mAb的同种型为3/F11(IgG2a)，3/A12(IgG1)和3/E7(IgG2b)。
d)鉴定mAb
通过流式细胞术可以观察到：这三种mAb与染色的LNCaP细胞结合得很好，阳性细胞百分比为95-98％。荧光相对于事件数的曲线形状提示，PSMA均匀分布在LNCaP细胞群体中(图1)。为评估这些抗PSMA mAb的结合特异性，PSMA-阴性的DU145、PC3细胞、HeLa和Jurkat细胞也被染色，并通过流式细胞术进行分析。所有三种mAb不能使PSMA-阴性细胞染色(阳性细胞百分比为0.04-2％)。
LNCaP细胞用浓度递增的抗PSMA mAb(第一步的抗体)处理，之后与饱和量的PE-(藻红蛋白)-标记的山羊抗体(第二步的抗体)温育，之后进行细胞荧光测定，来比较这三种抗体的结合特性。在抗原饱和浓度[100nM]，mab3A12的经校正的PE(藻红蛋白)平均荧光强度为约1000，mAb 3F11的为约1400，mAB 3E7的为约1600。mAb 3A12的结果显示，MFI在表达未糖基化PSMA的LNCaP细胞(在有衣霉素时进行培养)上低5倍。
免疫荧光细胞学和激光扫描共焦显微镜检查表明，这三种mAb都与LNCaP细胞强结合(图2)，并内化到这些细胞中(图3)。所有mAb在用纯化PSMA作为固相的ELISA中都是阳性的。这些mAb在用变性PSMA进行的western印迹中显示约100KD的信号(图4)，而在用去糖基化PSMA进行的印迹中显示约84KD的弱信号，这与文献数据相对应(图5)。
前列腺癌石蜡切片用mAb 3/E7进行免疫组化检测为阳性，用mAbs3/F 11和3/A12不是阳性(图6)。数据见表1。
表1：表征3种抗细胞表面PSMA的单克隆抗体
  杂交瘤   同种型   FACSLNCaP[MFI]*   FACSPSMA-转染的DU*[MFI]   ELISAPSMA   印迹PSMA   印迹去糖基化PSMA   免疫组化
  3/F11   IgG2a   1400   105   阳性   阳性   (阳性)   阴性
  3/A12   IgG1   1000   110   阳性   阳性   (阳性)   阴性
  3/E7   IgG2b   1600   90   阳性   阳性   (阳性)   阳性
MFI＝在scFv浓度达到抗原饱和时的平均荧光强度(减去只用第二抗体染色的背景)
(阳性)＝弱阳性
从这些数据我们得出结论，这3种mAb与天然的和变性的PSMA有非常强的、高度特异性结合。尽管与去糖基化PSMA的结合较弱，但根据与不表达PSMA的细胞无结合的事实，可以排除糖特异性。
实施例5
在噬菌粒pSEX中制备scFv表达文库
用基于硅胶的膜(Rneasy，Qiagen，Hilden，Germany)根据生产商的说明从B细胞文库或从杂交瘤细胞分离总RNA和mRNA。cDNA合成在42℃进行60min，反应终体积50μl，其中包含25μl变性RNA，10μl 5x缓冲液(Promega，Heidelberg，Germany)，5μl 10mM dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，Promega)，1.5μl RNAsin(40U/μl，Promega)，2.5μl 150pM随机六体(hexamer)引物，2.5μl AMV逆转录酶(10U/μl，Promega)。然后，重链、γ和κ链的编码区用PCR扩增，方法见Orum等[Nucleic Acies Res.(1993)，4491-4498]。对于每条链，将25个不同的恒定区正向引物与各自的一个对应反向引物组合，进行25个分别的反应。轻链和重链的扩增产物用琼脂糖凝胶电泳纯化。
轻链的PCR产物用MluI和NotI消化，以1∶3的摩尔比(2μg载体，400ng插入片段)连接到噬菌粒pSEX81中[Dübel等，Gene(1993)，97-101]。用其中一个连接反应的产物对50μl电感受态的大肠杆菌XL1 blue细胞(Stratagene)按供应商的方案实施电穿孔。将细菌铺在9个80mm直径、30℃、含有100μg/ml氨苄青霉素和0.1M葡萄糖(SOB-AG)的琼脂糖平板上，30℃温育过夜。在每个平板中加入3ml 2xYT培养基，用无菌玻璃涂布器将细菌刮下，在3,000g离心沉淀15min，从而分离出细菌。从这些细菌分离得到质粒DNA，它们是Vl子文库(sublibrary)。然后将重链的PCR产物和该Vl亚文库用NcoI和HindIII消化。以3∶1的比例进行连接(2μg子文库和400ng插入片段)。利用电穿孔进行转化，铺板，收集转化的细菌，方法与用于获得Vl子文库的方法相同。从9个80mm直径的SOB-AG平板共获得18ml的VHVL文库。
实施例6
制备和筛选展示抗体的噬菌体
a)制备
在噬菌粒pSEX的VHVL文库中，将所述抗体的基因与基因III融合在同一读框内，基因III编码丝状噬菌体的次要表面蛋白gIIIp。因此，要制得重组噬菌粒颗粒以在其表面展示这些抗体，需要用复制缺陷性噬菌体M13KO7感染携带噬菌粒的细菌细胞[14]。将M13KO7以复数10加入10ml文库培养物。在37℃温育90min后，使细胞沉淀，在含100μg/ml氨苄青霉素、10μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素的15ml 2xYT-培养基中重悬。将培养物在37℃、250rpm温育过夜，然后在冰上冷却，离心除去细胞。将含有噬菌体的上清与1/5体积的含有20％PEG 8,000和14％NaCl的水溶液混合，4℃温育1h。然后在4℃、6,200g离心30min。将含噬菌体的沉淀重悬在2ml 10mM Tris/HCl pH 7.5，20mM NaCl，2mM EDTA，pH 7.5中，以备淘选。
b)淘选出结合抗原和结合细胞的克隆
在96孔Maxi-Sorb微滴板(Nunc)中基于纯化的PSMA进行淘选，所述板用纯化的PSMA的溶液(100μl/孔，含12μg/ml PSMA的PBS)包被，并用4％脱脂奶/PBS封闭。将1ml纯化重组噬菌体(约1011)在1ml补充了15μl 10％Triton X100的4％脱脂奶/PBS中温育15min，然后加入8个PSMA包被孔中37℃维持2h以使其结合。结合的噬菌体用PBS/Tween(0.1％)洗涤20次后，用0.1M甘氨酸缓冲液pH 2.2洗脱。为了淘选LNCaP活细胞，事先使噬菌体吸附到DU 145细胞上。为此，在室温，将1ml(约1011)重组噬菌体在2％脱脂奶/PBS中温育15min，然后与107个DU 145细胞在摇床上温育1h。之后，将细胞离心，将含有未被吸附的噬菌体的上清与106个LNCaP细胞在室温于摇床上温育1h。结合的噬菌体用2％脱脂奶/PBS洗涤10次，用PBS洗涤5次，之后用50mM HCl洗脱，再用1M Tris-HCl(pH7.5)中和。
用洗脱的噬菌体感染大肠杆菌TGl细胞，在SOB-AG平板上铺板，30℃温育过夜。用一份洗脱物进行滴定。将该选择过程重复3-6次。
c)小规模噬菌体拯救(small scale phage rescue)
从滴定板分离得到96个克隆，将每个转移到96孔深孔微滴板的一个孔中，所述孔都已有500μl含100μg/ml氨苄青霉素和0.1M葡萄糖(YT-AG)的2xYT培养基，37℃温育过夜(主平板(master plate))。从该主平板的每个孔取40μl饱和培养物，转移到一个新平板上含有400μl 2x YT-AG培养基的对应孔中。
每孔加入约1×1010个M13KO7辅助噬菌体，37℃于摇床上温育2小时。然后将平板离心，沉淀重悬在补充了100μg/ml氨苄青霉素、10μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素的2xYT培养基中，29℃以240rpm温育过夜。离心后回收含有经拯救的噬菌粒的上清，用其进行噬菌体ELISA和流式细胞术。
d)噬菌体-ELISA
微滴板用纯化的PSMA(1.5μgPSMA/ml PBS)包被过夜，然后用2％脱脂奶/PBS封闭。每孔加入200μl已与2％脱脂奶/PBS以1∶1预温育的经拯救的噬菌粒，在室温温育2h。微滴板用PBS-Tween洗5次后，加入200μl/孔辣根过氧化物酶偶联型抗M13抗体(Pharmacia)，室温维持2h，以检测结合的噬菌体。用3，3′，5′，5′-四甲基联苯胺作底物进行显色。
e)分离并鉴别抗PSMA构象性scFv
为产生抗PSMA构象性scFv，用LNCaP细胞的M-PER-裂解物免疫小鼠，制得B细胞文库，从中构建基于噬菌粒pSEX的VHVL文库。此文库的成员数达到107。用类似方法，从来自同一只经LNCaP裂解物免疫的小鼠的单克隆抗体3/A12制备VHVL文库。此VHVL文库的成员数达到105。为了分离出在其表面展示与细胞PSMA结合的scFv的噬菌体，交替(performedalternatively)进行在聚苯乙烯管中用DU-145细胞吸附、之后用LNCaP细胞淘选，和在包被了20μg/ml纯化PSMA的微滴板中进行的淘选，共进行六轮淘选。在3、4和6轮淘选后，对分离得到的噬菌粒集落进行培养，用M13KO7进行感染，来拯救噬菌体颗粒。从所述B细胞文库得到800个噬菌体克隆，用LNCaP细胞进行流式细胞术，并基于纯化的PSMA进行ELISA，结果得到一个阳性克隆，为E8。来自mAb 3/A12的VHVL文库经四轮淘选后获得两个阳性克隆，为A4和A5。测序发现A4即E8。
将scFv E8和A5的编码区从噬菌粒pSEX转移到含C-末端c-myc和His-标签的表达载体pHOG中。相应序列及其CDR见图13和14。编码抗原结合部分的CDR的编码区在图13和14中标出。那些序列不应被改变，而序列中未被标记的其它部分可以改变。但是，必须保持合适的三维结构。
通过流式细胞术测定，scFv E8与LNCaP活细胞强烈反应，在饱和浓度时MFI值为约100，而A5的结合则弱很多，在饱和浓度时MFI-值为约40(图7)。相反，E8与在ELISA中作为固相的纯化PSMA的结合弱，A5与纯化PSMA的结合则有些强。类似的模式可见于用变性的糖基化和去糖基化PSMA进行的western印迹中(图8)。用LNCaP细胞进行免疫荧光细胞学检查，以及通过共焦激光显微镜进行检测，都可观察到scFv E8的极好结合和内化(图9)。scFv的数据汇总见表2。
表2：表征2种抗细胞表面PSMA的scFv
  ScFv   来源   FACSLNCaP[MFI]*   FACSPSMA-转染的DU[MFI]  ELISAPSMA   印迹PSMA   印迹去糖基化PSMA
  E8＝A4   B细胞文库和mAb A12   100   70  阳性   (阳性)   (阳性)
  A5   MAb A12   40  阳性   阳性   (阳性)
MFI＝在scFv浓度达到抗原饱和时的平均荧光强度(减去只用第二抗体进行染色得到的背景)
(阳性)＝弱阳性
实施例7
表达和纯化ScFv
ScFv片段用分泌型载体pHOG 21表达在大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)中，所述载体在scFv的C-末端位置包含His-6和c-myc-标签的序列[Kipriganov等，J.Immunol.Methods(1997)，p.69-77]。大肠杆菌细菌用pHOG质粒转化后，于37℃在2x YT-AG-培养基中过夜培养、1∶20稀释、并生长为600ml的培养物。当培养物达到OD 0.8后，细菌在1,500g离心10min得到沉淀，将其重悬在含50μg/ml氨苄青霉素、0.4M蔗糖和1mM IPTG的等体积新鲜YT培养基中。然后在室温继续生长18-20h。4℃5,000g离心10min以收获细胞。为分离可溶性周质蛋白，将细菌沉淀重悬在5％最初体积、且经冰冷却的50mM Tris-HCl、20％蔗糖、1mM EDTA pH 8.0中。在冰上维持1h后，将原生质球(spheroblast)在4℃以20,000g离心30min，上清中得到可溶性周质提取物。用截留值为10kDa的Amicon YM10膜(Amicon，Witten，Germany)浓缩该提取物，之后在50mM Tris-HCl、1M NaCl，pH 7.0中彻底透析。
用固相金属亲和层析进行纯化，所用的是螯合型Sepharose(Pharmacia)的1ml柱，其带Cu2+，用含50mM Tris-HCl和1M NaCl，pH 7.0的缓冲液平衡。在柱上装载所述周质提取物，用20个柱体积的含30mM咪唑的平衡缓冲液洗柱，再用含250mM咪唑的相同缓冲液洗脱。洗脱的物质在PBS中透析。
蛋白含量用Micro BCA Protein Reagent Kit(Pierce)按说明书确定。
用IPTG进行蛋白诱导，从600ml大肠杆菌XL1培养物产生约20μgscFv。
实施例8
流式细胞术
从组织培养瓶新鲜收获LNCaP、DU 145、和PC3细胞，在含3％FCS和0.1％Na N3的PBS中制备单细胞悬液。约105个细胞与50μl经拯救的噬菌粒在冰上温育1h，所述噬菌粒已与2％脱脂奶/PBS 1∶1预温育。用PBS洗3次后，加入25μl/孔抗c-myc单克隆抗体9E10(10μg/ml；Becton Dickinson)，或检测噬菌体时，加入25μl/孔抗M13抗体(10μg/ml；Pharmacia)，在冰上温育40min。用PBS洗3次后，将细胞与100μl PE-标记的山羊抗小鼠IgG(Becton Dickinson)在冰上温育40min。再次洗涤细胞，并在100μl含1μg/ml碘化丙啶(Sigma，Deisenhofen)、3％FCS和0.1％NaN3的PBS溶液中重悬，从而除去死细胞。用FACScan流式细胞仪和CellQuest软件(Becton DickinsonMountain View，CA)测量染色细胞的相对荧光。
实施例9
免疫荧光细胞学检查
LNCaP细胞在玻璃盖玻片上生长24小时。为了固定，细胞用含2％多聚甲醛的PBS室温处理30min(这不使细胞膜透化)，用1％BSA-PBS洗涤，在含50mM NH4Cl的PBS中猝灭10min，用1％BSA-PBS漂洗(rinse)。加入含4μg/ml第一单克隆抗体的1％BSA-PBS，4℃温育60min。与FITC-标记的山羊抗小鼠第二抗体(2μg/ml；Southern Biotechnology Associates Inc.Birmingham，USA)温育30min，用1％BSA-PBS充分洗涤。将玻片固定(mount)在Vectashield(Vector Laboratories，Inc.Burlingame，CA)上。
在内化试验中，将第一抗体在37℃温育30min，之后用2％多聚甲醛固定细胞，并用含0.5％Triton X100的PBS进行透化。
实施例10
a)免疫组织化学
石蜡组织切片先脱蜡，再用0.3％Triton X100的PBS溶液处理，以回收抗原(antigen retrieval)。恒冷箱切片(Kryostat section)在冷丙酮中固定。将这些切片用3％H2O2和10％甲醇处理30min，以猝灭内源性过氧化物酶。用1％BSA-PBS封闭后，加入2μg/ml第一抗体，室温温育1h。针对所述scFv，加入第二抗体即小鼠抗c-myc抗体室温作用1h。然后与生物素化的山羊抗小鼠抗体在室温温育30min，最后用ABC-试剂(Vectastain)显色。
b)Western印迹分析
纯化的PSMA以及LNCaP细胞裂解物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS)凝胶电泳后，进行Western印迹分析，转移到聚偏二氟乙烯膜上。这些膜在含5％脱脂奶的PBS中封闭过夜，再与10μg/ml纯化mAb或scFv温育1h，然后用PBS-Tween(0.5％)洗5次，与偶联了辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG室温温育1小时，用PBS-Tween(0.5％)洗5次后，用3，3′，5′，5′-四甲基联苯胺作为底物来显色。
实施例11
构建、表达并纯化scFv-PE40蛋白
本方法所用毒素是截短型假单胞菌外毒素(PE40)，其缺乏结构域Ia，仅含有结构域Ib、II、和III[Pastan等，J.Biol.Chem.(1989)，p.15157-15160]。载体pSW200中包含带编码区的DNA，其来自W.Wels教授，Frankfurt[Wels等，Biotechnology(1992)，p.1128-1132]。用PCR扩增质粒pSW200中编码PE40的DNA片段(bp 253-613)。然后利用限制性酶切位点XbaI将扩增的DNA连接到载体pHOG-His-scFv中所述scFv的C-末端位置。所有克隆步骤都按照在大肠杆菌XL1blue中操作时的标准方法进行，产物经测序确认。
对该免疫毒素进行的蛋白诱导和IMAC纯化与scFv相同。产物用SDS-page、western印迹和流式细胞术检验并鉴定。
实施例12
scFv-PE40免疫毒素的细胞毒活性
红色四氮唑盐WST代谢为水溶性甲
Figure A20068002758000211
(form azan)染料的现象按说明书(Boehringer)来测定。靶细胞(LNCaP和作为对照的DU 145)以2.5×104/孔接种在96-孔板上，生长24小时直至形成汇合的细胞层。以50μl/孔加入重组免疫毒素的不同稀释度，板在37℃、5％CO2温育48小时。之后，培养物用15μl/孔WST试剂脉冲，在37℃、5％CO2温育90分钟。样品的分光光度计吸收值在450nm(参比690nm)测量。计算与未处理的对照培养物相比使得细胞活力下降50％所需的免疫毒素浓度(50％抑制浓度＝IC50)。
包含免疫毒素E8-P40和A5-P40的细胞毒性试验(WST)用表达PSMA的LNCaP细胞和DU 145对照细胞进行。如图11所示，免疫毒素E8-PE40对LNCaP细胞显示强细胞毒活性，IC50值为0.05nM。在图12中，免疫毒素A5-PE40显示细胞毒活性，IC50为约0.09nM。在不表达PSMA的DU 145细胞上，E8构建体的细胞毒活性本底为5％，而A5构建体的仅为0.01％，这预示它们有很好的治疗前景。
实施例13
从mAb 3/F11和3/E7产生scFv H12和D7
如实施例5所述，从每个mAb产生基于噬菌粒pSEX的scFv表达文库。
如实施例6所述，产生并筛选展示抗体的噬菌体。
在PSMA和在LNCaP细胞上交替进行6轮淘选后，从mAB 3/E7获得一个特异性阳性克隆H12，从mAB 3/F11获得一个阳性克隆D7。将每个scFv的编码区转移到表达载体pHOG-21中。
如实施例7所述，进行ScFv的表达和纯化。
实施例14
鉴定scFv H12和D7
a)对PSMA-阳性和阴性细胞系进行流式细胞术
scFvs H12和D7与LNCaP活细胞发生反应，用流式细胞术测量。
根据饱和曲线确定，达到PSMA位点50％饱和度的抗体浓度分别为大约120nM(H12)和20nM(D7)。在饱和浓度，H12的MFI值达到70，D7的MFI值达到40(图15)。
为评价scFv H12和D7的PSMA结合特异性，另对PSMA-阴性前列腺癌细胞DU145、PC3及其它PSMA阴性细胞系(HeLa、MCF7、HCT15和Jurkat)进行染色，并进行流式细胞术分析。所有三种scFv都不使这些PSMA-阴性细胞染色。
b)对PSMA转染物进行流式细胞术
为确认PSMA-特异性结合，scFv H12和D7也在转染了PSMA的BOSC-23细胞上进行试验。两种scFv都与转染全长PSMA的BOSC细胞(而非未经转染的细胞)有浓度依赖性结合(图16)。在100nM(D7)和200nM(H12)达到饱和条件。与mAb类似，在转染物中的MFI值低于在LNCaP细胞中的该值，并显示宽范围的分布，这可能是因为转染物的细胞表面PSMA分子的变化(varying)。
c)免疫荧光细胞学检查
如实施例4所述，制备免疫荧光细胞学检查所用物质。用激光扫描共焦显微镜检测到，scFv与LNCaP细胞强烈结合，并内化到这些细胞这。
d)ELISA和Western印迹
固相ELISA以及Western印迹检测到的scFv H12和D7与纯化PSMA的结合都是弱的。
H12和D7的(氨基酸和核酸)序列见图20和图21。
表3：表征抗PSMA scFv H12和D7
  scFv   起始mAb   FACSLNCaPMFI*   FACSPSMA-转染的BOSC(MFI*)   印迹PSMA   (编码链)核酸序列号   氨基酸序列号   (互补链)核酸序列号
  H12   3/E7   70   25   100kD   19   20   23
  D7   3/F11   40   24   100kD   21   22   24
*MFI＝饱和条件时的平均荧光强度值，已减去背景染色，所述背景染色是用同种型匹配的无关对照抗体或单独的抗小鼠免疫球蛋白进行的染色。
实施例15
H12-PE40免疫毒素和D7-PE40免疫毒素的构建和细胞毒性
H12-PE40和D7-PE40免疫毒素的构建与实施例11中对A5和E8免疫毒素的描述类似。PE-40代表假单胞菌外毒素片段。
细胞毒活性按实施例12所述进行检验。
所述免疫毒素以时间依赖方式促进LNCaP细胞死亡；最高的细胞毒活性可在温育48h后观察到。
此时，H12-PE40和D7-PE40的IC50值为约200pM(图17)。
另外，在PSMA-阴性细胞系DU 145、PC-3、MCF7和HCT 15测试H12-PE40和D7-PE40的细胞毒活性。即使浓度最高达到25000pM，也未在这些细胞系中发现细胞毒性。
实施例16
构建抗-PSMA/CD3双抗体
产生特异于PSMA以及T细胞受体复合物的CD3链这两者的双特异性双抗体。所述双特异性双抗体用含双顺反(dicistronic)操纵子的载体在大肠杆菌中表达，以实现VhCD3-VlA5和VhA5-VlCD3scFv的共分泌(图18)。构建抗-A5/CD3双抗体使用质粒pKID19x3和pKID 3x19[Kipriyanov，Int.J.Cancer 1998，pp 763]。细菌性周质表达和纯化与scFv类似。
实施例17
由双抗体A5-CD3诱导特异性细胞毒活性
用健康供体的PBMC作为效应细胞，研究双特异性双抗体通过强化引导(redirecting)T细胞-介导的细胞毒活性来诱导肿瘤细胞裂解的能力。所述细胞在有或无IL-2的条件下温育4天，之后加入以1.5×104细胞/孔接种到96-孔板上的LNCaP靶细胞中。效应细胞-靶细胞比为10∶1。加入不同浓度的双抗体。温育48小时后，培养物用15μl/孔WST试剂进行脉冲，在37℃、5％CO2中温育90分钟。取样在450nm(参比690nm)测量分光光度计吸收值。
此体外试验显示，所述双抗体非常强效地以浓度依赖方式强化靶向(retargeting)活化和未活化的PBMC，从而裂解LNCaP靶细胞(图19)。
实施例18
双抗体A5-A5
这种二价单特异性双抗体按照类似A5-CD3双抗体(实施例16)的方式制得。细菌性周质表达和纯化与scFv类似。
由流式细胞术可以观察到双抗体A5-A5与LNCaP细胞的特异性强结合。
序列表
<110>弗赖堡后期临床教学医学院(Universitaetsklinikum Freiburg)
<120>抗细胞表面前列腺特异性膜抗原的单克隆抗体和单链抗体片段
<130>ZEE20050222c
<150>EP 05011536.9
<151>2005-05-27
<160>24
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>251
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>scFv E8
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(103)..(103)
<223>Xaa表示Tyr或Ser
<400>1
Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro
1               5                   10                  15
Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
            20                  25                  30
Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Glu Arg His Gly Lys Ser Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Asp Ile Asn Pro Lys Asn Gly Val Thr Ile Tyr Asn Gln
    50                  55                  60
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Xaa Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu
        115                 120                 125
Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Asp Ile Gln Met Thr Gln
    130                 135                 140
Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr
145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
                165                 170                 175
Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Thr Ala Thr Asn Leu
            180                 185                 190
Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln
        195                 200                 205
Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser Asp Asp Ser Gly Thr Tyr
    210                 215                 220
Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225                 230                 235                 240
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Ala
                245                 250
<210>2
<211>10
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>CDR序列
<400>2
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp
1               5                   10
<210>3
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>CDR序列
<400>3
Gly Asp Ile Asn Pro Lys Asn Gly Val Thr Ile
1               5                   10
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>CDR序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa表示Tyr或Ser
<400>4
Arg Gly Asp Xaa Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>5
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>CDR序列
<400>5
Arg Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1               5                   10
<210>6
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>CDR序列
<400>6
Thr Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1               5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>CDR序列
<400>7
Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr
1               5
<210>8
<211>753
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>scFv E8
<400>8
atggccgagg tgcagctgca gcagtcagga cccgacctgg tgaagcctgg ggcctcaat      60
aagatttcct gcaaggcttc tggatacaca ttcactgact acaacatgga ctgggtgaag    120
gagagacatg gaaagagcct tgagtggatt ggagatatta atcctaaaaa tggcgttact    180
atttacaacc agaagttcaa gggcaaggcc acattgactg tagacaagtc ctccaccaca    240
gcctacatgg agctccgcag cctgacatct gaagacactg cagtctatta ttgtgcaaga    300
ggggactmct atggtaacta ctttgactac tggggccaag gcaccagtct cacagtctcc  360
tcagccaaaa cgacmcccaa gcttgaagaa ggtgaatttt cagaagcacg cgtagacatt  420
cagatgacac agtctccagc ctccctatct gtatctgtgg gagaaactgt caccatcaca  480
tgtcgaacaa gtgagaatat ttacagtaat ttagcatggt atcagcagaa acagggaaaa  540
tctcctcagc tcctggtcta tactgcaaca aacttagcag atggtgtgcc ctcaaggttc  600
agtggcagtg gatcaggcac acagtattcc ctcaagatca acagcctgca gtctgatgat  660
tctgggactt attactgtca acatttttgg ggtactccgt acacgttcgg aggggggacc  720
aagctggaaa taaaacgggc tgatgctgcg gcc                               753
<210>9
<211>753
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SEQ ID N0：8的反义互补链
<400>9
ggccgcagca tcagcccgtt ttatttccag cttggtcccc cctccgaacg tgtacggagt   60
accccaaaaa tgttgacagt aataagtccc agaatcatca gactgcaggc tgttgatctt  120
gagggaatac tgtgtgcctg atccactgcc actgaacctt gagggcacac catctgctaa  180
gtttgttgca gtatagacca ggagctgagg agattttccc tgtttctgct gataccatgc  240
taaattactg taaatattct cacttgttcg acatgtgatg gtgacagttt ctcccacaga  300
tacagatagg gaggctggag actgtgtcat ctgaatgtct acgcgtgctt ctgaaaattc  360
accttcttca agcttgggkg tcgttttggc tgaggagact gtgagactgg tgccttggcc  420
ccagtagtca aagtagttac catagkagtc ccctcttgca caataataga ctgcagtgtc  480
ttcagatgtc aggctgcgga gctccatgta ggctgtggtg gaggacttgt ctacagtcaa  540
tgtggccttg cccttgaact tctggttgta aatagtaacg ccatttttag gattaatatc  600
tccaatccac tcaaggctct ttccatgtct ctccttcacc cagtccatgt tgtagtcagt  660
gaatgtgtat ccagaagcct tgcaggaaat cttcattgag gccccaggct tcaccaggtc  720
gggtcctgac tgctgcagct gcacctcggc cat                               753
<210>10
<211>253
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>scFv A5
<400>10
Met Ala Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
1               5                   10                  15
Gly Glu Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
            20                  25                  30
As p Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu
         35                  40                  45
Trp Val Ala Ile Ile Ser Asp Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ser Asp
    50                  55                  60
Ile Ile Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Thr Arg Gly Phe Pro Leu Leu Arg His Gly Ala Met Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Leu Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Lys Thr Thr Pro
        115                 120                 125
Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Asp Ile Gln Met
    130                 135                 140
Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser
145                 150                 155                 160
Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala Trp Tyr
                165                 170                 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser
            180                 185                 190
Tyr Arg Tyr Ser Asp Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Glu Ser Gly
        195                 200                 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala
    210                 215                 220
Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
225                 230                 235                 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Ala
                245                 250
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>CDR序列
<400>11
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met
1               5
<210>12
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>CDR序列
<400>12
Ile Ile Ser Asp Gly Gly Tyr
1               5
<210>13
<211>12
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>CDR序列
<400>13
Gly Phe Pro Leu Leu Arg His Gly Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>14
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>CDR序列
<400>14
Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn Val Ala
1               5                   10
<210>15
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>CDR序列
<400>15
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser
1               5
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>CDR序列
<400>16
Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Tyr Thr
1               5
<210>17
<211>759
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>scFv A5
<400>17
atggccgacg tgaagttggt ggagtctggg ggaggcttag tgaagcctgg agagtccctg     60
aaactctcct gtatagcctc tggattcact ttcagtgact attatatgta ttgggttcgc    120
cagactccgg aaaagaggct ggagtgggtc gcaatcatta gtgatggtgg ttattatacc    180
tactattcag acattatcaa ggggcgattc accatctcca gagacaatgc caagaacaac    240
ctgtacctcc aaatgagcag tctgaagtct gaggacacag ccatgtatta ctgtacaaga    300
ggttttcctc tactacggca cggggctatg gactactggg gtcttggaac ctcagtcacc    360
gtctcctcaa ccaaaacgac acccaagctt gaagaaggtg aattttcaga agcacgcgta    420
gacattcaga tgacccagtc tccaaaattc atgtccacat cggtaggaga cagggtcagc    480
gtcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaatgtag cctggtatca acagaaacca    540
ggacaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtga cgtccctgat    600
cgcttcacag gcagtgaatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct    660
gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tatgacagct atccatacac gttcggaggg    720
gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcggcc                           759
<210>18
<211>759
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>SEQ ID NO：17的反义互补链
<400>18
ggccgcagca tcagcccgtt ttatttccag cttggtcccc cctccgaacg tgtatggata   60
gctgtcatat tgctgacaga aatactctgc caagtcttca gactgcacat tgctgatggt  120
gagagtgaaa tctgtcccag attcactgcc tgtgaagcga tcagggacgt cactgtaccg  180
gtaggatgcc gagtaaatca gtgctttagg agattgtcct ggtttctgtt gataccaggc  240
tacattagta tccacattct gactggcctt gcaggtgacg ctgaccctgt ctcctaccga  300
tgtggacatg aattttggag actgggtcat ctgaatgtct acgcgtgctt ctgaaaattc  360
accttcttca agcttgggtg tcgttttggt tgaggagacg gtgactgagg ttccaagacc    420
ceagtagtcc atagccccgt gccgtagtag aggaaaacct cttgtacagt aatacatggc    480
tgtgtcctca gacttcagac tgctcatttg gaggtacagg ttgttcttgg cattgtctct    540
ggagatggtg aatcgcccct tgataatgtc tgaatagtag gtataataac caecatcact    600
aatgattgcg acccactcca gcctcttttc cggagtctgg cgaacccaat acatataata    660
gtcactgaaa gtgaatccag aggctataca ggagagtttc agggactctc caggcttcac    720
taagcctccc ccagactcca ccaacttcac gtcggccat                           759
<210>19
<211>777
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>scFv H12
<220>
<221>misc_feature
<222>(58)..(58)
<223>n是a，c，g，或t
<400>19
atggcgaggt tcagctccag cagtctggat ctgaactggt atagcctggg gcttcagntg   60
aaattgtcct gcasggcttc tggctacacc ttcacatact ttgacataaa ctggttgaga  120
cagaggcctg aacagggact tgagtggatt ggagtgattt ctcctggaga tggcaataca  180
aactacaatg agaacttcaa gggcaaggcc acactgacta tagataaatc ctccaccaca  240
gcctacattc agcttagcag gctgacatct gaggactctg ctgtctattt ctgtgcaaga  300
gatggcaact tcccttacta tgctatggac tcatggggtc aaggaacctc agtcaccgtc  360
tcctcagcca aaacgacacc caagcttgaa gaaggtgaat tttcagaagc acgcgtagac  420
attgtgatga cccagattcc actctccctg cctgtcattc ttggagatca agcctccatc  480
tcttgcagat ctagtcagag ccttgtatac agtaatggaa acacctattt acattggttc  540
ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca atgtttccaa cctattttct  600
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggactg atttcacact caagatcagc  660
agagtggagg ctgaggatct gggaatttat ttctgctctc aaagtacaca tgttcccacg  720
ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa cgggctgatg ctgcggccgc tggatcc     777
<210>20
<211>259
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>scFv H12
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>位置20的′Xaa′表示Met，Val，或Leu。
<400>20
Met Ala Arg Phe Ser Ser Ser Ser Leu Asp Leu Asn Trp Tyr Ser Leu
1               5                   10                  15
Gly Leu Gln Xaa Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
            20                  25                  30
Tyr Phe Asp Ile Asn Trp Leu Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Val Ile Ser Pro Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Thr Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Ile Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Phe Cys Ala Arg Asp Gly Asn Phe Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Ser Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys
        115                 120                 125
Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Asp Ile Val Met Thr
    130                 135                 140
Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ile Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile
145                 150                 155                 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
                165                 170                 175
Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
            180                 185                 190
Tyr Asn Val Ser Asn Leu Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
        195                 200                 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
    210                 215                 220
Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Thr
225                 230                 235                 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Ala
                245                 250                 255
Ala Gly Ser
<210>21
<211>777
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>scFv D7
<400>21
atggcccagg tgcagctgca gcagtctggg gctgaactgg tagagcctgg ggcttcagtg     60
aaactgtcct gcaaggcttc tggctacacc ttcacatact ttgacataaa ctggttgaga    120
cagaggcctg aacagggact tgagtggatt ggagggattt ctcctggaga tggtaataca    180
aactacaatg agaacttcaa gggcaaggcc acactgacta tagacaaatc ctccaccaca    240
gcctacattc agctcagcag gctgacatct gaggactctg ctgtctattt ctgtgcaaga    300
gatggcaact tcccttacta tgctatggac tcatggggtc aaggaacctc agtcaccgtc    360
tcctcagcca aaacgacacc caagcttgaa gaaggtgaat tttcagaagc acgcgtagac    420
attgagctca cccaatctcc actctccctg cctgtcattc ttggagatca agcctccatc    480
tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agtaatggaa acacctattt acattggttt    540
ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca cagtttccaa ccgattttct    600
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc    660
agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtaccca tgttcccacg    720
ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa cgggctgatg ctgcggccgc tggatcc       777
<210>22
<211>259
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>scFv D7
<400>22
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu Pro
1               5                   10                  15
Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
            20                  25                  30
Tyr Phe Asp Ile Asn Trp Leu Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Gly Ile Ser Pro Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu
    50                  55                  60
Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Thr Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Ile Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Phe Cys Ala Arg Asp Gly Asn Phe Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Ser Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys
        115                 120                 125
Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg Val Asp Ile Glu Leu Thr
    130                 135                 140
Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ile Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile
145                 150                 155                 160
Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
                 165                170                 175
Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
            180                 185                 190
Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
        195                 200                 205
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
    210                 215                 220
Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Thr
225                 230                 235                 240
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Ala
                245                 250                 255
Ala Gly Ser
<210>23
<211>777
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>scFv H12-SEQ ID NO：19的反义互补链
<220>
<221>misc_feature
<222>(720)..(720)
<223>n是a，c，g，或t
<400>23
ggatccagcg gccgcagcat cagcccgttt tatttccagc ttggtccccc ctccgaacgt   60
gggaacatgt gtactttgag agcagaaata aattcccaga tcctcagcct ccactctgct  120
gatcttgagt gtgaaatcag tccctgatcc actgccactg aacctgtctg ggaccccaga  180
aaataggttg gaaacattgt agatcaggag ctttggagac tggcctggct tctgcaggaa  240
ccaatgtaaa taggtgtttc cattactgta tacaaggctc tgactagatc tgcaagagat  300
ggaggcttga tctccaagaa tgacaggcag ggagagtgga atctgggtca tcacaatgtc  360
tacgcgtgct tctgaaaatt caccttcttc aagcttgggt gtcgttttgg ctgaggagac  420
ggtgactgag gttccttgac cccatgagtc catagcatag taagggaagt tgccatctct  480
tgcacagaaa tagacagcag agtcctcaga tgtcagcctg ctaagctgaa tgtaggctgt  540
ggtggaggat ttatctatag tcagtgtggc cttgcccttg aagttctcat tgtagtttgt  600
attgccatct ccaggagaaa tcactccaat ccactcaagt ccctgttcag gcctctgtct  660
caaccagttt atgtcaaagt atgtgaaggt gtagccagaa gccttgcagg acaatttcan  720
ctgaagcccc aggctatacc agttcagatc cagactgctg gagctgaacc tcgccat     777
<210>24
<211>777
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>scFv D7，SEQ ID NO：21的反义互补链
<400>24
ggatccagcg gccgcagcat cagcccgttt tatttccagc ttggtccccc ctccgaacgt   60
gggaacatgg gtactttgag agcagaaata aactcccaga tcctcagcct ccactctgct  120
gatcttgagt gtgaaatctg tccctgatcc actgccactg aacctgtctg ggaccccaga  180
aaatcggttg gaaactgtgt agatcaggag ctttggagac tggcctggct tctgcagaaa  240
ccaatgtaaa taggtgtttc cattactgtg tacaaggctc tgactagatc tgcaagagat  300
ggaggcttga tctccaagaa tgacaggcag ggagagtgga gattgggtga gctcaatgtc  360
tacgcgtgct tctgaaaatt caccttcttc aagcttgggt gtcgttttgg ctgaggagac  420
ggtgactgag gttccttgac cccatgagtc catagcatag taagggaagt tgccatctct  480
tgcacagaaa tagacagcag agtcctcaga tgtcagcctg ctgagctgaa tgtaggctgt  540
ggtggaggat ttgtctatag tcagtgtggc cttgcccttg aagttctcat tgtagtttgt  600
attaccatct ccaggagaaa tccctccaat ccactcaagt ccctgttcag gcctctgtct  660
caaccagttt atgtcaaagt atgtgaaggt gtagccagaa gccttgcagg acagtttcac  720
tgaagcccca ggctctacca gttcagcccc agactgctgc agctgcacct  gggccat    777

Claims (19)

1.分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其
a)结合肿瘤细胞表面的天然形式的前列腺特异性膜抗原，
b)能被肿瘤细胞内化，
c)强结合LNCAP细胞，但不结合或者仅最小程度地结合不表达前列腺特异性膜抗原的细胞，和
d)特征在于，其与标记物或细胞毒剂连接。
2.权利要求1的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，特征在于，在抗原饱和时，mAb的PE荧光强度(MFI)超过1000，scFv的PE MFI超过40。
3.权利要求1或2的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其在1-120nM的浓度对LNCAP细胞显示高结合活性，达到PSMA位点的50％饱和。
4.权利要求1-3任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，特征在于所述标记物是发射放射性辐射或荧光辐射的粒子。
5.权利要求1-4任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，特征在于所述细胞毒剂是细胞毒物质，其选自毒素，尤其紫杉醇，松胞菌素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，依米丁，丝裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷，长春花新碱，长春花碱，秋水仙素，阿霉素，柔红霉素，二羟基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，光辉霉素，放线菌素D，1-去氢睾酮，糖皮质激素类物质，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔和/或嘌呤霉素。
6.权利要求1-5任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，特征在于，其包含SEQ ID NO：1中至少10个连续氨基酸的部分氨基酸序列。
7.权利要求6的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，特征在于，其至少包含SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：7之一。
8.权利要求1-5任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，特征在于，其包含SEQ ID NO：10中至少10个连续氨基酸的部分氨基酸序列。
9.权利要求8的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，特征在于，其至少包含SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：16之一。
10.权利要求1-5任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，特征在于，其包含SEQ ID NO：20中至少10个连续氨基酸的部分氨基酸序列。
11.权利要求10的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，特征在于，其包含SEQ ID NO：20中至少25个连续氨基酸的部分氨基酸序列。
12.权利要求1-5任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，特征在于，其包含SEQ ID NO：22中至少10个连续氨基酸的部分氨基酸序列。
13.权利要求12的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，特征在于其包含SEQ ID NO：20的至少25个连续氨基酸
14.药物组合物，其包含上述权利要求任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。
15.权利要求1-13任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分用于制备治疗癌症的药物的用途。
16.用于检测肿瘤细胞的诊断试剂盒，其包含权利要求1-13任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。
17.体外鉴定肿瘤细胞的方法，特征在于，将待鉴定的肿瘤细胞与权利要求1-13任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分接触。
18.权利要求1-13任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分用于诊断性鉴定肿瘤细胞的用途。
19.分离的多核苷酸，特征在于，其包含SEQ ID NO：8，9，17，18，19，21，23和24中任一序列的至少20个连续核苷酸的序列。
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