JPH06504528A - シュードモナス層ペプチド組成物およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 シュードモナス属ペプチド組成物およびその製造方法この出願は、１９８９年４ 月２８日に出願された５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、　３４４，５６５の「合成緑膿菌（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ビリンペプチド」に関する係 属中米国出願の一部係属出願である。

１、本発明の分野 本発明は、シュードモナス属由来のポリペプチド抗原、このような抗原の製造方 法および当該抗原に対して免疫反応性の抗体に関する。

２、参考文献 Ａｄａｍｓ、　Ｍ、Ｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　５ｔｕｃｌｙ　ｏｆ　ｂａｃｔ ｅｒｊａｌ　ｖｉｒｕｓｅｓ、　ｐ、　４４３−４５２．　l、庄Ａｄ ａｍｓ（編者）、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ中、　Ｉｎｔｅｒｓｃｊｅｎ ｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏ窒求@（＋ ９５９）。

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Ｐａ５ｌｏｓｋｅ、　Ｂ、Ｌ、、ら、Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７０：３７３ ８−３７４１　（１９８８）。

ｐａｒａｎｅｈｙｃｈ、　ｗ、、ら、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 　２５：１１７５−１１８１　。

Ｐａｒａ、ｃｈｙｃｈ、Ｗ、　＋ろ、Ａｄｖａｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｐｈｙ ｓ、２９：５３−１１４　（１９８８）。

Ｐａｒｍｌｅｙ、　Ｓ、Ｆ、　＆　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｇ、Ｐ、　Ｇｅｎｅ　７３： ３０５−３１８　（１９８８）。

Ｒａｂｂｉｔｔｓ、　Ｔ、Ｈ，ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　 ９：４５０９−４５２４　（１９８１）。

Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ、、ら、　ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、　７４：５４６３−５４ｆ ３７　（１９７７）。

５ａｔｏ、　Ｈ，＆　Ｏｋｉｎａｇａ、　Ｋ、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ 、　５５：１７７４−１７７８　（１９８７）。

５ｃｏｔｔ、　Ｊ、に、　＆　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｇ、Ｐ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２ ４９：３８６−３９０　（１９９０）。

５ａｓｔｒｙ、　Ｌ、、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、 　ＵＳＡ　８６：５７２８−５７３２　（１９８９）。

５ａｓｔｒｙ、　Ｐ、Ａ、、ら、　Ｃａｎ、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　６３ ：２８４−２９１　（１９８５）。

Ｓｔ、ａｄｄｏｎ、　Ｗ、、ら、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３ ６＋３３６−３４０　（１９９０）。

Ｔｏｄｄ、Ｔ、、ら、　Ａｍ、Ｒｅｖ、Ｒｅ５ｐｉｒ、Ｄｉｓ、１４０二１５８ ５−１５８９　（１９８９）。

Ｔｓａｉ、　Ｃ，、ら、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１９：１１５−１１９ 　（＋９８２）。

Ｗｏｒｏｂｅｃ、Ｅ、Ａ、、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０：９３８ −９４３　（＋９８５）。

ｚｕ　Ｐｕｔｌｉｔｚ、Ｊ、、ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：６５１ −６５４　（＋９９０）　。

３、本発明の茸景 過去２０年間、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、 たいていの病院における感染の１０％〜２０％を引き起こす病原菌として認識さ れてきた。シュードモナス属の感染は、熱傷創、嚢胞性線維症、急性白血病、臓 器移植、および静脈内薬物嗜癖の看者の間で特にはやっている。緑膿菌（Ｐ、　 ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、一般的院内汚染物質であり、流行（異常発生）は、 病院環境中の多くの条項まで追跡されている。長期間入院している患者は、この 生物によってしばしば悪影響を及はされ、感染の発生の増大した危険の丁に置か れている。最も重い感染としては、悪性外耳炎、眼内炎、ｅｎｄｏｅｏｎｄｉ　 を比髄膜炎、肺炎、および敗血症かある。ノコ、−トモナス属感染からの回復の 可能性は、看者の、潜在的な疾病プロセスの激しさに関連している。緑膿菌（Ｐ 、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）肺炎に関する報告されている死亡率は５０〜８０％ と高い。より新規な抗生物質が開発されても、耐性は、重い緑膿菌（Ｐ。

ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染のためには組み合わせた抗生物質による治療を要す るという問題を残す。

重い緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染の管理のための種々の療法が、 特に菌カフアクタ−に焦点を合わせて注意をして、何年もの間評価されてきた。

たいていの細菌の病原菌と同様に、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の菌 内は、多要素からなりそして多くの相互に作用する変数−細菌および宿主の両方 を包含する−の積である。

証拠は、感染の最初の出来事は、粘膜表面の上皮細胞への微生物の付着（ａｄｈ ｅｒｅｎｃｅ）であることを示唆している（Ｂｌｅａｃｈｙ）。粘膜表面に付着 できない生物は、集落化できない。なぜならば、該生物は粘膜表面をおおう分泌 物によって除去されてしまうからである。付着方法は、細菌と上皮細胞との間の 特異的認識によって決まる。

緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含む多数のグラム陰性菌の場合、付着 の媒介物として表面付属器に注意が向けられている。多くのグラム陰性菌、例え ば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｊａ　ｃｏＨ）、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｌ ｎｏｓａ）、モラクセラ呻ボビス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｂｏｖｉｓ）　、淋菌 （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）の表面は、ピリ線毛（ｐｉｌｉ） または線毛（ｆｉｍｂｒｉａｅ）と呼ばれている繊維状構造で覆われている。ビ リ線毛は、主としてタンパク質（ピリン）からなり、試験動物に注射された時、 抗原決定基として作用することが見出されている。緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉ ｎｏｓａ）において、菌株に特異的なビリ線毛、例えば、ＰＡＯ，ＰＡＫ、およ びＣＤ４と呼称されるものは、ヒトにおける細菌の集落化を媒介する（Ｄｏｉｇ 、　８８）。

ピリ線毛遺伝子を持つプラスミドの突然変異または欠損のいずれかにより、これ らのビリ線毛を持たない、いくつかの緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細 菌は、粘膜に集落形成できない。明らかに、細菌の表面上のビリ線毛は、上皮細 胞受容体との特異的相互作用を通して、咽喉および気管の裏層に付着する。緑膿 菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、ヒトの呼吸肺胞細胞への媒介付着物（ａ ｔｔａｃｈｍｅｎｔ）に付着するものとして、ビリ線毛とアルギン酸塩の両方（ 緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）カプセルの生成分）を利用できる（Ｄｏ ｉｇ）。

ヒトの呼吸肺胞細胞への緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の結合の平衡分 析は、シュードモナス属のビリ線毛付着が、アルギン酸塩付着よりも著しく高い 見掛けの親和性または結合定数を有していることを示している（＆ｌｅＥａｅｈ ｒａｍ、　１９８５．１９８６）　ｏこれらの観察は、ビリ線毛付着が、おそら く、感染の始めにおいては、シュードモナス属の支配的付着であろうことを示唆 している（ｆｒｖｉｎ）。付着が媒介する固定は、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉ ｎｏｓａ）による疾病の誘発のだめの前提条件である。

より早期に提出された、共に係属中の特許出願は、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉ ｎｏｓａ）ビリンタンパク質のＣ末端領域、とりわけ、２つのＣｙｓ残基および 介在アミノ酸残基を含むＣ末端領域に由来する緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏ ｓａ）ペプチドを開示している。該領域に由来する代表的なペプチドは、長さが １４〜１９アミノ酸残基−一２つのＣｙｓ残基を含む−の間で変わり、そして酸 化された（ジスルフィドが連結した）形および還元された（非環化）形で調製さ れる。ペプチド（還元および酸化形）は次の特性を有することが示された：（ａ ）　ヒトの気管上皮網）ｔｉｓ（ＴＥＣｓ）およびヒトの頬上皮細胞（ＢＥＣｓ ）に結合する能カニ （ｂ＋　気管上皮細胞（ＴＥＣｓ）および頬上皮細胞（ＢＥＣｓ）へのシュード モナス属ビリンペプチドの結合を阻害する能カニ（Ｃ）　シュードモナス属のビ リンペプチドと免疫反応性である血清抗体を引き出す能力；および （ｄｌ　Ｂ　Ｅ　Ｃｓへのシュードモナス属ビリンペプチドの結合を阻止する血 清抗体を引き出す能力。

今や、ンユードモナス属由来のペプチドが、ＴＥＣｓおよび／またはＢＥＣｓへ の無関係な（聞ｒｅｌａｔｅｄ）細菌および真菌生物の結合を阻害できることが 見出された。従って、シュードモナス属由来の当該ペプチドを結合する、それに よってＴＥＣｓおよびＢＥＣｓへのシュートモナス属ビリン（およびシュードモ ナス属細菌）の結合を阻害する上皮細胞受容体部位は、これらの標的細胞への別 の細菌および真菌生物の結合の際にも関係している。さらに、本発明を支持して 行われた研究において、シュードモナス属由来のペプチドに対して調製された単 クローン抗体が、ＢＥＣｓへの真菌細胞の付着を阻止するのに有効であることが 示された。

これらを合わせた知見は、シュードモナス属由来のペプチドおよび当該ペプチド に応答して産生された抗体は、細菌および真菌感染を阻害でき、その際、感染微 生物は、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ビリンタンパク質のＣ末端の、 ジスルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体と抗原的に交差反応を示 す表面タンパク質を有していることを示している。

４、本発明の概要 本発明は、−面において、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ビリンタンパ ク質のＣ末端領域に対応する配列、より具体的には、配列（ｉ）〜（ｖｌ）の間 および配列（ｖｉ）〜（ｘ）の間で内部で一致する、アミノ酸変化を含む次の配 列：（ｉ）　ＫＣＴＳＤＱＤＥＱＦ　ＩＰＫＧＣ８Ｋ。

（ｉｉ）ＫＣＴＳＤＱＤＥＱＦ　ＩＰＫＧＣ３Ｒ１（ｉｉｉ）ＡＣＫＳＴＱＤＰ ＭＦＴＰＫＧＣＤＮ、（ｉｖ）ＴＣＴＳＴＱＥＥＭＦ　ＩＰＫＧＣＮＫＰ、（ｖ ）ＳＣＡ、ＴＴＶＤＡＫＦＲＰＮＧＣＴＤ、（ｖｉ）ＡＣＴＳＮＡＤＮＫＹＬＰ ＫＴＣＱＴＡＴＴＴＴＰ、（ｖｉｉ）　ＮＣＫ　ＩＴＫＴＰＴＡＷＫＰＮＹＡＰ ＡＮＣＰＫＳ　、（ｖｉｉ）ＴＣＧＩＴＧＳＰＴＮＷＫＡＮＹＡＰＡＮＣＰＫＳ 。

（ｉｘ）ＴＣＧＩＴＧＳＰＴＮＷＫＴＮＹＡＰＡＮＣＰＫＳ、および（ｘ）ＧＣ ３ｌ５ＳＴＰＡＮＷＫＰＮＹＡＰＳＮＣＰＫＳの中の１つを有するペプチドに関 する。

本発明のペプチドはさらに、（ａ）２つのＣｙｓ　（Ｃ）残基の間のジスルフィ ド連結、　（ｂ）ＰＫ　９９　ＨまたはＰＫ３４０単クローン抗体への免疫特異 的結合：（Ｃ）気管または頬の上皮細胞への特異的結合：および（ｄ）緑膿菌（ Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ビリンタンパク質への特異的結合の不存在によっ て特徴づけられる。

関連した面において、本発明は、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ビリン タンパク質のＣ末端の、ジスルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体 と抗原的に交差反応を示す表面タンパク質を存する細菌および真菌生物による感 染に対するワクチンとして使用するための組成物に関する。当該組成物は、上記 ペプチドと、当該ペプチドが結合される免疫原性キャリヤーを含む。一実施態様 において、シュードモナス属感染に対するワクチンとして使用するために、当該 ペプチドは、ＰＫ３４Ｃ単３４Ｃ単クローン抗 ンジダ属感染に対するワクチンとして使用するために、当該ペプチドは、ＰＫ９ ９Ｈ抗体と免疫反応性である。

別の面で、当該ペプチドは、配列（１′）〜（ｖｉ’）の間で内部で一致する、 アミノ酸変化を含む・ （ｉ’　）ＤＥＱＦＩＰＫ。

（ｉｉ’　）ＤＥＱＦ　ＩＰＫ、 （ｉｉ’　）ＤＰＭＦＴＰＫ、 （ｉｖ’　）　ＥＥＭＦ　Ｉ　ＰＫ、 （ｖ’　）ＤＡＫＦＲＰＮ、および （ｖｉ’　）ＤＮＫＹＬＰＫ からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、そして、当該ペプチドは、ｔａ ）　ＰＫ９９ＨまたはＰＫ３４Ｃ単３４Ｃ単クローン抗はヒトの気管上皮細胞へ の特異的結合：および（Ｃ１緑膿菌（Ｐ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ビリンタン パク質への特異的結合の不存在によって特徴づけられる。

当該ペプチド組成物は、緑膿菌（Ｐ，　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ビリンタンパク 質のＣ末端の、ジスルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体と抗原的 に交差反応を示す表面タンパク質を有する細菌および真菌生物による感染に対し て固体を保護する予防接種法において使用される。

同様に本発明は、緑Ｉｌ菌（Ｐ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ’）ビリンタンパク質 のＣ末端の、ジスルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体と抗原的に 交差反応を示す表面タンパク質を有する細菌および真菌生物による感染に対する ワクチンどして使用するための組成物の製造方法にも関する。当該方法において は、５〜１ｏコドンのランダム配列に一般に対応する、ランダム配列ポリヌクレ オチドのベクターライブラリーにより作り出されたランダム配列ペプチドを選択 する。選択は、緑膿菌（Ｐ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ビリンタンパク質のＣ末 端の、ジスルフィド連結ペプチド領域と免疫反応性の単クローン抗体に、好まし くはＰＫ３４ＣまたはＰＫ９９Ｈ単クロー単流ローン抗体るペプチドによって行 われる。選択した、結合するポリペプチドの配列は、対応するライブラリーベク ターのポリヌクレオチドフード化配列から決定できる。この配列から、所望のポ リペプチドが、合成または組換え手段によって作られ得る。

同様に、マウスのＰＫ３４ＣまたはＰＫ９９Ｈ単クロー単流ローン抗体域、およ びヒトのイムノグロブリンＧ抗体の不変領域からなるキメラ単クローン抗体も開 示される。当該抗体は、緑膿菌（Ｐ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ビリンタンパク 質のＣ末端の、ジスルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体と抗原的 に交差反応を示す表面タンパク質を有する細菌および真菌生物による感染を治療 するために使用され得る。

さらに別の面において、本発明は、緑膿菌（Ｐ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ビリ ンタンパク質のＣ末端の、ジスルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗 体と抗原的に交差反応を示す表面タンパク質を有する細菌および真菌生物によっ て引き起こされる肺の感染を治療する方法を包含する。当該方法は、ペプチドの エーロゾル剤を作りそして当該ペプチドを吸入により投与することを包含する。

本発明の以下の詳細な記載を添付の図面と合わせて読むと、本発明の、これらの および他の目的ならびに特徴はさらに充分に明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図１は、本発明のシュードモナス属ペプチドのアミノ酸配列を示す；図２は、天 然のＰＡＫペプチドならびに変性したＣ末端およびＮ末端を有するＰＡＫペプチ ドならびに単クローン抗体ＰＫ９９ＨのためにＣｙｓ残基以外の１７のペプチド 残基のそれぞれにＡｌａ置換基を含むペプチドの、相対的な結合親和性を示ず： 図３は、ヒトＢＥＣ８への合成ペプチドＰＡＫ，．，（■）およびＰＡＫ６．の 結合を示すプロットである。

図４は、ヒトＢＥＣｓへのＰＡＫピリ線毛の結合の、修正ラインウィーヴアー〜 ブルクプロットであり、ＰＡＫペプチドの濃度を高めることによる結合の阻害を 示している； 図５は、示した抗体のＦａｂフラグメントとのＢＥＣｓのプレインギュベーシヲ ン後の、ＢＥＣｓへのＰＡＫビリ線毛の結合のパーセントを示す捧グラフである ； 図６は、単クローン抗体ＰＫ９９Ｈ（ロ）およびＰＫ３４Ｃ（△）のＦａｂフラ グメントによるＢＥＣｓへのシュードモナス属細菌の結合の阻害を示すプロット である； 図７は、ポリクローンの抗ＰＡ、にビリ線毛抗体（レーンりを用いてイムノプロ ットにより染色された、分別されたＭ、　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓタンパク質、 ならびにタンパク質染料（レーン２）および標準液（レーン３）を用いて染色さ れたものを示す。

図８Ａおよび８Ｂは、ポリクローンの抗ＰＡＫピリ線毛抗体（８Ａ）および対照 の抗体（８Ｂ）との結合後のＭ、　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ細胞を示す免疫電気 顕微鏡写真である。

図９Ａおよび９Ｂは、コロイド状金により場所が決められたＰＫ９９Ｈ抗体と共 にＭ、　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ細菌を示す電気顕微鏡写真である：図１０は、 ＰＫ９９Ｈ単クローンり体を用いてイムノプロットしたいくつかのバクテロイデ ス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）菌株のＷｅｓｔｅｒｎプロットを示す；図１１ は、ＢＥＣｓに結合したカンジダ属細胞の位相顕微鏡写真である；図１２は、精 製したカンジダ属線毛タンパク質（レーン３）の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルパターン を示す。

図１３は、ＢＥＣｓへのカンジダ属付着に対するカンジダ属線毛による阻害を示 す棒グラフである。

図１４は、ＢＥＣｓへのカンジダ属付着に対するシュードモナス属ビリ線毛によ る阻害を示す棒グラフである； 図１５は、ＢＥＣｓへのシュードモナス属ビリ線毛の結合に対するカンジダ属線 毛による阻害を示す棒グラフである。

図１６は、ＢＥＣｓへのカンジダ属結合に対する抗ＰＡＫピリ線毛抗体による阻 害を示す捧グラフである。

図１７は、本発明による、ランダム配列ペプチドを製造し選択する組み換え方法 を説明する。そして 図１８は、本発明によるキメラ単クローン抗体を製造するのに適当な組換え方法 を説明する。

本明細書において使用される術語「エピトープ（ｅｐｉ　ｔｏｐｅ）Ｊおよび［ エピトープの（ｅｐｉｔｏｐｉｃ）Ｊは、同一のまたは関連した抗原により引き 出される対応する抗体（イムノグロブリン）分子との特異的相互作用に応答する 分子の構造上の成分を示す。

本明細書において使用される術語「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）は、抗体により認識 される実体を意味する。

本明細書において使用される術語［イムノゲン（ｉｍｍｕ口ｏｇｅｎ）Ｊは、宿 主動物における抗体産生を誘導する実体を意味する。いくつかの例において、抗 原およびイムノゲンは同一の実体であるが、別の例では２つの実体は異なる。

術語［免疫学的な模倣（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｌｙ　ｍ１ｍ１ｃｓ）Ｊ は本明細書において、本発明のイムノゲンボリベブチドが天然ペプチドまたは天 然タンパク質の開裂フラグメントではなく、例えば固相合成または遺伝子工学技 術により、製造されたポリペプチドであることを意味するために使用され、その ポリペプチドは、生じるポリペプチドに結合する、また、対応するピリンまたは ピリンポリペプチド部分にも結合する抗体の産生を引き起こす。

本明細書において同定された全てのアミノ酸残基は、特記なき限り天然またはＬ −立体配置にあるものである。標準ペプチド命名法と一致して、本明細書におい て使用したアミノ酸残基の略語は次の通りである：記号　アミノ酸 １文字　３文字 Ｙ　ＴＹＲ−Ｌ−チロシン Ｇ　ＧＬＹ　−グリシジ Ｆ　ＰＨＥ　−Ｌ−フェニルアラニン Ｍ　ＭＥＴ　−Ｌ−メチオニン Ａ　ＡＬＡ　−Ｌ−アラニン Ｅ　ＧＬＵ　−Ｌ−グルタミン酸 Ｗ　ＴＲＰ　−Ｌ−）リプトファン ＲＡＲＧ　−Ｌ−アルギニン Ｄ　ＡＳＰ　−Ｌ−アスパラギン酸 図１は、今日までに配列決定された１０種の緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓ ａ）菌株から得られたピリンタンパク質の、Ｃ末端アミノ酸配列および対応する ポリヌクレオチドコ−１・化配列を示す。緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ）菌株または単離されたちのｍ−それから配列が得られるｍ−は図の左に示され ており、本明細書において特定のピリンペプチド配列を呼称するために使用され る。菌株ＣＤ４、ＫＢ７、Ｋ１２２、ＧＡｌ、およびＴＢＯＵＩと同様に（Ｐｏ ｓｌｏｓｋｅ）、菌株ＰＡＫ、ＰＡＯ１および４９２ｃが報告されている（Ｄｏ ｉｇ、　１９９０）。ＰＡＫ　（Ｒ）と呼称される菌株は、Ｃ木端σ月、、ｌ　 Ｙ　ＳからＡｒｇまての（Ｌｙｓ−ｔｏ−Ａｒｇ）置換基を含む突然変異体のＰ ＡＫ菌株である。菌株ＰＡＫ　（Ｒ）　、ＰＡＯ，ＣＤ４、Ｋ１２２、ＫＢ７、 ＰＩ、４９２Ｃ１およびＴＢＯＵＩのＣ末端配列はより早期に提出された共に係 属中の出願において報告した。

種々の菌株に関する対応するポリヌクレオヂ１−コート化配列は、公表された報 告から、または個々の菌株から得られる、単離された緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇ ｉｎｏｓａ）のゲノム材料の配列決定によって決めた。ゲノム材料は、従来の方 法（ＭｃＢｒｉｄｅ）に従って、図中に示したアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末 端領域に対応する縮退プローブを用いて、複製連鎖反応（ＰＣＲ）方法により増 幅された。増幅したゲノム材料の配列決定は、標準方法（Ｓａｎｇｅｒ）による ジデオキシ配列決定法により行われた。

図１を続けて参照すると、好ましいペプチド配列は、ｔａｌｃ　ｙ　ｓからＣｙ ｓまでの（Ｃｙｓ−ｔｏ−Ｃｙｓ）残基、（ｂｌＮ末端に接する残基からＣｙｓ −ｔｏ−Ｃｙｓ残基までおよび（Ｃ）Ｃ末端に接する残基からＣｙｓ−ｔｏ−Ｃ ｙｓ残基までを含み、好ましくは、Ｃ末端からＣｙｓ−ｔｏ−Ｃｙｓ残基までの 残基の全てを含む。これらの好ましい配列は、以下に配列（ｉ）〜（Ｘ）として 、上に示した慣用の１文字アミノ酸コードを用いて示されている：（ｉ）ＫＣＴ ＳＤＱＤＥＱＦＩＰＫＧＣ３Ｋ、（ｉｉ）　ＫＣＴＳＤＱＤＥＱＦ　ＩＰＫＧＣ ＳＲｌ（ｉｉ）ＡＣＫＳＴＱＤＰＭＦＴＰＫＧＣＤＮ、（ｉｖ）ＴＣＴＳＴＱＥ ＥＭＦ　ＩＰＫＧＣＮＫＰ。

（ｖ）ＳＣＡＴＴＶＤＡＫＦＲＰＮＧＣＴＤ。

（ｖｉ）ＡＣＴＳＮＡＤＮＫＹＬＰＫＴＣＱＴＡＴＴＴＴＰ。

（■）ＮＣＫＩＴＫＴＰＴΔＷＫＰＮＹＡＩ）ＡＮＣＰＫＳ、（ｖ−ｉｉ）ＴＣ Ｇ　ＴＴＧＳＰＴＮＷＫＡＮＹＡＰＡ、ＮＣＰＫＳ、（ｉｘ）ＴＣＧｒＴＧＳＰ ＴＮＷＫＴＮＹＡＰＡＮＣＰＫＳ、および（ｘ）ＧＣ３ｌ５ＳＴＰＡＮＷＫＰＮ ＹＡＰＳＮＣＰＫＳ。

これらの１０個の配列は２つの群に分類できることがわかる：第一の群（配列１ −ｖｉ）は１４個のＣｙｓ−ｔ、ｏ−Ｃｙｓ残基を含み、第二の群（配列ｖｉ　 −ｘ　）は１９のＣｙｓ−ｔｏ−Ｃｙｓ残基を含む。各配列が由来する緑膿菌（ Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）菌株は、（ｉ）、ＰＡＫ；　（ｉｉ）、ＰＡＫ　 （ＬｙｓからＡｒｇへの突然変異）；　（ｉｉ）、ＰＡＯ；　（ｉｖ）、ＣＤ４ ：　（ｖ）、ＫＢ７；　（ｖｉ）、に１２２；（ｖｉ）、　ＰＩ　；　（ｖｉ） 、　ＧＡＩ　；　（ｉｘ）、４９２Ｃ；および（ｘ）、ＴＢＯＵＩである。当該 ペプチドは、本明細書においてこれらの菌株の名称によって呼称される。例えば 、配列（ｉ）を含むペプチドは本明細書においては、ｒＰＡＫペプチド」と呼ば れ、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　Ｋピリンタンパク質のＣ末端の、 ジスルフィド連結ペプチド領域を意味し、以下に示す付加的な制約を有する。

好ましいジスルフィド連結ペプチドは、配列（ｉ）〜（ｖｉ）の間および配列（ ｖｉ）〜（ｘ）の間で内部で一致する、上記配列のアミノ酸変化を同様に含む。

従って、例えば、ペプチド（１）〜（ｖｉ）の群の第一（左手）の残基は可能な 変化に、　Ａ、　Ｔ、およびＳを含み、この群の第三の位置は、可能な変化Ｔ、 、Ｋ、およびＡを含む。

内部変化置換基は、天然に見出される置換基であり、従って明らかに、ペプチド の必要な抗原性特性と適合性であることを特に言及する。さらに、当該置換基は 一般に、次のことの１つまたはそれ以上に関連して同様の特性を有するアミノ酸 群の中にある。（１）疎水性−（２）極性：（３）側鎖の大きさ；（４）電荷； （５）回転の採択。

（６）β鎖（ｓｔｒａｎｄ）二次構造の採択、および（７）螺旋二次構造の採択 。例えば、第７の位置で、可能な置換基の変動は、Ｔ（Ｔｈｙ）および５（Ｓｅ ｒ）の間、またはＹ（Ｔｙｒ）およびＦ（Ｐｈ、ｅ）の間である。アミノ酸変化 は、以下に論じたΔｌａ置換基の効果によっても支持される。

さらに、当該ペプチドは： （ａ）２つのＣｙｓ（Ｃ）残基の間のジスルフィド連結。

（ｂｌＰＫ９９ＨまたはＰＫ３４Ｃ単３４Ｃ単クローン抗（Ｃ比１−の頬または ヒトの気管の一Ｅ皮細胞への特異的結合；およびｔｄｉ緑膿菌（Ｐ．　ａｅｒｕ ｇｉｎｏｓａ）ビリンタンパク質への特異的結合の不存在によって特徴づけられ る。

２つのＣｙｓ残基の間のジスルフィド連結−それはペプチドを有効に環化するｍ −は、以下に論ぜられるように、異なる緑膿菌（Ｐ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ） 菌株からのビリ線毛と交差反応を示す抗血清を調製する際に、ペプチドの免疫原 性にとって重要であることが見出された。

以下に示されるように、ＭａｂのＰＫ９９１（およびＰＫ３４Ｃは、ＰＡＫペプ チドに対して調製され（酸化形）そして種々の別の緑膿菌（Ｐ．　ａｅｒｕｇｉ ｎｏｓａ）菌株ビリ線毛と交差反応を示す。本発明のペプチドが、これらの抗体 の少なくとも１つと交差反応性を有するという必要条件は、ペプチドがＰＡにペ プチドどの必要なエピトープ類似性を有することを保証する。

同様に以下に示されるように、本発明のペプチドは、ヒトの頬上皮細胞（ＢＥＣ ｓ）およびヒトの気管上皮細胞（ＴＥＣｓ）上の受容体部位に結合する能力を有 しており、この結合は、これらの上皮細胞への緑膿菌（Ｐ．　ａｅｒｕｇｉｎｏ ｓａ）の結合を阻害するのに有効である。これらの細胞へのペプチド結合に関す る必要条件は、ペプチドが必要な受容体結合活性を有することを保証する。

緑膿菌（Ｐ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ビリンタンパク質への特異的結合の不存 在は、当該ペプチドと、より早く報告されたＣ末端の緑膿菌（Ｐ．　ａｅｒｕｇ ｉｎｏｓａ）フラグメント（Ｐａｒａｎｅｈｙｃｈ）−それはＰＡ．に菌株ペプ チドのＣ末端配列を含むが、しかしさらにビリンタンパク質とのペプチド結合を 引き起こすＮ末端の残基を含むーとを区別する。このような結合は、ビリンタン パク質の自己凝集特性におそらく関連する。このような結合は、本発明の目的の ためには望ましくないエピトープを意味する。

本発明のペプチドは、上記制約と矛盾しない、付加的なＮ末端またはＣ末端残基 を含み得る。

２つのＣｙｓ残基以外のＰＡＫペプチド中の１５の残基部分のそれぞれでのＡｌ ａ置換基の効果を調べて、アミノ酸変化に最も敏感なベブチ・ドの領域を同定し た。手短に言えば、特定のΔ１ａ置換基を有するペプチドを、抗ＰＡＫ単クロー ン抗体ＰＫ９９Ｈ（以下に記載した）への結合親和性について、置換されていな いＰＡＫペプチドと比較した。置換されていないペプチドと置換されているペプ チドを、実質的に例１に記載したように、固相合成によって製造した。置換され ていないペプチドと、置換されているペプチドの各々の相対的な結合親和性を、 標準方法に従って、競合的酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）に よってめた。相対的結合は、ｌｏｇｉｃｓ。（Ｒ換されている）　−　ｌｏｇｌ ｃｓ。（天然の）として表され、その際ＩＣｓ。は、固定化した抗体から、酵素 連結ペプチドの５０％を追い出すのに必要なペプチド濃度である。

結果を図２に示す。ｌｏｇｌＣｓ。（置換されている）　−　！ｏｇ１ｃｍ。（ 天然の）の正の値は、置換されているペプチドにおける結合親和性の喪失を示す 。Ａｌａ置換基に対する最も感受性の強い残基位置は、７（Ａｓｐ）、８（Ｇｌ ｕ）、１０（Ｐｈｅ）、ｉｔｃ目ｅ）、＋２（Ｐｒｏ）、および１３（Ｌｙｓ） の位置であることが判る。図１から明らかなように、これらの位置は、ペプチド 配列（１）〜（ｉ）において、特に７（ＡＳｐおよびＧｌｕ）、１０（Ｐｈｅお よびＴｙｒ）、＋２（Ｐｒｏ）、および（ＬｙｓおよびＡｓｎ）の位置で強く維 持されている。

残基７〜１３が結合活性に最も決定的であり、そしてこれらの領域のいずれの側 の置換基も結合活性に比較的はとんど影響を与えないので、この７−ｍｅｒ、お よび場合により、Ｎ末端またはＣ末端の側面残基を含むペプチドは、以下に記載 したペプチド適用のためにも使用でき、その際、緑膿菌（Ｐ．　ａｅｒｕｇｉｎ ｏｓａ）に対するおよび、緑膿菌（Ｐ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ビリンタンパ ク質のＣ末端の、ジスルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体と抗原 的に交差反応を示す表面タンパク質を有する細菌および真菌細菌に対するワクチ ンとしてのその使用を含む。

７ｍｅｒペプチド、および上記の配列（１）〜（ｖｉ）に由来する対応する１７ ｍｅｒペプチドの配列は、以下の（ｉ′）〜（ｖｉ”　）にそれぞれ示される。

配列（ｉ）〜（ｖｉ）と同様に、７ｍｅｒ配列は、６個の配列の間の内部変化を 含み、そして当該ペプチドはさらに（ａｌＰＫ９９ＨまたはＰＫ３４Ｃ単３４Ｃ 単クローン抗 異的結合の不存在によって特徴づけられる。ペプチドの側面にジスルフィド連結 Ｃｙｓ基が、好ましくは７ｍｅｒのＮ末端のＤまたはＥ残基から１〜５個の残基 、および７ｍｅｒのＣ末端のＬｙｓまたはＡｓｎ残基から１〜２ｆａの残基の間 隔をあけて置かれ得る。

（　ｉ’　）　ＤＥＱＦ　Ｉ　ＰＫ、 （ｉｉ’　）ＤＥＱＦ　ＮＰＫ、 （ｉｉ’　）ＤＰＭＦＴＰＫ、 （ｉｖ’　）ＥＥＭＦ　ＩＰＫ、 （ｖ’　）ＤＡＫＦＲＰＮ．および （ｖｉ’　）ＤＮＫＹＬＰＫ。

それぞれの配列が由来する緑膿菌（Ｐ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の菌株は、（ ｉ’　）、ＰＫＡ；　（ｉｉ’　）、ＰＡＫ　（ＬｙｓからＡｒｇへの突然変異 ）；　（ｉｉ’　）、ＰＡＯ；（ｉｖ’　）　、ＣＤ４　；　（ｖ’　）　、　 ＫＢ７　；および（ｖｉ’　）、に１２２である。これらの［コアＪペプチドは 本明細書においてそれらの菌株の名称によって呼称される。例えば、配列（ｆ） を含むペプチドは本明細書においてはｒＰＡＫコアペプチドＪと呼ばれ、その際 、緑膿菌（Ｐ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　Ｋビリンタンパク質のＣ末端の、ジ スルフィド連結ペプチドを意味し、７のコア残基とさらに上に示した制約を有す る。

ＢＥＣｓおよびＴＥＣｓへのＰＡＫペプチド（還元形および酸化形の両方の）の 結合、および当該ペプチドの、ＴＥＣｓおよびＢＥＣｓへのビリンタンパク質の 結合を阻害する能力は、より早期に提出された、共に係属中の出願に記載されて いる。手短に言えば、ＢＥＣおよびＴＥＣの調製を例２に記載したように行った 。ＢＥＣｓへのＰＡＫペプチドの結合は、先ずＢＥＣｓを（ａｌ　Ｐ　Ａ　Ｋペ プチド、（ｂｌＰＫ９９Ｈマウス単クローン抗体（ＰＡＫペプチドに免疫特異的 に結合する）、および（Ｃ１酵素標識化したヤギ抗マウス抗体と連続的に接触さ せることによって行われた。ペプチド濃度の関数としてペプチド結合の量（測定 した酵素活性として表した）を、図３中で、還元（■）および酸化（＋）ペプチ ドについて示した。

ＴＥＣｓへのＰＡＫペプチドの結合も同様に示した。

ＢＥＣｓへのビリンタンパク質結合を阻害するＰＡＫペプチドの能力を、競合的 結合によって測定し、その際、ＢＥＣｓを先ず、還元形ＰＡＫペプチドと、一連 の増加する濃度の１つでインキュベーションし、次いでビリンタンパク質と、一 連の増加する濃度の１つでインキュベーションした。細胞に結合したビリンタン パク質の量は、細胞を、ＢＫ３Ｂマウス単クローン抗体（それは、ビリンタンパ ク質に対しで免疫特異的であるかしかしＰＡＫペプチドを認識しない）および酵 素標識化したヤギ抗マウス抗体と連続的に接触させ、次いで細胞に結合した酵素 活性を検定することによって測定された。結果を図４に、ラインウィーヴアーー プルクプロットとしてプロットし、それは、０　（Ｘ）、４０　（Ｍ）、８０　 （△）、および１２０（◇）ｎｍｏＩ　ｓ／ｍｌのペプチドでの、ビリ線毛タン パク質濃度の逆数の関数としてプロットした、測定された酵素活性の逆数を示し ている。当該ペプチドは、ＢＥＣｓへのピリンタンパク質結合の、濃度依存阻害 を引き起こすことがわかった。

■、抗ペプチド抗体 このセクションでは、本発明のペプチドと免疫反応性であるポリクローンおよび 単クローン抗体の製造方法、および抗体結合特性を概説する。抗体は、セクショ ンＶに詳述されているように、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンＣ 末端ペプチドと交差反応性であるランダム配列ペプチドの選択に有用であり、ま た、セクション■に詳述されているように、キメラ治療抗体を製造するのに有用 である。

ＩＩ［Ａ、ポリクローン抗体 ＰＡＫペプチドの還元および酸化形に対して特異的なポリクローン抗体を、より 早期に提出された共に係属中の出願に記載されているように、そして公表されて いるように（Ｌｅｅ）　、製造した。手短に言えば、ＰＡＫペプチドを、キーホ ールカサガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｉｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎ ｉｎ）（ＬＫＨ）に抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）シ、抱合体を、雌のＦｌｅｍｉ ｓｈラビットを免疫化するために使用した。ペプチドは、還元形（ＰＡ、に、、 、）および酸化形（ＰＡＫ、、）のＰＡＫペプチド、ならびにＮ末端のＣｙｓ残 基でＡｌａ置換基を持つＰＡＫ　（ＰＡＫＡ、、）を含む。ラビットに、最初の 免疫処置を施し、２週間後に、ブースター免疫処置を施し、次いで２週間後に採 血した。イムノグロブリン分画を、プロティンＡ親和クロマトグラフィーによっ て精製した。天然のＰＡＫビリンタンパク質、ＰＡＫペプチド、およびＰＡＯペ プチドに対する抗体結合を、標準ＥＬＩＳＡ手順（Ｗｏｒｏｂｅｃ）によって調 べた。抗体特異性は次の通りであった（ａｌ　Ｐ　Ａ　Ｋ　ａｔおよびＰＡＫ、 、、の両方によって産生された抗血清は、天然のＰＡＫビリ線毛に結合でき、力 価は、両方のペプチドに対して同様に上昇した；（ｂ）　Ｐ　Ａ　Ｋ、ヨベブチ ドに対して上昇した抗血清は、天然のＰＡＯビリ線毛と強く交差反応を示した。

（ＣＩＰＡＫ、、、ペプチド゛に対して上昇した抗血清は、天然のＰＡＯビリ線 毛と弱い交差反応のみを示した：および （ｄ）ＰＡＫＡ、、ペプチドに対して調製した抗血清は、Ｐ　Ａ　ＫまたはＰＡ Ｏピリ線毛線毛タンパク−ずれにも結合しなかった。

これらの結果は、ペプチドの酸化形および還元形のいずれも、同一種のピリンタ ンパク質と反応性である抗体を誘導するのに有効であるが、ペプチドの酸化（ジ スルフィド連結）形は、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の別の菌株から のピリンタンパク質と交差反応を示す抗体の同時産生に重要であることを示して いる。

ＢＥＣｓへのＰＡＫビリン結合を阻害するポリクローン抗体の能力を、例３に詳 述したように試験した。手短に言えば、ポリクローン抗体を、ＰＡＫペプチドに 対応するいくつかのペプチド領域に対して調製し、これらから、Ｆａｂフラグメ ントを調製した。Ｆａｂフラグメントの名称は、還元（ｒ）および酸化（０）形 のＰＡＫペプチド（ＰＡＫピリンタンパク質の１２８〜１４４残基）に対する（ “ｒｌ”、“ｒ２″）および（“０ビおよび“０２”）、２２〜３３残基（ＰＡ Ｋピリンタンパク質の）に対する“２２”、４１〜４９残基に対する“４ビ　、 ５８〜７０残基に対する“５８”　ニア５〜８４残基に対する“７５”、８９〜 ９９残基に対する“８９″、１０７〜１１６残基に対する“１０７”　；および １１７〜１２５残基に対する“１１７ｍである。“Ｐｒｅ”は、プレ免疫血清を さし、“９９Ｈ”は単クローン抗体ＰＫ９９Ｈをさす。Ｆａｂフラグメントを、 ＢＥＣｓの添加前に、ＰＡＫピリ線毛と共にブレインキュベーションし、ＢＥＣ ｓに結合したピリンタンパク質の量を、上述したように、マウス単クローン抗体 ＰＫ３Ｂ（それは、ビリ線毛タンパク質に対して特異的であるが、ＰＡＫペプチ ドに対しては特異的でない）および酵素連結したヤギ抗マウス抗体の連続的結合 によって検出した。結果は、プレ免疫抗体Ｆａｂフラグメントに関するビリ線毛 の阻害％として表して、図５の棒グラフに示している。

棒グラフは、ＰＡＫビリンのＣ末端以外の領域に対して産生されるＦａｂフラグ メントは、ＢＥＣｓへのピリン結合を阻害するのに効果がない。最も有効なフラ グメントは、残基１２８〜１４４に対して向けられているｒｌ、ｒ２、Ｏｌおよ びｏ２であり、ビリ線毛結合を、コントロールおよびプレ免疫血清の４０％〜７ ０％に減する。これは、このＣ末端領域に同様に向けられている抗ＰＡＫビリン 単クローン抗体ＰＫ９９Ｈ（以下に記載）から作られるＦａｂ９９Ｈによって示 される効果に似ている。

以下に示される単クローン抗体を用いた研究によって、ＴＥＣまたはＢＥＣ細胞 へのビリ線毛結合の抗体阻害が同様に、これらの細胞への緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒ ｕｇｉｎ。

Ｓａ）の結合を阻害することが確認される。

Ｉ［ＩＢ、単クローン抗体 天然のＰ　Ａ　Ｋビリ線毛タンパク質に対する単クローン抗体が、発明者（Ｄｏ ｉｇ）によってほかで記載された方法によって調製された。手短に言えば、ＢＡ ＬＢ／ｃマウスを、Ｐ　Ａ　Ｋピリ線毛の１週１回の注射で免疫化した。動物か らの牌繊細胞を、マウスハイブリドーマ細胞系Ｎ　Ｓ　Ｉ　ＣＩｒｖｉｎ）と融 合さ也好結果の融合を、抗ビリン抗体を分泌する能力についてＥＬＩＳＡ方法に よってスクリーニングした。ＰＡＫビリ線毛と免疫反応性の抗体を分泌する２６ ２ハイブリド−マクローンのライブラリーを得た。プロティンＡ精製Ｍａｂｓを 次いで、ピリンペプチドフラグメントに対してスクリーニングして（Ｄｏｉｇ） これらの抗体の特異性をめた。

４つのハイブリドーマ細胞系ＰＫ９９Ｈ，ＰＨ３４Ｃ，ＰＫ３Ｂ、およびＰＫ４ １Ｃを、さらに特異性の研究のために選択した。

精製したＰＡＫおよびＰＡＯビリ線毛のイムノプロットは、ＰＫ９９ＨおよびＰ Ｋ３Ｂ　ＭａｂｓがＰ　Ａ　Ｋピリンタンパク質に対して特異的であるが、ＰＫ ３４ＣおよびＰＫ４］ＣＭａｂｓは、ＰＡＫおよびＰＡＯピリンペプチドの両方 に免疫反応性であることを明らかにした。ＰＫ９９ＨおよびＰＫ３４ＣＭａｂＳ は共に、ＰＡＫビリンのＣ末端フラグメン）・と免疫反応性であった。

ＰＫ９９ＨおよびＰＫ３４Ｃから調製したＦａｂフラグメントを、例４Ｂに詳述 したように、ＢＥＣｓへの緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ビリ線毛結合 を阻害する能力について調へた。手短に言えば、ＰＫ９９Ｈ，ＰＫ３２Ｃ，およ び非免疫性■ｇＧのＦａｂフラグメントを、表１に示した濃度で、ＰＡＫビリ線 毛と共に、プレインキユヘーンヨンし、次いで、ＢＥＣｓを添加しさらに３７℃ で２時間インキュベーションした。ＢＥＣｓへの結合を、ＥＬＩＳＡ方法によっ て検出して、表１に示す結果を得た。

表１ Ｆ　ａ　ｌ）フラグメント　濃度８　（μｇ／ｒｎり　対照に対する％ＰＫ９９ ８　１００　５３．５±３３ ＰＫ９９Ｈ２００７，５±　０　６ ＰＫ３４Ｃ１００４４，５±０．　１ ＰＫ３４Ｃ２００４，５±０７ ＩｇＧ”　１００　９５．６±０．９ ＩｇＧ　２００　９４．９±２．２ ”　Ｆａｂフラグメントの最終濃度。使用したＰＫＡビリ線毛の最終濃度（よ、 ５ＰＫ９９ＨおよびＰＫ３４ＣＦａｂフラグメントは共に、ＢＥＣｓへのビｌ〕 線毛の結合を、濃度依存で阻害することがわかった。非免疫性１ｇＧ　Ｆａｂフ ラグメントは、ビリ線毛結合をわずかにだけ減少した。

ＢＥＣｓへの、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の多数の異なる菌株の結 合を阻止する、ＰＫ９９ＨおよびＰＫ３４ＣのＦａｂフラグメントの能力も調べ た。細菌菌株をまず、Ｆ　ａ、　ｂフラグメンと共にインキュベーションし、次 し）でＢＥＣｓと混合した。細胞への細菌の結合を、記載されているように行っ た（ＭｃＥａｒｃｈｒａｎ）。図６（よ、ＢＥＣｓへの緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕ ｇｉｎｏｓａ）のに結合の阻害を、抗体Ｆａｂ１度の関数として示す。Ｆａｂフ ラグメントを、単クローン抗体ＰＫ９９Ｈ（ロ）およびＰＫ３４Ｃ（△）から調 製した。両方の抗体フラグメント（よ、標的上皮細胞への緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒ ｕｇｉｎｏｓａ）の結合を阻害するのに有効であること力くわ力入る。

種々のシュードモナス菌株の結合に対するＰＫ９９Ｈ，ＰＫ３４Ｃ１およびＩＩ Ｅ免疫性の対照１ｇＧ　Ｆａｂフラグメンｌ−の効果を表２１こ示す。

表２ いて、Ｅｌ、ＩＳＡにより１０Ｉ′の力価を有していた。平均上標準偏差を示す 。対照に対する％は丸かっこの中１−示す。

ゝ正常の゛７ウスＩｇＧから調製さｔまた１ｍ、ｌあたり１００μｇのＦａｂフ ラグメントを添加し、た時の対照値 ゛有意な差（Ｐ＜０．０５）が、スヂューデントを検定によりめられた。

これらのデータは、ＰＫ９９Ｈ抗体が、菌株ＰＡＫ、ＨＤ！、および４９２ｃの 結合の結合阻害を引き起こすことを示している。ＰＫ３４Ｃ抗体は、対照的に、 ＰＡＫ／３を除いて、試験した菌株全ての結合の著しい阻害を引き起こす。これ らの結果は、ＰＫ３４Ｃ抗体が、ンユードモナス属菌株の中で、ＰＫ９９Ｈ抗体 より交差反応性であることを示唆している。これらのデータは、ＢＥＣｓへのシ ュードモナス属結合を阻害するのに有効な抗体が、ＢＥＣｓへのシュードモナス 属細菌の付着を阻害するのにも有効であることをも証明している。

■、細菌および真菌感染の阻害 上で説明したように、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のにビリンタンパ ク質のＣ末端の、ジスルフィド連結ペプチドに対して産生される抗体、例えば単 クローン抗体ＰＨ３４Ｃが、ＢＥＣｓへの種々のシュードモナス属菌株の結合を 阻止する抗体の能力によって証明されているように、種々の緑膿菌（Ｐ、　ａｅ ｒｕｇｉ口０Ｓａ）菌株からのビリンタンパク質と交差反応を示す。

本発明の一面によれば、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＣ末端の、ジ スルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体が、種々の細菌および真菌 微生物上の表面タンパク質と交差反応を示すことか見出された。細菌および真菌 タンパク質および／または細胞に結合する抗体を以下に示す。以下にも同様に示 される、ＢＥＣｓ・＼のカンジダアルヒカシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａ ｎｓ）結合を阻害する抗体の能力に関する付加的な研究は、このような結合が、 ＢＥＣｓのような標的上皮細胞への細胞結合を阻害するのに有効であることを証 明している。

本発明は、さらに、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ） ビリンタンパク質のＣ末端の、ジスルフィド連結ペプチド領域に対して産生され る抗体と抗原的に交差反応を示す表面タンパク質を有する細菌および真菌生物の 、標的上皮細胞への付着を阻止する方法を包含する。この方法は２緑Ｉｌ菌（Ｐ 、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＣ末端の、ジスルフィド連結ペプチド領域に対し て産生されるこのような抗体と細菌または真菌微生物を接触させて交差反応を示 す表面タ：ノバク質に結合することを含む。

この結合は、その後、標的上皮細胞、例えばＴＥＣｓおよびＢＥＣｓとの微生物 の結合を阻止するのに有効である。

抗体を産生ずるのに使用されるペプチドは、（ｉ）〜（ｖｉ）、（ｖｉ−ｘＬお よび（ｉ゛）〜（ｖｉ’　）としたペプチド群から選択されるペプチドを含む、 セクション■に記載したペプチドから選択するのが好ましい。あるいは、抗体を 産生ずるために使用されるペプチドは、セクションＶ中に記載されているように 、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）とのその交差反応性のために選びださ れたものである。

ポリクローンまたは単クローンのいずれかの抗体が、セクション■に概説されて いる方法のような標準方法によって産生され得る。この方法に有用な１つの抗体 は、セクション■に記載したＰＫ９９ＨまたはＰＫ３４Ｃ単クローツクローン抗 体治療目的のために、すなわち、抗体が非経口的に投与される場合、抗体は、マ ウスの単クローン抗体、例えば抗体ＰＫ９９ＨまたはＰＫ３４Ｃの、可変領域、 およびヒトのイムノグロブリン遺伝子の不変領域を含むキメラ抗体であるのが好 ましい。このようなキメラ抗体の調製に関する詳細は、以下のセクション■に示 す。あるいは、該抗体は、セクション■に記載したように、Ｃ末端の緑膿菌（Ｐ 。

ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ペプチドを用いた予防（ワクチン）接種によっても産生 し得る。

ＩＶＡ　モラクセラ・カタルハリス（ＩＪｏｒａｘｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａ ｌｉｓ）モラクセラ・カタルハリスは、ビリ線毛の２つの形態学的形状を引き起 こし、ヒトの呼吸肺胞細胞に結合する（Ｃａｒｒ）。引き起こされたビリ線毛の 少なくとも一方は、寒天侵食、単収縮自動運動性、およびＭ、　ｂｏν１ｓのビ リン遺伝子プローブでの探査に基づき、Ｎ−メチルフェニルアラニン（Ｎ−＾１ ｅＰｈｅ）ビリ線毛、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ。

緑ＩＮ菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、　Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｂｏｖｉｓ 、　Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｎｏｄｏｓｕｓ　、およびコレラ菌（Ｖｉｂｒｉ ｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）（Ｐａｒａｎｅｈｙｃｈ、　１９８８）によって引き起 こされるのと同一種類のビリ線毛であることが示唆さゎた（ＭａｒｒＳ）。

本発明を支持して行われた実験により、Ｍ、　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが、αお よびβビリ線毛と呼称される、ビリ線毛の２つの形態学的形状を引き起こすとい う、より早期の観察（Ｍａ、ｒｒｓ）か確認された。さらに本発明を支持する研 究は、１．２ｋｂのＨｉｎｄＤＩ緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　ＰＡ Ｋピリン遺伝子プローブは、合理的な説得力をもって、多数のＭ、　ｃａｔａｒ ｒｈａｌｉｓの臨床上の単離物（ｉｓｏｌａｔｅｓ）の制限エンドヌクレアーゼ フラグメントに交雑することを示した。さらに研究は、ラビットのポリクローン 抗シュードモナス属ＰＡＫビリ線毛抗血清（上のセクション■）が、イムノプロ ットにおいて、１８ｋＤタンパク質（図７中のレーン２）と特異的に反応するこ とを証明した。この１８ｋＤタンパク質は、β−ビリ線毛の構造的サブユニット を構成する。

β−ビリ線毛タイプは、Ｍ、　ｅａｔａｒｒｈａｌｉｓにおける毒性と大いに関 連しており、回想的疫学研究において毒性菌株中に高い頻度で見出される。１つ の研究において、集落化した患者および感染した患者の４３の臨床上の単離物の 中のα−およびβ−ビリ線毛タイプの分布は、α−ビリ線毛については、集落化 した患者および感染した患者においてそれぞれ６７％および８７％であり、β− ビリ線毛については、集落化したビリ線毛および感染したビリ線毛においてそれ ぞれ４２％および８１％であることを示した。例５に記載した免疫位置確認研究 は、ポリクローン抗ＰＡＯビリ線毛抗血清は、Ｍ、　ｅａｔａｒｒｈａｌｉｓの 表面および表面付属器に高い親和性で結合することを示している。

■Ｂ、　Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ屯クローン抗体Ｐ Ｋ９りＨは、イムノプロットに基づいて多数の単離物（オンタリオ州トロント所 在のＦａｃｕｌｔｙ　ｏｆ　Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏ ｆ　ＴｏｒｏｎｔｏのＤｒ。

Ｒ，Ｅｌ、Ｉｅｎから入手した）中のＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ（以前はＢａ ｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓと呼称されていた）　ｇｉｎｇｉν・ａｌｉｓ　４０　ｋ Ｄ細胞性タンパク質と交差反応することが見出された。手短に３えば、ＢＨＩ寒 天上の嫌気性ジャー中で嫌気的に培養したｐ、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓｕコロニ ーの全細胞性タンパク質を可溶化し、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、電気泳動 によりニトロセルローストに移し、そして、既に記載したように、単クローン抗 体ＰＫ９９ＨおよびＰＫ３４Ｃてイムノプロットした。図１０に示されるように 、弔離物に依り４０〜５０ｋＤのタンパク質に特異的に結合したＰＫ９９Ｈを観 察しこ。Ｗｅｓｔｅｒｎプロットに関する説明は以Ｆの通りである１、　Ｂａｃ ｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、　ＡＴＣＣ２５６１！２、Ｂａｃ ｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、ＮＴＣＣ９３３６３、Ｐｏｒｐｈ ｙｒｏｍｏｎａｓ　（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３８ １４　、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａ！ｉｓ　９−１４に−１ ５、８ａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ　２０／３０６ 、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　３３２７７？、　Ｂａ ｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｅｕｓ　ＶＰ［２３８１Ｐ、　 ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ以外の細菌との反応の欠損、およびＢ、　ｉｎｔｅｒｍｅ ｄｉｕｓ　ＮＴＣＣ９３３６どの弱い反応は、ＰＫ９９Ｈ抗体との反応性の欠損 よりむしろ、別の菌株による低いビリ線毛の発現のためてあり得る。

ＩＶＣカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）ＴＥＣｓ およびＢＥＣｓへのＣ，ａｌｂｉｃａｎｓの結合を、標的上皮細胞への真菌性細 胞の付着の阻害に関する研究において調べた。例６Ａで同定したいくつかのＣ。

ａｌｂｉｅａｎｓ菌株を使用した。ＢＥＣｓおよびＴＥＣｓは、それぞれ例６Ｂ および６Ｃに記載したように入手した。ＴＥＣｓおよびＢＥＣｓへのＣ，ａｌｂ ｉｃａｎｓ細胞の結合は、例６Ｄに記載したように、顕微鏡的方法によって示す ことができる。

図１１は、ＴＥＣｓ　（暗い細胞）に結合したＣ、　ａｌｂｉｃａｎｓ細胞（明 るい細胞）を示す位相顕微鏡写真である。ＢＥＣｓおよびＴＥＣｓへのＣ，ａｌ ｂｉｃａｎｓ細胞の定量的結合は、例６Ｅに詳述された付着アッセイによって同 様に証明された。

（：、　ａｌｂｉｃａｎｓ中の付着タンパク質は、酵母細胞の細胞表面上に表面 自己重合線毛を形成する線毛タンパク質である。線毛は、例６Ｆに詳述した単離 方法により、実質的に精製されｔ：形で得られた。ドデシル硫酸すｌ・リウムポ リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による精製された線毛の分 別により、図１２のレーン３における銀染色法により示された単一の６４ｋＤタ ンパク質が得られた。精製された線毛は、比色アッセイに基づいて約１５％（Ｗ ／Ｗ）のタンパク質および８５％の炭水化物（Ｗ／Ｗ）からなる。

ＢＥＣｓへのカンジダ属の付着を阻害する精製された線毛の能力を、例６Ｈに概 説したように、直接競合方法によって調へた。図１３中の棒グラフで示した結果 は、線毛の増加する濃度は、上皮細胞へのカンジダ属の結合の増大する阻害を引 き起こすことを示している。これらの知見は、標的上皮細胞への真菌細胞付着お けるカンジダ属の線毛タンパク質の役割と矛盾しない。

競合阻害についての同様の研究が、精製された緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏ ｓａ）　Ｋピリ線毛を用いて行われ、図１４の棒グラフに示される結果が得られ た。この結果から明らかなように、比較的高い濃度のＰＡＫビリンタンパク質は 、濃度に依存して、ＢＥＣｓへのカンジダ属の結合を阻害した。ＢＥＣｓへのシ ュードモナス属のビリンタンパク質の結合の、カンジダ属線毛タンパク質による 阻害を示す相互補完的研究の結果を、図１５に示す。

論じたばかりの阻害結果は、ビリ線毛によるシュードモナス属細胞および線毛に よるカンジダ属細胞の両方の付着が、ピリンまたは線毛タンパク質のいずれによ っても少なくとも部分的に阻止される共通の上皮細胞受容体で生じることを示唆 している。

これらの結果は、シュードモナス属、モラクセラ属、およびバクテロイデス科細 菌細胞からの表面タンパク質について上で得られた結果と同様に、シュードモナ ス属のＣ末端ビリ線毛ペプチドおよび細菌細胞タンパク質の間の抗原性エピトー プの維持を示唆している。この部位の維持は、Ｃ末端ピリンペプチド（ＰＫ９９ ＨおよびＰＫ３４ＣＭａｂｓ）に対して特異的な抗体および線毛タンパク質に対 して特異的な抗体に結合するためのピリンおよび線毛タンパク質に関する、相互 競合的ＥＬＩＳＡの研究によって証明されている。後者の抗体は、精製した線毛 に対して調製されるポリクローン抗体である。

結合方法の詳細は、例７Ａおよび７Ｂに示されている。手短に言えば、線毛また はピリンタンパク質を、固体支持体上で固定化する。競合者（ｃｏｍｐｅｔｉｔ ｏｒ）抗原および抗体を一緒に混合し、次いて固体支持体に、競合者の不存在下 で、固定化抗原の約５０％が抗体に結合するであろうような抗体濃度で加える。

固体支持体に実際に結合した抗体の量は、標準ＥＬＩＳＡ方法によってめた。研 究の結果を以下の表３に示す。２つの異なる抗原に対する３つの抗体のそれぞれ の、同様の結合親和性値は、２つの抗原の間のエピトープ部位の強い維持を示唆 している。

表３ 線毛　線毛　ビリ線毛　ビリ線毛 競合者　線毛　ビリ線毛　線毛　ビリ線毛ＰＫ９９Ｈ１，２１ＸＩＯ’　２．０ ４ＸＩＯ”　１．８４刈０”　３．ＯＸＩＯ’ＰＫ３４Ｃ１゜５０ＸＩＯ’　３ ．１６Ｘ１０”　２．８２ＸｌＯ”　３゜８　ＸＩＯ”抗線毛　４．７４ｘｌＯ ’　２．５０刈０’　１．２４刈０２３．９　ＸＩＯ’関連した研究において、 酸化または還元形のＰＡＫペプチドに対して調製したラビットのポリクローン抗 体を、線毛タンパク質およびピリ線毛タンノくり質に対する結合親和性について 調べた。抗体を、固定化抗原、ピリンまたは線毛タンノ々り質のいずれかに、表 ４の左に示す４つの抗体希釈度の１つで添加した。支持体に結合した抗体の量を 、上記ＥＬＩＳＡ方法によってアッセイし、結果を表４に示した。Ｃ末端のジス ルフィド連結ビリ線毛タンパク質に対する、それぞれのポリクローン抗体は、ピ リンおよび線毛タンパク質の両方に対する高い親和性を示し、再度２つのタンパ ク質の間のエピトープの高い維持を証明した。

表４ 抗酸化抗体　抗還元抗体 固定化抗原 希釈度　線毛　ビリ線毛　線毛　ビリ線毛１０−’　＞２．　０”　＞２．　Ｑ 　＞２．　Ｑ　＞２．　Ｑ１０−２＞２．０　＞２．０　＞２．０　＞２．０１ ．０”　０．４５０　、＞２．０　０．５９８　＞２．０１０−’　０．　４３ ０　０．　４９６　０．　４８０　１．　２８１、これらの値は、ＥＬＩＳＡ、 、。、値である。

Ｃ，ａｌｂｉｃａｎｓの種々の菌株と交差反応する単クローン抗体ＰＫ９９Ｈお よびＰＫ３４Ｃの能力を、例７Ｃに記載の方法によって、ドツトプロ・ソテイン グによって調へた。手短に言うと、選択したカンジダ属菌株の細胞をニトロセル ロースフィルター上に固定化し、ＰＫ９９ＨまたはＰＫ３４Ｃ抗体、およびアル カリ性ホスファターゼに抱合したヤギの抗マウス抗体に連続的にさらした。結合 した抗体の量を、ニトロブルーテトラゾ１功ム基質の色の変化によって測定した 。測定さオ］た抗体レヘルを以下の表５に示す。これらの結果から、カンジダ属 菌株全ては、２一つの抗ビリ線毛抗体と高い免疫反応性であったことは明らかで ある。

表５ カンジダ属菌株Ｎα　ＰＫ９９ＨＰＫ３４Ｃ３５ＸＩＯ’　１０” ６　５ＸＩＯ’　１０＠ ＋２　５ＸＩＯ”　１０＠ １３　５ｘｌＯ’　１０’ ＋４　５Ｘ１．０’　１０’ １９　５Ｘ１．Ｏ’　１．０２ ＃Ｉ０　１０”　１０’ ＃３０　５Ｘ１０’　１０″ ＰＫ９９Ｈ１ＰＫ３４Ｃの免疫特異的結合、お１よびポリクローンの抗線毛抗体 の免疫特異的結合を、カンジダ属細胞への抗体結合の後、間接的な免疫蛍光によ −）で同様に証明［−５た。

ツユ−トモナス属ビリ線毛およびカンジダ属線毛のための、明白な共通の結合受 容体および２つのタンパク質の間のエビド−ムの維持は、抗ンユー用・モナス属 抗体か標的上皮細胞への真菌性細胞の結合を阻止するのに有効であろうことを示 唆している。この効果は、実際、ＰＫ、３４ＣおよびＰＫ９９Ｈ抗体て観察さ１ １た。

図１６は、示された抗体に真菌性細胞を最初にさらした後のＢＥＣｓへのカンジ ダ属結合の阻害％を示している。阻害方法の詳細を例７Ｄに示す。存意な阻害が 、シュートモナス属ビリンタンパク質のＣ末端配列に対して特異的な両方の抗体 で見られた。

前述したことから、種々の細菌および真菌細胞が、本発明のシュードモナス属の Ｃ末端ビリ線毛ペプチドに対して調製された抗体と免疫反応性である表面タンパ ク質を有することがわかるてあろう。標的上皮細胞へのこれらの細胞の結合が、 Ｃ末端のビリ線毛ペプチドに対して調製された抗体によって阻害されるので、こ のような抗体および、それを産生させるためのワクチンは、交差反応性の微生物 による感染を予防しそして治療するために使用できる。

このような治療に応答する細菌および真菌は、上述した方法によって、例えば、 シュードモナス属ビリ線毛のＣ末端ペプチドに対して調製された抗体の、該微生 物への結合を示すことによって、または単離された、該抗体への付着物の交差反 応性を示すことによって容易に同定され得る。

■、シランム配列抗原 上記研究は、本発明のＣ末端のビリ線毛ペプチドに対して産生される抗体が、ツ ユ−トモナス属ビリ線毛中に存在するエピトープおよび無関係な細菌および真菌 微生物中に存在する表面タンパク質に対して特異的であることが証明される。

この知見は、本発明の別の面に従って、種々の表面タンパク質に共通なエピトー プを含む、一般化されたランダム配列ペプチドを調製するために利用できる。こ のような一般化されたペプチドは、共通のエピトープに対する抗体を誘発するた めのくセクション■）、キメラ抗体を調製するための（セクション■）、および ペプチドエーロゾル治療方法において治療に使用するための（セクション■）ワ クチ゛／絹成物中で使用される。

選択されたエピトープ部位を有する、一般化されたランダム配列ペプチドを引き 起こしそして同定する方法が最近轄告された（Ｓｃｏｔｔ：　Ｃｗｉｒｌａ）。

両方の研究は、長さか５〜１０残基のランダム配列ペプチドを含むランダム配列 ペプチドの大きい集団を、受容体分子に関して、選択された結合活性を有するペ プチドの存在について、選択された抗体（または別の受容体）・＼の免疫特異的 結合によって首尾よくスクリーニングできることを証明している。この方法は、 従って、緑膿菌（Ｐ。

ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）および共通の免疫反応性部位を有する別の微生物種に対 する免疫性の発生のための代わりのイムノゲンであることが予測される新規配列 を引き起こし同定するのに作動である。

例８は、ランダム配列ペプチドが調製されそして本発明によるイムノゲンとして の存用性について選択されうる方法を記載している。好ましい方法において、約 １０７〜１０”の新規へブタペプチドが、ベクターとして、繊維状ファージｆＵ ＳＥ５を用いて、エピトープライブラリーの構成を通じて引き起こされる。別の 繊維状ファージベクターは、このようなライブラリーを引き起こす際に同様に作 動であると考えられる。あるいは、類似のエピトープライブラリーが、細菌発現 系中または機械的に引き起こされたペプチド系中で引き起こされ得る（Ｇｅｙｓ ｏｎら、　ＣＩＢＡ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｓｙｍｐ、１１９：　１３１−１ ４９）。

図１７は、ｆＵＳＥ５繊維状ファージエピトープライブラリーを引き起こしそし てスクリーニングすることを必要とする、一連の工程を図式的に示している。

手短に言えば、ｆＵｓＥ５　ＲＦ　ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ５ｆｉｌで 消化させて前述のＤＮＡの挿入のための挿入部位をつくり出す。合成（１５＋３ ｍ）塩基対（ｂｐ）Ｂｇｌ　Ｉ　ＤＮＡフラグメントが調製され、それは、（Ｎ ＮＫ）、−ＮはＡ、Ｇ、Ｃ１またはＴを表し：Ｉ＜はＧまたはＴを表し、モして ｍは２から１５の間を変動し得るーの形の縮退配列を含む。本発明の好ましい実 施態様において、ｍは５からＩＯの間、典型的には６〜７の間を変動し得、そし て塩基は、単独付加の場合に、テンプレートブライマーにランダムに添加される 。２０のアミノ酸についてコード化するコドンのランダム添加を行う代わりの方 法は、各アミノ酸を表すトリヌクレオチドコドンをテンプレートブライマーにラ ンダムに付けることである。

クローン化ベクターへの挿入物連結に続いて、繊維状ファージベクターの増幅か 、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞のトランスフェクションによって行われる。好 結果のトランスフェクションが、ベクター由来のマーカーの存在によって測定さ れる。

本発明の好適な実施態様において、このマーカーはテトラサイクリン抵抗性であ る。組換えファージを次いで細菌細胞から単離する。ファージを運ぶ重要な配列 を、ファージを重要な抗体、例えばＰＫ３４ＣまたはＰＫ９９と共にインキュベ ーションする抗体パンニング方法によって単離する。ビオチニル化した（ｂｉｏ ｔｉｎｙｆａｔｅｄ）第二の抗体（ヤギの抗マウス］’ｇＧ）を次いで添加し、 そしてビオチニル化ト化した第二の抗体、抗体ＰＫ３４ＣまたはＰＫ９９Ｈ，お よびファージを運ぶ免疫反応性ペプチドを含む複合体を、未反応抗体およびファ ージから、ストレプトアビジンで被覆したプレート上での付着によって分離する 。ファージを運ぶ免疫反応性配列を溶出した後、対応するＤＮＡコード化配列を 決定する。

選択したエピトープペプチドに対応するコード化配列を、慣用のペプチド合成方 法を用いて利用してエピトープペプチドを調製する。このことは、例１に記載し たように、固相合成、または、既知の方法による組換えペプチド発現を包含し得 る。

繊維状ファージ融合タンパク質ｐＩＩＩ中に存在する外来のＤＮＡ配列は、免疫 反応性ペプチドの配列を決定する。この方法により免疫反応性であると見出され たペプチドを次いで、標準ペプチド合成方法により合成しそして適当なペプチド キャリヤーに抱合することによってイムノゲンとして調製する。

■、ワクチン組成物 本発明には、Ｃ末端のシュードモナス属ピリ線毛ペプチドおよび、該ペプチドが 結合している免疫原性ペプチドキャリヤーを含むワクチン組成物も含まれる。

当該組成物は、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ビリンタンパク質のＣ末 端の、ジスルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体と抗原的に交差反 応を示す表面タンパク質を有する細菌および真菌生物による感染に対するワクチ ンとして使用される。

１つの実施態様において、該ペプチドは、配列（ｉ）〜（ｖｉ）の間および配列 （ｖｉ）〜（Ｘ）の間で内部に一致する、アミノ酸変化を含む次の配列。

（ｉ）ＫＣＴＳＤＱＤＥＱＦＩＰＫＧＣ３Ｋ、（ｉｉ）ＫＣＴＳＤＱＤＥＱＦＴ ＰＫＧＣ３Ｒ１（ｉｉ）ＡＣＫＳＴＱＤＰＭＦＴＰＫＧＣＤＮ。

（ｉｖ）ＴＣＴＳＴＱＥＥＭＦ　Ｉ　ＰＫＧＣＮＫＰ、（ｖ）ＳＣＡ、ＴＴＶＤ ＡＫＦＲＰＮＧＣＴＤ、（ｖｉ）ＡＣＴＳＮＡＤＮＫＹＬＰＫＴＣＱＴＡＴＴＴ ＴＰ。

（ｖｉ）ＮＣＫ　ＩＴＫＴＰＴＡＷＫＰＮＹＡＰＡＮＣＰＫＳ。

（ｖｉ）ＴＣＧ　ＩＰＧＳＰＴＮＷＫＡＮＹＡＰＡＮＣＰＫＳ。

（ｉｘ）ＴＣＧＴＴＧＳＰＴＮＷＫＴＮＹＡＰＡＮＣＰＫＳ、および（ｘ）ＧＣ ３ｌ５ＳＴＰＡＮＷＫＰＮＹＡＰＳＮＣＰＫＳを包含する。当該ペプチドはさら に、 （ａ）Ｃｙｓ　（Ｃ）残基の間のジスルフィド連結および（ｂ）ＰＫ９９Ｈまた はＰＫ３４Ｃ単クローツクローン抗体特異的結合によって特徴つけられる。

別の実施態様において、該ペプチドは、配列（ｉ゛）〜（ｖｉ’　）の間に内部 で一致する、アミ、／酸受化を含む次の配列：（ｉ’　）ＤＥＱＦ　ＩＰＫ、 （ｉｉ’　）ＤＥＱＦ　ＴＰＫ、 （ｉｉ’　）ＤＰＭＦＴＰＫ。

（ｉｖ’　）ＥＥＭＦＩＰＫ、 （ｖ’　）ＤＡＫＦＲＰＮ、および （ｖｉ’　）ＤＮＫＹＬＰＫ を包含する。当該ペプチドはさらに、 （ａ）ＰＫ９９ＨまたはＰＫ３４Ｃ単クローツクローン抗体特異的結合（ｂ）ヒ トの頬またはヒトの気管上皮細胞への特異的結合：および（ｃ）緑膿菌（Ｐ、　 ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のビリ線毛付着への特異的結合の不存在によって特徴づ けられる。

特に任用な免疫原性キャリヤーは、キー、トールカザガイヘモシアニン（ＫＬＨ ）、破傷風前、ポリ−Ｌ−（ＬＹＳ　：ＧＬＵ）、ビーナツツ凝集素、ポリーＤ −リジン、ジフテリア毒、オボアルブミン、大豆凝集素、ウシ血清アルブミン（ ＢＳＡ）　、ヒト血清アルブミンなどを包含する。

当該ペプチドは、化学誘導体化を含む種々の公知の方法により、または標準遺伝 子工学技術（例えばＡｕ５ｕｂｅｌ）によりキャリヤーに抱合され得る。

本発明のワクチンおよび接種材料は、注射により通常筋肉内にまたは皮下に、腸 溶カプセルまたは錠剤により経口で、座薬として、鼻スプレーとして、また投与 の別の適当な経路により、投与され得る。ヒトの患者のためには、ポリペプチド の適当な薬用量は、部分的には、選択した投与経路および多数の別のファクター によって決まる。これらのファクタの中には、免疫化すべき被験者の体重、使用 キャリヤー、使用補助剤、および使用が所望される接種数が含まれる。

ヒトの患者のための個々の接種は、一般的には、ポリペプチドが連結され得る任 意のキャリヤーを除いて、約１０ミリグラム〜約１００ミリグラムのポリペプチ ド単位用量を含む。所望であれば、一連の薬用量が、最適の免疫性のためにある 時間にわたって投与され得る。場合により上記量のポリペプチドを含む、ワクチ ンの単位用量形も提供され得る。

■、キメラ抗体 本発明は、好ましくは上記のマウスの単クローン抗体ＰＫ９９ＨまたはＰＫ３４ Ｃの可変領域から由来する、緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンタン パク質のＣ末端領域について免疫特異的な可変（抗原反応性）領域、およびヒト の免疫グロブリンネ変領域からの不変抗体領域を有するキメラ抗体を同様に意図 している。ここに記載したキメラ抗体はＩｇＧ抗体であるが、ＩｇＭ抗体のよう な別のイムノグロブリンタイプも適していると認識されている。

２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなるＩｇＧ類の抗体分子は、示し たように、ジスルフィド結合によって一緒に連結している。図１８に示されてい るように、抗体分子の可変領域は、重鎮および軽鎖ポリペプチド（Ｖ、およびＶ Ｌ）の両方の一部からなる。同様に当該分子の不変領域は、重鎮および軽鎖ポリ ペプチド（Ｃ□およびＣＬ）の両方の一部からなる。それ故、マウスの単クロー ン抗体に由来する可変領域およびヒｌ−１ｇＧに由来する不変領域を含むキメラ 分子を構成するためには、ポリペプチドの適当な部分についてコード化する部分 的遺伝子を、ポリペプチドの発現の前に連結しなければならない。

組換え方法によるキメラのマウス−ヒト抗体の構成方法は、当該技術において公 知である（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ＋　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）。適当な発現系は、当該 技術に公知の原核生物および真核生物発現系を含むが、それらに限定されない。

発現系は昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）系であるの が好ましく、それを組換えバキュロウイルスベクターで感染する。同様に、キメ ラ抗体のポリペプチド鎖についてコード化する組換えＤＮＡ配列は別のベクター −それは次いで細胞中にコートランスフエクショ：ノされる−に挿入され得、ま たは、同一発現ベクター中に挿入し得ることが理解されるであろう。組換えＤＮ Ａ配列を、共発現バキュロウィルス由来のベクター　（ｐＡＣＶＣ３）−それは 、挿入した遺伝子配列を転写する反対方向の２つのポリヘトリン（ｐｏｌｙｈｅ ｄｒｉｎ）プロモーターを含むｍ−中に続いて挿入するのが好ましい。

図１８は、説明したバキュロウィルス発現系における使用に適した好ましい構成 を図解している。図に示したように、適当なハイブリドーマ細胞系、例えば細胞 系ＰＫ３４ＧまたはＰＫ９９Ｃから単離したｍＲＮＡを、重要な可変領域の側面 にある３゛プライマー〜不変領域と共にインキュベーションしそして逆転写酵素 と共にインキュベーションする。複製連鎖反応（ＰＣＲ）による遺伝子増幅を、 側面にある不変領域から選択される５′プライマーを用いて行う。マウスの重鎖 （ｖ８）の可変領域のための適当なプライマーを含むこの手順は５ａｓｔｒｙら によって開示されている。

ＶＨについてコート化する遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよび Ｓａｃ■により消化してＢａｍＨＩ／Ｓａｃ　Ｉ　（５°−３′）フラグメント を調製するのが好ましい。同様の手順を実施してマウスＶ、領域についてコード 化する遺伝子フラグメントを得、それを好ましくは制限エンドヌクレアーゼ旦見 更Ｈ１およびＨｉｎｄｌＴＩて消化して旦ａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ　Ｔ　Ｉ　Ｉ　（ ５°　−３°）フラグメントを調製する。

重鎮および軽鎖の不変領域（それぞれＣ１ｌおよびＣ−についてコード化する遺 伝子のフラグメントは同様に当該技術において公知の方法（Ｒａｂｂｉ　ｔ　ｔ ｓ）によって得られる。ＣＩＩを含む遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼＨｊｎ ｄＴＩＩおよびＢａ、ｍＨｉによって消化してＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｒｎＨ Ｉ　（５’　−３’　）フラグメントを調製するのか好ましい。Ｃ１，を含む遺 伝子を、ＨｉｎｄｌｌｌおよびＢａｒｎＨＸによって消化してＨｉｎｄｌｌｌ− ＢａｍＨＩ　（５°−３’）７ラグメントを調製するのが好ましい。

キメラ重鎖についてコード化する遺伝子は、次いで、Ｖｏについてコード化する ＢａｒｎＨＴ−３ａｃ　ｌＤＮＡフラグメントを、ヒトのＩｇＧ１または１ｇＧ ２のＨｉｎｄ　Ｉ　Ｔ　１部位に連結することによって構成される（Ｂｏｕ　ｌ 　１ａｎｎｅら（Ｎａｔｕｒｅ３１２：　６４３−６４６；　１９８４）；　Ｍ ｏｒｒｉｓｏｎら（ＰＮＡＳ　８１：　６８５１−６８５５；　１９８４））。

得られる組換えＤＮＡ５を次いで、引き続いて共発現バキュロウィルスベクター ｐＡＣＶＣ３に挿入するのが好ましい。まずキメラ重鎖（Ｖ□−Ｃ，）についせ る（Ｐｕｔｌｉｔｚら）。分泌された抗体の結合能力を、記載したようにＥＩｊ ＳＡによって分析する。

本発明により調製されるキメラ抗体は、抗体の非経口投与により、シュードモナ スおよび交差反応性感染作用因子の哺乳動物の感染の治療または予防に有用であ る。

■、ペプチド治療 投与の１つの好ましい方法において、本発明のペプチドは、ペプチドを含む粉末 または噴霧溶液の鼻吸入によって送達される。この投与方法は、ペプチドの送達 が肺の粘膜上皮表面に直接なされるという利点を存する。

本発明のペプチドのさらに別の使用は、肺の上皮細胞への薬物送達のための標的 分子としてである。当該ペプチドは肺の上皮細胞に特異的に結合するので、それ らは肺に関連する病理学的状態における治療アジュバントとして有用であると解 される。１つのこのような状態は肺の癌腫である。１つの好ましい使用において 、本発明のペプチドを、肺の癌腫の治療に有用である光活性化できる化学療法剤 に抱合する。薬物−ペプチド抱合体を次いで、鼻吸入によって投与し、該薬物を 、気管支鏡により送達される高強度の光によって活性化する。

以下の例により、本発明のベプチおよび抗体の調製方法および用途を説明する。

これらの例により本発明の詳細な説明するがそれを限定しない。

この例で使用される略語はＢＯＣ，第三ブトキンカルボニル、ＤＣＭ、ジクロロ メタン：ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸：およびＢＯＣ−ＡＡ−ＯＨＳＢＯＣ基によ りα−アミノ基で保護されているアミノ酸である。

ポリペプチド合成のための市販のフェニルアセトアミドメチル樹脂はＡｐｐｌｉ ｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ）から 入手した。ＢＯＣ−ＡＡ−０■（は、Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ａｒｍａｎｄ　Ｆｒ ａｐｐｉｅｒ（カナダ国、ケベック州、Ｌａｖａｌ）から入手した。

残基上の側鎖保護基は次のものである。チロシンのためのｏ　−（ｐ−ブロモベ ゛）Ｉイルオキソカルボニル）、トレオニン、セリン、アスパラギン酸およびグ ルタミン・酸のための０−ベンジル、システィンのためのＳ−メトキシベンジル ンおよびホルミルトリプトファンのための２−クロロベンゾイルオキシカルボニ ル。

Ａ６固相合成 上記固相方法によるこの発明の合成ポリペプチドの製造の際に、アミノ酸残基を 、カルボニル末端残基からエステル結合により樹脂（固相）に連結する。

反応性アミノ酸側鎖は、ポリペプチドの合成の間に同様に保護される。力・ノブ リ〉・グは一般に、最初のＮ−末端アミノ酸のミリ当量数に対して、２倍モル過 剰の保護されたアミノ酸および１当量のシンクロへキシルカルボジイミドを用い て行わｔする。アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）のために、２モル当 量のＮ−ヒドロキソ−ヘンシトリアゾールおよびジシクロへキシルカルボジイミ ドを使用した。カップリング反応を、Ｓａｒｉｎ（　１９８１　）の二〉ヒドリ ン試験により監視し、それは−４９に９９％より高く完了する。

Ｂ　ペプチドの酸化および精製 当該ペプチドを樹脂から開裂し続いて環化してシスルフイＦ結合を形成する。

ペブチｉ・の開裂および側鎖保護基の完全な除去は、無水フッ化水素を用いて行 オ〕第１る。当該樹脂を、フッ化水素およびアニソール（９　：　Ｉ，ｖ／ｖ） を含む，昆合物に懸濁させて反応を５°Ｃで４５分間減圧下に進行させる。フッ 化水素を次いて蒸発させる。樹脂を除去してエーテル（３ｘｌＯｍｌ）で洗浄し 、該ペプチドを３０％酢酸（３ＸｌＯｍｌ）で抽出する。合わせた濾液を希釈し て５％の酢酸水溶液としそして凍結乾燥する。

粗製ペプチドは、浅い勾配を用いて分析用の逆相１（ＰＬＣカラム（２５０ｘ４ 。

６ｍｍ内径）で精製することができる。粗製ペプチドを可能な最小容積の出発緩 衝液（約５ｍｌ）中に溶解した。非常に濃縮されたペプチドを遠心分離して未溶 解材料を沈降させた。分析試料、５〜ｌＯμｌを線状勾配を用いてクロマトグラ フィーで分離して（溶剤Ａは０．０５％濃度の水性ＴＦＡであり溶剤Ｂはアセト ニトリル中０．０５％濃度のＴＦＡである。）存在するペプチドの全量を測定し た。粗製ペプチドが、分析用流れ（１％８７分　勾配速度）の中で重要なペプチ ドに近ルＡ保持時間を有する親水性および疎水性不純物を含んでいた時、流速１ ｍ１／分での０　２％Ｂ／分の浅い勾配を用いた。

３０〜５０ｍｇの全貯蔵溶液をカラム上に注入して流れを２１０ｎｍで監視した 。ワラクン３ン（１ｍｌ）を集めて分析した。第３または第４フラクソヨン毎に 分析して重要なピークを持ったクロマトグラムに関する領域を同定した。次いて この領域中のフラクションのさらに別の分析を行った。各法れのクロマトグラム を、精製前の最初の分析用流れと比較して重要なピークを確認することができた 。この方法において、重要なフラクションを集めて凍結乾燥すると同時に、隣接 ピークの肩を除去した。乾燥したペプチドを乾燥語中のガラスバイアル中に貯蔵 しｔ二。

重量分析およびＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃ分析を用いてＰＡＫペプチド構造を確認した。

八　頬の上皮細胞（ＢＥＣ）の調製 ＢＥＣｓを、健庸な喫煙していない男性のボランティアから、木製アプリケータ ー捧で頬の内側を穏やかに擦って集め、その際頬ごとに３本の木製アプリケータ ー捧を用いｔ二。これらの棒を３０ｍＬのリン酸緩衝食塩水中で一緒に優しく擦 ）でＢＥ　Ｃ　ｓを懸濁させた。これらの細胞を、連続遠心分離（６５０ｘｇ） によリ３０ｍＬリン酸緩衝食塩水で３回洗浄して再懸濁させた。最終ベレットを ｐＨ７，２の５ｍＬリン酸緩衝食塩水中で懸濁した。この懸濁液をろ過しく予め 湿らせた７０μｍナイロンメツシュ）、細胞を希釈して、ｐＨ７，２のリン酸緩 衝食塩水中２ＸｌＯ’細胞／ｍＬの最終濃度にした。この懸濁液を使用のための 準備まで４°Ｃて貯蔵した。

Ｂ、気管上皮細胞の調製 ヒトの繊毛のある気管上皮細胞（ＴＥＣｓ）を、Ｔｏｒｏｎｔｏ　Ｇｅｎｅｒａ ｌ　）ｌｏｓｐｉｔａｌのＳｕｒｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ　Ｃａｒｅ　 ｓ、＝ットの患者から、Ｆｒａｎｋｌｉｎらによって記載されたような（１９８ ７）、気管支粘膜の気管支鏡ブラッシングによって得た。ＴＥＣｓを、手術を要 する患者（一般的な麻酔剤の下で）、挿管した集中治療室（ＩＣＵ）の患者、お よび健康なボランティアから気管支鏡法によって得た。手術を要する患者および ＩＣＵ患者のために、気管支鏡法は、気管内挿入管を通じて挿入されたたわみや すいＯｌｙｍｐｕｓ　Ｔｙｐｅ　２　ＢＦ気管支鏡を用いて行った。細胞学ブラ シを用いて、気管−気管支粘膜を剥離し、そしてＴＥＣｓを、１％（Ｗ／Ｖ）の クエン酸ナトリウムを含む高グルコースＤｕｌｂｅｅｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地中 に集めた。

気管支鏡検査法により得られた細胞懸濁液は、種々の量の粘液、赤血球、顆粒球 、および細胞破片に加えて繊毛のあるまたは繊毛のない立方上皮および円柱上皮 細胞を含んでおり、付着アッセイにおいて直接使用するのに適当でなかった。

細胞懸濁液を短時間、渦巻き状にし、続いて７０〜３０ミクロンの気孔径のメツ シュナイロンスクリーンを通し、１０ｍ１の０．０１Ｍリン酸緩衝食塩水（ｐＨ ７，２）（ＰＢＳ）で２回（５００Ｘｇ、４℃で１５分間）洗浄し次いで１ｍｌ のＰＢＳ中に再懸濁させる。次いて細胞懸濁液を、ＰＢＳで前もって形成した（ ４８，０００Ｘｇ、４°Ｃて４０分間）６５％（容積／容積）の浸透勾配（ｐｅ ｒｃ。

Ｉ）　ｇｒａｄｉｅｎ＋月二で密度勾配遠心分離（５００Ｘｇ、４℃で１５分間 、揺れパケットローター中）により分別した。

ＴＥＣ帯域を集めて第二の浸透勾配に適用した。繊毛のあるＴＥＣ帯域を第二勾 配から集め、細胞をＰＢＳ中で一度洗浄し次いてＰＢＳｌ、５ｍｌ中で再懸濁さ せた。直接細胞計数を、血球計数器を用いて行った：細胞生育能力を、トリパン 青染料排除によってめた。細胞分別方法は一般に（２０８±０．３４）Ｘ１０６ 細胞（平均ｔＷ準誤差）を生じ、その中３２．８±６．５％が繊毛のあるＴＥＣ ｓであった。これらの細胞の大多数は生育可能であり、多くの場合、繊毛は未だ 繊毛打を繰り返していた。分別したＴＥＣｓは、上皮細胞のみ含み、実質的に汚 染粘液を含まず、直接付着アッセイに使用された。

Ａ、Ｆａｂフラグメントの調製 ポリクローン抗体を、ＰＡＫビリンタンパク質の次のペプチド領域に対して調製 した・天然Ｐ　Ａ　Ｋビリンタンパク質の残基１２８〜１４４からなる還元した （ｒ）または酸化した（ｏ）ＰＡＫペプチドに対する“ｒｌ、”ｒ２．”Ｏビお よび“ｏ２”、残基４１〜４９に対する“４ビ、残基５８〜７ｏに対する“５８ ”、残基７５〜８４に対する“７５”、残基８９〜９９に対する“８９”、残基 １０７〜１１６に対する“１０７”　；および残基１１７〜１２５に対する“１ １７”。“Ｐｒｅ“はブレ免疫血清を、そして“９９Ｈ”は単クローン抗体ＰＫ ９９Ｈのことである。

各ペプチド抗原に由来する上記ポリクローン血清のＦａｂフラグメントは、固定 化パパインを用いて調製した（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｒ ｏｃｋｆｏｒｄ、　ｒＬ）　ｏ手短に言えば、アフィニティー精製したポリクロ ーン抗体を、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，２中で２０ｍＭシスティ ンＨＣＩ、１．ＯｍＭエチレンジアミン四酊酸（ＥＤＴＡ）四ナトリウムに対し て透析した。抗体（約２ｍｇの抗体を含む１ｍ１）を０．５ｍｌの固定化パパイ ンに添加してｉ５ｏｒｐｍで振とうしなから３７°Ｃて２０時間インキュベーシ ョンした。固定化パパインを遠心分離により除去し、Ｆａｂフラグメントを含む 上清を１ｍｌのＰＢＳで希釈した。

Ｆａｂフラグメントを、ＰＢＳて溶出したプロティンＧカラムを用いてＨＰＬＣ により精製した。Ｆａｂフラグメントを、フロースルー（ｆ　Ｉｏｗｔｈｒｏｕ ｇｈ）中に集め、Ｆｃフラグメントを、１０ｍＭグリシンＩ）８２．７５を用い てカラムから溶出した。Ｆａｂフラグメントを、透析チューブ中にＦａｂ流出液 を入れ（８０００未満の分子量のカット才力、ポリエチレングリコールを用いて 透析袋から液体を抽出する（分子量１５，０００〜２０，０００）ことによって 濃縮した。次いでフラグメントをＰＢＳに対して透析した。Ｆａｂフラグメント の活性を、ＥＩ、ＩＳＡによりチェックし、Ｆａｂフラグメントの調製を、５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥにより確認した。

Ｂ、ＦａｂフラグメントによるＢＥＣｓへのＰＡＫビリン結合の阻害ＰＡＫビリ ンタンパク質を、公表された方法（Ｐａｒａｎｃｈｙｃｈら、　１９７９）に従 って単離した。上述したように調製したＦａｂフラグメントを、ＢＥＣｓの添加 前にＰ　Ａ　Ｋビリ線毛と共にプレインキュベーションしく　＋、　Ｘ　ｌ　０ ５細胞／ｍＬの最終濃度）、ビリ線毛結合を単クローン抗体ＰＫ３８Ｂを用いて 検出した（それはビリンタンパク質に対して特異的であるが、Ｐ　Ａ　Ｋペプチ ドに対しては特異的でない）。全てのＦａｂｓを希釈して、ＰＡＫビリ線毛に対 するＥＬＩＳＡによって測定される最終力価を１Ｏ−３とした。

興よ りＥＣ８への緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびピリ線毛結合の単ク ローン抗体阻害 Ａ　単クローン抗体 ハイブリドーマ細胞系ＰＫ９９ＨおよびＰ　Ｋ　３４　Ｃ（Ｄｏｉｇ）を、カナ ダ国、アルハータ州所在のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ａｎ ｄ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｏｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓ奄■ ｙ　ｏｆ　Ａｌｂｅｒｊａの細胞寄託所に寄託した。それらは細胞系Ｎｏｓ、　 ＰＫ　９９　ＨおよびＰＫ　３４　Ｃにより同定される。ＰＫ９９ＨおよびＰＫ ３４ＣＭａｂｓ、および非免疫性１ｇＧのＦａｂフラグメントを例３Ａに記載し たように調製した。

Ｂ、ＢＥＣｓへのピリ線毛結合の阻害 ＢＥＣｓを例２に記載したように調製した。ＰＡＫピリ線毛を、公表された手順 （Ｐａｒａｎｃｈｙｃｈら、　１９７９）に従って単離した。ＰＡＫビリンタン パク質を、公表された方法（Ｐａｒａｎｃｈｙｃｈ）に従って単離した。ＰＫ９ ９Ｈ，ＰＫ３４Ｃおよび非免疫性１ｇＧのＦａｂフラグメントを上記表１に示さ れた濃度でＰＡＫビリ線毛と共にブレインキュベーションした（Ｄｏｉｇ）。イ ンキュベーション後、ＢＥＣｓを添加してｌＸｌ０’細胞／ｍＬの最終濃度にし た。ビリ線毛の結合を、単クローン抗体Ｐ　Ｋ　３　Ｂを用いて検出し、次いて 、上述したように、酵素標識化したヤギ坑マウス抗体と反応させた。ＢＥＣｓと 関連した酵素活性により測定される、ピリ線毛結合を、表１中に対照（Ｆａｂフ ラグメントを添加しない）に対する％として表す。

Ｃ，ＢＥＣｓへの緑膿菌（Ｐ、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）結合の阻害緑膿菌（Ｐ 、　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の菌株ＰＡＫ、ＰＡＯ，ＨＤＩ、４９２ｃ、ＰＩ、 Ｋ１．２２−４、およびＰＡＫ／３が報告されている（Ｄｏｉｇ）。ＰＫ９９Ｈ ，ＰＫ３４Ｃ１および標準マウス非免疫性１ｇＧのＦａｂフラグメン）・を上述 したように調製した。Ｆａｂフラグメンｌ（０，５ｍｌの０〜３．２ｍｇ／ｍｌ ）を、ＰＢＳ中に０．７ｘ　ｌ　Ｏ”　ＣＦＵ／ｍｌを含む細菌０．１ｍｌに添 加し、この混合物を室温で３０分間インキュベーションした。この混合物に次い て０．４ｍｌのＰＢＳおよび２Ｘ　Ｉ　Ｏ’細胞を含むＢＥＣｓｌｍｌまたは１ ｍｌのＰＢＳのいずれかを添加する（フィルターへの非特異的な細菌結合を評価 する）。３７℃で２時間据とうじながらインキュベーションした後、細胞を、上 述したように、洗浄し、ろ過し、濾液を、抗ビリン単クローン抗体および酵素連 結抗体を用いるＥＬＩＳ八方法へより、結合した細菌の存在についてアッセイし た。結果を上記表２に示す。

ポリクローン抗ＰＡＯビリ線毛抗血清を用いる免疫固定化の研究は、Ｍ、　ｃａ ｔａｒｒｈａｌｉｓ細胞を用い、それを、炭素で被覆した、光（ｇｌｏｗ）を放 つ電子顕微鏡の格子の表面に吸収させ、ＰＢＳ　ｐＨ７，４中１％（ｗ／ｖ）Ｂ ＳＡで２×５分間阻止し、そして０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ　ｐＨ ７，４中のラビットの抗ＰＡＯピリ線毛と３７℃で３５分間反応させた。次いで 格子を０．　５％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ　ｐＨ７，４５滴で洗い、１％ （Ｗ／ｖ）ＢＳＡで２×５分間阻止し、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ 　ｐＨ７，４中でヤギの抗マウスＩｇＧ−２０ｎｍコロイド状金抱合体（カリフ ォルニア州、　Ｓａ口Ｍａｔｅａ所在のＥ、Ｙ、　Ｌａｂｓ　Ｉｎｃ、）と３０ ０分間反応せ、０．　５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳ　ｐＨ７，４５滴で洗 浄し、次いてＨ，０５滴で洗浄し最後に乾燥させた。次いて格子を、１％（Ｗ／ Ｖ）リンタングステン酸で染色した後、８゜ｋＶの加速電位で操作するＰｈ由ｐ ｓ　ＥＭ　４０１透過型電子顕微鏡で調べた。対照は、第−の抗体および通常の マウスＩ　ｇ　Ｇ　（Ｊａｃｋｓｏ口Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含んでいな かった。ポリクローン抗ＰＡＯビリ線毛抗血清が、高い親和性でＭｏｒａｘｅｌ ｌａ　ｃａｔａｒｒ＋１３１ｉｓの細胞表面および表面付属器に結合しているこ とが観察された。

午りローノ抗体ＰＫ９９Ｈを用いる免疫固定化の研究は、ＬＸＩ２中に前もって 埋め込んで、薄片に切断したＭ、　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ細胞の薄片を用いて 行われ、この薄１１を３ｒｎｍの銅ＥＭ格子の表面に集め、そして薄片に飽和メ タ過ヨウ素酸すトリウムてエツチングを施してオスミウムを除去し抗体活性を回 復した。薄片を次いて上述したように処理した。但し、単クローン抗体ＰＫ９９ Ｈをポリクローン抗体の代わりに用いた。単クローン抗体ＰＫ９９Ｈの免疫特異 的結合を、抗体を、Ｍ、　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ細胞中の細胞表面成分および 細胞質成分の両方に結合して観察した。

１　！１ｏｓｐ山１の集中治療室の患者の気管から単離するかまたはアルバータ 州エドモントン所在のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｌｂｅｒｔａ　Ｈｏ５ｐｉｔａ撃■ ら入手した。

５ａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天（Ｇｉｂｃｏ）からの培養物のループフ ル（ｌｏｏｐｆｕｌ）を接種材料源として、０．４％（ｗｔ／ｖ）グルコースて 補ったＭ９培地（Ａｄａｍｓ。

１９５９）　Ｉ　Ｏｍ　Ｉのために使用した。２つのインキュベーションのプロ ］・コールを使用した。１５０ｒｐｍで振とうした培地を、２５°Ｃて１９時間 または２５°Ｃて１６時間インキュベーションし、次いで３７°Ｃて３時間イン キュベーションした。

放射性付着アッセイにおいて用いられ得る培養物は、１７時間インキユベーソヨ ンした後に、５５　Ｃｉ／ｍ　Ｉの［”Ｓ］　−Ｌ−メチオニン（Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ。

Ｂｏｓｔｏｎ　Ｍｓｓｓ、　）で補った。細胞を遠心分離（１２，０００Ｘｇ、 １０分間）によって採取し、ＰＢＳ　ｐＨ７，２て３回洗浄して組み込まれてい ないメチオニンを除去した。洗浄した細胞を、変化する濃度のＰＢＳ　ｐＨ７， ２中て再懸濁した。３７°Ｃてインキュベーションした細胞を、１８ゲージの針 の中を２回強制的に通過させて細胞塊を解体した。凝集は付着アッセイの間観察 されなかった。

Ｂ、頬の上皮細胞 ＢＥＣｓを、木製のアプリケーター捧で、健康な、喫煙していない男性ボランテ ィア（ｎ＝１０）から集めた。ＢＥＣｓを、ＰＢＳ　ｐＨ７，２中で穏やかに攪 拌することによってアプリケーター捧から除去した。ＢＥＣｓをＰＢＳ　ｐＨ７ ２て３回洗浄しく２０００Ｘｇ、４℃で１０分間）、次いで７０μｍナイロンメ ツシュに通した。ＢＥＣｓに関する細胞濃度を血球計数器で測定してＢＥＣの濃 度を調整した。この方法で得られたＢＥＣｓの生存率は、トリノ（ン青染料排除 によって測定した時、一般に約５％であった。

Ｃ，ヒトの繊毛のある気管上皮細胞へのＣ，ａｌｂｉｃａｎｓの付着ヒトの繊毛 のある気管上皮細胞（ＴＥＣｓ）はＦｒａｎｋｌｉｎら（１９８７）によってお よびＴｏｄｄら（１９８９）によって記載されているように入手した。手短に言 えば、鼻および口の咽頭通路に５ｍｌの１％（Ｗ／Ｖ）キシロカインを投与し、 さらに５ｍｌの１％（Ｗ／Ｖ）キシロカインを、声門のレヘルて気管支鏡の吸引 口を介して投与した後、細胞を気管支鏡法によって得た。さらに５ｍｌを気管の 中に投与して、使い捨ての細胞学ブラシで気管を繰り返しくｎ＝１０）ブラ・ソ シングした。細胞を、１％（ｗ／ｖ）クエン酸ナトリウムを含む、血清を含まな いＤｕｂｅｃｃｏｏｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｎｇｌｅ培地（高グルコース配 合物）３０ｍｌ中で攪拌することによってブラシから溶離し、使用前に４０°Ｃ て貯蔵した。

ＴＥＣｓを、粘液、血液細胞、微生物汚染物質、および破片から、７０μｍおよ び３０μｍのナイロンメツシュを通して穏やかにろ過し、細胞を、１０ｍ１のＰ ＢＳ　ｐＨ７，２で３回洗浄しく５００Ｘｇ、４０℃で１０分間）、ＩｍＬのＰ ＢＳ　ｐＨ７，２中て遠心分離しく５００Ｘｇ、４０℃で１０分間）、ＰＢＳｐ Ｈ７，２中で予め作られた６５％（ｖ　／　ｖ　）　Ｐｅｒｃｏｌ　Ｉ勾配（４ ８，ＯＯＯＸｇて４０°Ｃて４０分間遠心分離することにより予め作られた）上 で、５００Ｘｇて４０°Ｃで２０分間、２回連続的に密度勾配遠心分離して細胞 を濃縮することによって分別し、５ｍｌのｐ１３３　ｐＨ７，２で２回洗浄し、 そしてＩｍＬのＰＢＳ　ｐＨ７，２中て再懸濁させた。ＢＥＣｓの量を、血球計 数器を使用する直接計数によってめた。

Ｄ　カンジダ属綿毛の免疫蛍光 酵母を、上述したように、２５°Ｃて成長させるかまたは３７°Ｃに移した。酵 母を遠心分離によって捕集した。細胞を、ＰＢＳ中で１，０％ホルムアルデヒド で３０分間固定させ、ＰＢＳで２回洗浄した。最初の抗体を加え、混合物を、３ ００ｒｐｍで振とうして３７°Ｃて１時間インキュベーションした。次いて酵母 を遠心分離（１２，０００Ｘｇ、室温で１分間）によって集めそしてＰＢＳ　ｐ Ｈ７゜２て３回洗浄した。ＰＢＳ　ｐＨ７，２（１１５００希釈度）中でフルオ レセインイソチオンアナート（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に 抱合した、ラビットの抗マウスＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）アフィニティー精製したＩｇ Ｇを、洗浄した酵母調製物に添加し、３００ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で３０ 分間インキュベーションした。

酵母を上述したように３回洗浄しそしてＯ，１，ｍＬのＰＢＳ　ｐＨ７，２中で 再懸濁した。スライドに載せた湿った標本を作製し、ＭＰＳ４カメラシステムを 備えたいｅｔｚ　Ｌａｂｏｒｌｕｘを用いてエビ蛍光および位相差顕微鏡法によ って調へた。写真をＫｏｄａｋ　Ｔ−Ｍａｘフィルムに記録した。

Ｅ、付着アッセイ ５４ａｄｄｏｎによって記載されているように変更されたＭｃＥａｃｈｒａｎの 付着ア・ソセイを用いて上皮細胞ごとの結合した細菌の数を測定した。ＢＥＣｓ 　（ＩｍＬあたり２ＸＩＯ’細胞のＩｍＬ）を、ＰＢＳ　ｐＨ７，２中に懸濁し た等容積の放射能標識化酵母と混合しそして、３００　ｒ　ｐｍて振とうしなが ら、３７℃で２時間インキユヘーノヨンした。次いで酵母が結合した上皮細胞を 、ＰＢＳ　ｐＨ７，２中で２９６（ｗ／ｖ）ウシ血ｒＮアルブミン（ＢＳＡ）で 前もって処理した、５ミクロンのポリカーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏ ｒｅ）上でろ過することによって集めて非特異的結合を減らし、１５ｍＬ　ＰＢ Ｓ　ｐＨ７，２で洗浄し次いでシンチレーノヨンバイアル中に入れた。アクアゾ ール（５ｍＬ）を各バイアルに添加し、放射能の量をＢｅｃｋｍａｎ　ＬＳ−１ ５０液体シンチレーションカウンターにおいてシンチレンヨン計数することによ って測定した。３つ組のアリコートを各試料についてろ過した。上皮細胞への酵 母の結合を、１２μｍのフィルターへの酵母の非特異的結合について補正しこ（ 非特異的結合は一般に実験値の１５％より低かった）。

上皮細胞濃度をアッセイの終わりに測定してインキュベーションの間に喪失した 細胞について補正した。

全細胞計数および生存細胞計数を付着アッセイの前後で行った。全細胞計数は、 血球計数器を用いて測定した。生存計数は、Ｃ，ａｌｂｉｃａｎｓをＰＢＳ　ｐ Ｈ７，２中て連続的に希釈し、適当な希釈度て５ａｂｏｕｒａｕｄ−デキストロ ース寒天（Ｇｉｂｃｏ）上に置きそれを、目に見えて数えられるコロニーが形成 されるまで（通常２４〜４８時間）３７°Ｃでインキュベーションすることによ ってめられた。

Ｆ、カンジダ属線毛の精製 Ｃ，ａｌｂｉｃａｎｓを、０．４％（ｗｔ／ｖ）グルコースで補ったＭ９培地（ Ａｄａｍｓ。

＋９５９）中で、１５Ｏｒｐｍで３７°Ｃて一晩培養した。この培養物を使用し て、アルミニウムトレー（約２　ｍ　ｌ　／　トレー）に５ａｂｏｕｒａｕｄ− デキストロース寒天（ＧｉｂｅＯ）に接種した。トレーを３７°Ｃで５日間イン キュベーションした。酵母細胞を次いて寒天表面から、曲がったガラス捧てかき 落とし、プロテアーゼ阻害剤としてＩｍＭ　フェニルメチルスルホニルフッ化物 （Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ　ｐＨ７゜２中に懸濁させた。線毛を次いて細胞表 面からブレンディング（１！ｊａｒｉｎｇブレンダーを用いて４×１５秒のサイ クル）することによってせん断した。細胞を位相顕微鏡法によって調へると、完 全であるように見えた。

細胞を遠心分離（１２，０００Ｘｇ、２０分間）し、続いて、上演を０．４５μ ｍポリカポリカーボネートフィルターフォルニア州、　Ｐｌｅａｓａロｔｏロ所 在のＮｕｃｌｅｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、　）でろ過することによって除去した。上 清を透析管（カリフォルニア州、ロサンシエルス所在のｓｐｅｃｔｒｕｍ　：分 子量カットオフ６０００〜８０００Ｄａ）に入れ、ポリエチレングリコールを用 いて濃縮した（分子量１５，０００〜２０、　０００．　Ｓｉｇｍａ）　（ＰＥ Ｇ）、最後に試料をＰＢＳ　ｐＨ７，４に対して透析した。最終的な調製物は粗 製線毛（ＣＦ）と名付けて一７０°Ｃて貯蔵した。

粗製線毛を、流速０．５ｍ！／分で操作する、Ｉ　ｍＭ　Ｃａ　Ｃ＋　２を含む ＰＢＳ　ｐＨ７，２緩衝液で前もって平衡化されたそして同一緩衝液で溶出され る３ｏｏ、ｏｏｏダルトンのサイズ排除限界を有するＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ　 ３００　ＳＷカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｉｎｃ、）上でＨＰ　Ｌ　Ｃサイズ 排除クロマトグラフィーにより精製した。精製した線毛は、カラムの空隙容量中 に最初に溶出した材料を再度クロマトグラフィーで分離し、第二のクロマトグラ フィーの流れから、空隙容量中に未だ溶出する材料を集めることによって得られ た。精製した線毛は、比色アッセイに基づくと、〜１５％（Ｗ／Ｗ）のタンパク 質および〜８５％（Ｗ／Ｗ）の炭水化物からなり、そして、銀染色を用いる５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析に基づくと、〜６４，０００ダルトン の単一ポリペプチドからなっていたく図を参照）。

Ｇ、ＢＥＣｓへのＰＡＫビリ線毛結合に対するカンジダ属線毛の効果イムノアッ セイを行って、ＰＡＫからのビリ線毛のＢＥＣｓへの結合に対するカンジダ属線 毛の効果を評価した。ＰＢＳ　ｐＨ７，２中のＢＥＣｓ　（ＩｍＬ。

２、Ｏｘｌ　Ｏ’　ＢＥＣｓ／ｍＬで）、ＰＡＫビリ線毛（０，５ｍＬの８０％ ｇ／ｍＬ）　、および線毛（０，５ｍＬの４００〜８００　ｕ　ｇ／ｍＬ）を混 合しそして、Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓ＋ｖｉｃｋジャイロ振とう機中で３０Ｏｒｐｍ で振とうしながら、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＢＥＣｓを遠 心分離（１２，０００Ｘｇ。

４°Ｃで１０分間）集め、ＰＢＳ　Ｉ）８７．２で２回洗浄した。抗ＰＡＫピリ 線毛単クローン抗体Ｐ　Ｋ　３　Ｂ　（Ｄｏｉｇら１９９０）をＢＥＣペレット （１０−’の希釈度のＩｍＬ）に添加し上述したように１時間インキュベーショ ンした。次いでＢＥＣｓを遠心分離によって集め、ＰＢＳ　ｐＨ７，２で２回洗 浄した。ヤギの抗マウスＴｇＧ　（Ｈ十Ｇ）ペルオキシダーゼ抱合体（Ｊａｃｋ ｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をＢＥＣベレット（使用のための指示によ って希釈されたＩｍＬ）に添加しそして当該混合物を上述したように１時間イン キュベーションした。ＢＥＣｓを遠心分離により集め、きれいな試験管に移し、 そしてＰＢＳ　ｐＨ７，２で２回洗浄した。ベレットを、１ｍＭ　２．２°　− アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、１０ｍＭクエン 酸緩衝液ｐＨ４，２中０．０３％（容積／容積）を含む溶液ＩｍＬ中で再懸濁し た。反応をＩｍＬの４ｍＭ　ＮａＮｔの添加によって停止さＬ４０５ｎｍでの光 学密度を、遠心分離によりＢＥＣｓを除去した後に測定した。各試験管中のＢＥ Ｃａ度を、ＢＥＣｓを遠心分離により除去する前にアッセイの最後で、血球計数 器で測定した。

Ｈカンジダ属の結合の、ＰＡ、にビリ線毛またはカンジダ属線毛阻害の評価ビリ 線毛および線毛の阻害アッセイを直接競合方法を用いて行った。ビリ線毛／線毛 と酵母の直接競合は、酵母結合アッセイの開始時に、ビリ線毛／線毛、酵母およ びＢ　Ｅ’Ｃｓを同時に添加することによって行われた。ｌ　ＢＥＣあたり結合 した酵母の数を上述したように測定した。

Ａ、酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）ＮＵＮＣ９６ウエルのポ リスチレンウェル上を抗原でおおった。抗原（０，０１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９， ５中１１ｚｇ／ｍＬ）を各ウェル（１００μｌ／ウエル）に添加し室温で６時間 放置した。ウェルを次いで、０．０２％（重量／容積）ＢＳＡで補ったＰＢＳ　 ｐＨ７，４２５０μＩ　（緩衝液Ａ）で３回洗浄した。ウェルを、−晩４℃でＰ ＢＳ　Ｉ）Ｎ７．４中５％（重量／容積）ＢＳＡで遮断した。ウェルを３回洗浄 し、最初の抗体１００μｌを２時間添加した。各ウェルを次いて、吸引を用いて ２５０μ■の緩衝液Ａで３回洗浄した。緩衝液Ａ（１００μｌ／ウエル）中のヤ ギの抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）イムノグロブリン−セイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅ 　ｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ抱合体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）を添加し室温で２時間インキュベーションした。ウェルを緩衝液Ａで ３回洗浄しそして、２５０μ＋／ウエルの基質溶液（１ｍＭ　２．２°−アジノ ージ−（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）、１０ｍＭ　クエン酸ナトリ ウム緩衝液ｐＨ４，２中０．０３％（容積／容積）過酸化水素）を添加した。反 応を、２５０μｌ／ウエルの４ｍＭアジ化ナトリウムを添加することによって停 止させ、４０５ｎｍでの吸光度をＥＬ−４０７プレート読み取り装置を用いて測 定した。

Ｂ、競合ＥＬＩＳＡ 競合者および抗体を、０．０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むｌｏｍＭ　ＰＢＳｐＨ ７，２緩衝液中で一緒に混合し、室温で３０分間インキュベーションした。

アッセイの条件は、競合者が存在しない場合に、ＥＬＩＳＡプレート表面に固定 化した抗原の一５０％が抗体と結合するであろうような条件である。抗体および 競合者の混合物を次いて、上述したように、ＰＡＫビリ線毛またはカンジダ属線 毛て被覆しＢＳＡで阻止したウェル（１００μｍ／ウェル）に添加した。ＥＬＴ ＳＡを次いで上述したように行った。抗原に対する抗体の結合を５０％阻害する であろう競合者の濃度を測定した後、競合者に対する抗体の見掛けの親和性を、 Ｎ１ｅｊｏら（１，９８４）によって記載されているようにめた。

Ｃ全細胞Ｃ，ａｌｂｉｃａｎｓ　ドツトプロットドツトプロットを、Ｂｉｏ−Ｒ ａｄドツトブロッティングマニホールドを用いて行った。カンジダ・アルビカン スの種々の臨床的分離物の全細胞を先ずＰＢＳｐＨ７，２緩衝液で３回洗浄し、 そして２Ｘ１０＠ＣＦＵを含む細胞懸濁液１００μｍを、予め湿らせたニトロセ ルロース膜」二でウェルごとに添加した。細胞を減圧ろ過によりフィルター表面 上に集めた。ウェルを、０．１％（容積／容積）ツイーン２０．５０　ｍＭ　ｌ −リス緩衝化食塩水ｐＨ７，５（ＴＴＢＳ）（２００μｌ／ウエル）で４回洗浄 し、ＴＴＢＳ中３％（重量／容積）ＢＳＡ１００μｍて１時間阻止した。ウェル を、次いで、ＴＴＢＳで４回洗浄し、ＴＴＢＳ中種々の希釈度の単クローン抗体 ＰＫ９９ＨおよびＰＫ３４Ｃを添加しく１００μＩ／ウエル）そして１時間イン キュベーションした。プロットをＴＴＢＳで４回洗浄し、ＴＴＢＳ中のヤギ抗マ ウスＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）イムノグロブリン−アルカリ性ホスファターゼ抱合体１ ００μｍを１時間各ウェルに添加した。プロットをＴＴＢＳで６回洗浄した後、 ０．３３ｍｇ／ｍＬのニトロ青テトラゾリウムクロリド、０゜］、６５ｍｇ／ｍ Ｌ　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルーポスファート、１００ｍＭ　塩 化ナトリウム、５ｍＭ　塩化マグネシウム、ｌｏＯｍＭ）リス緩衝液ｐＨ９，５ からなる基質溶液を添加した。吸引し、蒸留水で膜をすすぐことによって発色を 止めた。

Ｄ　酵母結合に関する抗体Ｆａｂフラグメントの評価Ｆａｂフラグメントの結合 に対する効果を次のように行った。Ｆａｂフラグメント（ＰＢＳ　ｐＨ７，２中 ８００μｇ／ｍＬの０．５ｍＬ）をＰＢＳ　ｐＨ７゜２中て酵母０．ＩｍＬに添 加しそして室温で３０分間インキュベーションした。

、二ｔ１．．　ｉ二、０．４ｍＬのＰＢＳ　ｐｌ−［７，２および、１．ＯｍＬ のＢＥＣｓ　（２ｘ１０５細胞／　ｍ　Ｌ　）かまたは］、０ｒｎＬのＰＢＳ　 Ｉ）Ｎ７．２のいずれかを添加し７た。次いて当該混合物を、３００　ｒ　ｐｍ で振どうしなから３“Ｉ”Ｃて２時間インキュベーションし、た。付着アッセイ の残りは上述したように行った。

Ａ　ペプチドリガンドのｔ２−めのエビト−グライブラリ−の構成約１０＠の新 規へブタペプチド配列のエピトープライブラリーを、５ｃｏｔｔ　＆　５ｗ１ｔ ｈによって記載されたように構成する。あるいは、同様のエピトープライブラリ ーをＣｗｉｒｌａらまたはＤｅｖｌｉｎらによって記載されたように構成するこ とができる。

図１７は、５ｃｏｔｔ　＆　Ｓｍ１ｔｈｈによって記載された、そしてここに要 約されたライブラリーの構成を図式で表している。

繊維状ファージｆＵＳＥ５を、Ｐａｒｍｌｅｙ　＆　Ｓｍ１ｔｈによって記載さ れた（１９８８：　Ｇｅｎｅ　７３：　３０５−３１８）および５ｃｏｔｔ　＆ 　Ｓｍ１ｔ１１によって記載されたエピトープライブラリーのためのベクターと して構成する。このファージは、テトラサイクリン抵抗遺伝子を含み、クローン 化部位を存するように設計され、それへの挿入は、より小さいカプシドタンパク 質ｐＨｌの露出したＮ−末端にペプチド配列を付加することになる。この部位で の外来ペプチド配列の付加は、ファージの伝染性を実質的に阻害しない。しかし ながら、それを置くことは、それをファージの表面上に露出させ、抗体を認識で きるようにさせる。

外来ＤＮＡフラグメントとの結合のつくる際に、ｆＵＳＥ５を、Ｓｆｉ　Ｉで消 化する（ＢＲＬ；１２０単位／３０ｕｇ　ｆＵｓＥ５　ＲＦ　ＤＮＡ）。フェノ ールとクロロホルムで抽出した後、容積をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリスｐＨ８， １ｍＭ　ＥＤＴＡ）で約０．８ｍｌに調整し、ＤＮＡを酢酸ナトリウム緩衝液（ ３Ｍ；ｐＨ６）およびイソプロパツールを添加することによって沈澱させる。

インキュベーション（０°で２０分）およびペレット化の後、ペレットを７０％ （Ｖ／Ｖ）エタノールで洗浄し、ＴＥＪｉｌＩ液中で再び溶解させ、エタノール 沈澱させモしてＴＥ中に再度溶解させる。

ランダムへブタペプチド配列を含む挿入断片を、図１７に示した７３塩基縮退鋳 型を、図１７（最］二部）中に示した両方の鎖の５゛末端の最初の２０塩基に相 当する５′　ビオチニル化プライマーで複製連鎖反応（ＰＣＲ）増幅することに よって調製する。鋳型を次いて示されｔ＝２一つのＢｇ１１部位で開裂し次いで ストレプトアビシノーアガロース上に吸着させて、消化されていないおよび部分 的に消化された副産物と共にビオチニル化末端フラグメントを除去する。ＰＣＲ 混合物は、ｌｏｇの鋳型、５μｇの各ビオチニル化プライマー、および２５単位 のＡｍｐ　１ｉＴａｑ　ＤＮＡボリメラ・＝−ゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／ Ｃｅｔｕｓ）を含んでいる。

この混合物を５つの温度サイクル（９５°で２．５分、４２°で４分、７２゜で ４．４分、７２°で５分）に付し次いで反応を、ＥＤＴＡ溶液（最終濃度、１ｍ Ｍ）、ｐＨ８の添加により停止させる。エタノールで沈澱させそして０．１ｍｌ のＴＥ緩衝液中に溶解させた後、生成物の一部をＢｇｌ　Ｉ　（Ｐｒｏｍｅｇａ ；６．　４単位／す１最終濃度）で３７°で２時間消化して３６ｂｐ縮退フラグ メントを調製する。このフラグメント中のランダムに選択されたコドンを（ＮＮ Ｋ）ｖと表す。但し、ＮはデオキシヌクレオチドＧ、ＡＳＴ、およびＣの等混合 物を意味し、Ｋは、ＧおよびＴの等混合物を意味する。Ｍは、相補的鎖中でＣお よびへの等混合物を意味する。ＮＮＫはそれ故、２０のアミノ酸のためのコドン とさらにアンバー終止コドンを含む、３２トリブレツトの等混合物を表している 。。Ｂｇｌｌによる消化を、ＥＤＴＡ溶液の添加によって停止させる（１０ｍＭ １最終濃度）。

前もって洗浄したストレプトアビジンビーズを次いで溶液に添加し３０分間混合 し、そして遠心分離により除去する。この工程を、新鮮なストレプトアビジンビ ーズを用いて繰り返す。最終生成物を抽出（フェノール＋クロロホルム）し蒸発 させて０．１ｍｌの容積にする。

５ｆｉｌで消化されたｆＵＳＥ５　ＲＦへの挿入断片の連結を容積２ｍｌ中で行 う。反応混合物は、縮退３６ｂｐ挿入断片３６μｌおよびｆＵＳＥ５の５ｆｉＩ 消化物１０ｕｇからなる。この生成物をフェノールおよびクロロホルムで抽出し 、エタノール沈澱させ、そして０．２ｍｆ　ＴＥ緩衝液に溶解させる。

連結生成物を、縮退ペプチド配列を運ぶファージの増幅のために大腸菌（ε、　 Ｃ０１ｉ）　ＭＣＩ　０６１細胞に電気穿孔する。電気穿孔に続いて、細菌を、 テトラサイクリンを含む成長培地中に希釈する。細胞のテトラサイクリン抵抗性 は、好結果のトランスフェクションを示唆する。

Ｂ、抗体結合性ペプチドの選択 ファージを、寒天表面からかき取り、Ｌブロス中に再懸濁させそして上滑を遠心 分離（Ｂｅｃｋｍａｎ　ＪＡｌｏｏ−ター中で４°で１０分間８０００ｒｐｍ） により２回清浄にすることによって、プレートから単離する。ファージ粒子を、 ０．４ＭＮａＣ１中でポリエチレングリコール（３，３％）で沈澱させ、次いで 遠心分離する。ファージベレッｌ□を、ＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ　）リス−ＨＣ Ｌ　ｐＨ７゜５、Ｉ　５０ｍＭ　ＮａＣ１）中で再懸濁しそして４°で貯蔵する 。

ファージを、パンニング法で単クローン抗体ＰＫ３４ＧまたはＰＫ９９Ｈを用い て親和精製する。あるいは、これらの抗体のＦＡｂフラグメントをこの方法で使 用する。手短に言えば、ファージを一晩、精製した抗体ｔｕｇと共にインキュベ ーションした後、抗体またはそれらのＦａｂフラグメントに対する親和性をもつ ファージ表現ペプチドを、Ｐａｒｍｌｅｙ　＆　Ｓｍ１ｔｈのパンニング法を用 いて単離する。

ビオチニル化されたヤギ抗マウス抗体をこの混合物に添加し、混合物を次いでス トレプトアビジンで被覆したプレートに添加する。この手順は、第二の（ヤギの ）抗体を使用せずに、Ｆａｂフラグメントの最初の抗体を直接ビオチニル化する ことによって行われることもできる。インキュベーションに続いて（１０〜３０ 分）、ストレプトアビジンで被覆したプレートを洗浄し、そして付着ファージを ０．１Ｍ　ＨＣＩ　（ｐＨ２，２、グリシンで調整）およびウシ血清アルブミン （１ｍｇ／ｍｌ）を含む緩衝液中で１０分間溶出する。溶出液の中和を、２Ｍト リスのアリコートを用いて行う。溶出ファージを次いで、大腸菌（［Ｅ、　ｃｏ ｌｉ）の感染によって増幅させ、次いで、テトラサイクリンを含む寒天プレート 上でインキュベーションする。得られた増幅ファージブールを、上述したのと同 一のパンニング法によって２回再精製する。

パンニング２〜３回を通じて選択されたファージをクローン化し繁殖させ、そし てそれらのＤＮＡ’　ｓを標準技術を用いてシーフェンスして、これらのペプチ ドエピトープのアミノ酸配列を決定する。

本発明の好ましい実施態様を本明細書で詳細に説明したが、当業者によって、変 更が、本発明の精神または請求の範囲から離れることなくなされ得ることが理解 される。

ｏｏ　ｏ　＆Ｉ　Ｅｌｋ　ｃＩ　ｋ　ｏｕ、ＰＩυＧ　υ＠　Ｃ１１ｌ　Ｃｌ４ １（Ｊ＆　ＩＩｍ　１１１ｗ　ｈａ　ｈｅ−１１Ｎ−ｍ　ｍｓ　４ｍ　ｍｍ １．１６．４ｈ　４　１１１　４１＋＋　ｍｈ４ｋ　ｍ、ｔ　ｄＪ　ｄＪ　４Ｊ ｕｓｅ　＋４ｓｏ　ｅｏ　ｅｏ　ｅ。

ｎｈ”ｕｂ　ＣＪＪ　ｕｈ　０ｈ ｅｔｓ　ｕａ　ａｍ　ａｃｈ　ａｈ、ｅｏ　ｅｏ　ｅａ　ｓ。

トｅｋ　ｄ＠　ｄＴｈ　１１１１　ＣＪＪＩ　（ＪＭ　ＣＪｋ　ＣＪｋ　υ−− １４４　＋１４　４Ｊ　６４　４１１”ｔｌｋ　ｔＪｋ　Ｅｌｋ　ＣＪＪ−＆１ 　ｔｌｋ　１１ａ　←−ｅａ、、ｃｌｓ　ｕｖｓ　＄１１１１　ＣＪＩＩＩｗｇ ・　−一　ａｍ　ＣＪＪ　ｍＰ４　υ−０−υ−υ−−？＠６４　４４　４１ｋ 　υｅ”ｅｍ　（１４ｅｌｍ　５ｍｕｓ　ｈｅａ　１１＠　１１＠　ｃｌｓ、ｕ ｈ　ＣＪｋ　Ｕｋ　ｈｋｘｅｈ　ｅｈ　ｅｈ　ｏｈ　ｅｈ−べｈ　ｎｈ　ａｈ　 ｇｈ−−υ　トＱ　−υ　←ｕｌ−１ｃＪ　ｈ←　トド　−ト　←ト１＋Ｔｈ＋ 　Ｉ’ｈ　ｋＴｈ　ＬＩＴｈ＋　Ｕｋ、υｃ＋　ｕａ　ｕａ　ｈａ＊６ｓ　ｅ＋ 　Ｏｓ　６−　υＡうｍ−−−−一　−一　−−１ｅｌｅｌ　ｅｅ　ｅｅ　ｅ５ ｅ　ｍＮ　４４　４４　４４　４ｍｅ５ｃｌ　６６　ｅＩｌａ−ａｍ　４ｍ　ｈ ｋ　ｈｈ　ＬｌｉｌＩＪＩ４ｐ４　ｄｇ−禰−トド　０−　べ飄　ロー　ｃ−０ −１Ｊ５　Ｕｅ　ＣＪｅｌ　６＞　６４　４Ｊ　ｅｅｌ　５６　４ｍＮＱ　ＣＪ ｋ　Ｎｋ　（Ｊ−υ１　υ細　−一　トド　トに１１１４１１　ｃＪｇ　ＣＪＪ 　υＡ　−一　υＪ　（ＪＪＩＩ　υ７１　ｅｅ５４　４トｄｌｈ　ａｈ　４４ 　Ａｈ　４？　４１１　４１１１υ−４書　υ−？＋１　Ｎｋ　４−Ｌｌｈ　ｅ ｈ　ｅｔ＋＋’１（ＪＪＩ　４ｈ　ＩＪＪ　Ｏ−ｕａ　ａｈ　ｅ−ｅ−ｕ・４ｈ 　ｎａ　−ｈ　ｅｍ　−ｈ　＜ａ　ａｅ　ｅｅ　ｂｅｅＬｏｇ　工Ｃ５０−Ｌｏ ｇ　ＩＣ會５０−０，０５００，０５０，１ １／（ｕｇ　／ｍｌ　ＰＡＫピリ線毛）μＧ／ＭＬ　添加ＦＡＢ ４ＩＩｈＦｉｇ、　１０ Ｆｉｇ、７ Ｆｉｇ、８Ａ　Ｆｉｇ、８Ｂ Ｆｉｇ、９Ａ Ｆｉｇ、９Ｂ Ｆｉｇ、１１ Ｆｉｇ。１３ ［線毛］　（μｇ／ｍｌ） ［ビリ線毛］　（μｇ／ｍｌ） Ｆｉｇ、１．５ ［線毛］　（μｇ／ｍ１） ＦＡＢフラグメント ＋ 組換えｐＨＩ表面タンパク質を有する ファージの多数のコピー 組換えｐＨｌ＝ ｗＨ２−Ａ５工Ｑ囚Ｅ　Ｔ　Ｖ　Ｂ−＊　−Ｆｉｇ、　１７　（ｃｏｎ”　ｔ） ｔ、ｒ−ｕ−〜　特異的抗体 免疫反応性のアミノ酸配列を決定する 配列ＤＮＡ Ｆｉｇ、１Ｂ υ 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 平成５年７月２日

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．配列（ｉ）〜（ｖｉ）の間および配列（ｖｉｉ）〜（ｘ）の間で内部に一致 する、アミノ酸変化を含む、 （ｉ）【配列があります】、 （ｉｉ）【配列があります】、 （ｉｉｉ）【配列があります】、 （ｉｖ）【配列があります】、 （ｖ）【配列があります】、 （ｖｉ）【配列があります】、 （ｖｉｉ）【配列があります】、 （ｖｉｉｉ）【配列があります】、 （ｉｘ）【配列があります】、および （ｘ）【配列があります】 からなる群から選択されるアミノ酸配列を存し、かつ（ａ）Ｃｙｓ（Ｃ）残基の 間のジスルフィド連結；（ｂ）ＰＫ９９ＨまたはＰＫ３４Ｃ単クローン抗体への 免疫特異的結合；（ｃ）ヒトの頬またはヒトの気管の上皮細胞への特異的結合； および（ｄ）緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンタンパク質への特異的 結合の不存在によって特徴づけられるペプチド。
2. ２．配列（ｊ）〜（ｖｉ）の間で内部で一致する、アミノ酸変化を含む、次の配 列（ｉ）【配列があります】、 （ｉｉ）【配列があります】、 （ｉｉｉ）【配列があります】、 （ｉｖ）【配列があります】、 （ｖ）【配列があります】、および （ｖｉ）【配列があります】 の１つを有する、請求項１記載のペプチド。
3. ３．（ｉ）〜（ｖｉ）の配列の１つを有する、請求項１記載のペプチド。
4. ４．配列（ｖｉｉ）〜（ｘ）の間で内部で一致する、アミノ酸変化を含む、次の 配列（ｖｉｉ）【配列があります】、 （ｖｉｉｉ）【配列があります】、 （ｉｘ）【配列があります】、および （ｘ）【配列があります】 の１つを有する、請求項１記載のペプチド。
5. ５．配列（ｖｉｉ）〜（ｘ）の１つを有する、請求項４記載のペプチド。
6. ６．配列（ｉ′）〜（ｖｉ′）の間で内部で一致する、アミノ酸変化を含む（ｉ ′）【配列があります】、 （ｉｉ′）【配列があります】、 （ｉｉｉ′）【配列があります】、 （ｉｖ′）【配列があります】、 （ｖ′）【配列があります】、および （ｖｉ′）【配列があります】 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、（ａ）ＰＫ９９Ｈまたは ＰＫ３４Ｃ単クローン抗体への免疫特異的結合、および（ｂ）緑膿菌（Ｐ．ａｅ ｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンタンパク質への特異的結合の不存在によって特徴づけ られるペプチド。
7. ７．配列のＮ末端のＤまたはＥ残基から１〜５残基およびＣ末端のＫまたはＮ残 基から１〜２残基間隔をあけて、ジスルフィド連結したＣｙｓ基が側面に置かれ ている、請求項１記載のペプチド。
8. ８．緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンタンパク質のＣ末端の、ジスル フィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体と抗原的に交差反応を示す表面 タンパク質を有する細菌および真菌生物による感染に対するワクチンとして使用 される組成物であって、 （Ａ）配列（ｉ）〜（ｖｉ）の間および配列（ｖｉｉ）〜（ｘ）の間で内部で一 致する、アミノ酸変化を含む、 （ｉ）【配列があります】、 （ｉｉ）【配列があります】、 （ｉｉｉ）【配列があります】、 （ｉｖ）【配列があります】、 （ｖ）【配列があります】、 （ｖｉ）【配列があります】、 （ｖｉｉ）【配列があります】、 （ｖｉｉｉ）【配列があります】、 （ｉｘ）【配列があります】、および （ｘ）【配列があります】 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）Ｃｙｓ（Ｃ）残基の 間のジスルフィド連結および（ｂ）ＰＫ９９ＨまたはＰＫ３４Ｃ単クローン抗体 への免疫特異的結合によって特徴づけられるペプチド；および（Ｂ）当該ペプチ ドを結合する免疫原性キャリヤーを含む、上記組成物。
9. ９．ペプチドが、配列（ｉ）〜（ｖｉ）の間で内部で一致する、アミノ酸変化を 含む、次の配列 （ｉ）【配列があります】、 （ｉｉ）【配列があります】、 （ｉｉｉ）【配列があります】、 （ｉｖ）【配列があります】、 （ｖ）【配列があります】、および （ｖｉ）【配列があります】 の１つを有する、請求項８記載の組成物。
10. １０．ペプチドが、配列（ｖｉｉ）〜（ｘ）の間で内部で一致する、アミノ酸変 化を含む、次の配列 （ｖｉｉ）【配列があります】、 （ｖｉｉｉ）【配列があります】、 （ｉｘ）【配列があります】、および （ｘ）【配列があります】 の１つを有する、請求項８記載の組成物。
11. １１．ペプチドが、ＰＫ３４Ｃ抗体と免疫反応性である、シュードモナス属感染 に対してワクチンとして使用される、請求項８記載の組成物。
12. １２．ペプチドが、ＰＫ９９Ｈ抗体と免疫反応性である、カンジダ属感染に対し てワクチンとして使用される、請求項８記載の組成物。
13. １３．緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンタンパク質のＣ末端の、ジス ルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体と抗原的に交差反応を示す表 面タンパク質を有する細菌および真菌生物による感染に対するワクチンとして使 用される組成物であって、 （Ａ）配列（ｉ′）〜（ｖｉ′）の間で内部で一致する、アミノ酸変化を含む、 （ｉ′）【配列があります】、 （ｉｉ′）【配列があります】、 （ｉｉｉ′）【配列があります】、 （ｉｖ′）【配列があります】、 （ｖ′）【配列があります】、および （ｖｉ′）【配列があります】 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、（ａ）ＰＫ９９Ｈまたは ＰＫ３４Ｃ単クローン抗体への免疫特異的結合、および（ｂ）緑膿菌（Ｐ．ａｅ ｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンタンパク質への特異的結合の不存在によって特徴づけ られるペプチド；および（Ｂ）当該ペプチドを結合する免疫原性キャリヤーを含 む、上記組成物。
14. １４．ペプチド配列のＮ末端のＤまたはＥ残基から１〜５残基およびペプチド配 列のＣ末端のＫまたはＮ残基から１〜２残基間隔をあけて、ジスルフィド連結し たＣｙｓ基がペプチドの側面に置かれている、請求項１３記載の組成物。
15. １５．緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンタンパク質のＣ末端の、ジス ルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体と抗原的に交差反応を示す表 面タンパク質を有する細菌および真菌生物による感染に対する個体を保護する方 法であって、個体を、 （Ａ）配列（ｉ）〜（ｖｉ）の間および配列（ｖｉｉ）〜（ｘ）の間で内部で一 致する、アミノ酸変化を含む、 （ｉ）【配列があります】、 （ｉｉ）【配列があります】、 （ｉｉｉ）【配列があります】、 （ｉｖ）【配列があります】、 （ｖ）【配列があります】、 （ｖｉ）【配列があります】、 （ｖｉｉ）【配列があります】、 （ｖｉｉｉ）【配列があります】、 （ｉｘ）【配列があります】、および （ｘ）【配列があります】 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）Ｃｙｓ（Ｃ）残基の 間のジスルフィド連結、および（ｂ）ＰＫ９９ＨまたはＰＫ３４Ｃ単クローン抗 体への免疫特異的結合によって特徴づけられるペプチド；および（Ｂ）当該ペプ チドを結合する免疫原性キャリヤーを含むペプチド組成物で予防接種することを 特徴とする、上記方法。
16. １６．ペプチドが、ＰＫ３４Ｃ抗体と免疫反応性である、シュードモナス属感染 に対する個体を保護する際に使用するための、請求項１５記載の方法。
17. １７．ペプチドが、ＰＫ９９Ｈ抗体と免疫反応性である、カンジダ属感染に対す る個体を保護する際に使用するための、請求項１５記載の方法。
18. １８．緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンタンパク質のＣ末端の、ジス ルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体と抗原的に交差反応を示す表 面タンパク質を有する細菌および真菌生物による感染に対する個体を保護する方 法であって、個体を、 （Ａ）配列（ｉ′）〜（ｖｉ′）の間で内部で一致する、アミノ酸変化を含む、 （ｉ′）ＤＥＱＦＩＰＫ、 （ｉｉ′）ＤＥＱＦＩＰＫ、 （ｉｉｉ′）ＤＰＭＦＴＰＫ、 （ｉｖ′）ＥＥＭＦＩＰＫ、 （ｖ′）ＤＡＫＦＲＰＮ、および （ｖｉ′）ＤＮＫＹＬＰＫ からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、（ａ）ＰＫ９９Ｈまたは ＰＫ３４Ｃ単クローン抗体への免疫特異的結合、および（ｂ）緑膿菌（Ｐ．ａｅ ｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンタンパク質への特異的結合の不存在によって特徴づけ られるペプチド；および（Ｂ）当該ペプチドを結合する免疫原性キャリヤーを含 むペプチド組成物で予防接種することを特徴とする、上記方法。
19. １９．ペプチド配列のＮ末端のＤまたはＥ残基から１〜５残基およびペプチド配 列のＣ末端のＫまたはＮ残基から１〜２残基間隔をあけて、ジスルフィド連結し たＣｙｓ基がペプチドの側面に置かれている、請求項１８記載の方法。
20. ２０．緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンタンパク質のＣ末端の、ジス ルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体と抗原的に交差反応を示す表 面タンパク質を有する細菌および真菌生物による感染に対するワクチンとして使 用される組成物の製造方法であって、 （ｉ）（ＮＮＫ）ｍ（但し、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣを表し、そしてＫはＴまた はＧを表し、そしてｍは５〜１０である。）の形のランダム配列ポリヌクレオチ ドの混合物を生じさせ、（ｉｉ）挿入配列を発現できるベクター中にポリヌクレ オチドを挿入することにより、ランダム配列ベクターのライブラリーを作り、（ ｉｉｉ）ライブラリーベクターを操作してランダムアミノ酸配列としてランダム 配列ポリヌクレオチドを発現させ、 （ｉｖ）ＰＫ３４ＣまたはＰＫ９９Ｈ単クローン抗体と免疫反応性であるアミノ 酸配列の存在についてライブラリーベクターをスクリーニングし、（ｖ）このよ うな免疫反応性アミノ酸配列を発現するライブラリーベクターを単離し、そして （ｖｉ）単離されたベクター中で挿入配列によってコード化されたポリペプチド を作り出す ことを特徴とする、上記方法。
21. ２１．ランダム配列ポリヌクレオチドが、ＣＧＨ−（ＮＮＫ）ｍ−ＣＧＨ（但し 、ＨはＵまたはＣである）の形を有し、かつ、発現アミノ酸配列が、酸化されて ジスルフィド連結を形成するＣｙｓ残基によって結合される、請求項２０記載の 方法。
22. ２２．ライブラリーベクターが、ＰＫ３４Ｃ単クローン抗体と免疫反応性である アミノ酸配列の存在についてスクリーニングされる、請求項２０記載の方法。
23. ２３．ライブラリーベクターが、ＰＫ９９Ｈ単クローン抗体と免疫反応性である アミノ酸配列の存在についてスクリーニングされる、請求項２０記載の方法。
24. ２４．緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンタンパク質のＣ末端の、ジス ルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体と抗原的に交差反応を示す表 面タンパク質を有する細菌および真菌生物による感染に対して個体の中に受動免 疫を生じさせる方法であって、 個体に、マウスＰＫ３４ＣまたはＰＫ９９Ｈ単クローン抗体の可変領域、および ヒトイムノグロブリン抗体の不変領域からなるキメラ単クローン抗体を非経口的 に投与することを特徴とする、上記方法。
25. ２５．抗体の可変領域が、マウスの単クローンＰＫ３４Ｃ抗体からの可変領域を 含む、請求項２４記載の方法。
26. ２６．抗体の可変領域が、マウスの単クローンＰＫ９９Ｈ抗体からの可変領域を 含む、請求項２５記載の方法。
27. ２７．マウスのＰＫ９９Ｈ単クローン抗体の可変領域、およびヒトイムノグロブ リンＧ抗体の不変領域からなるキメラ抗体。
28. ２８．マウスのＰＫ３４Ｃ単クローン抗体の可変領域、およびヒトイムノグロブ リンＧ抗体の不変領域からなるキメラ抗体。
29. ２９．緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンタンパク質のＣ末端の、ジス ルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体と抗原的に交差反応を示す表 面タンパク質を有する細菌および真菌生物によって引き起こされる肺の感染を治 療する方法であって、 （Ａ）配列（ｉ）〜（ｖｉ）の間および配列（ｖｉｉ）〜（ｘ）の間で内部で一 致する、アミノ酸変化を含む、 （ｉ）【配列があります】、 （ｉｉ）【配列があります】、 （ｉｉｉ）【配列があります】、 （ｉｖ）【配列があります】、 （ｖ）【配列があります】、 （ｖｉ）【配列があります】、 （ｖｉｉ）【配列があります】、 （ｖｉｉｉ）【配列があります】、 （ｉｘ）【配列があります】、および （ｘ）【配列があります】 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ（ａ）Ｃｙｓ（Ｃ）残基の 間のジスルフィド連結、および（ｂ）ＰＫ９９ＨまたはＰＫ３４Ｃ単クローン抗 体への免疫特異的結合によって特徴づけられるペプチドのエーロゾルを作り、そ して（Ｂ）当該エーロゾルを吸入によって投与することを特徴とする、上記方法 。
30. ３０．感染が、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）によって引き起こされる、 請求項２９記載の方法。
31. ３１．緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンタンパク質のＣ末端の、ジス ルフィド連結ペプチド領域に対して産生される抗体と抗原的に交差反応を示す表 面タンパク質を有する細菌および真菌生物によって引き起こされる肺の感染を治 療する方法であって、 （Ａ）配列（ｉ′）〜（ｖｉ′）の間で内部で一致する、アミノ酸変化を含む、 （ｉ′）【配列があります】、 （ｉｉ′）【配列があります】、 （ｉｉｉ′）【配列があります】、 （ｉｖ′）【配列があります】、 （ｖ′）【配列があります】、および （ｖｉ′）【配列があります】 からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、（ａ）ＰＫ９９Ｈまたは ＰＫ３４Ｃ単クローン抗体への免疫特異的結合、および（ｂ）緑膿菌（Ｐ．ａｅ ｒｕｇｉｎｏｓａ）ピリンタンパク質への特異的結合の不存在によって特徴づけ られるペプチドのエーロゾルを作り、そして（Ｂ）当該エーロゾルを吸入によっ て投与することを特徴とする、上記方法。
32. ３２．感染が、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）によって引き起こされ、治 療化合物が上記ペプチドに連結される、請求項３１記載の方法。