CN115960222B

CN115960222B - 一种用于幽门螺旋杆菌分型检测纳米抗体的制备及应用

Info

Publication number: CN115960222B
Application number: CN202211296143.2A
Authority: CN
Inventors: 李润乐; 胥瑾; 汤锋; 刘文婧; 郭乐; 辛明远; 马敬唯; 彭司南
Original assignee: Qinghai University
Current assignee: Qinghai University
Priority date: 2022-10-21
Filing date: 2022-10-21
Publication date: 2024-05-24
Anticipated expiration: 2042-10-21
Also published as: CN115960222A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，其公开了一种用于幽门螺旋杆菌分型检测纳米抗体的制备及应用，基于噬菌体纳米抗体展示文库，通过多轮筛选获得了针对螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基的纳米抗体，经Elisa验证能够特异性识别幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基，且结合活性较高。本发明还提供了含有该纳米抗体可变区编码序列的表达载体、含有该表达载体的宿主细胞，成功构建出重组基因工程菌株，经表达纯化后得到目标蛋白。CagA和尿素酶B亚基的纳米抗体分别对CagA和尿素酶B亚基具有显著的特异性结合能力，可用于幽门螺旋杆菌分型检测，后续也可作为治疗抗体应用到临床治疗中。

Description

一种用于幽门螺旋杆菌分型检测纳米抗体的制备及应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及到一种用于幽门螺旋杆菌分型检测纳米抗体的制备及应用。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter Pylori,Hp)是一种能特异性地寄居于人体胃部的病原菌，是最常见的慢性细菌感染之一，影响着世界上至少一半的人口。研究证实Hp是慢性胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡的主要致病因子，也是胃腺癌与胃淋巴瘤的诱发因素之一。在Hp致病因素中，尿素酶(Urease)和细胞毒素蛋白(CagA)等相关蛋白起重要作用，因不同感染蛋白致病机制不同，所导致的胃部症状差异较大。研究显示，与CagA阴性菌株比较，带有CagA阳性菌株的幽门螺旋杆菌感染胃癌风险会明显增加。尿素酶是幽门螺旋杆菌高表达的蛋白，存在于幽门螺旋杆菌的整个生命周期，占总蛋白的10-15％，但多导致胃部轻微症状，如浅表性胃炎等等。

目前幽门螺旋杆菌的检测主要是碳13或碳14元素检测、经胃镜取胃粘膜快速尿素酶测试及病理活检等方式，但都未对幽门螺旋杆菌的感染蛋白进行分型检测，从而导致过度治疗、无临床症状服药、治疗成本高、耐药性等问题的产生。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，第一个目的是一种用于幽门螺旋杆菌分型检测纳米抗体。

本发明第二个目的是提供用于幽门螺旋杆菌分型检测纳米抗体的制备方法。

本发明第三个目的是提供幽门螺旋杆菌分型检测纳米抗体的用途。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供一种用于抗幽门螺旋杆菌分型检测纳米抗体，这类纳米抗体能够特异性结合幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基，其全部氨基酸序列如序列1—5所示；

该纳米抗体的全部核苷酸序列如序列6—10所示；

在本发明中上述纳米抗体是骆驼源化的VHH，此抗体可特异性识别幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基；

本发明中所述的纳米抗体，含有四个氨基酸突变位点。

本发明进一步提供了一种表达载体，其包括序列1-10所展示的氨基酸和核苷酸序列，并且提供了一种宿主菌，其同样包括序列1-10所展示的氨基酸和核苷酸序列；

并且本发明中的纳米抗体均为一种融合蛋白，能够特异性结合幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA或尿素酶B亚基的功能结构域，其中包括功能结构域的纳米抗体氨基酸序列、核苷酸序列、表达载体或宿主菌任一项。

本发明进一步提供了基于幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基纳米抗体的筛选方法或表达载体的制备方法。

技术路线如下：通过羊驼噬菌体纳米抗体展示文库筛选幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基纳米抗体，自过夜培养平板挑取单菌落扩大培养后进行Elisa亲和检测。将高亲和力阳性单菌落提取质粒进行测序。

本发明提供了针对幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基纳米抗体基因工程表达载体的纯化蛋白。

技术路线如下：将经测序后获得的纳米抗体目的基因连入载体pSumo-mut获得重组质粒，电转至BL-21(DE3)大肠杆菌表达系统建立原核表达系将基因工程菌株扩大培养后经IPTG诱导表达。包涵体蛋白复性后通过Ni-IDA镍离子亲和层析获得高纯度的纳米抗体融合蛋白。

本发明提供的幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基纳米抗体可用于Hp分型检测。

本发明中的所有纳米抗体可用于传统抗体或人源化抗体的改造，例如将本发明纳米抗体的CDR区结构应用到传统抗体上，以获得可以特异性结合幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA或尿素酶B亚基的传统抗体，这类传统体也属于本发明的保护范围；再如将本发明中的纳米抗体序列与人IgG Fc片段偶联，其也属于本发明的保护范围；在基因工程双特异性纳米抗中，其中在双特异性纳米抗体构建时使用本发明中的所有纳米抗体也属于本发明的保护范围。

本发明提供的纳米抗体可以单独或与任何蛋白结合以实现不同的使用目的，例如检测试剂盒的应用或与酶、放射性元素、荧光蛋白等结合以用于检测目的；再如与治疗幽门螺旋杆菌感染相关疾病的一系列蛋白融合以达到更佳治疗目的。与本发明中纳米抗体融合的蛋白类型，本领域技术人员可以根据实际需要而合理选择，无论与何种类型物质融合，其也在本发明的权利范围内。

纳米抗体(Nanobody，Nb)作为一种新型小分子抗体越来越受到关注，其来自于羊驼的外周血液中，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，其最具优势的特点是体积较传统抗体小，分子量约为12-15kDa，是传统抗体的1/10。Nb具有很强的致密组织穿透性以及高特异性、高亲和力和高稳定性等优势性状。基于纳米抗体的众多优势，从而非常适合用于分型检测、诊断试剂盒的开发、靶向给药及中和抗体治疗等研究，并且极高的灵敏度、高特异性使纳米抗体在检测诊断方面优势突出。

本发明通过噬菌体纳米抗体展示文库筛选抗幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基纳米抗体，达到将感染蛋白进行分型检测的目的。本发明基于噬菌体纳米抗体展示文库，多轮淘选后分别得到幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基高亲和力噬菌粒，测序分别获得其氨基酸序列后经重组质粒的构建、菌株诱导表达后建立纳米抗体大肠杆菌原核表达体系，经纯化获得幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基纳米抗体。

本发明可对于幽门螺旋杆菌感染类型进行分型检测，在应用中，能够通过明确感染的蛋白进而确定所感染Hp的类型，若感染中无细胞毒素相关蛋白感染，轻症或无症状即可选择性服药或不服药，防止了过度治疗及耐药性的产生。鉴于纳米抗体的性能特点，对幽门螺旋杆菌的感染能够发挥高灵敏的检测作用，并且本发明中的纳米抗体有中和抗原的的活性作用，具有潜在的治疗价值。

附图说明

图1：针对幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA筛选纳米抗体单克隆的亲和检测图；

图2：针对幽门螺旋杆菌尿素酶B亚基筛选纳米抗体单克隆的亲和检测图；

图3：纳米抗体序列中四个氨基酸突变位点图；

图4：成功构建纳米抗体原核表达载体；

图5：CagA纳米抗体蛋白纯化SDS-PAGE分析(M：蛋白质分子质量标准；1：破碎后处理样品；2：流出；3：纯化后样品)；

图6：尿素酶B亚基纳米抗体蛋白纯化SDS-PAGE分析(M：蛋白质分子质量标准；1：0.5mg/mL BSA；2：纯化后样品)；

图7：各纳米抗体和相应抗原的亲和检测图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，当然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，并不意味着对本发明的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

材料

1、氨苄青霉素(Amp)储存液(100mg/mL)：称取1g氨苄青霉素(Amp)溶于10mL无菌水，制得浓度为100mg/mL的贮存液，通过0.22μm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。

2、盐酸四环素储存液(100mg/mL):称取1g盐酸四环素溶于10mL无菌水，制得浓度为100mg/mL的贮存液，通过0.22μm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。

3、卡那霉素(100mg/mL):称取0.5g卡那霉素溶于10mL无菌水，制得浓度为100mg/mL的贮存液，通过0.22μm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。

4、IPTG溶液：称取2.4g IPTG溶于10mL无菌水，用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装，-20℃保存。

5、培养基：(1)2YT液体培养基：称取16g胰蛋白胨、10g酵母提取物和5g NaCl，加蒸馏水至1L，调整pH至7.4，高压蒸气灭菌。(2)2YT-ATG培养基：1.5g琼脂粉/100mL LB培养液，高压灭菌后，倾倒平板。(3)2YT-ATK培养基(4)2YT-T培养基。

4、DNA电泳缓冲液(50x TAE)：称取242g Tris、37.2g Na₂EDTA·2H₂O和57.1ml冰乙酸，加水至1L，使用时稀释50倍。

5、SDS-PAGE电泳缓冲液(5X)：称取Tris粉末15.1g、甘氨酸94g、SDS5.0g；加入约800mL的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1L，室温保存；注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于SDS的原因产生很多泡沫。

6、考马斯亮蓝蛋白染色试剂：(1)考马斯亮蓝G-250染液(蛋白质定量用)：考马斯亮蓝G-250 100mg溶解在50mL 95％乙醇中，然后加入86％磷酸100mL，用蒸馏水稀释至1000mL。(2)脱色液：250mL乙醇、80mL冰醋酸用蒸馏水稀释至1000mL。

9、ELISA试剂：(1)包被液：1.6g Na₂CO₃，2.9g NaHCO₃，0.2g NaN₃，加双蒸水至1L，调pH值至9.6。(2)洗涤液：分别称取0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，8.0g NaCl，0.2gKCl，0.5ml Tween-20，加入ddH₂O定容至1L(PBST)。(3)封闭液：称取0.6g脱脂奶粉溶解于5ml洗涤缓冲液中，过滤除菌后4℃保存。(4)底物液：可溶性单组份TMB底物溶液。(5)终止液：量取蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓硫酸21.7mL(1M H₂SO₄)。

实施例1：基于驼源噬菌体纳米抗体展示文库筛选抗幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基纳米抗体

噬菌体纳米抗体展示文库由课题组前期构建，基于文库通过固相免疫亲和淘选法将靶分子毒力岛蛋白CagA或尿素酶B亚基与包被液混合加入酶标孔中，另一排空孔为阴性对照，4℃静置过夜。经2次洗涤，加3％的脱脂奶粉封闭液，室温静置1h；弃去封闭液后洗涤2次，将噬菌体文库按每孔100μL加入到包被的抗原孔里，37℃孵育1.5～2h。进行第一轮淘洗，向洗完的孔里加入100μL 0.1mol/L Gly-HCl(pH2.2～2.5，1mg/mL BSA)洗脱液，洗脱特异性结合的噬菌体，而后加入pH为9.1的1mol/L Tris-HCl进行中和。将经过洗脱和中和后的噬菌体，加入到预先培养的5mL处于对数生长期的X-Blue大肠杆菌中1h。辅助噬菌体M13侵染30min后，加入2YT-ATG液体培养基，离心去上清后加入2YT-ATK液体培养基重悬过夜培养，次日离心后，收集上清得到第一轮淘筛后的噬菌体展示文库以用于下一轮的筛选，步骤同上。

结果：通过纳米抗体噬菌体文库经四轮淘筛后在过夜平板上富集得到针对毒力岛蛋白CagA或尿素酶B亚基的高特异性纳米抗体，进一步挑取单克隆进行验证。

实施例2：扩增培养抗Cag A和尿素酶B亚基单克隆进行亲和检测

在第四轮筛选后的过夜平板上随机挑取单菌落，放入5mL 2YT-ATG液体培养基中扩增，当OD值达到0.5时加入M13辅助噬菌体培养1h 30min。离心后弃上清加入5mL 2YT-ATK液体培养基30℃过夜培养。第二天将培养物离心后提取上清进行间接Phage-Elisa鉴定，OD450读值，实验组与阴性对照组相差值大于0.5时作为阳性克隆。

结果：经Elisa亲和检测过夜培养的上清，成功筛选到针对CagA和尿素酶B亚基的阳性单克隆，图1所示为抗原CagA检测结果，图2所示为尿素酶B亚基检测结果。选择经elisa检测后亲和数值较高的单克隆进行测序，经测序排除重复序列后成功获得两个针对CagA和三个针对尿素酶B亚基的纳米抗体序列。序列表中序列1—5为其氨基酸序列，序列6—10为核苷酸序列。如图3所示，经氨基酸序列比对分析观察到3个纳米抗体序列在FR2区中的四个特征性疏水性氨基酸突变位点，从而判断为5个抗体亲水性和稳定性均较高。

实施例3：构建抗幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基表达载体

将测序获得的Urease纳米抗体序列连入载体pSumo-mut获得重组质粒。通过双酶切连接入载体Nde Ⅰ-Xba Ⅱ位点后电转至BL-21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴10min，振荡活化。将电转的菌液涂布在2YT-Kana平板中过夜培养，次日挑取转化平板上的单克隆菌落接种于5ml TB-Kana液体培养基中，37℃、220r·min-1过夜培养，按1％接种于50mL TB-Kna液体培养基中，220r·min 37℃培养至OD值为0.4左右后扩大培养，加入0.2mmol·L-IPTG 15℃过夜，诱导融合蛋白表达。次日收集菌体，超声破碎后收集上清和沉淀，将诱导前菌液、诱导后菌液、超声破碎后上清和沉淀分别进行SDS-PAGE鉴定。

结果：将目的基因通过酶切连接连入载体pSumo-mut获得重组质粒，如图4所示1泳道为目的基因成功载入质粒。挑取单克隆扩增培养后进行IPTG诱导表达，并进行超声破碎。对未诱导样本、诱导后样本及破碎后上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析(图5)，结果显示目的蛋白主要存在于沉淀中，目的为包涵体表达。

实施例4：融合蛋白的复性与Ni-IDA镍离子亲和层析柱的纯化

将上述超声后的重悬液离心后弃上清，沉淀50mM NaH₂PO₄，10mM Tris-HC1，8M尿素溶液混悬，超声助溶，沉淀溶解即可。上述溶液离心后将上清加入透析袋中，将透析袋封闭好后依次放入含有不同浓度尿素的复性缓冲液中。复性后利用低压层析系统，蛋白溶液以0.5ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱；用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5mL/min流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线；用Ni-IDA Washing-Buffer(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，pH8.0)以1mL/min流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线；用Ni-IDAElution-Buffer(20mM Tris-HCl，250mM咪唑，0.15MNaCl，pH8.0)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS(PH7.4)进行透析过夜。

结果：经Ni-IDA镍离子亲和层析柱的纯化后，收集的各个蛋白峰进行SDS-PAGE分析，可以发现目的蛋白集中在250mM咪唑洗脱产生的蛋白峰。如图6中2泳道所示通过凝胶成像检测仪分析在250mM咪唑洗脱的目的蛋白纯度可达电泳纯度。

实施例5：抗幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基亲和活性

(1)抗幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基生物素标记

将纯化后的CagA和尿素酶B亚基进行浓缩至抗体浓度为2mg/mL，将生物素溶解为浓度20mg/mL，按照生物素与抗体分子摩尔比1:20的比例加入抗体溶液，室温反应1h，去除游离生物素，添加抗体保护液，-20℃保存备用。

(2)将CagA和尿素酶B亚基融合蛋白以10μg/mL浓度包被到ELISA板中，并包被BSA作为阴性对照。1％BSA 37℃封闭2h后加入生物素标记的CagA和尿素酶B亚基，37℃孵育1h后，PBST洗涤4次后加入1:10000稀释二抗IgG-Streptavidin，PBST洗涤4次，加入100μL TMB显色液，避光显色5～20min，加入50μL终止液，读取OD₄₅₀吸光度。

结果：图7所示幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基纳米抗体对CagA和尿素酶B亚基具有高亲和性，对BSA无亲和性，表明该纳米抗体对幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA和尿素酶B亚基具有高度特异性。

以上已将本发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。

Claims

1.用于幽门螺旋杆菌分型检测纳米抗体组合，其特征在于：该纳米抗体组合为抗胃部幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA的纳米抗体和抗胃部幽门螺旋杆菌尿素酶B亚基的纳米抗体，其中，抗胃部幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA能够特异性结合幽门螺旋杆菌CagA，其氨基酸序列如序列1或序列2所示；

而抗胃部幽门螺旋杆菌尿素酶B亚基的纳米抗体能够特异性结合幽门螺旋杆菌尿素酶B亚基，其氨基酸序列如序列序列3、序列4或序列5所示。

2.抗胃部幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白CagA的纳米抗体的编码核苷酸，其特征在于：核苷酸序列如序列6或序列7所示。

3.抗胃部幽门螺旋杆菌尿素酶B亚基的纳米抗体的编码核苷酸，其特征在于：核苷酸序列如序列8、序列9或序列10所示。

4.一种表达载体，其特征在于：包含权利要求2或3所述的核苷酸序列。

5.一种宿主菌，其特征在于：包含权利要求2或3所述的核苷酸序列。

6.权利要求1所述的用于幽门螺旋杆菌分型检测纳米抗体在制备幽门螺旋杆菌感染诊断检测药物中的应用。