DE69906729T2

DE69906729T2 - Zusammensetzung und methode zur behandlung von pseudomonas aeruginosa infektionen

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Publication number: DE69906729T2
Application number: DE69906729T
Authority: DE
Inventors: Randall T. Irvin; Randy J. Read; Bart Hazes; Wah Y. Wong; Sastry Parimi; Linda M.G. Glasier
Original assignee: University of Alberta
Current assignee: University of Alberta
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2019-06-12
Also published as: CA2329689A1; EP1083922A2; US6767545B2; WO1999065511A3; EP1083922B1; US6342233B1; AU4253999A; US20020098196A1; WO1999065511A2; DE69906729D1

Description

Zusammensetzung und Methode zur Behandlung von Pseudomonas aeruginosa Infektionen
Die vorliegende Endung betrifft eine neue Zusammensetzung und die Herstellung eines Arzneimittels unter Verwendung dieser Zusammensetzung zur Behandlung und Prävention einer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa.

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Pseudomonas aeruginosa ist ein signifikantes opportunistisches Pathogen, welches eine Vielzahl von lebensbedrohenden Infektionen bei immunsupprimierten oder im Immunsystem beeinträchtigten Patienten [1–4] verursacht. Individuen, bei denen ein Risiko besteht, P. aeruginosa Infektionen zu entwickeln, schließen Patienten mit Cystischer Fibrose, Patienten mit Verbrennungen, Patienten mit schwerer Neutropenie (z. B. Krebspatienten, die ein Chemotherapie erhalten) und Intensiv-Patienten, die eine künstliche Beatmung erhalten, ein. Die Preis dieser Infektionen ist hoch, >60,000 Leben pro Jahr in Nord Amerika und ungefähr $ 5 Milliarden/Jahr an Kosten im Gesundheitswesen.
Die erste Schritt im Pseudomonas Infektions-Prozeß scheint die Anheftung an die Wirtszelle zu sein. Diese Anheftung wird durch Pili auf der Oberfläche des Bakteriums vermittelt [2,5,6]. P. aeruginosa nutzt mehrere Adhäsine, um die Anheftung an die mucosale Oberfläche zu vermitteln, eine Analyse der Bindungsfähigkeiten der Adhäsine [1,7,8] und Bindungs-Kompetitions Studien [9] zeigen jedoch, dass der Pilus das dominante, für die Initiierung der Infektionen verantwortliche Adhäsin ist [1].
P. aeruginosa Pili besitzen eine Struktur, die einer hohlen Röhre von ungefähr 5.2 nm im äußeren Durchmesser und 1,2 nm Durchmesser im zentralen Tunnel (Innendurchmesser) sowie einer durchschnittliche Länge von 2,5 μm [10–12] ähnelt. Der Pilus von P. aeruginosa ist aus multiplen Kopien einer 13–17 kDa monomeren Protein-Untereinheit, genannt Pilin, zusammengesetzt, die sich eigenständig zu Pili zusammensetzen („selfassembling").
Die C-terminale Region des Pilin-Monomers enthält die epitheliale Zell-Bindungs-Domäne [5,12] und ist in sieben verschiedenen Stämmen dieses Bakteriums semikonserviert [13,14]. Es ist auch gezeigt worden, dass diese semikonservierte Region an eine minimale strukturelle Kohlenhydrat Rezeptor-Sequenz, ß-GalNAc(1–4)ßGal bindet, die in Glycosphingolipiden, insbesondere Asialo-GM₁ und Asialo-GM₂ [15,16] vorkommt. Es gibt Hinweise dafür, dass die Pili-Bindung an eine Wirtszelle durch multivalente Bindung von in jedem Pilus vorhandenen C-terminalen Bindungs-Domänen an epitheliale Zell-Rezeptoren vermittelt wird, wobei eine solche Bindung dazu dient, Rezeptoren auf den Zellen zu mobilisieren. Dies könnte dann wiederum für eine Cytokin-, z. B. IL-8 Herstellung durch die Wirtszellen und daraus folgende Entzündungsantworten verantwortlich sein.
Es ist bekannt, dass die C-terminale, durch Disulfid-Brücken verbundene 17-Reste aufweisende Region des PAK Pilin für die Generierung von Antikörpern, die die Bindung sowohl von Bakterien als auch ihrer Pili an epitheliale Zellen blockieren, wichtig ist [6,17,18]. Es ist gezeigt worden, dass sowohl monoklonale, mit P. aeruginosa Pili generierte Antiseren oder mit synthetischen Peptiden, die die Rezeptor- Bindungs-Domäne des Pathogens repräsentieren, generierte polyklonale Antiseren bei der Prävention von Infektionen effektiv sind [19].
Die Fähigkeit von Antikörpern, die gegen die C-terminale Pilin-Peptid-Domäne produziert wurden, eine Pseudomonas Infektion effektiv zu hemmen, ist gezeigt worden (siehe, z. B. U.S. Patent Nr. 5,468,484). Die Nutzung der Pilin-Peptid-Domäne bei der Impfung gegen eine Pseudomonas-Infektion ist ebenfalls demonstriert worden, z. B. U.S. Patente 5,445,818, 5,494,672 und 5,612,036.
Es wäre ebenfalls wünschenswert, eine vorhandene Pseudomonas-Infektion direkt zu behandeln, oder ein Individuum, bei dem ein Risiko einer Pseudomonas-Infektion besteht, prophylaktisch zu behandeln. Obwohl intakte Pili für diesen Zweck vorgeschlagen wurden, ist dieses Verfahren durch die Tatsache begrenzt, dass isolierte Pili, die sich eigenständig zusammengesetzt haben („self-assembled"), die Fähigkeit besitzen, eine starke Entzündungsantwort zu verursachen. Alternativ dazu ist das C-terminale Pilin-Peptid für diesen Zweck vorgeschlagen worden. Dieser Ansatz ist jedoch durch die relativ schwache Bindung des Peptids an die Rezeptor-Stellen der Wirtszelle begrenzt.
WO 90/11777 offenbart die Verwendung von nicht-assemblierten bakteriellen Pilus-Untereinheiten, die mittels eines spezifischen Verfahrens direkt aus Bakterien erhalten wurden, als Impfstoffe zum Schutz von Tieren gegen eine bakterielle Infektion. MacDonald et al. offenbaren Pilin-Monomere, die in der N-terminalen Region mutiert sind, um den Zusammenbau der Pilin-Monomere zu Pili zu hemmen (42).
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung zur Verwendung in der Behandlung oder Prävention einer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa. Die Zusammensetzung umfasst ein P. aeruginosa Pilin-Protein mit einer N-terminalen Peptid-Region, die durch eine Peptideinheit ersetzt worden ist, die ein superspiralisiertes (superhelikales, (α-Helix-) "coiled-coil") Homodimer oder Heterodimer bilden kann. Die Zusammensetzung enthält zwei modifizierte, durch eine superspiralisierte Heterodimeroder Homodimer- Wechselwirkung verbundene Pilin-Peptide, wobei die modifizierten Pilin-Peptide die in SEQ ID Nrn. 2,4,6,8 oder 10 identifizierten Sequenzen aufweisen. Das Peptid kann in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wie einer Flüssigkeit, die ein Aerosol bilden kann, einem partikulären Träger oder einer injizierbaren Lösung formuliert werden.
Die N-terminale Region des Pilin Peptids ist durch eine Peptideinheit ersetzt worden, die in der Lage ist, eine superspiralisierte Heterodimer- oder Homodimer-Struktur mit einer gegensätzlich geladenen oder identischen alpha-Helix formenden Peptideinheit zu bilden, wie durch ein so genanntes Leucin-Zipper Peptid repräsentiert. Das modifizierte Pilin-Peptid kann dimere Strukturen bilden, die aufgrund divalenter Bindung eine höhere Bindungsaffinität zu Wirtszellen als das korrespondierende Monomer besitzen. Diese sind jedoch weniger entzündlich als intakte Pili, und zwar aufgrund des herabgesetzten Grades an Mobilisierung der Wirtszell-Rezeptor-Stellen, wenn man sie mit der durch Bindung intakter Pili hervorgerufenen Mobilisierung vergleicht. Weiterhin erlaubt die dimere Konstruktion, dass Pilin-Peptide von zwei verschiedenen Pseudomonas Stämmen in dimerer Form assembliert werden oder eine Kombination eines einzelnen Pilin-Peptids und eines anderen therapeutischen Agens, z. B. eines antibakteriellen Agens, das in spaltbarer Form auf einem Träger-Peptid transportiert wird, und das andere Monomer in der dimeren Struktur bildet.
Das modifizierte Pilin-Peptid kann erfindungsgemäß weiter modifiziert werden, um die Immunogenität in Ziel-Organismen wie z. B. Menschen, zu reduzieren oder zu eliminieren. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Eifindung wird die Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prävention einer P. aeruginosa Infektion eines Individuums verwendet. Die Zusammensetzung soll dem Individuum in einer pharmazeutisch wirksamen Menge an modifiziertem P. aeruginosa Pilin-Protein verabreicht werden. Das Peptid soll z. B. mittels Formulierung des Peptids als eine Flüssigkeit oder ein partikuläres Aerosol verabreicht werden. Dabei soll das Aerosol dem Individuum über den Atemweg oder mittels intravenöser Verabreichung zugeführt werden. Diese und andere Ausführungsformen und Merkmale der Erfindung werden deutlicher, wenn die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung im Zusammenhang mit den anhängigen Figuren gelesen wird.
1A-1E zeigen die Nukleotid- und korrespondierende Aminosäure-Sequenz eines beispielhaften verkürzten Pilin-Proteins aus K122 (1A), PAK (1B), PAO (1C), P1 (1D), und KB7 (1E), wobei die Nukleotid- und Polypeptid-Sequenzen von K122, PAK, PAO, P1 und KB7 in SEQ ID Nrn.: 1 und 2, SEQ ID Nrn: 3 und 4, SEQ ID Nrn: 5 und 6, SEQ ID Nrn: 7 und 8 beziehungsweise SEQ ID Nrn: 9 und 10 identifiziert werden;
2A und 2B zeigen Vektor-Konstrukte mit der Bezeichnung pDLB42 und pDLB43, die ein N-terminales H-Spiralen-verkürztes ("H coil-truncated") PAK Fusionspeptid (2A) und ein N-terminales E-Spiralen-verkürztes ("E coil-truncated") PAK Fusions-Peptid (2B) enthalten;
3A und 3B zeigen die Nukleotid- und Polypeptid-Sequenzen eines beispielhaften N-terminalen H-Spiralen-verkürzten PAK Fusions-Peptids (3A) und eines beispielhaften N-terminalen E-Spiralen-verkürzten PAK Fusionspeptid (3B) in den Vektor-Konstrukten in den 2A bzw. 2B, wo die Nukleotid- und Polypeptid-Sequenzen jeweils in SEQ ID Nrn: 11 und 12 bzw. SEQ ID Nrn: 13 und 14 identifiziert sind;
4A und 4B zeigen jeweils Nukleotid- und Polypeptid-Sequenzen eines beispielhaften N-terminalen H-Spiralen-verkürzten K122 Fusionspeptids (4A) bzw. eines beispielhaften N-terminalen E-Spiralen-verkürzten K122 Fusionspeptids, wobei die Nukleotid- und Polypeptid-Sequenzen jeweils in SEQ ID Nrn: 15 und 16 bzw. SEQ ID Nrn: 17 und 18 identifiziert sind;
5A und 5B zeigen jeweils Nukleotid- und Polypeptid-Sequenzen eines beispielhaften N-terminalen H-Spiralen-verkürzten PAO Peptids (5A) bzw. eines beispielhaften N-terminalen E-Spiralen-verkürzten PAO Fusionspeptid; wobei die Nucleotid- und Polypeptid-Sequenzen jeweils in SEQ ID Nrn: 19 und 20 bzw. SEQ ID Nrn: 21 und 22 identifiziert sind.
6 zeigt Schritte in der Aufreinigung des verkürzten K122 Pilin-Proteins aus 1A;
7 ist eine Darstellung einer Größenausschluß-Chromatographie des verkürzten K122 Pilin-Proteins aus 1A;
8 ist eine Darstellung der kompetitiven Inhibition der Bindung von biotinylierten PAK Pili an immobilisiertes Asialo-GM₁ durch das verkürzte K122 Pilin-Protein von 1A; und
9 zeigt die Fähigkeit eines modifizierten Pilin-Proteins, welches eifindungsgemäß erzeugt wurde, in einem Maus-Modell das Überleben bei einer Pseudomonas-Infektion zu verlängern.
Der erste Abschnitt beschreibt modifizierte, gemäß der Erfindung erzeugte Pseudomonas Pilin-Peptide und Expressionsvektoren zur rekombinanten Expression der Proteine. Der zweite Abschnitt stellt Verfahren zur Konstruktion eines Modell-Expressionsvektors für ein verkürztes PAK Pilin-Protein bereit, zur Isolierung des Proteins und einen kompetetiven Bindungs-Test zur Charakterisierung der Fähigkeit des modifizierten Proteins, ASIALO-GM₁ Glycosphingolipid zu binden. Im dritten Abschnitt wird gemäß einer weiteren Ausführungsform der Endung das Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Pseudomonas-Infektionen und die Wirkung der Behandlung in einem Modell-Tiersystem dargelegt.
Modifizierte Pilin-Peptid Zusammensetzungen
Die Eifindung macht sich die Beobachtung zunutze, dass das P. aeruginosa Pilin-Protein modifiziert werden kann, um durch Modifizierung des N-Terminus des Proteins zur Verhinderung einer alpha Helix Bildung ein eigenständiges Zusammensetzen („selfassembly"), d. h. Oligomerisierung zu verhindern. Die Erfindung macht sich die weitere Beoachtung zunutze, dass eine dimere Form des Pilin-Peptids in der Behandlung oder als ein Prophylaktikum für Pseudomonas-Infektionen wirksam ist, diese verglichen mit intakten Pili jedoch keine oder eine signifikant verminderte Entzündungsantwort hervorruft.
Die hier betrachteten N-terminalen Peptid-Modifizierungen betreffen den allgemeinen Typ: Ersetzen des N-terminalen Teils durch eine alpha-helikale superspiralisierte homodimere oder heterodimere Sequenz.
Der N-terminale Teil des Peptids kann deletiert werden, um ein Pilin-Protein herzustellen, dessen N-terminaler Region ein kritischer, α-Helix bildender Teil fehlt. Die Deletionen in dem N-terminalen Teil des Peptids sind bevorzugt die ersten 15 bis ersten 40 N-terminalen Aminosäuren, bevorzugt die ersten 25 bis ersten 30 N-terminalen Aminosäuren. In einem im folgenden beschriebenen beispielhaften Peptid sind die N-terminalen Reste 1-28 des Pilin-Proteins aus dem Stamm K122 deletiert. Dieses Peptid wird im folgenden als K-122-4 bezeichnet. In 1A ist die Polynukleotid- und korrespondierende Polypeptid-Sequenz des modifizierten Proteins gezeigt und hier als SEQ ID Nr:l (Polynukleotid-Sequenz) und SEQ ID Nr.2 (Polypeptid-Sequenz) identifiziert. Die ersten fünf Aminosäure-Reste in der Polypeptid-Sequenz sind in der K122 Sequenz ursprünglich nicht vorhanden, sondern stammen von einer intrinsischen kodierenden Sequenz des Expressionsvektors. Der C-terminale Rest des Polypeptids ist der Pro-Rest unmittelbar stromaufwärts der zwei OCH Stop-Codons; d. h. die in SEQ ID Nr:2 identifizierte Polypeptid-Sequenz enthält nicht die Reste Ser-Ser-Lys-Leu-Gly stromabwärts der Stop-Codons.
In den 1B-1E sind ähnliche Polynukleotid- und Polypeptid-Sequenzen der verkürzten Pilin-Peptide aus PAK, PAO, P1 bzw. KB7 Pseudomonas-Stämmen gezeigt. Die Polynukleotid- und Polypeptid-Sequenzen des verkürzten Pilin-Peptids aus dem Stamm PAK sind dargestellt in SEQ ID Nrn:3 beziehungsweise 4 (1B); des verkürzten Pilin-Peptids aus Stamm PAO in SEQ ID Nrn:5 beziehungsweise 6 (1C); des verkürzten Pilin-Peptids aus Stamm P1 in SEQ ID Nrn:7 beziehungsweise 8 (1D); und des verkürzten Pilin-Peptids aus Stamm KB7 in SEQ ID Nrn:9 beziehungsweise 10 (1E).
Das nachfolgende Beispiel erläutert die rekombinante Herstellung des obigen verkürzten, als K122-4 bezeichneten Pilin Proteins, wobei seine 28 N-terminalen Aminosäure-Reste deletiert werden. Dem Fachmann ist bekannt, dass eine Vielzahl von Verfahren zur Verfügung steht, um P. aeruginosa Pilin-Protein mit einer modifizierten N-terminalen Region herzustellen. Die Referenzen 20 – 26 z. B. offenbaren verschiedene P. aeruginosa Pilin-Protein-Gene. Referenz 27 zeigt detailliert Verfahren zur Expression von Pilin-Peptiden in E. coli.
Es wird weiterhin anzuerkennen sein, dass Verfahren zur Modifizierung der N-terminalen Region eines Pilin-Protein-Gens, um eine gewünschte Modifikation in dem Protein zu erreichen, für den Fachmann in seinem Fachwissen liegt. Die orts-gerichtete Mutagenese z. B., beinhaltend Substitution, Deletion und zusätzliche Mutationen der Gen-Sequenz können mittels bekannter Verfahren ausgeführt werden, wobei z. B. PCR Primer eingesetzt werden. Ähnlich können Gene mit Verkürzungen verschiedener Länge mittels Standard-Verfahren, wie im Folgenden beispielhaft dargestellt, präpariert werden.
Diese N-terminale Region eines Pilin Peptids, z. B. die ersten wie vorstehend aufgeführten deletierten 15 – 40 Reste, wird durch ein Peptidsegment ersetzt, welches ein superspiralisiertes („coiled coil") Homodimer mit einem identischen Peptid-Segment ausbilden kann oder ein Heterodimer mit einem gegensätzlich geladenen Peptid-Segment. Peptide mit dieser ein superspiralisiertes Dimer bildenden Fähigkeit sind z. B. in den PCT Anmeldungen WO 97/12988 und WO 95/31480 offenbart worden.
Beispielhafte superspiralisierte Peptide werden hier als E-Spiralen ("E coils") bezeichnet, bezugnehmend auf negativ-geladene Untereinheiten, deren Ladung überwiegend durch Glutaminsäure-Reste bereit gestellt wird und als K-Spiralen ("K coils"), bezugnehmend auf positiv-geladene Untereinheiten, deren Ladung überwiegend durch Lysin-Reste bereit gestellt wird. Die zwei Spiralen („coils") bilden, wenn gemischt, ein stabiles 1 : 1 K:E Dimer. Eine exemplarische E-Spiralen-Sequenz wird in den 3B-5B gezeigt, wo das E-Spiralen-Segment in etwa die Reste mit den Nummern 13-53 der Fusionspeptid-Sequenzen ausmacht. In den zwei vorgenannten PCT-Anmeldungen wird die Sequenz einer K-Spiralen-Sequenz, die für die Dimerisierung mit dieser E-Spirale geeignet ist, dargestellt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das superspiralisierte Segment eine homodimere Sequenz sein, hier als H-Spirale ("H coil") bezeichnet, welche mit sich selbst dimerisieren kann. Exemplarische H-Spiralen-Sequenzen werden in den 3A-5A gezeigt, wobei das H-Spiralen-Segment in etwa die Reste mit den Nummern 13–53 der angegebenen Fusionspeptid-Sequenzen ausmacht. Diese zwei Segmente bilden, wenn gemischt, ein 1 : 1 Homodimer.
Um ein heterodimeres modifiziertes Pilin-Peptid herzustellen, werden Fusionsproteine, die sowohl E-Spiralen als auch K-Spiralen N-terminale Segmente enthalten, gebildet und dann gemischt, um das gewünschte Dimer herzustellen. Die zwei verschiedenen, das Dimerbildenden Peptide können modifiziertes Pilin-Protein aus demselben Stamm sein, z. B. ein PAK/PAK Pilin-Dimer, oder aus verschiedenen Stämmen stammen wie im Falle des PAK/K122 Dimers. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann eines der zwei Peptide ein nicht mit einem Pilin verwandtes Peptid sein, zum Beispiel ein Träger-Protein, dass selbst ein therapeutisches Peptid ist, z. B. ein antibakterielles Peptid-Agens, oder ein Träger-Protein, welches mit einer therapeutischen Komponente derivatisiert ist, die von dem Träger z. B. mit einer Esterase abgespalten werden kann.
Im Falle eines Homodimers sind die zwei modifizierten Pilin-Proteine üblicherweise die gleichen, obwohl Homodimere mit Pilin-Proteinen aus verschiedenen Stämmen oder mit einem Gemisch eines Pilin und Nicht-Pilin Peptids in einem Gemisch aus Dimeren mit gleichen Peptiden und verschiedenen Peptiden gebildet werden können.
Die 2A und 2B zeigen die allgemeine Herstellung von Expressionsvektoren zur rekombinanten Herstellung von modifizierten Pilin-Peptiden (Fusionspeptiden) mit einem N-terminalen H-Spiralen verkürzten Pilin-Fusions-Peptid in einem E. coli Wirt, in diesem Fall ein PAK-Peptid (2A) und einem N-terminalen E-Spiralen-verkürztem PAK Pilin-Fusions-Peptid (2B). Die Vektoren werden gemäß Standard-Verfahren durch Insertion einer geeigneten Kodierungssequenz in den pDLB Vektor, gespalten mit EcoRI und HindIII, hergestellt, [33,34]. Die in 3-5 gezeigte Polynukleotid-Sequenz erläutert beispielhafte, für die Fusionsproteine kodierende Sequenzen, die in die Vektoren inseriert werden.
Die 3A und 3B zeigen die Nukleotid- und Polypeptid-Sequenzen des N-terminalen H-Spiralen verkürzten PAK Peptids (3A) und des N-terminalen E-Spiralen verkürzten PAK-Peptids (3B) in den Vektor-Konstrukten in 2A beziehungsweise 2B. Die Nukleotid- und Polypeptid-Sequenzen sind in SEQ ID Nrn: 11 und 12 (H Spiralen Peptid) beziehungsweise SEQ ID Nrn: 13 und 14 (E Spiralen Peptid) identifiziert. Die 4A und 4B zeigen jeweils Nukleotid- und Polypeptid- Sequenzen für die H-Spiralen und E-Spiralen Fusionsproteine, wobei die Sequenzen in den SEQ ID Nrn: 15 und 16 (H-Spiralen-Peptid) beziehungsweise in den SEQ ID Nrn: 17 und 18 (E-Spiralen-Peptid) identifiziert sind. Die 5A und 5B zeigen Nukleotid- und Polypeptid-Sequenzen des N-terminal verkürzten H- Spiralen PAO Peptids (5A) beziehungsweise des N-terminal verkürzten E-Spiralen PA0-Peptids (5B), wobei die Nukleotid- und Polypeptid-Sequenzen in den SEQ ID Nrn: 19 und 20 (H-Spiralen-Peptid) beziehungsweise in den SEQ ID Nrn: 21 und 22 (E-Spiralen Peptid) identifiziert sind.
Das erfindungsgemäße, modifizierte Pilin-Peptid kann weiter modifiziert werden, um seine Immunogenität in Menschen zu verringern oder eliminieren. Dies kann z. B. durch den in der PCT Anmeldung WO 98/52976 offenbarten Ansatz erreicht werden. Kurz gesagt, involviert der Ansatz die Schritte (a) Bestimmung mindestens eines Teils der Aminosäure-Sequenz des Proteins, in diesem Fall des modifizierten Pilin-Peptids, (b) Identifizierung in der Aminosäure-Sequenz von einem oder mehr potentiellen Epitopen für T-Zellen (T-Zell-Epitope) der Spezies und (c) Modifizieren der Aminosäure-Sequenz, um mindestens eines der in Schritt (b) identifizierten T-Zell Epitope zu entfernen, wodurch die Immunogenität des Proteins beseitigt oder reduziert wird, wenn es dem Immunsystem der Spezies ausgesetzt wird.
Obwohl die folgenden Beispiele 1 bis 5, gerichtet auf Zusammensetzungen mit N-terminal verkürzten Pilin-Proteinen, nicht durch die vorliegende Erfindung umfasst sind, werden sie zu illustrativen Zwecken beibehalten. Sie zeigen beispielhaft die Herstellung und Effektivität der Proteine, die strukturell mit den beanspruchten modifizierten Pilin-Proteinen mit Ausnahme der N-terminalen Region verwandt sind, und die mit den beanspruchten Proteinen die Fähigkeit gemeinsam haben, das eigenständige Zusammensetzen der P. aeruginosa Pilin-Proteine zu verhindern und tragen somit zur Ausführbarkeit der beanspruchten Zusammensetzung bei.
Herstellung und Charaktertsierung modifizierter Pilin Proteine
A. Herstellen der kodierenden Sequenz und Konstruktion eines Expressionsvektors.
In einem allgemeinen Verfahren werden modifizierte Pilin-Proteine mittels PCR Amplifikation bekannter und verfügbarer Pilin kodierender Sequenzen unter Verwendung von Primern hergestellt, die die gewünschte Deletion, Modifizierung oder Insertion einer superspiralisierten Einheit in die amplifizierten kodierenden Sequenzen bewirken. Die Primer stellen auch geeignete Endonuclease-Spalt-Sequenzen in den amplifizierten Fragment-Enden zur Einführung in ausgewählte Insertions-Stellen eines Expressionsvektors bereit. Nach Amplifizierung und Endonuclease-Behandlung wird das kodierende Sequenzfragment gereinigt und zur Expression in einer Wirtszelle in einen geeigneten Expressionsvektor, z. B. in einen E. coli Expressionsvektor, unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors eingefügt. Das nachstehende Beispiel 1 zeigt detailliert die Konstruktion der kodierenden Sequenz und eines Expressionsvektors für das verkürzte PAK Pilin-Peptid, dessen Sequenz in 1A gezeigt ist.
Beispiel 1
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR). PCR wurde im Stratagene Robocycler 40 Thermocycler, unter Verwendung des Standard-Protokolls, durchgeführt. Jedes Reaktionsgemisch (insgesamt 100 μl), das den Reaktionspuffer 700mM Trts HCl pH 8.8, 200 mM MgCl₂, 200μM von jedem dNTP, Matrizen DNA (1μg), 825 ng von jedem der Primer und 2.5 Einheiten Taq Polymerase, enthielt, wurde 10 Min bei 94°C denaturiert, woran sich von 30 Amplifizierungszyklen (3 Min. Denaturierung bei 94°C, 2 Min Aneinanderlagern bei 58°C und 2 Min Verlängerung bei 72°C) anschlossen.
DNA-Sequenzierung. DNA aus den klonierten Plasmid-Präparationen wurden unter Verwendung der Didesoxy-Nukleotid-Methode von Sanger et al. in Kombination mit geeigneten, als Primer verwendeten Oligonukleotiden, sequenziert.
Verkürzte K122-4 Pilin-Protein-Gene. Verkürzte K122 (1–28) Pilin-Gene wurden mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) hergestellt. Zuerst wurde zuvor klonierte K122 DNA (22), die das Pilin-Gen enthielt, einer PCR unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotidprimer (mit Restriktionsstellen, die für Klonierungszwecke zugesetzt wurden) unterworfen, die den Anfang und das Ende der Nucleotidreste, entsprechend der Aminosäuren 28 und 150, flankierten. Das erhaltene PCR Produkt wurde mittels Elektrophorese auf einem 8%-igem Polyacrylamid Gel gereinigt. Fragmente von etwa 380 Bp wurden isoliert und mit den Enzymen EcoRI und HindIII gespalten. Die Spaltprodukte wurden mittels Phenol-Extraktion und nachfolgender Ethanol-Präzipitation gereinigt. 1A zeigt die Polynukleotid-Sequenz und entsprechende Aminosäure-Sequenz des verkürzten Pilin-Proteins.
Die gereinigten Spaltprodukte wurden in den pRLD Expressionsvektor in EcoRI-HindIII Stellen kloniert. Die ligierte Plasmid-DNA wurde zur Expression in den Wirtsstamm BL21 transformiert. Plasmid-DNAs wurden aus den Carbenicillin-resistenten Rekombinanten mittels des Klarlysat-Verfahrens isoliert und mit Restriktionsenzymen gespalten, um die korrekte Größe der Inserts zu kontrollieren. Rekombinante DNA, die Inserts der korrekten Größe enthielt, wurde wie oben beschrieben, in beiden Orientierungen sequenziert.
B. Expression eines modifizierten Pilin-Proteins
Das rekombinante Protein wird in einem geeigneten Wirt unter geeigneten Expressionsbedingungen gemäß allgemein bekannter Verfahren exprimiert. Bei der bakteriellen Synthese, z. B., kann das Protein aus dem periplasmatischen Raum der Bakterien oder in sezernierter Form aus dem Wirtszell-Kulturmedium erhalten werden. Das nachfolgende Beispiel 2 erläutert die Expression des vorgenannten, verkürzten PAK Pilin-Proteins in E coli.
Beispiel 2
E. coli Zellen (BL21), die das K122(1–28) Plasmid mit dem K122 verkürzten Pilin-Gen beherbergten, wurden bei 37°C in LB Medium, das Carbenicillin (100μg/ml) enthielt, bis zu einer A50 von 0,5 – 0,7 unter Schütteln angezogen. Die Herstellung rekombinanter Proteine wurde durch Zugabe von Isopropyl ß-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert. Dann wurden die Bakterien für weitere 8 Stunden bei 37°C angezogen. Das exprimierte periplasmatische Protein wurde mittels osmotischem Schock wie folgt extrahiert: Die Zellen wurden bei 4.000 g für 10 min bei 4°C geerntet und in TES Puffer (10mM Tris-HCl, 5mM EDTA, 20% Sucrose, pH 8.0) in einem Endvolumen von 80 ml pro Gramm Nassgewicht resuspendiert. Die Zellen wurden vorsichtig 10 min bei Raumtemperatur (150 UpM) geschüttelt. Die Suspension wurde dann zentrifugiert und das erhaltene Sediment wurde in 5 mM eiskaltem MgSO₄ (80 ml pro Gramm Nassgewicht) resuspendiert. Die Zellsuspension wurde vorsichtig für 30min auf Eis geschüttelt, und danach bei 8.000 g für 15 min bei 4°C zentrifugiert. Der die periplasmatische Fraktion enthaltende Überstand wurde dann durch Passage durch einen 0,45μm Filter geklärt und anschließend mittels Säulenchromatographie wie beschrieben gereinigt.
C. Protein Reinigung
Verfahren, die zur Reinigung von Pilin-Peptiden beschrieben wurden, sind geeignet, obwohl einige Modifizierungen zur Anpassung an die modifizierte Sequenz erforderlich sein können. Im Falle eines Fusions Pilin-Peptids mit einer N-terminalen superspiralisierten Peptid-Einheit kann das Fusionsprotein mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung eines immobilisierten superspiralisierten Peptids zum Einfangen des Fusionsproteins isoliert werden. 6 illustriert ein allgemeines Schema zur Reinigung eines gemäß der vorliegenden Endung hergestellten modifizierten Pilin-Proteins, die im folgenden Beispiel 3 detailliert beschrieben ist. Hierbei soll das Proteinreinigungsschema nur beispielhafter Natur sein.
Beispiel 3
Die periplasmatischen Fraktionen der transformierten bakteriellen Expressions-Wirtszellen wurden durch einen 0,45μM Filter gefiltert und mit einem gleichen Volumen von 20 mM Natriumacetat-Puffer pH 4,5 verdünnt, dann an eine Carboxymethyl-Zellulose Säule (CM-52 von 30 cm × 2 cm) adsorbiert, die zuvor mit 10 mM Natriumacetat-Puffer pH 4,5 (Basis-Puffer) äquilibriert wurde und mit einem linearen Gradienten von 0 – 0,8 M NaCl in 10 mM Natriumacetat pH 4,5 eluiert. Fraktionen (3 ml Volumen) wurden gesammelt und die Absorption bei A280 nm bestimmt. Fraktionen, die das Pilin-Protein enthielten, wurden vereinigt, gefriergetrocknet und in kleinen Volumina destillierten Wassers gelöst und dann über Sephadex G-75 fraktioniert. Wie in 7 gezeigt, war das Molekulargewicht des Pilin-Proteins (Stern in der Grafik) etwa 13 kD, übereinstimmend mit der Länge des Proteins von 129 Aminosäure-Resten (siehe 1A).
Das isolierte Protein wurde durch Elektrophorese auf einem Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gel (SDS-PAGE Gele) fraktioniert. Die Gele wurden anschließend mit Coomassie Brilliant Blau R-250 gefärbt oder auf PVDF Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit K122 IgG-Antiserum inkubiert. Der verwendete sekundäre Antikörper war Anti-Maus IgG-alkalische Phosphatase. Der gebundene Antikörper wurde mit BCIP Substrat detektiert. Die Ergebnisse (nicht gezeigt) weisen auf ein im wesentlichen reines Protein hin.
D. Fähigkeit des Fusionsprotein, mit nativen Pili um die Bindung an Rezeptor-Stellen zu konkurrieren.
Um zu bestätigen, dass das modifizierte Pilin-Peptid, einschließlich dimerisierter Formen des Peptids, in der Lage ist, mit Pili um die Bindung an Rezeptorstellen zu konkurrieren, kann das Peptid in einem kompetitiven Bindungstest mit nativen Pili getestet werden. Die Pili können von gleich-stämmigen oder verschieden-stämmigen Pseudomonas Organismen stammen. Im weiteren kann das modifizierte Pilin gegen eine Anzahl von verschiedenstämmigen Pili getestet werden, um die Kreuzspezifität, welche das Peptid wahrscheinlich als therapeutisches Agens haben würde, zu untersuchen. Das nachfolgende Beispiel 4 beschreibt einen beispielhaften Bindungstest diesen Typs.
Beispiel 4
Eine Polystyren-Mikrotiter Platte (Costar, Cambridge, MA) wurde mit 50 μl/Vertiefung Asialo-GM₁ (40 μg/ml) in Methanol beschichtet. Das Lösungsmittel wurde bei Raumtemperatur in einer Dunstabzugshaube evaporiert. Nicht-spezifische Bindungsstellen wurden mit 200 μl/Vertiefung 5% (Gew./Vol.) BSA in PBS blockiert. Nach Inkubation bei 37°C für 1,5 Stunden wurden die Vertiefungen 3 mal mit 250 μl PBS, ergänzt mit 0,05% (Gew./Vol.) BSA (Puffer A), gewaschen. Aliquots (50 μl) von biotinylierten P. aeruginosa PAK Pili (0,88 mg/ml, verdünnt 1 : 1000 in Puffer A), die verschiedene Konzentrationen von K122-4 verkürztem Pilin enthielten, wurden jeder Vertiefung zugesetzt. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Vertiefungen 5 mal mit 250 μl Puffer A gewaschen, dann wurde 50 μl/Vertiefung Streptavidin-Alkalische Phosphatase Konjugat (Gibco BRL) bei einer 1 : 3000 Verdünnung mit Puffer A zugesetzt und 1 Stunde bei Raum-Temperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Platte 5 mal mit 250 μl/Vertiefung Puffer A gewaschen. Nach dem Waschen wurden 80 μl/Vertiefung p-Nitrophenylphosphat Substrat Lösung (1 mg/ml in 10% Diethanolamin, pH 9.8) zugegeben. Die Ablesungen bei 405nm wurden aufgenommen und die Ergebnisse wurden als Prozent Hemmung ausgedrückt.
Wie in 8 gezeigt, war die prozentuale Hemmung von der Konzentration des verkürzten Proteins Dosis-abhängig.
Behandlungsverfahren
Die erfindungsgemäße modifizierte Pilin-Peptid-Zusammensetzung ist bei der Behandlung bestehender Pseudomonas-Infektion oder für eine prophylaktische Behandlung von Individuen, bei denen ein Risiko von Pseudomonas Infektionen besteht, z. B. Cystische Fibrose Patienten, Patienten mit Verbrennungen und Patienten mit schwerer Neutropenie (z. B. Krebspatienten, die eine Chemotherapie erhalten) und Intensiv-Patienten, die eine künstliche Beatmung erhalten, nützlich.
Das Peptid, das verabreicht werden soll, ist in seinem N-terminalen Segment durch Dimerbildende Einheiten modifiziert, wie zuvor ausführlich beschrieben. Weiter kann das Peptid modifiziert werden, z. B. wie in W098/52976 ausführlich für eine herabgesetzte Immunogenität beschrieben.
Eine bevorzugtes Verfahren der Verabreichung ist die Inhalation, typischerweise in einer Aerosol- oder Mikropartikel-Form. Verfahren zur Herstellung und Verabreichung der Peptide mittels Aerosol sind genau bekannt und für dieses Verfahren geeignet. Charakteristischerweise ist die Menge des verabreichten Peptids etwa 0,5 bis 25 mg/Dosis/Patient, wobei die Menge Peptid, die die Atmungswege der Lunge erreicht, von der Effizienz des Aerosols und des Verabreichungsverfahrens abhängt. Das Peptid kann regelmäßig verabreicht werden, z. B. alle 6–8 Stunden, und zwar über einen Zeitraum, bis ein zufriedenstellendes therapeutisches Ergebnis erreicht ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das Peptid zur Verabreichung durch eine transmucosale Route bereit gestellt werden, z. B. intranasal oder für intravenöse (IV), intraperitoneale (IP), intramuskuläre (IM) oder subkutane (SubQ) Injektion. Charakteristischerweise liegen geeignete Dosen bei einer Menge von 1 mg bis 50 mg, einmal am Tag oder über ein häufigeres Dosierungsschema verabreicht, obwohl höhere Dosen bei der IP, IM, oder SubQ Verabreichung erforderlich sein können, entsprechend der relativ langsamen Peptid Freisetzung und Aufnahme an Orten der Infektion. Transdermale Verabreichung kann ebenfalls wirkungsvoll sein, und zwar unter der Annahme, dass das Peptid wirksam über diese Route aufgenommen werden kann. Das nachfolgende Beispiel 5 demonstriert die therapeutische Effizienz bei intraperitonealer Verabreichung des Peptids.
Zur prophylaktischen Verabreichung kann das Peptid zur Verabreichung in einer Einzeldosis oder in mehreren Dosen bereitgestellt werden, z. B. alle 8 Stunden, und zwar für einen Zeitraum, der einem erhöhten Infektionsrisiko vorausgeht. Die Peptid Dosen können ähnlich wie vorstehend angegeben sein.
Das Peptid kann zur Verabreichung zusammen mit anti-bakteriellen Agenzien, typischerweise nicht-peptidischen Agenzien bereitgestellt werden, die üblicherweise verwendet werden, um Pseudomonas-Infektionen zu behandeln.
Beispiel 5
A. BY/SnJ Mäuse wurden verwendet, da sie gegenüber P. aeruginosa Infektionen weniger resistent als andere Maus-Stämme sind. Gewicht: 18–20 Gramm; Alter: 10 Wochen. K122-4 verkürztes Pilin (1A) wurde A.BY/SnJ Mäusen intraperitoneal verabreicht, 15 Minuten bevor die Mäuse intraperitoneal mit PAK Wildtyp bei einer 3LD₅₀ infiziert wurden. Die Mäuse wurden im Stundenrhythmus zwischen 16 und 48 Stunden beobachtet. Wie festgestellt wurde, war das prozentuale Überleben innerhalb des Bereichs der getesteten Pilin-Protein Mengen Dosis-abhängig.
Aus dem vorhergehenden kann gefolgert werden, dass (i) ein N-terminal modifiziertes Pilin-Protein, welches unfähig ist, zu oligomerisieren (eigenständiges Zusammensetzen, „self-assemble"), leicht als ein sezerniertes prozessiertes Protein in einem rekombinanten Expressionssystem exprimiert wird; (ii) das modifizierte Protein eine funktionelle epitheliale Zellrezeptor-Bindedomäne bewahrt, die die Bindung an GalNAcGal enthaltende Glycokonjugate vermittelt; (iii) das modifizierte Protein bei einer Protein-Konzentration von <600 μg/ml ein Monomer ist; (iv) die Vor-Verabreichung des modifizierten Proteins in Säugern einen Dosis-abhängigen Schutz vor Exposition mit einem heterologen P. aeruginosa Stamm verleiht.
Obwohl die Erfindung unter Bezug auf spezifische Ausführungsformen beschrieben worden ist, soll sie so verstanden werden, dass eine Vielzahl verschiedener N-terminaler Modifizierungen von Pilin-Peptiden und eine Vielzahl verschiedener P. aeruginosa Stämme eingesetzt werden können, ohne den Sinn der Erfindung zu verlassen.
SEQUENZPROTOKOLL

SEQ ID Nr:l: Polynukleotid-Sequenz von modifiziertem K122 Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:2: Polypeptid-Sequenz von modifiziertem K122 Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:3: Polynukleotid-Sequenz von modifiziertem PAK Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:4: Polypeptid-Sequenz von modifiziertem PAK Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:5: Polynukleotid-Sequenz von modifiziertem PAO Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:6: Polypeptid-Sequenz von modifiziertem PAO Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:7: Polynukleotid-Sequenz von modifiziertem P1 Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:8: Polypeptid-Sequenz von modifiziertem P1 Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:9: Polynukleotid-Sequenz von modifiziertem KB7 Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:10: Polypeptid-Sequenz von modifiziertem KB7 Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:l 1: Polynukleotid-Sequenz von H-Spiralen/verkürztem PAK Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:12: Polypeptid-Sequenz von H-Spiralen/verkürztem PAK Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:13: Polynukleotid-Sequenz von E-Spiralen/verkürztem PAK Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:14: Polypeptid-Sequenz von E-Spiralen/verkürztem PAK Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:15: Polynukleotid-Sequenz von H-Spiralen/verkürztem K122 Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:16: Polypeptid-Sequenz von H-Spiralen/verkürztem K122 Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:17: Polynukleotid-Sequenz von E-Spiralen/verkürztem K122 Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:18: Polypeptid-Sequenz von E-Spiralen/verkürztem K122 Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:19: Polynukleotid-Sequenz von H-Spiralen/verkürztem PAO Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:20: Polypeptid-Sequenz von H-Spiralen/verkürztem PAO Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:21: Polynukleotid-Sequenz von E-Spiralen/verkürztem PAO Pilin-Peptid;
SEQ ID Nr:22: Polypeptid-Sequenz von E-Spiralen/verkürztem PAO Pilin-Peptid.

Claims

Zusammensetzung für die Verwendung in der Behandlung oder Verhinderung einer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa, umfassend ein Pilinpeptid von P. aeruginosa, das einen N-terminalen Peptidbereich besitzt, der durch eine Peptideinheit ersetzt wurde, die ein superspiralisiertes α-Helix-Homodimer oder -Heterodimer bilden kann, _ wobei die Zusammensetzung zwei modifizierte Pilinpeptide enthält, die durch eine superspiralisierte α-Helix-Heterodimer- oder -Homodimer-Wechselwirkung miteinander verbunden sind, wobei die modifizierten Pilinpeptide die in SEQ 1D Nr. 2, 4, 6, 8 oder 10 dargestellte Sequenz besitzen.
Verwendung eines Pilinpeptids von P. aeruginosa, das einen modifizierten Nterminalen Peptidbereich besitzt, der durch eine Peptideinheit ersetzt wurde, die ein superspiralisiertes α-Helix-Homodimer oder -Heterodimer bilden kann, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Verhinderung einer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa in einem Individuum, wobei die Zusammensetzung zwei modifizierte Pilinpeptide enthält, die durch eine superspiralisiertes α-Helix-Heterodimer- oder -Homodimer-Wechselwirkung miteinander verbunden sind, und wobei die modifizierten Pilinpeptide die in SEQ 1D Nr. 2, 4, 6, 8 oder 10 dargestellte Sequenz besitzen.