CN113402607A - 一种抗lap单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用 - Google Patents

一种抗lap单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113402607A
CN113402607A CN202110658452.9A CN202110658452A CN113402607A CN 113402607 A CN113402607 A CN 113402607A CN 202110658452 A CN202110658452 A CN 202110658452A CN 113402607 A CN113402607 A CN 113402607A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
chain variable
variable region
amino acid
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110658452.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113402607B (zh
Inventor
白义
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Dongfang Baitai Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Dongfang Baitai Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Dongfang Baitai Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Dongfang Baitai Biotechnology Co Ltd
Priority to CN202110658452.9A priority Critical patent/CN113402607B/zh
Publication of CN113402607A publication Critical patent/CN113402607A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113402607B publication Critical patent/CN113402607B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39566—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against immunoglobulins, e.g. anti-idiotypic antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及生物医药领域，提供了一种抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区HCDR1、HCDR2、HCDR3和轻链可变区LCDR1、LCDR2、LCDR3。本发明提供的抗LAP单克隆抗体从源头抑制TGFβ1的释放，删除抑制性T细胞，提高肿瘤免疫响应，可与多种免疫治疗药物联合应用，可扩展到更多类型的癌症、自身免疫性疾病以及纤维化疾病，临床需求巨大，市场潜力巨大；癌症选自包括非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤或神经胶质瘤；纤维化疾病包括肺纤维化或肝纤维化；自身免疫疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、皮肌炎、多肌炎、血管炎或干燥症。

Description

一种抗LAP单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗LAP单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用。
背景技术
癌症免疫治疗是利用人体的免疫机制，通过主动或被动的方法来增强患者的免疫功能，以达到杀伤肿瘤细胞的目的，目前癌症免疫检查点抑制剂治疗取得了突破性进展和持久的癌症免疫治疗响应，并在逐渐成为日益增加的癌症治疗的一线标准治疗方式。但仍有大量的肿瘤病人对此治疗方式不响应，表明存在有其他的机制阻止免疫系统靶向消除肿瘤细胞。
目前在对肿瘤病人的临床数据的回顾性分析中，发现TGFβ信号通路的激活是免疫治疗不响应的关键因素，对抗PD-1抗体治疗不响应的黑色素瘤病人的治疗前肿瘤活检样品进行转录图谱分析，结果显示存在大量丰富的TGFβ相关的信号通路，另外对恶性膀胱癌病人肿瘤样品进行相同的分析，结果也显示TGFβ相关的转录标签与抗PD-1治疗缺乏响应存在明显的相关性，尤其是在CD8 T细胞不能进入肿瘤内部的肿瘤中更明显，这些临床数据在临床前鼠同种异源肿瘤模型中也得到验证，在对PD-L1治疗低或无响应的EMT-6乳腺癌模型中，PD-L1抑制剂联合TGFβ抑制子治疗导致肿瘤响应比例显著增加，此联合治疗的抗肿瘤活性与癌症相关成纤维和激活的浸润到肿瘤内部CD8的表型相关。在小鼠结肠癌模型中，联合PD-L1抑制剂和TGFβI型受体的小分子抑制剂ALK5治疗也产生相同的效果。总而言之，临床来源的相关证据以及临床前有效的抑瘤结果指出，在增加临床癌症免疫治疗响应比例的临床药物开发中，抑制TGF信号通路的药物开发有着巨大的希望。
哺乳动物体内存在TGFβ1，TGFβ2，TGFβ3三种形式的TGFβ生长因子，每个生长因子各由不同的基因编码，但都通过相同的TGFβ受体复合物进行信号传递，这三种异构体均以潜伏的无活性蛋白复合体形式在体内表达。在体内，潜伏的TGFβ1和TGFβ3被αν整合蛋白激活，其通过作用于LAP(Latency-associated peptide)上的RGD区域触发构象变化，从而释放出活性的TGFβ1和TGFβ3因子，TGFβ1也可以以蛋白酶水解LAP的方式从潜伏复合物中释放出。TGFβ1以前体蛋白形式在体内合成，其成熟的具有生物活性的TGFβ1细胞因子与LAP蛋白质笼子形成小复合物，后者通过二硫键与5种不同的锚定蛋白(GARP、LRRC33、LTBP1、LTBP3、LTBP4)形成大复合物，从而将TGFβ1局限在不同类型的细胞或细胞外基质中。
TGFβ1是一种多功能肽分子，控制和影响多种细胞的增殖、分化、凋亡以及其他的细胞功能。TGFβ1在免疫系统中也发挥重要功能，在不同类型的免疫细胞和不同发育阶段的细胞中起着不同的作用，通常TGFβ1被认为是免疫抑制因子。大多数免疫细胞均分泌TGFβ1，调节性T细胞通过释放TGFβ1抑制其他T细胞的活性，例如TGFβ1抑制IL-1/IL-2依赖性的激活T细胞的增殖；抑制静息辅助T细胞和细胞毒性T细胞等的激活；抑制IFN-γ、TNF-α等不同细胞因子的分泌和活性，同时可通过减少细胞因子受体的表达水平下调免疫细胞活性，TGFβ1在巨噬细胞和单核细胞上表现出抑制功能。
尽管TGFβ信号通路在疾病中的生物学机制非常清楚，但靶向TGFβ信号通路的治疗开发充满挑战。靶向TGFβI型受体激酶的ALK5小分子抑制剂或可同时封闭TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3三个异构体的抗体在小鼠、大鼠和狗中表现出严重的心脏瓣膜病毒性，这意味着广谱抑制一个或多个异构体驱动的信号通路会限制这类药物的临床获益。LAP是TGFβ1的蛋白质笼子，将成熟的TGFβ1锁在潜伏复合物中，作用LAP靶点的药物可以通过调节LAP-TGFβ1复合物结构来调控TGFβ1的释放或抑制，从而调控TGFβ1介导的活性通路，目前国内外无相同品种的药物上市，为了满足市场需求，急需研发一种能够调控TGFβ1的释放改善肿瘤微环境的抗LAP单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明公开了一种能够从源头抑制TGFβ1的释放，删除抑制性T细胞，提高肿瘤免疫响应的抗LAP单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的HCDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:30；所述重链可变区的HCDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25或SEQ IDNO:31；所述重链可变区的HCDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:32；所述轻链可变区的LCDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:33；所述轻链可变区的LCDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:28；所述轻链可变区的LCDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:34。
进一步的，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自以下任意一种：
A-1:所述重链可变区的HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR2包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR3包含如SEQID No:3所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR2包含如SEQ ID No:5所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR3包含如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列；
A-2:所述重链可变区的HCDR1包含如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR2包含如SEQ ID No:8所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR3包含如SEQID No:9所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID No:10所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR2包含如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR3包含如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列；
A-3:所述重链可变区的HCDR1包含如SEQ ID No:13所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR2包含如SEQ ID No:14所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR3包含如SEQ ID No:15所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID No:16所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR2包含如SEQ ID No:17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR3包含如SEQ ID No:18所示的氨基酸序列；
A-4:所述重链可变区的HCDR1包含如SEQ ID No:19所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR2包含如SEQ ID No:20所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR3包含如SEQ ID No:21所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID No:22所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR2包含如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR3包含如SEQ ID No:23所示的氨基酸序列；
A-5:所述重链可变区的HCDR1包含如SEQ ID No:24所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR2包含如SEQ ID No:25所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR3包含如SEQ ID No:26所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID No:27所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR2包含如SEQ ID No:28所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR3包含如SEQ ID No:29所示的氨基酸序列；
A-6:所述重链可变区的HCDR1包含如SEQ ID No:30所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR2包含如SEQ ID No:31所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR3包含如SEQ ID No:32所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID No:33所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR2包含如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR3包含如SEQ ID No:34所示的氨基酸序列。
进一步的，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自以下任意一种：
A-1:所述重链可变区包含如SEQ ID No:35所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:36所示的氨基酸序列；
A-2:所述重链可变区包含如SEQ ID No:37所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:38所示的氨基酸序列；
A-3:所述重链可变区包含如SEQ ID No:39所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:40所示的氨基酸序列；
A-4:所述重链可变区包含如SEQ ID No:41所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:42所示的氨基酸序列；
A-5:所述重链可变区包含如SEQ ID No:43所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:44所示的氨基酸序列；
A-6:所述重链可变区包含如SEQ ID No:45所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:46所示的氨基酸序列。
进一步的，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区，所述重链恒定区为鼠的IgG1、IgG2a、IgG3、IgG4型中的一种；
优选的，所述重链恒定区为鼠的IgG2a型。
本发明还提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码所述的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体，所述重组DNA表达载体包含所述的多核苷酸分子。
本发明还提供了一种转染所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；
优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。
本发明还提供了一种药物，所述药物包含所述的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了所述的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗癌症、纤维化疾病或自身免疫疾病药物中的应用；所述癌症选自非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤或神经胶质瘤；所述纤维化疾病包括肺纤维化或肝纤维化；所述自身免疫疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、皮肌炎、多肌炎、血管炎或干燥症。
本发明还提供了所述的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段和抗PD-1单克隆抗体联合用于制备治疗癌症药物中的应用；所述癌症选自非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤或神经胶质瘤。
本发明的有益效果如下：本发明提供的抗LAP单克隆抗体从源头抑制TGFβ1的释放，删除抑制性T细胞，提高肿瘤免疫响应，该抗体可与多种免疫治疗药物联合应用，可扩展到更多类型的癌症、自身免疫性疾病以及纤维化疾病，临床需求巨大，市场潜力巨大；癌症选自但不限于非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤或神经胶质瘤；纤维化疾病包括肺纤维化或肝纤维化；自身免疫疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、皮肌炎、多肌炎、血管炎或干燥症。
附图说明
图1为本发明实施例3中pScFv-Disb-HS载体的质粒图谱；
图2为本发明实施例4中梯度稀释ELISA比较抗LAP噬菌体单克隆抗体相对亲和力的图；
图3为本发明实施例5中载体pTSE的图谱；
图4为本发明实施例6中抗LAP单克隆抗体与抗原LAP结合能力比较图；
图5为本发明实施例7中抗LAP单克隆抗体与阳性抗体的竞争曲线；
图6为本发明实施例8中抗LAP单克隆抗体与表面表达LAP的细胞结合能力比较图；
图7为本发明实施例10中抗LAP单克隆抗体抑制细胞表面TGFβ1的释放情况图；
图8为本发明实施例11中抗LAP单克隆抗体(单独给药)在小鼠结肠癌模型中的抑瘤效果图；
图9为本发明实施例12中抗LAP单克隆抗体(联合抗PD-1抗体给药)在小鼠结肠癌模型中的抑瘤效果图；
图10为本发明实施例12中各组小鼠的生存曲线图。
具体实施方式
为了更加容易理解本发明，描述实施例之前，先对本发明某些技术和科学术语作以下说明：
本文所使用的术语“LAP(Latency-associated peptide)”，是TGFβ前体蛋白N端的一部分多肽序列。TGFβ前体蛋白在体内合成后，分解成成熟的具有生物活性的TGFβ细胞因子与LAP蛋白质，后者呈笼子状将TGFβ包裹在内形成小复合物，并通过二硫键与5种不同的锚定蛋白形成大复合物，从而将TGFβ局限在不同类型的细胞或细胞外基质中；当LAP被蛋白酶水解或其RGD区域构改变时，TGFβ从潜伏复合物中释放出，表现出其细胞因子活性。
本文所使用的术语“抗体”，包含全抗体及其任一抗原结合片段，抗体包括鼠源抗体、人源化抗体、双特异抗体或嵌合抗体，抗体也可以是Fab、F(ab)2、Fv或ScFv(单链抗体)，抗体可以是天然存在的抗体也可以是通过改变(例如突变、缺失、置换等)的抗体。
本文所使用的术语“可变区”和“恒定区”，即为抗体重链和轻链靠近N段的序列区为可变区(V区)，靠近C段的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)，可变区包括3个互补性决定区(CDR)和4个框架区(FR)，每条轻链可变区和重链可变区均有3个CDR区和4个FR区组成，重链的3个CDR区分别通过HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，轻链的3个CDR区分别通过LCDR1、LCDR2和LCDR3表示。
本文所使用的术语“抗体分子”，其来源是用LAP抗原免疫注射小鼠后得到的抗体。
术语“CHO细胞”为中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell)；术语“HEK293细胞”为人胚肾293E细胞(human embryonic kidney 293E cell)，术语“NS0细胞”为小鼠NS0胸腺瘤细胞。
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供了一种抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的HCDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQID NO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:30；所述重链可变区的HCDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25或SEQID NO:31；所述重链可变区的HCDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:32；所述轻链可变区的LCDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:33；所述轻链可变区的LCDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:28；所述轻链可变区的LCDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:34。
实施例2
本发明实施例2通过用LAP抗原免疫小鼠，优化免疫方法，创建噬菌体展示库，获得了一种抗LAP单克隆抗体，筛选得到的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段选自以下任意一种：
Figure BDA0003114169610000061
实施例3
本发明实施例3在实施例2的基础上具体的提供了抗LAP单链抗体的筛选方法如下：步骤一：LAP抗原免疫小鼠
1、实验动物：
种属品系：BALB/c，雌性，小鼠；体重：18-20g；
实验动物提供商：北京华阜康生物科技股份有限公司。
2、免疫：对小鼠进行免疫，免疫抗原为人LAP(南京金斯瑞生物科技有限公司合成基因，本公司构建载体并表达纯化)。
步骤二：噬菌体抗体库的构建
取效价较高的小鼠脾细胞，利用Trizol试剂(购买自Ambion，货号：15596026)，提取小鼠脾细胞中的总RNA，RT-PCR获得cDNA，以cDNA为模板，采用简并引物(所用简并引物参考文献：Journal of Immunological Methods233(2000)167-177)进行PCR扩增，从而获得免疫小鼠抗体重链可变区基因库(VH)及轻链可变区基因库(VL)，轻重链分别双酶切，连接至同样分步骤酶切处理过的载体上，构建pScFv-Disb-HS-VH-VL基因库，PscFv-DisB-HS载体是采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名pScFv-Disb-HS载体，获得其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建小鼠免疫噬菌体抗体库。
步骤三：以LAP为抗原包被免疫管，抗原包被量为4μg/500μl/管，4℃包被过夜，再用4％脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和免疫噬菌体抗体库，室温封闭1h。封闭后的免疫噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为109～1012个，室温反应1h后，使用PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，通过0.1MpH2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5MpH 8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH7.0左右。
步骤四：将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
步骤五：将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体超感染，在28℃条件下，220rpm培养过夜制备噬菌体，PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选，共进行一轮噬菌体库富集筛选。
步骤六：LAP噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选：经过一轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，在37℃条件下，220rpm的条件下培养至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30min。4000rpm，离心15min，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，在28℃且220rpm的条件下培养过夜。4000rpm，4℃的条件下离心15min后，吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定，最终筛选得到六个亲和力较高的抗LAP的单克隆抗体分子，分别命名为A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A-6，将上述得到的单克隆抗体进行基因测序确定为正确的抗体序列，经过测序，上述筛选到的6个单克隆抗体序列如下：
抗体分子 重链可变区序列 轻链可变区序列
A-1 SEQ ID No:35 SEQ ID No:36
A-2 SEQ ID No:37 SEQ ID No:38
A-3 SEQ ID No:39 SEQ ID No:40
A-4 SEQ ID No:41 SEQ ID No:42
A-5 SEQ ID No:43 SEQ ID No:44
A-6 SEQ ID No:45 SEQ ID No:46
具体的，SEQ ID No:35(A-1的重链可变区的氨基酸序列)；
EVQLEQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTSYGMNWVKQAPGKALKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAYSLEATANTAYLQIYNLKNEDTATYFCARSGRYTRPLYYIMDFWGQGTSVTVSS；
SEQ ID No:36(A-1的轻链可变区的氨基酸序列)；
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGNSYMNWHQQKPGQPPKLLIYGASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK；
SEQ ID No:37(A-2的重链可变区的氨基酸序列)；
EVQLEESGAELVRSGASVKLSCTASGFNFNDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQVKATMTADTSSNTAYLHLSSLASEDTAVYYCNTPTEDMDYWGQGTSVTVSS；
SEQ ID No:38(A-2的轻链可变区的氨基酸序列)；
DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLFNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRGSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLLTFGAGTKLELK；
SEQ ID No:39(A-3的重链可变区的氨基酸序列)；
EVKLQESGAELVMPGASVKMSCKASGYTFTDYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIDTSDSYTSYNQKFKGKATLTVDESSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARKALSGYFDVWGAGTTVTVSS；
SEQ ID No:40(A-3的轻链可变区的氨基酸序列)；
DIVLTQTPSSLSASLGGKVTITCKASQDIYKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLRTFGGGTKLEIK；
SEQ ID No:41(A-4的重链可变区的氨基酸序列)；
EVKLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTTYGVSWVRQPPGKGLEWLGIIWGDGTTIYQSGLISRLSISKDDSKSQVFLKLSSLQTDDTATYYCAKHYFVMDYWGQGTSVTVSS；
SEQ ID No:42(A-4的轻链可变区的氨基酸序列)；
DIVLTQSPSSLAVSAGEKVTMNCKSSQSLLNSRIRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLWTFGGGTKLEIK；
SEQ ID No:43(A-5的重链可变区的氨基酸序列)；
EVQLQQSGAVLVRPGDSVKLSCKASGYSFTRSWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLRSPTSEDSAVYYCTNYYLYYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVY；
SEQ ID No:44(A-5的轻链可变区的氨基酸序列)；
DIVLTQSPSSLAVSTGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKSYLAWYQQKPGQSPKLLIYWTSIRESGVPDRFTGNGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLFTFGGGTKLEMKRADAAPTVS；
SEQ ID No:45(A-6的重链可变区的氨基酸序列)；
QVKLQESGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYFYPYNGGTGYKQKFKSKATLTVDNSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARNHYYYYAMDYWGQGTSVTVSS；
SEQ ID No:46(A-6的轻链可变区的氨基酸序列)；
DIVMTQTPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYNLPWTFGGGTKLEIK。
实施例4梯度稀释ELISA比较抗LAP噬菌体单克隆抗体的亲和力
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被LAP，50ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包被过夜，使用PBST洗涤三次，将实施例3中筛选得到的6个噬菌体单克隆抗体和阳性对照抗LAP单克隆抗体28G11(该抗体选自专利申请号为US20190144549A1，专利名称为抗搭接抗体及其用途的专利中)，上述单克隆抗体分别用PBST三倍梯度稀释，每孔加入100μl稀释后的样品，在室温下静置1小时。用PBST洗涤ELISA板，将PBST稀释后的HRP-anti-M13单克隆抗体加入ELISA板中，在室温放置1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色10分钟，用2M H2SO4终止后，在450nm/630nm下读数，采用GraphPad Prism 5.0作图软件做出抗原抗体结合曲线图，如图2所示，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 A-1 A-2 A-3 A-4 A-5 A-6 28G11
EC50 0.0188 0.0634 0.0878 0.3102 0.0603 0.1559 0.0692
通过上述数据及如图2所示，实施例2筛选出的6个不同的单克隆抗体分子均能够与LAP进行结合，其亲和力与抗LAP单克隆抗体28G11接近，但抗LAP单克隆抗体A-1的亲和力高于阳性对照抗LAP单克隆抗体28G11。
实施例5
本发明实施例5在实施例3基础上进一步限定了抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区，所述重链恒定区为鼠的IgG1、IgG2a、IgG3、IgG4型中的一种；
优选的，所述重链恒定区为鼠的IgG2a型；鼠的IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:47所示；具体序列如下：
SEQ ID No:47(鼠的IgG2a型的重链恒定区序列)
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK。
选择实施例4中抗LAP单克隆抗体进行全抗制备，抗体制备方法具体如下：
1、将实施例3中筛选出来的6个抗LAP单克隆抗体和阳性对照抗LAP单克隆抗体28G11的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，重链恒定区优选为鼠的IgG2a型恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:47所示)，轻链恒定区均为鼠源Ck链(氨基酸序列如SEQ ID No:48所示)，pTSE载体结构如图3所示(pTSE载体制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段)。
SEQ ID No:48(鼠源Ck链的轻链恒定区)
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC；
2、瞬时转染HEK293E细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，细胞摇床培养3-4天，收集细胞上清，用proteinA柱进行纯化，即得到纯化后的全抗体。
实施例6抗LAP单克隆抗体与抗原LAP的结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被LAP-TGFβ1抗原，50ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被；用300μl/孔PBST洗涤五次，加入100μl含有2％BSA-PBST封闭液，在37℃温度条件下封闭2小时；弃去板中液体，用PBST洗涤三次，在纸巾上拍干检测板；加入不同稀释浓度的抗LAP单克隆抗体A-1，A-2，A-3，A-4，A-5和A-6抗体及阳性对照抗体28G11，抗体的起始最高浓度均为10μg/ml，分别经过5倍浓度梯度稀释后，每种抗体均设置7个浓度梯度，在37℃温度条件下孵育1h；弃去板中液体，用300μl/孔PBST洗涤三次，在纸巾上拍干检测板；用封闭液稀释二抗(HRP-anti mIg,1:2000)，加入ELISA检测板，每孔100μl，室温避光放置1小时；弃去板中液体，用PBST洗涤三次，在纸巾上拍干检测板；加入预制的ABTS底物液(购买自Thermo，货号002024)显色，每孔100μl，室温显色10-30min，然后用2MH2SO4终止显色。在450nm/630nm下读数，采用GraphPad Prism 5.0作图软件做出抗原抗体结合曲线图，如图4所示，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
Figure BDA0003114169610000101
Figure BDA0003114169610000111
通过上述数据和图4得知，筛选出的6个不同的单克隆抗体均能与LAP进行结合，此外，这6个抗体分子中抗LAP单克隆抗体A-1的EC50值最小，且小于阳性对照抗体28G11，说明其与LAP结合能力最好。
实施例7抗LAP单克隆抗体与抗原LAP的竞争实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被LAP-TGFβ1抗原，50ng/孔/100μl，在4℃的温度条件下过夜包被；用300μl/孔PBST洗涤五次，加入100μl含有2％BSA-PBST封闭液，在37℃温度条件下封闭2小时；弃去板中液体，用PBST洗涤三次，在纸巾上拍干检测板；加入50μl使用Sulfo-NHS-LC-Biotin试剂(购自thermo，货号1854210)标记上生物素的28G11，加入不同稀释浓度的抗LAP单克隆抗体A-1，A-2，A-3，A-4，A-5和A-6抗体及阳性对照抗体28G11；生物素标记的28G11在体系中浓度为1μg/ml，七种抗体的起始最高浓度均为10μg/ml，分别经过5倍浓度梯度稀释后，每种抗体均设置7个浓度梯度，在37℃温度条件下孵育1h；弃去板中液体，用300μl/孔PBST洗涤三次，在纸巾上拍干检测板；用封闭液稀释二抗(HRP-anti mIg,1:2000)，加入ELISA检测板，每孔100μl，室温避光放置1小时；弃去板中液体，用PBST洗涤三次，在纸巾上拍干检测板；加入预制的ABTS底物液(购买自Thermo，货号002024)显色，每孔100μl，室温显色10-30min，然后用2MH2SO4终止显色。在450nm/630nm下读数，采用GraphPadPrism 5.0作图软件做出抗体竞争曲线图，如图5所示，并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 A-1 A-2 A-3 A-4 A-5 A-6 28G11
IC50(ng/ml) 97.2 76.4 6.95 8.05 52.6 55.7 361
通过上述数据和图5得知，6个不同的单克隆抗体均能与28G11进行竞争。其中抗LAP单克隆抗体A-1、A-2、A-5的竞争抑制率与28G11非常接近，且IC50值低于28G11，说明它们能有效的阻碍28G11与抗原的结合，从而推论出它们的抗原结合位点可能与28G11的抗原结合位点相邻、重叠、甚至相同。
实施例8抗LAP单克隆抗体与表面表达LAP的细胞的结合实验
将过表达LAP-TGFβ1的CHO细胞按2x 105个细胞/孔接种至96孔板。设置抗LAP单克隆抗体A-1、A-2、A-5和阳性对照抗体28G11的起始浓度均为200μg/ml，5倍梯度稀释，共8个梯度，每孔100μl加入细胞孵育一小时，然后加入FITC标记的羊抗鼠的荧光抗体(购买自southernbiotech，货号：1030-02)进行流式分析检测，并采用GraphPad Prism 5.0作图软件做出细胞的结合曲线，结果如图6所示。
结果表明，上述抗LAP单克隆抗体A-1、A-2、A-5和阳性对照抗体28G11都能与表面表达LAP的细胞结合，其中A-1抗体和阳性对照抗体28G11与自然状态下的LAP蛋白结合能力最强。
实施例9
本发明实施例9还提供了一种多核苷酸分子，多核苷酸分子编码的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体，重组DNA表达载体包含的多核苷酸分子。
本发明还提供了一种转染的重组DNA表达载体的宿主细胞，宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；
优选的，宿主细胞为哺乳动物细胞，哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。
本发明还提供了一种药物，药物包含的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明还提供了的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗癌症、纤维化疾病或自身免疫疾病药物中的应用；优选的，癌症选自：非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤或神经胶质瘤；纤维化疾病包括肺纤维化或肝纤维化；自身免疫疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、皮肌炎、多肌炎、血管炎或干燥症。
本发明还提供了的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段和抗PD-1单克隆抗体联合用于制备治疗癌症药物中的应用；抗PD-1单克隆抗体选自Nivolumab、Pembrolizumab、特瑞普利单抗、信迪利单抗、替雷利珠单抗、卡瑞利珠单抗或专利号为ZL201510312910.8，专利名称为一种抗PD-1的单克隆抗体及其获得方法的专利文件中公开的DFPD1-9、DFPD1-10、DFPD1-11、DFPD1-12或DFPD1-13，这里不仅限于上述对抗PD-1单克隆抗体的限定，还可以为其他商业化用于实验中的抗PD-1单克隆抗体，只要靶点为PD-1的单克隆抗体均可以，在此不具体限定其他的抗PD-1单克隆抗体。
本发明中，抗PD-1单克隆抗体优选为专利号为ZL201510312910.8，专利名称为一种抗PD-1的单克隆抗体及其获得方法的专利文件中公开的DFPD1-9、DFPD1-10、DFPD1-11、DFPD1-12或DFPD1-13。优选的，癌症选自：非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤或神经胶质瘤。
实施例10纯化的全抗形式功能抗体抑制细胞表面TGFβ1的释放
提前一天接种过表达LAP-TGFβ1的细胞株50μl(1x 106个细胞/ml)于96孔板中，并加入一系列浓度梯度稀释的抗LAP单克隆抗体A-1、A-2、A-5和阳性对照抗体28G11全抗药物50μl孵育过夜，起始浓度均为20μg/ml，然后3倍浓度梯度稀释，每种抗体均设置共7个浓度梯度。第二天加入50μl(1x 106个细胞/ml)的稳定表达PAI-LUC的Mv.1.lu水貂肺上皮细胞(购买自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，货号：3111C0001CCC000195)，细胞培养箱孵育6小时后测试荧光素酶活性，并采用GraphPad Prism 5.0作图软件做出抗体抑制TGFβ1的释放的抑制曲线，如图7所示，并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 A-1 A-2 A-5 28G11 同型IgG
IC50(μg/ml) 0.741 NA 1.69 0.626 NA
结果表明，A-1和A-5两个抗体都能有效抑制细胞表面TGFβ1的释放，尤其是A-1抗体，其IC50值与阳性对照抗体28G11接近，且在同等浓度下对TGFβ1释放的抑制都略高于阳性对照抗体28G11。
实施例11体内单独给药抑瘤实验
1、实验动物：
种属品系：BALB/c，雌性，小鼠；周龄：6-8周；
实验动物提供商：北京华阜康生物科技股份有限公司。
2、实验方法：
每只小鼠右侧背部皮下接种3*105个CT26肿瘤细胞(购买自ATCC；货号：CRL-2638)，成瘤后动物随机分若干组，每组10只，3天后进行腹腔注射本发明中提供的抗LAP单克隆抗体A-1(10mg/kg)，同时设置阳性对照度注射等量的阳性对照抗体28G11对照组(10mg/kg)，阴性对照组注射等量的同型IgG(10mg/kg)，每周给药两次，每周测三次瘤体积并一周测一次体重，观察记录瘤生长情况，瘤体积超过3000mm3，断颈法处死小鼠，用手术剪镊小心分离出各个肿瘤，称重，结果见图8所示。
通过图8可见，注射实验组的肿瘤体积与阳性对照组的肿瘤体积相当，都小于阴性对照组的肿瘤体积。但由于同组小鼠间肿瘤体积相差较大使得每组的标准偏差都较大，因而抗LAP单克隆抗体A-1及28G11的药效都不显著。考虑到本项目的一个目标是提高肿瘤免疫响应，下一步验证联合PD-1给药进行抑瘤实验。
实施例12体内联合给药抑瘤实验
1、实验动物：
种属品系：BALB/c，雌性，小鼠；周龄：6-8周；
实验动物提供商：北京华阜康生物科技股份有限公司。
2、设置不同给药组，具体如下：
抗鼠PD-1单克隆抗体(购买自Bio X Cell，货号BE0146)单独给药组、抗LAP单克隆抗体A-1单独给药组(10mg/kg)、抗LAP单克隆抗体A-1联合抗鼠PD-1抗体给药组(10mg/kg)和同型IgG对照组(10mg/kg)；
实验方法与实施例11方法相同，每只小鼠右侧背部皮下接种3*105个CT26肿瘤细胞，成瘤后动物随机分若干组，每组10只，3天后进行腹腔注射上述给药组，每周给药两次，每周测三次瘤体积并一周测一次体重，观察记录瘤生长情况，瘤体积超过3000mm3，断颈法处死小鼠，用手术剪镊小心分离出各个肿瘤，称重。结果见图9和图10。
通过图9可见，PD-1抗体组和对照组相比，基本没有体现出抑瘤效果，这和文献中结肠癌对PD-1抗体不敏感是一致的。联合用药组与PD-1抗体组相比体现出了显著的抑瘤效果；与抗体A-1单独给药组相比也体现出了一定的抑瘤效果。通过图10可见，从生存曲线上看，联合用药组与PD-1抗体组或A-1抗体单独给药组相比都体现出了显著的抑瘤效果。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技股份有限公司
<120> 一种抗LAP单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
Ala Arg Ser Gly Arg Tyr Thr Arg Pro Leu Tyr Tyr Ile Met Asp Phe
1 5 10 15
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asn Ser Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
Gly Ala Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
Gly Phe Asn Phe Asn Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
Cys Asn Thr Pro Thr Glu Asp Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 3
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 11
Trp Ala Ser
1
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 13
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 14
Ile Asp Thr Ser Asp Ser Tyr Thr
1 5
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 15
Ala Arg Lys Ala Leu Ser Gly Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 16
Gln Asp Ile Tyr Lys Tyr
1 5
<210> 17
<211> 3
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 17
Tyr Thr Ser
1
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 18
Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Arg Thr
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 19
Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Gly
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 20
Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 21
Ala Lys His Tyr Phe Val Met Asp Tyr
1 5
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 22
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Ile Arg Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 23
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Trp Thr
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 24
Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Ser Trp
1 5
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 25
Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr
1 5
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 26
Thr Asn Tyr Tyr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 27
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Ser Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 3
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 28
Trp Thr Ser
1
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 29
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Phe Thr
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 30
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn
1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 31
Phe Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr
1 5
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 32
Ala Arg Asn His Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 33
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 34
Lys Gln Ser Tyr Asn Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 35
<211> 123
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 35
Glu Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Thr Ala Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Tyr Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Arg Tyr Thr Arg Pro Leu Tyr Tyr Ile Met Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 111
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 36
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asn Ser Tyr Met Asn Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 116
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 37
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Val Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Thr Pro Thr Glu Asp Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gly Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 39
<211> 118
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 39
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Met Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Thr Ser Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Ala Leu Ser Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 106
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 40
Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Tyr Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Arg Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 115
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 41
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Ile Tyr Gln Ser Gly Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Phe Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 112
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 42
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Ile Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 43
<211> 126
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 43
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Val Leu Val Arg Pro Gly Asp
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Asn Tyr Tyr Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115 120 125
<210> 44
<211> 121
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 44
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Thr Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Asn Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
115 120
<210> 45
<211> 119
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 45
Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Phe Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Lys Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn His Tyr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 113
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 46
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 47
<211> 330
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 47
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 48
<211> 106
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 48
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
1 5 10 15
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
35 40 45
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
65 70 75 80
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
85 90 95
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105

Claims (10)

1.一种抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的HCDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:30；所述重链可变区的HCDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:31；所述重链可变区的HCDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQID NO:21、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:32；所述轻链可变区的LCDR1的氨基酸序列选自SEQID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:33；所述轻链可变区的LCDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17或SEQID NO:28；所述轻链可变区的LCDR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:34。
2.如权利要求1所述的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自以下任意一种：
A-1:所述重链可变区的HCDR1包含如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR2包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR3包含如SEQ IDNo:3所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR2包含如SEQ ID No:5所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR3包含如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列；
A-2:所述重链可变区的HCDR1包含如SEQ ID No:7所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR2包含如SEQ ID No:8所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR3包含如SEQ IDNo:9所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID No:10所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR2包含如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR3包含如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列；
A-3:所述重链可变区的HCDR1包含如SEQ ID No:13所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR2包含如SEQ ID No:14所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR3包含如SEQ IDNo:15所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID No:16所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR2包含如SEQ ID No:17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR3包含如SEQ ID No:18所示的氨基酸序列；
A-4:所述重链可变区的HCDR1包含如SEQ ID No:19所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR2包含如SEQ ID No:20所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR3包含如SEQ IDNo:21所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID No:22所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR2包含如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR3包含如SEQ ID No:23所示的氨基酸序列；
A-5:所述重链可变区的HCDR1包含如SEQ ID No:24所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR2包含如SEQ ID No:25所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR3包含如SEQ IDNo:26所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID No:27所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR2包含如SEQ ID No:28所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR3包含如SEQ ID No:29所示的氨基酸序列；
A-6:所述重链可变区的HCDR1包含如SEQ ID No:30所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR2包含如SEQ ID No:31所示的氨基酸序列，所述重链可变区的HCDR3包含如SEQ IDNo:32所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID No:33所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR2包含如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的LCDR3包含如SEQ ID No:34所示的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自以下任意一种：
A-1:所述重链可变区包含如SEQ ID No:35所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:36所示的氨基酸序列；
A-2:所述重链可变区包含如SEQ ID No:37所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:38所示的氨基酸序列；
A-3:所述重链可变区包含如SEQ ID No:39所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:40所示的氨基酸序列；
A-4:所述重链可变区包含如SEQ ID No:41所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:42所示的氨基酸序列；
A-5:所述重链可变区包含如SEQ ID No:43所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:44所示的氨基酸序列；
A-6:所述重链可变区包含如SEQ ID No:45所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID No:46所示的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区，所述重链恒定区为鼠的IgG1、IgG2a、IgG3、IgG4型中的一种；
优选的，所述重链恒定区为鼠的IgG2a型。
5.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子编码权利要求1-4任一项所述的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段。
6.一种重组DNA表达载体，其特征在于，所述重组DNA表达载体包含权利要求5所述的多核苷酸分子。
7.一种转染如权利要求6所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；
优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞、CHO细胞或NS0细胞。
8.一种药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1-4任一项所述的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段。
9.权利要求1-4任一项所述的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段在制备治疗癌症、纤维化疾病或自身免疫疾病药物中的应用；所述癌症选自非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤或神经胶质瘤；所述纤维化疾病包括肺纤维化或肝纤维化；所述自身免疫疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化症、皮肌炎、多肌炎、血管炎或干燥症。
10.权利要求1-4任一项所述的抗LAP单克隆抗体或其抗原结合片段和抗PD-1单克隆抗体联合用于制备治疗癌症药物中的应用；所述癌症选自非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤或神经胶质瘤。
CN202110658452.9A 2021-06-15 2021-06-15 一种抗lap单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用 Active CN113402607B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110658452.9A CN113402607B (zh) 2021-06-15 2021-06-15 一种抗lap单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110658452.9A CN113402607B (zh) 2021-06-15 2021-06-15 一种抗lap单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113402607A true CN113402607A (zh) 2021-09-17
CN113402607B CN113402607B (zh) 2022-05-10

Family

ID=77683788

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110658452.9A Active CN113402607B (zh) 2021-06-15 2021-06-15 一种抗lap单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113402607B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117106084A (zh) * 2021-12-02 2023-11-24 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种抗tslp的单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
CN117447593A (zh) * 2022-07-26 2024-01-26 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种抗Siglec-15单克隆抗体

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107530423A (zh) * 2015-01-14 2018-01-02 布里格姆及妇女医院股份有限公司 用抗lap单克隆抗体治疗癌症
WO2019075090A1 (en) * 2017-10-10 2019-04-18 Tilos Therapeutics, Inc. ANTI-LAP ANTIBODIES AND USES THEREOF
US20200140530A1 (en) * 2018-10-10 2020-05-07 Tilos Therapeutics, Inc. Anti-lap antibody variants and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107530423A (zh) * 2015-01-14 2018-01-02 布里格姆及妇女医院股份有限公司 用抗lap单克隆抗体治疗癌症
WO2019075090A1 (en) * 2017-10-10 2019-04-18 Tilos Therapeutics, Inc. ANTI-LAP ANTIBODIES AND USES THEREOF
US20200140530A1 (en) * 2018-10-10 2020-05-07 Tilos Therapeutics, Inc. Anti-lap antibody variants and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SALAMONE M C.，ET,AL: "Antibodies recognizing CD24 LAP epitope on human T cells enhance CD28 and IL-2 T", 《JOURNAL OF LEUKOCYTE BIOLOGY》 *
SHANG LI.,ET AL.: "The Effects of Anti-LAP Monoclonal Antibody Down-regulation of CD4+LAP+ T Cells", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117106084A (zh) * 2021-12-02 2023-11-24 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种抗tslp的单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
CN117209604A (zh) * 2021-12-02 2023-12-12 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种抗tslp的单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
CN117209604B (zh) * 2021-12-02 2024-03-22 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种抗tslp的单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
CN117106084B (zh) * 2021-12-02 2024-03-22 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种抗tslp的单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
CN117447593A (zh) * 2022-07-26 2024-01-26 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种抗Siglec-15单克隆抗体

Also Published As

Publication number Publication date
CN113402607B (zh) 2022-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110272490B (zh) 靶向ctla-4抗体、其制备方法和用途
TW201837056A (zh) Ｂ７－ｈ３抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
CN114901697B (zh) 一种抗lag-3的单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
CN113402607B (zh) 一种抗lap单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
CN110964111A (zh) 一种抗pd-l1单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
CN110117329A (zh) 包含趋化因子与结合伴侣的融合多肽及其用途
JP2022514693A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
CN114262377B (zh) 一种阻断cd70与其配体cd27结合的抗人cd70纳米抗体的制备方法及其编码序列
CN114685666B (zh) 抗间皮素纳米抗体及其应用
CN110642950B (zh) 一种人源化t细胞活化的v域免疫抑制因子抗原结合片段
CN107840885B (zh) Gm-csf抗体及其用途
CN113698493B (zh) 一种针对VEGF和TGF-β的双功能蛋白及其应用
WO2019238074A1 (zh) 一种高亲和力高生物活性的lag-3抗体及其应用
JP2022514786A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
CN113924316B (zh) 抗cd25抗体及其应用
WO2021083248A1 (zh) 抗tspan8单克隆抗体及其用途
CN106749661B (zh) 抗psmp的单克隆抗体及其用途
KR101854529B1 (ko) 인간 및 마우스 Ｓｅｍａ３Ａ에 교차결합하는 항체 및 그의 용도
CN115819587B (zh) 一种抗nkg2a单克隆抗体及其应用
CN115957319B (zh) 一种抗nkg2a单克隆抗体的注射制剂
CN114456267B (zh) 一种抗cd73人源化单克隆抗体及其应用
WO2023103962A1 (zh) Tnfr2结合分子及其用途
KR20220002098A (ko) Lgals3bp에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
CN116173202A (zh) 一种抗lilrb4单克隆抗体注射制剂
CN115947850A (zh) 一种靶向lilrb4的单克隆抗体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant