JP2016190839A - 細胞表面の前立腺特異的膜抗原に対するモノクローナル抗体および単鎖抗体フラグメント - Google Patents
細胞表面の前立腺特異的膜抗原に対するモノクローナル抗体および単鎖抗体フラグメント Download PDFInfo
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Abstract
Description
な死因の2番目である。現在、切除可能限界を超える進行後は、この腫瘍に対する完治性
の処置は存在しない。疾患の進行に関連する重大な死因および罹患率のため、新規の標的
型処置に対する火急の必要性が存在する。他の器官系における癌とは対照的に、前立腺癌
は多くの理由のため、抗体治療法にとっての重要な標的を示す。その理由としては、i)
前立腺は組織特異的抗原を発現すること、ii)前立腺は非必須器官であり、その破壊は宿
主に危害を与えないこと、iii)転位部位が、高レベルの循環中の抗体を受け取るリンパ
節および骨であること、およびiv)PSA血清レベルが治療応答をモニタリングする手段を
提供することが、挙げられる。
MA)は最も優勢であるようである。約100kDのこのII型膜貫通型糖タンパク質は、短い細
胞内セグメント(アミノ酸1〜18)、膜貫通ドメイン(アミノ酸19〜43)、および長い細
胞外ドメイン(アミノ酸44〜750)からなる。PSMAは免疫治療の有用な標的として役立ち
得る。なぜなら、このPSMAは以下の要件を満たすからである:i)発現が主として前立腺
に限定される、ii)PSMAは疾患の全ての段階においてタンパク質として十二分に発現され
る、iii)これは細胞膜表面に提示されるが、循環中には入れられない、iv)発現が酵素
活性またはシグナル伝達活性と関連する。PSMAはまた、大部分の他の固形腫瘍の新生脈管
構造(neovasculature)においても発現され、これによって特異的な抗脈管形成薬物の送
達のための標的となり得る。
用および治療利用のためのモノクローナル抗体(mAb)の開発に重要性が多く置かれてい
る。しかしながら、mAbのインビボ使用は、それらのサイズおよび免疫原性のため、重要
な問題と関係する。従って研究は、より少ない副作用、より良好な腫瘍アクセス能および
より迅速なクリアランス速度を有する、より小さな治療抗体の開発に集中している。遺伝
子工学は、癌治療に対する潜在的に強力なツールである単鎖抗体フラグメント(scFv)を
構築するのを可能にした。これらの小抗体は、リンカーペプチドにより連結された軽鎖(
VL)可変ドメインおよび重鎖(VH)可変ドメインからなる。これら小抗体は、ほとんど免
疫原性を示さず、ほぼ無毒性の効果、クリアランス速度の増加、腫瘍による取り込みの改
善、および腫瘍細胞内へのより良好な浸透性を示す。組換えマウスscFvは、ハイブリドー
マ由来の発現ライブラリーまたは特に免疫したマウスの脾臓細胞由来の発現ライブラリー
のいずれかを使用する標準的な方法に従って確立され得る(Chowdhuryら, Mol. Immunol.
4 (1997), p. 9−20:非特許文献1)。
ンを標的化し、そして高度に前立腺特異的であると示された(Horoszewiczら, Anticance
r Res. 7 (1987), p. 927−935:非特許文献2)。また、PSMA細胞外ドメインに対する
モノクローナル抗体は、抗原による免疫後に惹起された。しかしながら、一方で固定され
た細胞上および組織学的切片上の抗原に結合することと、他方で生存する腫瘍細胞に結合
することとの間には、依然として不一致が存在する。
も前立腺癌においても同じくらい良好に高発現される。この発現は、前立腺癌において上
昇され、そして前立腺において主に見出される。
いて、そして他の多くの固形腫瘍の新生脈管構造において数倍に過剰発現されるが、正常
組織の脈管構造においては過剰発現されない。PSMAの固有の発現により、このPSMAは、重
要なマーカーおよび画像作成薬剤(造影剤;imaging agents)の大規模な細胞外標的とさ
れる。
PSMAは2つの固有の酵素機能(葉酸加水分解酵素およびNAALADase)を有し、そしてクラ
スリン被覆されたピットを介して他の膜結合型レセプターと同様に再利用されることが見
出される。
(登録商標)」として市販され、これは通常、前立腺癌の転位および再発を診断するため
に使用されている。モノクローナル抗体7E11−C5.3によって認識されるPSMAエピトープは
、前立腺特異的膜抗原の細胞内ドメインに位置付けられる。
を説明する報告も存在する。従って、可能性ある説明は、O'Keefeら、Prostate, 2004, 2
月1日号 ; 58 (2) 200−10(非特許文献3)により提供される。すなわち、ヌクレオチ
ドレベルでPSMA遺伝子と98%の同一性を有するPSMA様遺伝子が存在し、これはPSMA遺伝
子とは異なるプロモーター制御下で腎臓および肝臓に発現される。
の開発を記載する。ヒト抗PSMAモノクローナル抗体は、精製PSMAまたはPSMA抗原の富化調
製物をマウスに免疫することによって調製された。このような精製抗原は、変性PSMAであ
る。なぜなら、イオン性界面活性剤を用いた細胞の溶解後に免疫吸着によって精製されて
いるからである。
クローナル抗体を記載する。免疫は、C末端ペプチドまたはPSMA発現腫瘍膜調製物を用い
て実施された。mAbはPSMA発現細胞には特異的に結合せず、このため診断目的にも治療目
的にも使用できない。
/0213791(特許文献3)はそれぞれ、前立腺特異的膜抗原に対するモノクローナル抗体を
開示する。精製した抗原を用いて免疫を実施したので、これらのモノクローナル抗体は高
度な細胞結合性を有さず、そしてこれらのmAbのいずれからもscFvを得ることができなか
った。
立腺特異的膜高原の細胞外ドメインを認識するその抗体の結合部分を記載する。これらの
抗体の結合部分が実際に抗原に結合することを示すことができなかった。
結合した抗PSMAモノクローナル抗体を記載する。この論文に記載された構築物は、標的に
は特異的に結合せず、免疫毒素の生成という一般的に記載される欠点を有している。
ク質を発現する)とPSMAネガティブ細胞との間を、より高い信頼性で区別するのを助ける
、より優れた手段および構築物を提供することである。このような構築物を使用して、よ
り特異的に前立腺癌を標的化し得る。
ことである。
しかしながら、前立腺細胞上では、PSMAは特異的な三次元および四次元の構造で発現され
、そして単離され変性されたPSMAを用いて惹起した抗体はPSMA発現腫瘍細胞を効果的には
認識しない。変性PSMAに結合する抗体およびscFvは、単離され精製した抗原を用いた免疫
の後に得ることができる。しかしながら本発明は、僅かな収量のみのポジティブクローン
を生じる異なる免疫方法によって、ネイティブな細胞性PSMAに対して高親和性の抗体およ
びscFvの作製を可能にする。ネイティブなPSMAにより惹起した後者抗体のみが細胞表面の
PSMAと反応でき、そしてこれは診断ツールおよび治療ツールとして使用できる。
ディ(二価抗体;diabody)を、マウス脾臓細胞から従来の方法に従って調製した。何ら
かの方法で、全長のネイティブPSMAを含むLNCap細胞およびLNCaP細胞溶解物を用いてマウ
スを免疫しておいた。本発明の好ましい実施形態において、抗原、いわゆる全長のネイテ
ィブPSMAを、細胞の処理後、好ましくはM−PERと呼称する特別の溶解バッファー(Pierce
(Roquefort, Illinois)から市販される哺乳動物タンパク質抽出試薬)を用いたLNCaP細
胞の処理後に取得した。このM−PERバッファーは、25 mMのビシン緩衝液(bicine buffer
)(pH 7.6)中に専有する界面活性剤を使用する。ハイブリドーマおよびscFvを、スクリ
ーニングし、そしてPSMAネガティブなDU145前立腺細胞を用いた吸着後、PSMAポジティブ
なLNCaP細胞におけるフローサイトメトリーによって選択した。さらに、これらハイブリ
ドーマおよびscFvを精製PSMAとの反応性について試験した。LNCaPおよびPSMAをトランス
フェクトしたDU−145におけるフローサイトメトリーによって、そして精製したグリコシ
ル化PSMAおよび非グリコシル化PSMAを用いたウエスタンブロットによって、得られたモノ
クローナル抗体およびscFvを特徴付けた。さらに、LNCaP細胞を用いた免疫細胞学および
前立腺癌サンプルのパラフィン切片における免疫組織化学を準備した。
は生存するLNCaP細胞およびPSMAをトランスフェクトした生存するDU−145細胞と反応性で
あったが、PSMAを発現しない他の細胞株とは反応性でなかった。LNCaP細胞への結合は非
常に強力であった。飽和濃度(100 nM)において、平均のPE蛍光強度(MFI)は1000〜160
0の間であった。精製PSMAとの反応性は、変性かつ非グリコシル化タンパク質との反応性
(ウエスタンブロット)よりも、ネイティブ形態との反応性(ELISA)がより強力であっ
た。パラフィン切片における免疫組織化学は、mAb E7を用いると上皮細胞に対して特異的
にポジティブであった。
おける組換えファージの選択によって取得した。scFv E8の配列は、同じマウスのB細胞
ライブラリーから取得したscFv A4と同一であった。scFv E8はLNCaP細胞と反応性が強く
、飽和濃度において約100のMFIを示した。一方、scFv A5のMFIは同じ濃度において約40の
みであった。PSMAの発現を欠く他の細胞株とは、結合は全く認められなかったかまたは最
小限認められた。精製した変性グリコシル化PSMAおよび非グリコシル化PSMAへの両scFvの
結合は弱かった。さらに、mAb 3/F11由来のscFv(D7と呼称される)およびmAb 3/E7由来
のscFv(H12と呼称される)を取得した。
度な結合親和性および高度な染色に関して、他の著者らにより公開されたものと異なって
いる。抗体3/F11、3/A12および3/E7は、強力な結合活性だけでなく、免疫蛍光細胞学およ
び共焦点レーザー走査顕微鏡を用いた検出により示される場合、LNCaP細胞中への内在化
も示す。これらのmAbを、全長のネイティブPSMAを用いた免疫処置(immunisation)の後
に得ることができる。この処置は、別の公開された免疫処置方法とは対照的である。
発現LNCaP細胞へは結合が制限されるにとどまり、また細胞内に内在化されなかった。こ
れらのコントロールデータは本出願には示されない。数個の抗PSMA mAbが文献に記載され
る。しかしながら、それらの平均の蛍光強度値は、本発明の抗体が有する値よりもずっと
低い。
した。変性PSMAを用いて、本発明者らは抗原に高度に特異的だがLNCaPには結合しないscF
vを取得した(本出願ではデータは示されない)。対象的に、ネイティブPSMAを用いて、
本発明者らは高度な細胞結合活性を有するが、単離した変性抗原には結合性が乏しいscFv
を取得した。
した問題は、免疫毒素、肝臓毒性および血管漏出症候群(vascular leak syndrome)に対
する抗体の開発であり、そしてまた多量の規定物質を生産するの困難さである。これらの
問題は、少なくとも部分的に、より少ない免疫原性および可能性あるより小さな免疫毒素
の構築物を作製し、そして多量の免疫毒素生産をより容易にさせる、組換えDNA技術を
使用して克服される。また、腫瘍内への浸透は大きな結合体よりも小さなタンパク質に関
してより良好であるはずであるとも考えられる。従って、組換え免疫毒素を、scFv E8、s
cFv H12、scFv D7およびscFv A5のコード配列と毒素PE40とを融合することによって操作
した。中心となる発見は、全ての組換え毒素が培養した前立腺癌細胞を用量依存的様式で
効果的に殺傷することであった。強力な殺傷は、約0.05nMのIC50を有する高結合性のE8融
合タンパク質を用いた場合だけでなく、0.09nMのIC50を有するより低結合性のA5融合タン
パク質を用いた場合でも見出された。PSMA非発現前立腺癌細胞の殺傷は、2000分の1未満
であった。このことは、免疫毒素調製物における残りの細菌性タンパク質または他の毒性
物質まで遡ることができる。なぜなら、scFv単独を用いる場合に等しい高濃度において同
じ背景が観察できるからである。用語IC50は、毒素を加えない場合の細胞増殖の50%まで
に細胞増殖を低減する毒素のnM濃度として定義される。
これによって前立腺癌に対する標的抗原としてPSMAに焦点を定める診断利用および治療利
用において、価値を有する。
性構造に対する抗体のみが生存する前立腺癌細胞およびPSMA発現組織を認識し得、そして
これに強力に結合し得る。従って、本研究の狙いは、前立腺癌の治療標的または診断標的
のために使用され得るmAbおよびscFvを調製することである。従って、本発明は、標識ま
たは細胞傷害性薬物に連結される、腫瘍細胞表面上に存在するネイティブ形態の前立腺特
異的膜抗原に結合する、単離された抗体モノクローナル抗体またはその抗原結合部位を提
供する。
b)腫瘍細胞によって内在化でき、
c)LNCAP細胞には強力に結合するが、前立腺膜特異的抗原の発現を欠く細胞には結合し
ないかごくわずかにのみ結合し、そして
d)標識または細胞傷害性薬物と連結されることを特徴とする、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
(2)前記モノクローナル抗体(mAb)のPE蛍光強度(MFI)が抗原飽和において1000より
高く、かつscFvのPE蛍光強度が抗原飽和において40より高いことを特徴とする、上記(1)
に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
(3)1nM〜120nMの間の濃度でPSMA部位のうち50%飽和に達するLNCAP細胞に対する高結
合活性を示す、上記(1)または(2)に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原
結合部分。
(4)前記標識が放射線または蛍光線を放射する粒子であることを特徴とする、上記(1)
〜(3)のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
(5)前記細胞傷害性薬物が、毒素からなる群、特にタキソール、サイトカラシンB、グ
ラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、
ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒ
ドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンD
、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リド
カイン、プロプラノロール、および/またはピューロマイシンからなる群より選択される
細胞毒性物質であることを特徴とする、上記(1)〜(4)に記載の単離されたモノクローナル
抗体またはその抗原結合部分。
(6)配列番号:1のうちの少なくとも10個の連続アミノ酸の部分アミノ酸配列を含むこ
とを特徴とする、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体または
その抗原結合部分。
(7)配列番号:2〜配列番号:7のうちの少なくとも1つを含むことを特徴とする、上
記(6)に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
(8)配列番号:10のうちの少なくとも10個の連続アミノ酸の部分アミノ酸配列を含むこ
とを特徴とする、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体または
その抗原結合部分。
(9)配列番号11〜配列番号16のうちの少なくとも1つを含むことを特徴とする、上記(8
)に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
(10)配列番号:20のうちの少なくとも10個の連続アミノ酸の部分アミノ酸配列を含む
ことを特徴とする、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体また
はその抗原結合部分。
(11)配列番号:20のうちの少なくとも25個の連続アミノ酸の部分アミノ酸配列を含む
ことを特徴とする、上記(10)に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合
部分。
(12)配列番号:22の少なくとも10個の連続アミノ酸の部分アミノ酸配列を含むことを
特徴とする、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体またはその
抗原結合部分。
(13)配列番号:22の少なくとも25個の連続アミノ酸を含むことを特徴とする、上記(1
2)に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
(14)上記(1)〜(13)のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗
原結合部分を含む、医薬組成物。
(15)癌の処置のための医薬調製のための、上記(1)〜(13)いずれかに記載の単離され
たモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の使用。
(16)上記(1)〜(13)のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗
原結合部分を含む、腫瘍細胞検出のための診断キット。
(17)上記(1)〜(13)のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗
原結合部分と、識別されるべき腫瘍細胞とが接触されることを特徴とする、腫瘍細胞のイ
ンビトロ識別のための方法。
(18)腫瘍細胞の診断識別のための、上記(1)〜(13)のいずれかに記載の単離されたモ
ノクローナル抗体またはその抗原結合部分の使用。
(18)配列番号:8、9、17、18、19、21、23および24からなる群のいずれかの配列の
うちの少なくとも20ヌクレオチドの連続配列を含むことを特徴とする、単離されたポリヌ
クレオチド。
少なくとも2つの重鎖(H鎖)および2つの軽鎖(L鎖)を含む糖タンパク質をいう。各々
の重鎖は、重鎖可変領域(VHと略される)および重鎖定常領域を含む。この重鎖定常領域
は、3つのドメイン、すなわちCH1、CH2およびCH3を含む。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域
(VL)および軽鎖定常領域(CL)を含む。VH領域およびVL領域はさらに、超可変領域に部
分分割され得る。これらはまた、より保存された領域により介在される、相補性決定領域
(CDR)と呼称される。これらの領域はまた、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる。各
々のVH領域およびVL領域は、3つのCDRおよび4つのFRを含む。アミノ末端からカル
ボキシ末端まで以下の順序で配置される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4
。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
らの領域は、モノクローナル抗体またはその抗原結合部位の結合に重要である。他の領域
は、他の配列によって置き換えられ得るフレームワーク領域である。但し、結合のために
必要とされる三次元構造は乱されない。構築物の構造が変更される場合、抗原に対する十
分な結合は存在しない。マウス由来のモノクローナル抗体は、抗体を惹起し得る別種由来
のタンパク質を含むという事実に起因して、所望されない免疫学的副作用を引き起こし得
る。この問題を克服するため、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分がヒト化され
得る。モノクローナル抗体をヒト化するプロセスは、当業者に公知である。マウスmAbの
フレームワーク領域は、対応するヒトフレームワーク領域により置換される。好ましい結
合特性を維持するため、CDRの配列は可能な限り維持されるべきである。しかしながら、
結合特性を最適化するためいくつかのアミノ酸の変更を実施することが必要とされ得る。
このことは、標準的手順によって当業者により実施され得る。さらに、ヒトフレームワー
クを導入することによって構築物の特性を改善するため、アミノ酸の変更および/または
欠失を実施することが必要であり得る。
抗原に特異的に結合する能力を保持するような抗体の1つ以上のフラグメントをいう。抗
体の抗原結合部分の例としては、Fabフラグメント、VLドメインとVHドメインとCLドメイ
ンとCH1ドメインとからなる1価フラグメント、F(ab')2フラグメント、二価フラグメ
ント(ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結される2つのFabフラグメントを含
む)、VHドメインおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント、抗体の単腕のVLドメイン
およびVHドメインからなるFvフラグメント、VHドメインと単離された相補性決定領域(CD
R)とからなるdAbフラグメント、およびが挙げられる。
治療目的のために使用される場合、腫瘍細胞により内在化できる。診断目的には内在化は
必要とされなくてもよい。
治療目的に使用される場合、腫瘍細胞によって内在化できる。診断目的には内在化は必要
とされなくてもよい。
強く結合するが、前立腺特異的膜抗原の発現を欠く細胞には結合しない。
により測定され、これは飽和濃度において、好ましくはscFvに関して40以上であり、好
ましくはmAbに関して1000以上である。
トの結合特性は、LNCaP細胞を漸増濃度の第一段階の抗PSMA Abを用いて処理し、その後第
二工程のPE標識化抗体と共にインキュベートすることによって比較された。得られた飽和
曲線から、PSMA部位の50%飽和に達する抗体濃度が読み取ることができる。3種のmAb 3/F
11、3/A12および3/E7は、約16 nM(3/F11)、約2 nM(3/A12)および約30 nM(3/E7)に
てPSMA部位の50%飽和に達する高結合活性を示した。scFvの場合、PSMA部位の50%飽和は、
10nM(E8)および60nM(A5)に認められた。
FI値を抗体濃度(またはその結合フラグメント濃度)に対してプロットし、これによって
MFIのプラトー値は抗原との100%飽和に対応する。頂点の値(抗原の100%飽和に対応する
プラトー)を決定した後、50%飽和に対応する値は容易に決定され得る。このグラフを使
用して、抗体またはその結合フラグメントの対応する濃度(nM単位)を認めることができ
る。
励起する粒子であり得る。この粒子は、構築物に連結され得る形態、好ましくは錯体の形
態の放射性元素であり得る。例えば、111インジウムにて標識されたmAbは、前立腺癌患者
における遠隔性転位腫瘍の検出における放射性免疫シンチグラフィー剤(radioimmunosci
ntigraphy agent)として使用され得る。無論、35Sまたは131Iのような他の適切な放射
性元素が使用できる。
を含み得、この薬物は、毒素(例えば、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD
、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチ
ン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアン
トラシンジオン(dihydroxy antracin dione)、ミトキサントロン、ミスラマイシン、ア
クチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テ
トラカイン、リドカイン、プロプラノロール、および/またはピューロマイシン)からな
る群より選択される細胞毒性物質である。
合部分は、配列番号:1(scFv E8)、配列番号:10(scFv A5)、配列番号:20(scFv H12)
、および/または配列番号:22(scFv D7)のうちの少なくとも10個の連続アミノ酸の部分
アミノ酸配列を含む。好ましい実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結
合タンパク質は、配列番号:1、配列番号:10、配列番号:20、および/または配列番号:22
それぞれのうちの、少なくとも25個、より好ましくは少なくとも35個、そして最も好まし
くは少なくとも50個の連続アミノ酸を含む。
合部分は、配列番号:2〜配列番号:7および/または配列番号:11〜配列番号:16を有するCD
Rのうちの少なくとも1つを含む。より好ましくは、そのような構築物はそれらCDR配列の
うちの少なくとも3つ、好ましくは少なくとも5つを含む。類似の様式で、CDRは、CDR配
列が設計される図20〜21から導くことができる。
めに使用され得るDNA配列を提供することである。配列番号:8および配列番号:9はscFv E8
に関係し、配列番号:17および配列番号:18はscFv A5に関係し、配列番号:19および配列番
号:23はscFv H12に関係し、そして配列番号:21および配列番号:24はscFv D7に関係する。
これらの配列は、コーディング鎖およびその相補鎖を報告する。配列番号:9および配列番
号:18は、5'→3'向きに示される。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号:8、9、17、18
、19、21、23および24からなる群のうちの少なくとも20ヌクレオチド、好ましくは50ヌク
レオチド、そしてより好ましくは75ヌクレオチドそして最も好ましくは少なくとも約100
ヌクレオチドの連続配列を含む。CDRに対するコード配列が特に好ましい。
結合部分を含む医薬組成物を提供することである。本発明の医薬組成物は、モノクローナ
ル抗体またはその抗原結合部分を、薬学的に許容可能な添加物と一緒に含む。好ましくは
、このような組成物は、筋肉内注射または静脈内注射のために調製される。あるいは、こ
の抗体は、好ましくは1〜6ヶ月に及び得る特定期間にわたって生物学的に活性な薬剤の
持続性放出を可能にするデポー処方物にて提供され得る。このような持続性放出処方物は
、ヒトの生体中で長期にわたって分解される生分解性ポリマー(ポリ乳酸またはポリ乳酸
/ポリグリコリドのコポリマーなど)を含み得る。これによって、好ましくは毒素を有す
る抗体またはその抗原結合部分が、特定の期間にわたって制御された様式で放出される。
ための医薬の調製のために使用され得る。
、腫瘍細胞検出のための診断キットを提供する。このような実施形態において、標識は適
切な検出デバイスを用いてこの構築物の検出を可能にする。
別されるべき腫瘍細胞は、適切な分析デバイスによって検出できる標識を保有する単離さ
れたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触される。標識は、例えば外科手術
後または生検後に取得されるヒト細胞の切片において、腫瘍細胞の診断的識別を可能にす
る。
ヒト前立腺癌細胞株のLNCaP、DU 145、PC−3およびHeLa、ならびにハイブリドーマ7E11
−C5.3(IgG1−κ、PSMA)を、American Type Culture Collection (ATCC)(Rockville
, MD, USA)より購入した。LNCaP、DU 145およびHeLaをRPMI 1640培地中で、PC−3をF12
Nutrimix培地中で、共にペニシリン(100,000 U/l)、ストレプトマイシン(100 mg/l)
および10 % FCS を補充して、5% CO2 の加湿した雰囲気において37℃で培養した。非グ
リコシル化PSMAを表面上に発現するLNCaP細胞の調製のため、2 μg/mlのツニカマイシン
(ICN Biomedicals)を培地に48時間添加した。
れたLNCaP細胞を取得し、次いで全体をPBSにより徹底的に洗浄した。
を含むPBS中に室温で20分間溶解した。10,000 gでの遠心分離後、上清を7E11−C5アフィ
ニティークロマトグラフィーカラム(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)にかけ
、そしてPSMAを1 %のTriton X−100を含む100 mMのグリシン緩衝液(pH 2.5)により溶出
した。中和後、タンパク質をPBSにより完全に透析した。
、精製PSMAを有する溶液に加え、そして100℃で10分間加熱した。次いで、1/10容量の10%
NP−40(10%)および1μgのPSMA当たり50UのPNGaseを添加し、37℃で1時間インキュ
ベートした。
e)を用いて10分間溶解し、次いで15,000 rpmにて4℃で30分間遠心分離した。全長のネイ
ティブPSMAを含む上清を収集した(M−PER溶解物)。この溶解物の高分子量画分(100〜6
00 KD)をBiosil 250サイズ排除カラムにてHPLCにより分離した。
全長PSMAを2つの断片(塩基対262から塩基対1573の固有のEcoRI制限部位までの断片1
、および1574位〜2512位までの断片2)にして、ベクターpCR3.1(Invitrogen)にクロー
ニングした。製造業者のプロトコルにしたがって、500μlのRPMI培地中の4μgのDNAおよ
び10μlのLipofectamine (Invitrogen)の混合物を、106 個の細胞に添加することによ
って、一過性トランスフェクションを得た。48時間のインキュベーション後、一過性トラ
ンスフェクトした細胞を試験に使用した。
4週齢の雌Balb/cマウスに、LNCaP細胞由来のM−PER溶解物300μg、またはこの溶解物
の高分子量HPLC画分、または2 %パラホルムアルデヒドで固定した106個のLNCaP細胞を、
腹腔内で免疫した。これらの調製物とフロイト完全アジュバントとを1:1で混合した。
マウスは各々、2週間間隔で4回または5回の免疫を受けた。最終免疫の4日後、脾臓細
胞を収集し、ハイブリドーマの調製またはB細胞ライブラリーの調製のいずれかのために
使用した。
マウス脾臓をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中で洗浄し、小片に細かく刻み、再度PBS
中で洗浄し、次いで「ルーズな取付けの(loose−fitting)」手動ホモジナイザーで静か
にホモジナイズした。得られた単一の細胞懸濁物をFicoll(Pharmacia, Freiburg, Germa
ny)上に重層し、400 gにて20分間室温で遠心分離した。製造業者(Miltenyi, Bergisch
Gladbach, Germany)の指示書に従って、CD19マイクロビーズを用いて、間期のB細胞を
単離した。106個のB細胞を350μlの溶液に、4 Mのグアニンチオシアネート、25 mMのク
エン酸ナトリウム、0.5%のN−ラウロシルサルコシネートナトリウムおよび100 mMの2−
メルカプトエタノールからなる溶液350μl中に溶解した。
脾臓を無菌的に取り出し、血清を含まないRPMI−1640中に細胞1個の懸濁物調製した。
脾臓細胞をSP2/0ミエローマ細胞に10:1の比率で加え、そして融合および選択を確立
された手順(Galfreら, Nature (1979), p. 131−133)に従って実施した。
よって、ハイブリドーマの上清を試験した。プロテインGカラム(Pharmacia)を使用し
てモノクローナル抗体を精製した。
抗PSMA mAbの免疫グロブリンアイソタイプを、標識なしの抗アイソタイプ特異的抗体(
固相)またはペルオキシダーゼ標識した抗アイソタイプ特異的抗体(トレーサー)(Sout
hern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)のいずれかを使用して、ELISAによっ
て決定した。
確立された方法に従って、LNCaP細胞由来のM−PER溶解物を用いて5回免疫したBalb/c
マウス由来の脾臓細胞をSP2/0細胞と融合した。LNCaP細胞を用いたフローサイトメトリー
および精製PSMAに対するELISAによって、ポジティブなハイブリドーマを選択した。この
ようにして、3つのポジティブなクローンを取得した。それらのアイソタイプとmAbとの
対応は、3/F11(lgG2a)、3/A12 (IgG1)および3/E7(lgG2b)であった。
フローサイトメトリーによって、3つのmAbおよび染色したLNCaP細胞が非常に良好に結
合し、ポジティブ細胞の割合が95%〜98%に及ぶことを観察できた。蛍光 対 事象数の曲
線の形は、PSMAがLNCaP細胞集団内で均一に分布されることを示唆する(図1)。抗PSMA
mAbの結合特異性を評価するため、PSMAネガティブなDU145細胞、PC3細胞、HeLa細胞およ
びJurkat細胞もまた染色してフローサイトメトリーにより分析した。3つ全てのmAbは、P
SMAネガティブな細胞を染色しなかった(ポジティブ細胞の割合は0.04%〜2%に及ぶ)。
し、次いで第二段階のPE(フィコエリシン)標識した飽和量のヤギ抗体とインキュベート
し、次いで細胞蛍光測定(cytofluorometry)分析によって比較した。抗原飽和濃度(100
nM)において、補正した平均PE(フィコエリシン)蛍光極度は、mab 3A12について約1000
であり、mAb 3F11について約1400であり、そしてmAB 3E7について約1600であった。mAb 3
A12について示されるように、非グリコシル化PSMAを発現するLNCaP細胞(ツニカマイシン
を補充して培養したもの)に対するMFIは1/5未満であった。
対する3種のmAbの強力な結合(図2)およびそれら細胞内での内在化(図3)も示すこ
とができた。固相として精製PSMAを用いたELISAにおいて、全てのmAbはポジティブであっ
た。変性PSMAを用いた場合、これらのmAbはウエスタンブロットにおいて約100 KDにシグ
ナルを示し(図4)、一方、非グリコシル化PSMAを用いたブロットは約84 KDに弱いシグ
ナルを示した。このことは、文献データと一致する(図5)。
あったが、mAbs 3/F11およびmAb 3/A12を用いるとポジティブではなかった(図6)。デ
ータを表1に要約する。
MFI=抗原飽和に達するscFv濃度における、平均の蛍光強度(二次抗体単独を用いたバッ
クグラウンド染色を差し引く)
(ポジティブ)=僅かにポジティブ。
つ高度に特異的な結合を示すこと結論付けられる。非グリコシル化PSMAに対する結合はよ
り弱いが、PSMAを発現しない細胞に対しては結合が全く認められない事実から、糖の特異
性は除外できる。
シリカゲルベースの膜(Rneasy、Qiagen、Hilden、Germany)を用いて、製造業者のプ
ロトコルに従って、B細胞ライブラリーまたはハイブリドーマ細胞から総RNAおよびmRNA
を単離した。cDNA合成を、25μlの変性RNA、10μlの5×緩衝液(Promega、Heidelberg、G
ermany)、5μlの10 mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP、Promega)、1.5μl RNAsin (4
0 U/μl、Promega)、2.5μlの150 pM ランダムヘキサマープライマー、および2.5μlのA
MV逆転写酵素(10 U/μl、Promega)を含む最終容量50μl中で、42℃で60分間実施した。
次いで、先に Orumら(Nucleic Acies Res.(1993), 4491−4498)に記載されるように
、重鎖ならびにγ鎖およびκ鎖のコード領域をPCRにより増幅した。各々の鎖について、
25種の異なる定常領域の順方向プライマーと対応する1種の逆方向プライマーとを組合
わせることによって、25種の別個の反応を実施した。軽鎖および重鎖の増幅産物をアガ
ロースゲル電気泳動により精製した。
ー、400ngのインサート)を使用してファージミドpSEX81にライゲーションした(Duebel
ら, Gene(1993), 97−101)。1回のライゲーションの産物を、業者のプロトコルに従
って、50μlのエレクトロコンピテント(electrocompetent)E. coli XL1 blue細胞(Str
atagene)のエレクトロポレーションに使用した。この細菌を、100μg/mlのアンピシリン
および0.1 Mのグルコース(SOB−AG)を含む直径80 mmの寒天プレート9個に播き、そし
て30℃で一晩インキュベートした。各プレートに3 mlの2×YT培地を加え、滅菌したガラ
ススプレッダを用いて細菌を剥がし落とし(scrap off)、そして3,000gにて15分間ペレ
ット化すること(pellet)によって、細菌を単離した。これらの細菌からVIサブライブラ
リーを表すファージミドDNAを単離した。次いで、重鎖およびVIサブライブラリーのPC
R産物をNcoIおよびHindIIIを用いて消化した。3:1の比(2μgのサブライブラリーお
よび400ngのインサート)でライゲーションを行った。VIサブライブラリーについて記載
されるように、エレクトロポレーションによる形質転換、形質転換した細菌の播種および
収集を行った。直径80mmのSOB−AGプレート9枚から、全部で18 mlのVHVLライブラリーを
取得した。
a)産生
ファージミドpSEXにおけるVHVLライブラリーにおいて、抗体遺伝子を遺伝子III(これ
は、線状ファージのマイナーな表面タンパク質gIIIpをコードする)とインフレームで融
合した。これにより、表面上に抗体を提示する組換えファージミド粒子の産生は、レプリ
コン欠失ファージM13KO7をファージミド保有細菌細胞に感染させることを必要とする(14
)。M13KO7を多重度10にて10 mlのライブラリー培養物に加えた。37℃で90分間のインキ
ュベーション後、細胞をペレット化し、そして100μg/mlのアンピシリン、10μg/mlのテ
トラサイクリンおよび50μg/mlのカナマイシンを含む15 mlの2×YT培地に再懸濁した。
この培養物を250rpmにて37℃で一晩インキュベートし、次いで氷上で冷却し、そして遠心
分離して細胞を取り除いた。ファージを含む上清を、20%のPEG 8,000および14%のNaClを
含む1/5容量の水溶液と混合し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、4℃および6
,200 gにて30分の遠心分離を加えた。ファージを含むペレットを、2mlの10 mM Tris/HCl
(pH 7.5)、20 mM NaCl、2mM EDTA(pH 7.5)中に再懸濁し、そしてパンニング(panni
ng)に使用した。
精製PSMAの溶液(100μl/ウェル、PBS中12μg/ml PSMA)によりコーティングし、そし
て4% 脱脂粉乳/PBSを用いてブロッキングした、96ウェルのMaxi−Sorbマイクロタイター
プレート(Nunc)において、精製PSMAに対するパンニングを行った。精製した組換えファ
ージ(約1011)1mlを、15μlの10% Titon X100を補充した1mlの4% 脱脂粉乳/PBS中で15
分間インキュベートし、次いでPSMAによりコーティングした8つのウェルに37℃で2時間
結合させた。PBS/Tween(0.1%)による20回の洗浄後、結合したファージを、0.1Mのグリ
シン緩衝液(Glycine−Puffer)(pH2.2)を用いて溶出した。生存するLNCaP細胞に対す
るパンニングのため、ファージを予めDU 145細胞に吸収させた。この手順のため、1ml(
約1011)の組換えファージを2%脱脂粉乳/PBS中で振盪機において室温で15分間インキュ
ベートし、次いでDU 145細胞と共に1時間インキュベートした。次いで細胞を遠心分離し
て、吸着されなかったファージを有する上清を、振盪機において室温で1時間、106個のL
NCaP細胞と共にインキュベートした。2%脱脂粉乳/PBSによる10回の洗浄およびPBSによる
5回の洗浄後、結合したファージを50mMのHClを用いて溶出させ、続いて1MのTris−HCl
(pH7.5)により中和した。
て30℃で一晩インキュベートした。溶出物のアリコートをタイトレーション(titration
)に使用した。この選択手順を3〜6回繰り返した。
タイトレーションプレートから96個の異なるコロニーを単離し、各コロニーを、100μg
/mlのアンピシリンおよび0.1 Mのグルコースを含む500μlの2×YT培地(YT−AG)を満た
した96ウェル深底マイクロタイタープレートのうちの1ウェルに移し、そして37℃で一晩
インキュベートした(マスタープレート)。次いで、このマスタープレートの各ウェルか
ら40μlの飽和培養物を、400μlの2×YT−AG培地を入れた新しいプレートの対応するウ
ェルに移した。
で2時間インキュベートした。次いで、このプレートを遠心分離し、ペレットを100μg/m
lのアンピシリン、10μg/mlのテトラサイクリンおよび50μg/mlのカナマイシンを補充し
た2×YT培地に懸濁し、そして29℃かつ240 rpmで一晩インキュベートした。遠心分離後
、レスキューされたファージミドを含む上清を取り出し、そしてファージELISAおよびフ
ローサイトメトリーに使用した。
マイクロタイタープレートを精製PSMA(1.5μg PSMA/ml PBS)により一晩コーティング
し、次いで2%脱脂粉乳/PBSによりブロッキングした。2%脱脂粉乳/PBSと1:1で予備イ
ンキュベートした200μlのレスキューされたファージを各ウェルに添加し、室温で2時間
インキュベートした。PBS−Tweenによる5回の洗浄工程の後、ホースラディッシュペルオ
キシダーゼ(Pharmacia)と結合体化された200μl/ウェルの抗M13抗体により、室温で2
時間結合したファージを検出した。基質として3,3',5,5'−テトラメチルベンジジンを用
いて、発色を実行した。
抗PSMA立体構造型scFvの調製のため、LNCaP細胞のM−PER溶解物で免疫したマウスのB
細胞ライブラリーから、ファージミドpSEX中にVHVLライブラリーを構築した。このライブ
ラリーは、107の複雑度を有した。同様の方法で、LNCaP溶解物で免疫した同一のマウスよ
り取得したモノクローナル抗体3/A12由来のVHVLライブラリーを調製した。このVHVLライ
ブラリーは105の複雑度を有した。細胞性PSMA結合性scFvをファージ表面上に提示するフ
ァージを単離するため、20μg/mlの精製PSMAによりコーティングしたマイクロタイタープ
レート中およびポリスチレンチューブ中で、DU 145細胞による吸収後にLNCaP細胞に対し
て6回のパンニングを交互に実施した。3回、4回および6回のパンニング後、単離した
ファージミドコロニーを培養して、M13KO7の感染によりファージ粒子をレスキューした。
LNCaP細胞を用いたフローサイトメトリーおよび精製PSMA上でのELISAによる、B細胞ライ
ブラリー由来の800個のファージクローンの分析は、1つのポジティブクローンを示した
(E8と呼称する)。mAb 3/A12由来のVHVLライブラリーからは、4回目のパンニング後に
2つのポジティブクローンを得た(A4およびA5と呼称する)。配列決定により、A4はE8と
同一であることが判明した。
はC末端にc−mycおよびHisタグを備える)の中へと移した。この配列を、対応するCDRと
共に図13および図14に示す。抗原結合部分のCDRのコード領域を図13および図14中に印を
付ける。これらの配列は変更されるべきではないが、一方、他の部分の印を付していない
配列は変更され得る。しかしながら、適切な三次元構造が維持されなければならない。
飽和濃度においてMFI値は約100であった。一方、A5の結合はずっと弱く、飽和濃度におけ
るMFI値は約40であった(図7)。対照的に、ELISAにおいて固相とした精製PSMAに結合す
ることは、E8に関しては弱く、そしてA5に関しては幾分強かった。変性したグリコシル化
PSMAおよびグリコシル化PSMAを用いたウエスタンブロットにおいて、同様のパターンが認
められた(図8)。LNCaP細胞を用いた免疫蛍光細胞学および共焦点レーザー顕微鏡によ
る検出によって、scFv E8の非常に良好な結合および内在化を示すことができる(図9)
。scFvのデータを表2に要約する。
クグラウンド染色を差し引く)
(ポジティブ)=僅かにポジティブ。
scFvのC末端位置にHis−6タグおよびc−mycタグの配列を備える選択ベクターpHOG 21
使用して、E. coli XL1−Blue(Stratagene)においてscFvフラグメントを発現させた(K
ipriganovら, J.lmmunol.Methods (1997), p. 69−77)。pHOGプラスミドで形質転換さ
れたE. coli細菌を、2×YT−AG培地中で一晩増殖させ、次いで1:20に希釈し、そして3
7℃で600mlの培養物として増殖させた。培養物がOD 0.8に達したとき、1,500gで10分間
の遠心分離により細菌をペレット化し、そして50:g/mlのアンピシリン、0.4 Mのショ糖
および1mMのIPTGを含む、等量の新鮮なYT培地に再懸濁した。次いで、培養を室温で18時
間〜20時間継続した。5,000gにて4℃で10分間の遠心分離によって細胞を収集した。可溶
性ペリプラズムタンパク質を単離するため、ペレット化した細菌を初期容量の5%の氷冷
した50 mMのTris−HCl、20%のショ糖、1 mMのEDTA(pH 8.0)中に再懸濁した。氷上での
1時間のインキュベーション後、スフェロブラストを20,000gにて4℃で30分間遠心分離
して、上清中に可溶性のペリプラズム抽出物を生じた。このペリプラズム抽出物を、10 k
Daのカットオフを有するAmicon YM 10膜(Amicon, Witten, Germany)を使用して濃縮し
、次いで50 mM Tris−HCl、1 M NaCl(pH 7.0)に対して完全に透析した。
で荷電したキレート性セファロース(Pharmacia)のカラム1mlを使用して実施し、そして
50 mM Tris−HClおよび1 M NaCl(pH 7.0)を含む緩衝液を用いて平衡化した。ペリプラ
ズム抽出物をロードし、30mMのイミダゾールを含む、20カラム容量の平衡化緩衝液により
洗浄し、次いで250mMのイミダゾールを含む平衡化緩衝液により溶出した。溶出した物質
をPBSに対して透析した。
パク質含量の測定を実施した。
約20μgであった。
LNCaP細胞、DU 145細胞およびPC3細胞を組織培養フラスコから新鮮に収集し、3% FCSお
よび0.1% NaN3を含むPBS中に単一細胞の懸濁物を調製した。およそ105個の細胞を、2%
脱脂粉乳/PBSと1:1で予めインキュベートしたレスキューしたファージミド50μlと共に
、氷上で1時間インキュベートした。PBSによる3回の洗浄後、25μl/ウェルの抗c−myc
モノクローナル抗体9E10(10μg/ml;Becton Dickinson)、またはファージをテストする
場合には25μl/ウェルの抗M13抗体(10μg/ml;Pharmacia)を添加し、そして氷上で40分
インキュベートした。PBSによる3回の洗浄後、それら細胞を100μlのPE標識化ヤギ抗マ
ウスIgG(Becton Dickinson)と共に氷上で40分間インキュベートした。次いで、これら
の細胞を再度洗浄し、死細胞を排除するため、3% FCSおよび0.1% NaN3を含むPBS中に1μg
/mlのヨウ化プロピジウム(Sigma, Deisenhofen)を含む溶液100μlに再懸濁した。染色
した細胞の相対的な蛍光を、FACScanフローサイトメトリーおよびCellQuestソフトウェア
(Becton Dickinson Mountain View, CA)を使用して測定した。
LNCaP細胞をガラスカバーストリップ上で24時間培養した。固定化のため、細胞をPBS中
2%のパラホルムアルデヒド(これは細胞膜を透過性にしない)により室温(RT)で30分
間処理し、1% BSA−PBSにより洗浄し、PBS中の50 mM NH4Cl中で10分間クエンチし、そし
て1% BSA−PBSによりリンスした。1% BSA−PBS中に4μg/mlにて一次モノクローナル抗体
を添加し、そして4℃で60分間インキュベートした。FITC標識化ヤギ抗マウス二次抗体(
2μg/ml;Southern Biotechnology Associates Inc. Birmingham, USA)を30分間インキ
ュベートし、そして1% BSA−PBSにより徹底的に洗浄した。スライドをVectashield(Vect
or Laboratories, Inc. Burlingame, CA)に取付けた。
%のパラホルムアルデヒドにより細胞を固定化し、PBS中0.5%のTriton X100により透過
性にした。
パラフィン組織切片を最初に脱パラフィン化し、次いで抗原の回復のためPBS中0.3% Tr
iton X100により処理した。クリオスタット(Kryostat)切片を冷アセトン中で固定した
。内在性ペルオキシダーゼをクエンチするため、この切片を3%のH2O2および10%のメタ
ノールにより30分間処理した。1%のBSA−PBSによるブロッキング後、濃度2μg/mlにて
一次抗体を添加し、室温で1時間インキュベートした。scFvのため、二次マウス抗c−myc
抗体を室温で1時間添加した。次いでビオチン化ヤギ抗マウス抗体を室温で30分間インキ
ュベートし、そして最後にABC試薬(Vectastain)を用いて発色させた。
精製PSMAおよびLNCaP由来の細胞溶解物をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリル
アミドゲルに電気泳動し、そしてポリビニリデンジフルオライド膜に移した後、ウエスタ
ンブロット分析を実施した。このブロットを5%脱脂粉乳を含むPBS中で一晩ブロッキン
グし、そして濃度10μg/mlにて精製mAbまたはscFvと共に1時間のインキュベートした。
次いで、このブロットをPBS−Tween(0.5%)により5回洗浄し、そしてホースラディッシ
ュペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗マウスIgGと共に室温で1時間インキュベートした。P
BS−Tween(0.5%)による5回の洗浄後、基質として3,3',5,5'−テトラメチルベンジジン
を使用してブロットを発色させた。
本発明者らのアプローチにおいて使用される毒素は、Pseudomonas外毒素(PE40)の短
縮バージョンであり、ドメインIaを欠失し、かつドメインIb、IIおよびIIIを含む(Pasta
nら, J.Biol.Chem, (1989), p.15157−15160)。ベクターpSW200中にコード領域を有す
るDNAを、Prof. W. Wels, Frankfurt (Welsら, Biotechnology (1992), p. 1128−
1132)から取得した。PE40をコードする塩基対位置253〜613由来のDNAフラグメントを
、プラスミドpSW200からのPCRにより増幅した。次いでこの増幅したDNAをベクターpHO
G−His−scFv中に、制限部位XbaIを使用してscFvに対してC末端位置にライゲーションし
た。全てのクローニング工程を、E. coli XL1 blueにおいて標準的な方法に従って実施し
、そしてその産物を配列決定によって確認した。
、ウエスタンブロット、およびフローサイトメトリーによって、その産物を試験し、特徴
付けた。
赤色テトラゾリウム塩WSTの水溶性ホルマザン色素への代謝を、製造業者の指示書(Boe
hringer)に従って決定した。標的細胞(コントロールとしてLNCaPおよびDU 145)を96ウ
ェルプレートに2.5×104/ウェルで播種し、コンフルエントな層を形成するまで24時間培
養した。50μl/ウェルのアリコート中の種々の希釈度の組換え免疫毒素を添加し、そして
そのプレートを37℃、5% CO2にて48時間インキュベートした。この時間後、培養物に15
μl/ウェルのWST試薬をパルス添加(pulse)し、そして37℃、5% CO2にて90分間インキ
ュベートした。次いで、それらサンプルの450 nm(参照は690 nm)においける分光学的吸
収を測定した。未処理のコントロール培養物と比較して、細胞生存率の50%低下を達成す
るのに必要な免疫毒素濃度(50%阻害濃度=IC50)を計算した。
NCaP細胞およびコントロールのDU 145細胞を用いて実施した。図11に示されるように、免
疫毒素E8−PE40の場合にLNCaP細胞に対して高い細胞傷害効果を示し、IC50値は0.05 nMで
あった。図12において免疫毒素A5−PE40の細胞傷害性を示し、IC50は約0.09 nMである。P
SMAを発現しないDU 145細胞についての細胞傷害性バックグラウンドは、E8構築物に関し
て5%であり、そしてA5構築物に関してわずか約0.01%であり、非常に良好な治療ウイン
ドウを明らかにした。
各々のmAbから、ファージミドpSEXにおけるscFv発現ライブラリーを実施例5に記載さ
れるように作製した。
特定のポジティブクローンを得(これをH12と名付けた)、mAB 3/F11由来の1個の特定の
ポジティブクローンを得た(これをD7と名付けた)。各scFvのコード領域を発現ベクター
pHOG−21に移した。
a)PSMAポジティブ細胞株およびPSMAネガティブ細胞株についてのフローサイトメトリ
ー
scFv H12およびscFv D7は、フローサイトメトリーによって測定した場合、LNCaP生細胞
と反応した。
H12)および20 nM(D7)であると決定した。飽和濃度において、MFI値は 70(H12)およ
び40(D7)に達した(図15)。
細胞DU145およびPC3ならびに他のPSMAネガティブ細胞株(HeLa、MCF7、HCT15およびJurka
t)をさらに染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。3種のscFv全てはPSM
Aネガティブ細胞を染色しなかった。
PSMA特異的結合を確認するため、scFv H12およびscFv D7を、PSMAをトランスフェクト
したBOSC−23細胞において試験した。両方のscFvは、全長のPSMAをトランスフェクトした
BOSC細胞に対して濃度依存的な結合を示したが、トランスフェクトしなかった細胞には濃
度依存的な結合を示さなかった(Fig. 16)。飽和条件は100 nM(D7)および200 nM(H12
)に達した。mAbと同様に、トランスフェクタントについてのMFI値は、LNCaP細胞につい
ての値より低く、幅広な分布を示した。この分布は、前者の細胞表面における多様なPSMA
分子に対応し得る。
実施例4に記載されるように免疫蛍光細胞学を実施した。レーザー走査型共焦点顕微鏡
を用いた検出後、LNCaP細胞に対するscFvの強力な結合およびこれらの細胞内への内在化
を観察した。
固相ELISAおよびウエスタンブロットにおける精製PSMAに対するscFv H12およびscFv D7
の結合は、弱かった。
*MFI=無関係のアイソタイプ適合性のコントロール抗体または抗マウス免疫グロブリン
単独を用いたバックグラウンドを差し引いた後の、飽和条件における平均の蛍光強度の値
。
H12−PE40免疫毒素およびD7−PE40免疫毒素の構築は、実施例11に記載されるA5免疫毒
素およびE8免疫毒素と同様であった。PE−40は、Pseudomonas外毒素フラグメントを表す
。
、48時間のインキュベーション後に認めることができた。
た(図17)。
よびD7−PE40の細胞傷害性を試験した。これらの細胞株について、25 000 pMまでの濃度
における細胞傷害性は見出さなかった。
PSMAおよびT細胞レセプター複合体のCD3鎖に特異的な二価特異的(bispecific)のダ
イアボディを作製した。VhCD3−VIA5 scFvおよびVhA5−VICD3 scFvの共分泌のためのジシ
ストロン性オペロンを含むベクターを使用して、E.coliにおいて二価特異的ダイアボディ
を発現させた(図18)。抗A5/CD3ダイアボディ構築のため、プラスミドpKID19x3およびpK
ID 3x19を使用した(Kipriyanov, Int.J. Cancer 1998, pp 763)。細菌のペリプラズム
性発現および精製は、scFvと同様であった。
二価特異的ダイアボディがT細胞媒介性細胞傷害性を方向変換することによって腫瘍細
胞の溶解を誘導する能力を、エフェクター細胞として健常なドナー由来のPBMCを使用して
調査した。IL−2の有無による4日間のインキュベーション後、これらの細胞を、96ウェ
ルプレートに1.5×104細胞/ウェルにて播種したLNCaP標的細胞に添加した。エフェクター
−標的の比率は10:1であった。異なる濃度でダイアボディを添加した。48時間のインキ
ュベーション後、培養物を15μl/ウェルのWST試薬によりパルス添加し、そして37℃およ
び5% CO2にて90分間インキュベートした。次いで、これらサンプルの450nm(参照は690
nm)における分光学的吸収を測定した。
不活性化PBMCを再標的化して標的のLNCaP細胞を溶解するのにかなり強力であるようであ
った(図19)。
この二価の単一物特異的(monospecific)ダイアボディを、A5−CD3ダイアボディ(実
施例16)と同様に作製した。細菌のペリプラズム性発現および精製は、scFvと同様であっ
た。
異的な結合を示すことができる。
配列番号1:XaaはTyrまたはSerを意味する(存在位置:103)。
配列番号2:CDR配列
配列番号3:CDR配列
配列番号4:CDR配列
配列番号4:XaaはTyrまたはSerを意味する(存在位置:4)。
配列番号5:CDR配列
配列番号6:CDR配列
配列番号7:CDR配列
配列番号8:scFv E8
配列番号9:配列番号:8の逆相補配列
配列番号10:scFv A5
配列番号11:CDR配列
配列番号12:CDR配列
配列番号13:CDR配列
配列番号14:CDR配列
配列番号15:CDR配列
配列番号16:CDR配列
配列番号17:scFv A5
配列番号18:配列番号:17の逆相補配列
配列番号19:scFv H12
配列番号19:nはa、c、gまたはtである(存在位置:58)。
配列番号20:scFv H12
配列番号20:XaaはMet、ValまたはLeuを表す(存在位置:20)。
配列番号21:scFv D7
配列番号22:scFv D7
配列番号23:配列番号:19のscFv H12の逆相補配列
配列番号23:nはa、c、gまたはtである(存在位置:720)。
配列番号24:配列番号:21のscFv D7の逆相補配列
Claims (10)
- a)ネイティブ形態の前立腺特異的膜抗原に結合し、
b)LNCAP細胞には強力に結合するが、前立腺膜特異的抗原の発現を欠く細胞には結合
しないかごくわずかにのみ結合し、
c)図20-1〜図20-2に示されるCDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2およびCDR L3
と称されるCDR配列、または、図21-1〜図21-2に示されるCDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L
1、CDR L2およびCDR L3と称されるCDR配列のうちの少なくとも3つを含むことを特徴とす
る、
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。 - 腫瘍細胞によって内在化できる、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはその抗原
結合部分。 - 標識または傷害性薬物と連結される、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体また
はその抗原結合部分。 - 前立腺特異的膜抗原が腫瘍細胞の表面上に存在する、請求項1〜3のいずれか1項に記
載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。 - 1nM〜120nMの間の濃度でPSMA部位のうち50%飽和に達するLNCAP細胞に対する高結合活
性を示す、請求項1〜4のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合
部分。 - 細胞傷害性薬物が細胞毒性物質である、請求項3に記載のモノクローナル抗体またはそ
の抗原結合部分。 - 細胞傷害性薬物が、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム
、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチ
ン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、
ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン
、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピ
ューロマイシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される細胞毒性物質であ
る、請求項6に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。 - 前記標識が放射線または蛍光線を放射する粒子である、請求項3に記載のモノクローナ
ル抗体またはその抗原結合部分。 - 請求項3に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む、腫瘍細胞検出の
ための診断キット。 - 請求項8に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む、腫瘍細胞検出の
ための診断キット。
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