DE69228015T2 - Antithrombin-Polypeptide - Google Patents

Antithrombin-Polypeptide

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide und ihre Herstellung. Die Polypeptide wurden aus dem Blutegel Hirudinaria manillensis isoliert. Die Polypeptide haben Antithrombin-Eigenschaften.
  • Die am weitesten verbreiteten gerinnungshemmenden Peptide sind wahrscheinlich diejenigen, die zur Familie der Hirudine gehören. Hirudin, ursprünglich aus dem medizinischen Blutegel isoliert, Hirudo medicinalis, ist ein wohlbekannter und gut charakterisierter polypeptidischer Inhibitor für Thrombin1,2. Insbesondere bindet es Thrombin durch ionische Wechselwirkungen und verhindert so die Spaltung von Fibrinogen zu Fibrin und die anschließende Fibrin-Gerinselbildung. In Tierversuchen hat Hirudin Wirksamkeit bei der Verhinderung von Thrombophlebitis, Gefäß-Shunt-Verschluß und Thrombin-induzierter verstreuter intravaskulärer Koagulation gezeigt. Zusätzlich weist Hirudin eine niedrige Toxizität, geringe oder keine Antigenität und eine sehr kurze Clearance-Zeit aus dem Kreislauf auf.
  • Polypeptide mit gerinnungshemmenden Eigenschaften wurden aus einer unterschiedlichen Blutegelart isoliert, Hirudinaria manillensis (EP-A- 0347376 und WO 90/05143). Dieser Blutegel ist evolutionsmäßig fortgeschrittener als Hirudo medicinalis und könnte deshalb gerinnungshemmende Peptide synthetisieren, deren Aminosäuresequenzen von denen von Hirudin und anderen bekannten Hirudin-Varianten unterschiedlich sein können.
  • Wir haben eine Zubereitung analysiert, erhalten aus Hirudinaria manillensis-Blutegeln. Wir haben drei neue Polypeptide mit Antithrombin- Wirkung gefunden. Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid mit Antithrombin-Aktivität bereit, welches die Aminosäuresequenz umfaßt: (i) P1 (SEQ ID NO: 1, worin Xaa in den Positionen 61 und 65 Yaa bzw. Zaa anzeigen) (ii) P2 (SEQ ID NO: 2, worin Xaa in den Positionen 61 und 65 Yaa bzw. Zaa anzeigen)
  • oder (iii) P3 (SEQ ID NO: 3)
  • und pharmazeutisch akzeptable Salze davon.
  • Aminosäurereste werden gemäß dem 3-Buchstaben-Code (Eur. J. Biochem. 138, 9-37, 1984) angegeben. Ein Rest Yaa stellt einen Asp- oder Tyr-Rest dar, und Zaa ist -OH, -NH&sub2; oder Gly-OH. Die Salze können Säureadditions salze sein. Sie können Salze mit einer anorganischen Säure sein, wie einer Halogenwasserstoffsäure, wie Chlorwasserstoffsäure; Schwefelsäure, Phosphorsäure; oder Pyrophosphorsäure. Die Salze können Salze mit einer organischen Säure sein, wie Benzolsulfon-, p-Toluolsulfon-, Methansulfon-, Essig-, Milch-, Palmitin-, Stearin-, Äpfel-, Wein-, Ascorbin- oder Zitronensäure. Die Polypeptide können ebenfalls freie Carboxyl-Gruppen enthalten und können deshalb als Natrium-, Calcium-, Kalium-, Magnesium- oder Ammoniumsalze oder als Salze mit einer physiologisch tolerierbaren organischen stickstoffhaltigen Base vorliegen. Die Polypeptide können ebenfalls in Form von inneren Salzen sein.
  • Die Polypeptide der Erfindung bestehen deshalb im wesentlichen aus den Aminosäuresequenzen (i) bis (iii). Die aus Hirudinaria manillensis- Blutegeln isolierten natürlichen Polypeptide haben die Aminosäuresequenz (i) oder (ii), worin Yaa Asp ist und Zaa -OH ist, oder die teilweise Aminosäuresequenz (iii). Die Polypeptide der Erfindung können zur Verwendung als Antithrombin-Mittel isoliert und gereinigt werden.
  • Den Polypeptiden kann alles oder ein Teil einer Leitsequenz vorangehen. Die Leitsequenz kann eine native oder fremde Leitsequenz hinsichtlich der Zelle sein, in der ein Polypeptid erhalten wird. Die Leitsequenz kann die Sekretion des Polypeptids aus der Zelle dirigieren, zwei der natürlichen Polypeptide der Erfindung werden mit einer Leitsequenz exprimiert, die anschließend abgespalten wird. Alles oder ein Teil dieser Leitsequenz kann deshalb vorhanden sein, wobei die Sequenz ist:
  • Ein erfindungsgemäßes natürliches Polypeptide oder Salze davon kann durch Isolieren des Polypeptids oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon aus dem Gewebe oder Sekretionen aus einem Blutegel der Art Hirudinaria manillensis hergestellt werden. Insbesondere kann ein erfindungsgemäßes Polypeptid erhalten werden durch Erhalt einer Zubereitung gemäß WO 90/05143 und Durchführen von Hochdruckflüssigchromatographie an der Zubereitung.
  • Ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder ein Salz davon kann ebenfalls hergestellt werden durch:
  • (a) Bereitstellen eines Wirtes, der mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der eine DNA-Sequenz umfaßt, die das Polypeptid kodiert, unter solchen Bedingungen, daß das Polypeptid darin exprimiert wird; und
  • (b) Isolieren des so erhaltenen Polypeptids oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon.
  • Dieser Ansatz beruht typischerweise auf dem Erhalt einer Nukleotidsequenz, die das Polypeptid kodiert, das man zu exprimieren wünscht, und der Expression des Polypeptids in rekombinanten Organismen. Die Kultivierung der genetisch modifizierten Organismen führt zur Produktion des gewünschten Produkts, das die volle biologische Aktivität zeigt. Die vorliegende Erfindung stellt deswegen zusätzlich bereit:
  • - einen Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid der Erfindung kodiert;
  • - einen mit einem kompatiblen Expressionsvektor gemäß der Erfindung transformierten Wirt; und
  • - eine DNA-Sequenz, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodiert.
  • Ein Wirt, in dem ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimiert werden kann, wird hergestellt durch Transformieren eines Wirtes mit einem kompatiblen Expressionsvektor der Erfindung. Der Expressionsvektor kann hergestellt werden durch:
  • (a) chemisches Synthetisieren einer DNA-Sequenz, die ein Polypeptid der Erfindung kodiert; und
  • (b) Insertieren der DNA in einen Expressionsvektor.
  • Alternativ kann ein Expressionsvektor hergestellt werden durch:
  • (a) Herstellen und Isolieren einer cDNA, die das Polypeptid der Erfindung aus mRNA kodiert, aus einem Blutegel der Art Hirudinaria manillensis; und
  • (b) Insertieren der isolierten cDNA in einen Expressionsvektor.
  • Ein erfindungsgemäßes Polypeptid wird als Konsequenz hergestellt durch Bereitstellen eines transformierten Wirtes unter solchen Bedingungen, daß das Polypeptid darin exprimiert wird. Wenn ein eukaryotischer Wirt eingesetzt wird, kann das Polypeptid in glycosylierter Form erhalten werden. Das Polypeptid kann als solches oder in Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes isoliert werden. Auf diese Weise kann ein Polypeptid oder Salz gemäß der Erfindung in reiner Form erhalten werden.
  • Die Polypeptide der Erfindung können mittels Aminosäureverlängerung an einem oder beiden Enden modifiziert werden. Ein aus einer solchen verlängerten Sequenz zusammengesetztes Polypeptid muß natürlich noch Antithrombin-Aktivität aufweisen. Z. B. kann eine kurze Sequenz von bis zu 30 Aminosäureresten an einem oder beiden Termini bereitgestellt werden.
  • Die Polypeptide der Erfindung können einer oder mehr post-translationalen Modifizierung unterworfen werden, wie Sulfatierung, COOH- Amidierung, Acylierung oder chemischer Veränderung der Polypeptidkette. Z. B. kann ein Polypeptid mit einem Glycin-Rest an seinem Carboxy-Terminus der enzymatischen Amidierung mit Peptidyl-glycin-a-amidierender Monooxygenase (PAM-Enzym) unterworfen werden.
  • Um ein Antithrombin-Polypeptid durch rekombinante DNA-Technologie herzustellen, wird ein Gen hergestellt, das ein Polypeptid der Erfindung kodiert. Die kodierende DNA-Sequenz schließt typischerweise keine Introns ein. Die DNA-Sequenz wird isoliert und gereinigt. Das Gen wird in einen Expressionsvektor insertiert, der die Produktion des rekombinanten Produkts antreiben kann. Die DNA-Sequenz kann eine cDNA-Sequenz sein. Die DNA- Sequenz kann eine synthetische DNA-Sequenz sein. Das synthetische Gen wird typischerweise hergestellt durch chemisches Synthetisieren von Oligonukleotiden, die insgesamt dem gewünschten Gen entsprechen. Die Oligonukleotide werden dann zusammengesetzt, um das Gen zu erhalten.
  • Ein Gen kann deshalb aus sechs chemisch synthetisierten Oligonukleotiden aufgebaut werden, wobei jedes Oligonukleotid etwa ein Drittel eines Stranges eines doppelsträngigen DNA-Gens darstellt. Die Oligonukleotide werden ligiert und verschmolzen, um das gewünschte Gen zu erhalten. Falls erwünscht, kann die Gen-Sequenz durch Stellen-gerichtete Mutagenese zur Einführung eines oder mehrerer Kodonänderungen modifiziert werden.
  • Typischerweise wird ein Gen mit Restriktionsstellen an jedem Ende aufgebaut, um seine anschließende Manipulation zu erleichtern.
  • Eine DNA-Sequenz kann bereitgestellt werden, die weiterhin ein Leitpeptid, wie oben erwähnt, kodiert. Das Leitpeptid kann die Sekretion des Polypeptids aus Zellen, in denen das Polypeptid exprimiert werden soll, dirigieren. Die Sequenz, die das Leitpeptid kodiert, ist typischerweise an das 5-Ende der DNA-Sequenz fusioniert, die das Polypeptid kodiert.
  • Das Leitpeptid kann das OmpA-Leitpeptid sein, wenn eine Expression in einem bakteriellen Wirt, wie E. coli, gefordert ist. Das Leitpeptid kann das Leitpeptid des vesikulären Stomatitis-Virus G Proteins (VSV G-Protein) sein, wenn die Expression in Insektenzellen stattfinden soll. Geeignete DNA-Sequenzen, die die OmpA- und VSV G-Protein-Leitsequenzen kodieren, sind: OmpA-Leitsequenz (SEQ ID NO: 4): VSV G Protein-Leitsequenz (SEQ ID NO: 5):
  • Es kann eine DNA-Sequenz bereitgestellt werden, die ein Fusionsprotein kodiert, welches zur Freisetzung eines Polypeptids der Erfindung abspaltbar ist. Eine DNA-Sequenz kann verwendet werden, die eine Träger- Polypeptidsequenz kodiert, die über eine abspaltbare Verknüpfung an den N- Terminus eines Polypeptids der Erfindung fusioniert ist. Die abspaltbare Verknüpfung kann eine solche sein, die durch Cyanbromid abspaltbar ist.
  • Zur Expression des Polypeptids wird ein Expressionsvektor konstruiert, der eine DNA-Sequenz umfaßt, die das Polypeptid kodiert, und der das Polypeptid exprimieren kann, wenn er in einem geeigneten Wirt bereitgestellt wird. Entsprechende transkriptionale und translationale Kontrollelemente werden bereitgestellt, einschließlich eines Promotors für die DNA- Sequenz, einer transkriptionalen Terminierungsstelle und translationaler Start- und Stop-Kodons. Die DNA-Sequenz wird im korrekten Rahmen bereitgestellt, um zu ermöglichen, daß die Expression des Polypeptids in einem mit dem Vektor kompatiblen Wirt auftritt.
  • Der Expressionsvektor umfaßt typischerweise einen Replikationsursprung und, falls erwünscht, ein auswählbares Marker-Gen, wie ein antibiotisches Resistenz-Gen. Ein Promotor wird funktionsfähig mit der DNA- Sequenz verknüpft, die das Polypeptid kodiert. Der Expressionsvektor kann ein Plasmid sein. In diesem Fall wird bevorzugt ein aus den Ptrp- und Plcc/lac-Promotoren ausgewählter Promotor funktionsfähig mit der DNA- Sequenz verknüpft. Alternativ kann der Expressionsvektor ein Virus sein. Das Virus kann ein rekombinantes Baculovirus sein, in dem der Polyhedrin- Promotor funktionsfähig mit der DNA-Sequenz verknüpft ist, die das Polypeptid kodiert.
  • Eine Expressionsvektor, der das Polypeptid exprimieren kann, kann auf jede zweckmäßige Weise hergestellt werden. Ein DNA-Fragment, das das Polypeptid kodiert, kann in eine entsprechende Restriktionsstelle eines Expressionsvektors, z. B. eines Plasmidvektors, insertiert werden. Ein rekombinantes Baculovirus kann hergestellt werden durch:
  • (i) Klonieren eines Gens, das das Polypeptid kodiert, in einen Baculovirus-Transfervektor an einer stromabwärts liegenden Restriktionsstelle des Polyhedrinpromotors; und
  • (ii) Co-Transfizieren von Insektenzellen, die für eine Baculovirus- Infektion anfällig sind, mit dem rekombinanten Transfervektor aus Schritt (i) und intakter Baculovirus-DNA vom Wild-Typ.
  • Homologe Rekombination tritt auf, was in einem rekombinanten Baculovirus resultiert, das das Polypeptidgen stromabwärts des Polyhedrin promotors beherbergt. Der Baculovirus-Transfervektor kann einer mit einer einzigartigen Klonierungsstelle stromabwärts des Polyhedrin-ATG-Startkodons sein. Das Produkt, das dann durch das resultierende rekombinante Baculovirus exprimiert wird, wird ein Fusionsprotein sein, in dem ein N-terminaler Anteil des Polyhedrinproteins an den N-Terminus des Polypeptids fusioniert ist. Wie oben angegeben, kann eine abspaltbare Verknüpfung an der Fusionsverbindung bereitgestellt werden.
  • Die in Schritt (ii) eingesetzten Insektenzellen sind typischerweise Spodoptera frugiperda-Zellen. Das Baculovirus vom Wild-Typ ist typischerweise das Autographa california nukleäre Polyhedrosis-Virus (AcNPV).
  • Ein Expressionsvektor, der das Polypeptid kodiert, wird in einem geeigneten Wirt bereitgestellt. Zellen werden mit dem Polypeptid-Gen transformiert. Ein transformierter Wirt wird unter solchen Bedingungen bereitgestellt, daß das Polypeptid darin exprimiert wird. Z. B. werden transformierte Zellen so kultiviert, daß sie das Auftreten der Expression ermöglichen. Jedes kompatible Wirt-Vektor-System kann eingesetzt werden.
  • Der transformierte Wirt kann ein prokaryotischer oder eukaryotischer Wirt sein. Ein bakterieller oder Hefe-Wirt kann eingesetzt werden, z. B. E. coli oder S. cerevisiae. Gram-positive Bakterien können eingesetzt werden. Ein bevorzugter bakterieller Wirt ist ein Stamm von E. coli Typ B. Insektenzellen können alternativ verwendet werden, wobei in diesem Fall ein Baculovirus-Expressionssystem geeignet ist. Die Insektenzellen sind typischerweise Spodoptera frugiperda-Zellen. Als eine weitere Alternative können Zellen einer Säugetier-Zellinie transformiert werden. Ein transgenisches Tier, z. B. ein nicht-menschliches Säugetier, kann bereitgestellt werden, in dem das Polypeptid hergestellt wird.
  • Das Polypeptid, das exprimiert wird, kann isoliert und gereinigt werden. Ein Polypeptid mit einer der obigen Aminosäuresequenzen (i), (ii) oder (iii), denen ein Met-Rest vorangeht, der einem Translations-Startkodon zugeordnet werden kann, können erhalten werden. Alternativ kann, wie oben erwähnt, ein Fusionsprotein erhalten werden, das die Aminosäuresequenz eines Polypeptids der Erfindung umfaßt, d. h. die obige Sequenz (i), (ii) oder (iii), die an eine Trägersequenz fusioniert ist. Wenn eine geeignete Verknüpfung im Fusionsprotein zwischen der Aminosäuresequenz (i), (ii) oder (iii) und der Trägersequenz bereitgestellt wird, kann ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz (i), (ii) oder (iii) durch Spaltung mit einem geeigneten Mittel freigesetzt werden.
  • Ein Polypeptid der Erfindung oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon kann ebenfalls hergestellt werden durch:
  • (a) chemisches Synthetisieren des Polypeptids, und
  • (b) Isolieren des so erhaltenen Polypeptids oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon.
  • Die Polypeptide können deshalb durch chemische Synthese aus einzelnen Aminosäuren und/oder vorgebildeten Peptiden aus zwei oder mehr Aminosäuren in der Reihenfolge der Sequenz des gewünschten Polypeptids aufgebaut werden. Festphasen- oder Lösungsverfahren können eingesetzt werden. Das resultierende Polypeptid kann zu einem pharmazeutisch akzeptablen Salz konvertiert werden, falls erwünscht.
  • Bei der Festphasensynthese wird die Aminosäuresequenz des gewünschten Polypeptids sequenziell von der C-terminalen Aminosäure aufgebaut, die an ein unlösliches Harz gebunden ist. Wenn das gewünschte Polypeptid hergestellt wurde, wird es vom Harz abgespalten. Wenn die Lösungsphasensynthese eingesetzt wird, kann das gewünschte Polypeptid von der C-terminalen Aminosäure aufgebaut werden. Die Carboxy-Gruppe dieser Säure bleibt durchgehend durch eine geeignete Schutzgruppe blockiert, die am Ende der Synthese entfernt wird.
  • Unabhängig davon, welche Technik eingesetzt wird, Festphase oder Lösungsphase, hat jede zum Reaktionssystem hinzugegebene Aminosäure typischerweise eine geschützte Amino-Gruppe und eine aktivierte Carboxy-Gruppe. Funktionelle Seitenkettengruppen sind ebenfalls geschützt. Nach jedem Schritt in der Synthese wird die Amino-Schutzgruppe entfernt. Fuktionelle Seitenkettengruppen werden im allgemeinen am Ende der Synthese entfernt.
  • Ein Polypeptid kann zu einem pharmazeutisch akzeptablen Salz konvertiert werden. Es kann zu einem Säureadditionssalz mit einer organischen oder anorganischen Säure konvertiert werden. Geeignete Säuren schließen Essig-, Bernstein- und Chlorwasserstoffsäure ein. Alternativ kann das Peptid zu einem Carbonsäuresalz konvertiert werden, wie dem Ammoniumsalz oder einem Alkalimetallsalz, wie dem Natrium- oder Kaliumsalz.
  • Ein Polypeptid oder pharmazeutisch akzeptables Salz davon kann in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Arzneimittelzusatzstoff dafür. Solch eine Formulierung ist typischerweise für die intravenöse Verabreichung (wobei in diesem Fall der Träger im allgemeinen sterile Salzlösung oder Wasser von akzeptabler Reinheit ist). Ein erfindungsgemäßes Polypeptid ist ein Antithrombin und ist geeignet zur Behandlung von thromboembolischen Ereignissen, wie der Blutkoagulation, typischerweise in einem menschlichen Patienten. Ein Polypeptid kann deshalb zur Therapie und Prophylaxe von Thrombosen und Thromboembolien verwendet werden, einschließlich der Prophylaxe von postoperativen Thrombosen, zur akuten Schocktherapie (z. B. für septischen oder polytraumatischen Schock), zur Therapie von Konsumptionskoagulopathien, in Hämodialysen, Hämoseparationen und im extrakorporalen Blutkreislauf. In einer Ausführungsform der Erfindung kann das Polypeptid oder Salz davon mit einem Plasminogenaktivator co-verabreicht werden, wie dem Gewebe-Plasminogenaktivator.
  • Die Dosierung hängt speziell von der spezifischen Form der Verabreichung und dem Zweck der Therapie oder Prophylaxe ab. Die Größe der individuellen Dosierungen und das Verabreichungsregime können am besten durch eine individuelle Beurteilung des besonderen Krankheitsfalles bestimmt werden; die Verfahren zur Bestimmung der relevanten Blutfaktoren, die für diesen Zweck erforderlich sind, sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt. Normalerweise liegt die therapeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen im Falle einer Injektion in einem Dosisbereich von etwa 0,005 bis etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht. Ein Bereich von 0,01 bis etwa 0,05 mg/kg Körpergewicht ist bevorzugt. Die Verabreichung wird durch intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektion bewirkt. Entsprechend enthalten pharmazeutische Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung in Einheitsarzneiformen pro Dosis, abhängig vom Verabreichungsmodus, etwa 0,4 bis etwa 7,5 mg der erfindungsgemäßen Verbindung. Zusätzlich zum Wirkstoff enthalten diese pharmazeutischen Zusammensetzungen gewöhnlich ebenfalls einen Puffer, z. B. einen Phosphatpuffer, der den pH-Wert zwischen etwa 3,5 und 7 halten soll, und ebenfalls Natriumchlorid, Mannit oder Sorbit zum Einstellen der Isotonie. Sie können in gefriergetrockneter oder gelöster Form sein, wobei es für Lösungen in vorteilhafter Weise möglich ist, ein antibakteriell wirksames Konservierungsmittel zu enthalten, z. B. 0,2 bis 0,3% 4-Hydroxybenzoesäuremethylester oder -ethylester.
  • Eine Zusammensetzung zur topischen Anwendung kann in Form einer wäßrigen Lösung, einer Lotion oder eines Gels, einer öligen Lösung oder Suspension oder einer fetthaltigen oder insbesondere emulgierten Salbengrundlage sein. Eine Zusammensetzung in Form einer wäßrigen Lösung wird z. B. erhalten durch Auflösen der erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder eines therapeutisch akzeptablen Salzes davon in einer wäßrigen Pufferlösung mit z. B. pH 4 bis pH 6,5 und, falls gewünscht, Zugeben eines weiteren Wirkstoffs, z. B. eines entzündungshemmenden Mittels, und/oder eines Polymerbinders, z. B. Polyvinylpyrrolidon und/oder eines Konservierungsmittels. Die Konzentration des Wirkstoffs beträgt etwa 0,1 bis etwa 1,5 mg, bevorzugt 0,25 bis 1,0 mg, in 10 ml einer Lösung oder 10 g eines Gels.
  • Eine ölige Verabreichungsform zur topischen Anwendung wird z. B. erhalten durch Suspendieren des erfindungsgemäßen Wirkstoffs oder eines therapeutisch akzeptablen Salzes davon in einem Öl, gegebenenfalls unter Zugabe von Quellmitteln, wie Aluminiumstearat, und/oder oberflächenaktiven Stoffen (Tensiden) mit einem HLB-Wert ("hydrophile-lipophile Balance") von unter 10, wie Fettsäuremonoestern von mehrwertigen Alkoholen, z. B. Glycerinmonostearat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonostearat oder Sorbitanmonooleat. Eine fetthaltige Salbengrundlage wird z. B. erhalten durch Suspendieren des erfindungsgemäßen Wirkstoffs oder eines Salzes davon in einer verstreichbaren fettigen Basis, gegebenenfalls unter Zugabe eines Tensids mit einem HLB-Wert von unter 10. Eine emulgierte Salbengrundlage wird erhalten durch Verreiben einer wäßrigen Lösung des erfindungsgemäßen Wirkstoffs oder eines Salzes davon in einer weichen verstreichbaren fettigen Basis unter Zugabe eines Tensids mit einem HLB-Wert von unter 10. Alle diese Formen zur topischen Anwendung können ebenfalls Konservierungsmittel enthalten. Die Konzentration an Wirkstoff beträgt etwa 0,1 bis etwa 1,5 mg, bevorzugt 0,25 bis 1,0 mg, in etwa 10 g der Basis.
  • Zusätzlich zu den oben beschriebenen Zusammensetzungen und dazu analogen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zur direkten medizinischen Verwendung im Körper eines Menschen oder eines Säugetiers gedacht sind, betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen und Zubereitungen zur medizinischen Verwendung außerhalb des lebenden Körpers von Menschen oder Säugetieren. Solche Zusammensetzungen und Zubereitungen werden speziell als gerinnungshemmende Additive für Blut verwendet, das einem Kreislauf oder der Behandlung außerhalb des Körpers (z. B. extrakorporaler Kreislauf oder Dialyse in künstlichen Nieren), der Konservierung oder Modifizierung (z. B. Hämoseparation) unterworfen wird. Solche Zubereitungen, wie Vorratslösungen oder alternativ Zubereitungen in Einheitsarzneiform, sind in der Zusammensetzung den oben beschriebenen Injektionszubereitungen ähnlich; jedoch ist die Menge oder Konzentration des Wirkstoffs in vorteilhafter Weise auf das Volumen des zu behandelnden Blutes oder, präziser, auf seinen Thrombin-Gehalt bezogen. In diesem Zusammenhang muß bedacht werden, daß der erfindungsgemäße Wirkstoff (in freier Form) etwa das 5-fache der Gewichtsmenge an Thrombin vollständig deaktiviert, selbst in relativ großen Mengen physiologisch harmlos ist und aus dem Blutkreislauf selbst in hohen Konzentrationen schnell eliminiert wird, so daß kein Risiko einer Überdosis besteht, z. B. selbst während Transfusionen. Abhängig vom speziellen Zweck beträgt die geeignete Dosis etwa 0,01 bis etwa 1,0 mg des Wirkstoffs/l Blut, obwohl die obere Grenze ohne Risiko noch überschritten werden kann.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Zu den begleitenden Abbildungen:
  • Fig. 1 ist ein Chromatogramm, das die Ergebnisse der HPLC-Analyse des Beispiels 1 zeigt. P1 bis P3 zeigen die drei unterschiedlichen Peaks an, die aus der Zubereitung gemäß Beispiel 1 erhalten sind, FT steht für Durchfluß, und 4-AB steht für 4-Aminobenzamidin.
  • Fig. 2 zeigt die Elutionsprofile, die in Beispiel 2(b) für Trypsin- verdautes PE-P1 (A) und PE-P2 (B) erhalten sind.
  • Fig. 3 zeigt die Nukleotidsequenz der sechs Oligonukleotide, die für das meiste des Proteins kodieren, das Peak 2 (P2) entspricht, worin der Aminosäurerest in Position 61 Asp ist und die letzte Aminosäure der Polypeptidkette Asn&sub6;&sub4; ist. Die in Fettdruck gezeigte Sequenz zeigt die BalI- Stelle an, die für weitere Konstruktionen verwendet wurde. Der untere Teil der Figur zeigt den Modus des Zusammenbaus der sechs Oligonukleotide. HindIII- und PstI-Stellen wurden eingeschlossen, um anschließende Manipulationen zu erlauben. Die Oligonukleotide 1-6 sind die SEQ ID NOS: 37-42, respektive.
  • Fig. 4 zeigt das Konstruktionsschema des intermediären Plasmids M13-P2, welches die Quelle eines BalI-BamHI-DNA-Fragments für alle weiteren P2-Kontruktionen ist.
  • Fig. 5 zeigt schematisch die Konstruktion eines neuen rekombinanten M13, genannt OMP-P2, welches das komplette P2-Gen trägt, das an das OmpA- Leitpeptid geknpüft ist. Die Leitpeptidsequenz ist in Fettdruck gezeigt, während das stumpfe BalI-Ende und das klebrige HindIII-Ende unterstrichen sind. Die Oligonukleotide 1 und 2 sind die SEQ ID NOS: 43 bzw. 44.
  • Fig. 6 zeigt schematisch die Konstruktion von pFC-P2, welches das zur Herstellung des P2-Proteins in E. coli verwendete Plasmid ist.
  • Fig. 7 zeigt die allgemeine Struktur des Plasmids pOMPA-P2, das zur Herstellung von P2 in E. coli verwendet wird. Wir setzten herkömmliche Gen- Manipulationstechniken zur Herstellung dieses neuen Plasmids ein, worin das P2-Gen unter transkriptionaler Kontrolle des Hybridpromotors Plpp/lac ist. Selbst in diesem Fall treibt das OmpA-Leitpeptid die Sekretion von P2 zum Periplasma von E. coli.
  • Fig. 8 zeigt die Nukleotidsequenz und den Zusammenbau der für die Sekretion von P2 aus Insektenzellen verwendeten synthetischen Oligo nukleotide. Die in Fettschrift gezeigte Sequenz zeigt das VSV G-Protein- Leitpeptid an. Die Oligonukleotide 1 und 2 sind die SEQ ID NOS: 45 bzw. 46.
  • Fig. 9 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines neuen rekombinanten M13, genannt VSV-P2, worin das komplette P2-Gen an das VSV G-Protein-Leitpeptid geknüpft ist.
  • Fig. 10 zeigt schematisch die Konstruktion von pAc-P2, das als Transfervektor zum Baculovirus-Genom verwendet wurde. pAcYM1 ist das Startplasmid, das weithin als Akzeptor für heterologe Sequenzen verwendet wird, die in das Virus übertragen werden sollen.
  • Fig. 11 zeigt die Nukleotidsequenz und den Aufbau der synthetischen Oligonukleotide, die für den Beginn der P2-Kette kodieren. Das ATG-Kodon, das für den zusätzlichen Methionin-Rest kodiert, ist in Fettdruck gezeigt. Die Oligonukleotide 1 und 2 sind die SEQ ID NOS: 47 bzw. 48.
  • Fig. 12 zeigt schematisch die Konstruktion von pAcFT1, das zur intrazellulären Expression verwendet wurde. Die Oligonukleotide 1 und 2 sind die SEQ ID NOS: 49 bzw. 50.
  • Fig. 13 ist eine schematische Darstellung eines neuen Transferplasmids, genannt pAcFT1-P2, das die komplette P2-Sequenz trägt, die an die ersten 18 Aminosäuren von Polyhedrin geknüpft ist. Dieses Plasmid wurde verwendet, um die heterologe Sequenz zum Baculovirus-Genom zu übertragen.
  • Fig. 14 ist eine schematische Darstellung des RACE-Protokolls zur Amplifizierung der 3'-Enden. In der Figur stellt "***TTTT..." den dT17- Adapter-Primer dar. In jedem Schritt ist das Diagramm vereinfacht, um nur zu erläutern, wie das während des vorhergehenden Schrittes gebildete neue Produkt eingesetzt wird.
  • Fig. 15 ist eine schematische Darstellung des RACE-Protokolls zur Amplifizierung der 5'-Enden. In der Figur stellt "***TTTT..." bzw. "***" den dT17-Adapter-Primer und den Adapter-Primer dar. In jedem Schritt ist das Diagramm vereinfacht, um nur zu erläutern, wie das während des vorhergehenden Schrittes gebildete neue Produkt eingesetzt wird.
    • Beispiel 1
  • Eine Antithrombin-Zubereitung wurde aus Hirudinaria manillensis- Blutegeln gemäß WO 90/05143 hergestellt, wobei dem unten unter a) und b) erläuterten Verfahren gefolgt wurde:
    • a) Aceton-Extraktion
  • Ethanol-getrocknete Blutegelköpfe (2920 g) wurden in kleine Stücke fein zerhackt und mit einer Mischung aus 40 : 60 Aceton/Wasser (7,5 l) behandelt. Nach Homogenisieren unter Rühren bei Raumtemperatur wurde die Mischung für 15 min bei 2 700 U.p.M. zentrifugiert, und der Überstand wurde abdekantiert; das Pellet wurde wieder in einer Mischung aus 40 : 60 Aceton : Wasser suspendiert, für 30 min gerührt, und die Mischung wurde für 15 min bei 2 700 U.p.M. zentrifugiert. Der Überstand wurde mit dem ursprünglichen vereinigt und mit Eisessig (Volumen von 8,5 l) auf pH 4,5 angesäuert. Die Mischung wurde 15 min bei 2 700 U.p.M. zentrifugiert, dann wurde der Überstand abdekantiert und der pH der Lösung durch Zugabe von 30% Ammoniak auf pH 6,0 eingestellt. Im Anschluß an Rotationsverdampfen bei 35ºC wurde der pH der konzentrierten Lösung auf 1,8 abgesenkt; ausgefällte Verunreinigungen wurden durch Zentrifugieren entfernt, und das rohe Antithrombin-Material wurde aus der Mischung unter Verwendung eines 9- fachen Aceton-Überschusses ausgefällt. Die Mischung wurde dann ausgeschleudert, das Pellet wieder in Aceton suspendiert und wieder zentrifugiert. Das ausgefällte Material wurde dann gefriergetrocknet.
    • b) Ionenaustauscherreinigung
  • Das rohe Antithrombin-Material wurde in Wasser wieder hergestellt, gegen 10 mM Ammoniunacetatpuffer bei pH 4,0 dialysiert und auf eine Carboxymethyl-Sepharose-Säule (cm Sepharose, Pharmacia, 2,6 · 30 cm) aufgetragen, die im gleichen Puffer voräquilibriert war. Im Anschluß an Waschen mit 100 ml des Ausgangspuffers wurden die aktiven Antithrombin- Fraktionen mit 20 mM Ammoniumacetat, pH 4,5, eluiert, aufgefangen und vereinigt (1,3 l). Für die weiteren Reinigungsschritte wurden die vereinigten Fraktionen auf 0,5 l in einem Minitan-Apparat (Millipore) konzentriert; die konzentrierte Lösung wurde mit NaOH neutralisiert und dann auf eine Q-Sepharose-Säule, äquilibriert in 20 mM Tris-HCl pH 7,0, aufgetragen. Das gebundene Material wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl im Ausgangspuffer eluiert. Die Fraktionen mit Antithrombin- Aktivität wurden vereinigt, aufkonzentriert und auf einer Superdex 5-200- Säule entsalzt, eluiert mit 20 mM Tris-HCl pH 7,5, bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min. Die aktive Ansammlung aus der Gel-Filtration wurde durch Minitan aufkonzentriert und weiter durch schwache Anionen- Austauscherchromatographie (DEAE FPLC) gereinigt. Das aktive Material wurde auf eine Protein Pak DEAE-5PW-Säule (Waters) aufgetragen und mit einem Gradienten von 0-1 M NaCl in 20 mM Tris-HCl pH 6,5 bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, auf Proteingehalt und Aktivität hin charakterisiert (spezifische Aktivität: 800 ATU/mg) und in einem SpeedVac-Konzentrator (Savant) gefriergetrocknet.
  • Das so erhaltene teilweise gereinigte Material (spezifische Aktivität 800 ATU/mg) wurde dann zwei zusätzlichen chromatographischen Schritten unterworfen, um homogene Peptide zu erhalten, wie unten unter c) und d) beschrieben:
    • c) Thrombin-Sepharose
  • Kommerzielles Rinderthrombin (Sigma) wurde gemäß dem von Lundblad (*) beschriebenen Verfahren weiter gereinigt und dann an aktivierte Sepharose CL 6B (Pharmacia) unter Befolgen der Herstelleranleitung gebunden. Die Säule (1,7 ml) wurde mit 50 mM Tris-HCl pH 8,3 äquilibriert, und das gefriergetrocknete Material aus DEAE-FPLC (in Puffer wieder hergestellt) wurde aufgetragen. Die Säule wurde drei Spülungen unterzogen, in Ausganspuffer, dann im gleichen Puffer, der 3,0 M NaCl enthielt, und wieder mit dem Ausgangspuffer (jede Spülung betrug das dreifache des Säulenvolumens). Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,3 mg/min. Das gebundene Material wurde mit 10 ml 0,1 M 4-Aminobenzamidin in 25 mM HCl eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und der Puffer in 50 mM Tris-HCl pH 8,3 auf einer PD-10-Säule (Pharmacia) ausgetauscht.
  • Ungebundenes Material, das von der Säule durch Waschen in Ausgangspuffer eluiert wurde und noch Antithrombin-Aktivität enthielt, wurde wieder auf die Säule gegeben, bis die gesamte Aktivität gebunden und chromatographiert war.
  • (*) R.L. Lundblad, 1971, Biochemistry, 10: 2501-2506.
    • d) RP-HPLC
  • Das nach Affinitätschromatographie erhaltene Material wurde schließlich durch Umkehrphasen-Hochleistungschromatographie ("reverse phase high performance chromatography", RP-HPLC) auf einer C4 Vydac-Säule (4,6 · 250 mm, 5 u) unter Verwendung von 20 mM Natriumphosphat pH 7,5 als erstem Laufmittel und 50% Acetonitril in Wasser wie modifiziert gereinigt. Antithrombin-Polypeptide wurden mit einem linearen Gradienten von 5% auf 55% des Laufmittels B in 45 min bei Raumtemperatur mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min eluiert. Das resultierende Chromatogramm ist in Fig. 1 gezeigt.
  • Die Protein-Peaks (gemessen bei 220 nm) wurden manuell aufgefangen, im Vakuum aufkonzentriert und unter den gleichen Bedingungen wieder chromatographiert.
  • Reine Antithrombin-Polypeptide nach C4-HPLC wurden auf Protein- Gehalt, Aminosäure-Zusammensetzung, N-terminale Sequenz, C-terminales Ende und ihre Aktivität, bestimmt durch in vitro-Assays (ATU/NIH-Test und "Thrombinzeit"-Test), charakterisiert. Es wurde gefunden, daß jeder der drei Protein-Peaks mit Antithrombin-Aktivität behaftet ist.
  • Die kompletten Aminosäuresequenzen der mit P1 und P2 in Fig. 1 markierten Polypeptide wurden durch N-terminales Sequenzieren der aus Trypsin- und V8-Protease-Verdauungen erhaltenen Peptide bestimmt. Die Sequenzen sind oben unter (i) und (ii) angegeben. Die teilweise Aminosäuresequenz des anderen Polypeptids (P3) ist oben unter (iii) angegeben.
    • Beispiel 2: Trypsinverdauung und Peptidkartierung-von pyridylethyliertem (PE) P1 und P2
  • a) Reduktion/Alkylierung - Durch Affinitätschromatographie an Thrombin-Sepharose (Beispiel 1c) gereinigte aktive Fraktionen wurden vereinigt und in 10 mM Tris-HCl pH 8,3 auf einer PD-10-Säule puffer- ausgetauscht. Die aktive Ansammlung (etwa 50 ug} wurde in einer Speed-Vac- Zentriguge (Savant) aufkonzentriert und mit 100 ul 1% b-Mercaptoethanol in 6 M Guanidin-HCl/50 mM Tris-HCl pH 8,5 unter Stickstoff im Dunkeln für 2 h bei Raumtemperatur behandelt. Dann wurden 4 ul 4-Vinylpyridin (unverdünnt) hinzugegeben und die Mischung wieder für 2 h wie oben inkubiert&sup4;.
  • Pyridylethylierte Polypeptide wurden zuerst aus der Reaktionsmischung durch RP-HPLC an einer C4 Vydac-Säule (4,6 · 250 mm, 5 um) gewonnen, die mit einem 90 min linearen Gradienten von 5 bis 65% Acetonitril in 0,1% TFA mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min eluiert wurde. Unter solchen Bedingungen wird die Mischung von Antithrombin-Polypeptiden schlecht aufgelöst, so daß sie auf der gleichen Säule unter Verwendung des Elutionssystems Natriumphosphat/Acetonitril mit den schon in Beispiel ID beschriebenen Bedingungen wieder chromatographiert werden müssen.
  • b) Trypsin-Verdauung und Peptid-Kartierung von PE-P1 und PE-P2 - Gereinigtes PE-P1 und PE-P2 (10 bzw. 20 ug) wurden mit TPCK-behandeltem Trypsin (Sigma) in 200 ul 1% Ammoniumbicarbonat pH 8,0 in Gegenwart von 0,2 M Natriumphosphat verdaut. Trypsin wurde mit einhem Enzym-Substrat- Verhältnis von 1 : 20 (G/G) hinzugegeben, und die Inkubierung wurde für 4 h bei 37ºC durchgeführt. Die Verdauung wurde durch Gefriertrocknen in einem Savant unterbrochen.
  • Die durch Trypsin-Verdauung erhaltenen Peptide wurden auf einer uBondapak C18-Säule (3,9 · 300 mm, 10 u, Waters) oder auf einer C4-Vydac- Säule (4,6 · 250 mm, 5 um) aufgetrennt, wobei unter Verwendung eines 60 min. linearen Gradienten von 5 bis 65 Acetonitril in 0,1% TFA bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min eluiert wurde (Fig. 2). Die eluierten Peaks wurden manuell aufgefangen, in einem Savant aufkonzentriert und dann der Aminosäureanalyse und N-terminalen Sequenzanalyse auf einem gepulsten Flüssigphasensequenzer Modell 477A (Applied Biosystems) unterworfen.
  • Die Ergebnisse der C&sub4;-HPLC-Peptid-Kartierung von Trypsin-verdautem PE-P1 (A) und PE-P2 (B) sind unten gezeigt.
    • Fragment Aminosäuresequenz
  • A 1-13 VSYTDCTESGQNY (SEQ ID NO: 6)
  • 14-26 CLCVGGNLCGGGK (SEQ ID NO: 7)
  • 27-36 HCEMDGSGNK (SEQ ID NO: 8)
  • 37-47 CVDGEGTPKPK (SEQ ID NO: 9)
  • 37-47(*) CVDGEGX*PKPK (SEQ ID NO: 10)
  • 48-64 SQTEGDFEEIPDEDILN (SEQ ID NO: 11)
  • B 1-13 VSYTDCTESGQNY (SEQ ID NO: 12)
  • 14-26 CLCVGSNVCGEGK (SEQ ID NO: 13)
  • 27-47 NCQLSSSGNQCVHGEGX*PKPK (SEQ ID NO: 14)
  • 48-64 SQTEGDFEEIPDEDILN (SEQ ID NO: 15)
  • (*) X = durch Aminosäuresequenzierung nicht nachgewiesener Rest; X = T nach Aminosäureanalyse.
  • Die kompletten Aminosäuresequenzen von P1 und P2 sind deshalb: (SEQ ID NO: 16) (SEQ ID NO: 17)
    • Beispiel 3: Chemische Synthese des P2-Gens
  • Die Nukleotid-Kodierungssequenz wurde auf der Basis der bevorzugten Escherichia coli-Kodons konstruiert&sup5;. Darüber hinaus wurde eine BalI- Restriktionsstelle sehr nahe am 5'-Ende des synthetischen Gens angepaßt, um die Insertion einer solchen Sequenz in unterschiedlichen Expressionsvektoren zu erlauben. Tatsächlich wurde das gleiche synthetische Gen für die Expression von rekombinantem P2-Protein in bakteriellen und Insektenzellen verwendet. Im Falle der Insektenzellen wurden Verfahren entwickelt, die das Protein P2 als sekretiertes oder cytoplasmatisches Produkt lieferten.
  • Alle Plasmid-DNA-Manipulationen wurden wie von Maniatis et al.&sup6; beschrieben durchgeführt.
  • Sechs synthetische komplementäre Oligonukleotide wurden unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthetisierers (Applied Biosystems) hergestellt, und ihre Sequenz ist in Fig. 3 gezeigt. Im Anschluß an die enzymatische Phosphorylierung wurden die sechs Oligonukleotide unter Verwendung von DNA-Ligase zusammengesetzt, und die resultierende doppelsträngige Sequenz wurde in den M13-Phagenvektor mp18 insertiert, wodurch das rekombinante Plasmid M13-P2 erhalten wurde, das in Fig. 4 gezeigt ist. Um die Insertion des P2-Gens in den M13-Vektor zu ermöglichen, wurden ebenfalls HindIII- und PstI-Stellen in die synthetischen Oligonukleotide eingefügt. Die korrekte Nukleotidsequenz wurde durch das Sanger-Verfahren verifiziert, durchgeführt an der einsträngigen Phagen-DNA&sup7;.
  • Das rekombinante Plasmid M13-P2 wurde als Quelle für das P2-Gen für alle in den Beispielen verwendeten Expressionsvektoren verwendet.
    • Beispiel 4: Expression und Sekretion von P2 aus E. coli-Zellen
  • Um die Sekretion des rekombinanten Produkts in das Periplasma zu erhalten, ist es notwendig, das P2-Molekül in Form eines Pro-Proteins zu synthetisieren. Insbesondere muß eine Aminosäuresequenz, genannt "Leitpeptid", die für eine effiziente Sekretion verantwortlich ist, am NH&sub2;-Ende von P2 vorliegen8,9. Diese Extrasequenz wird dann während der Sekretion in vivo durch eine spezifische E. coli-Leitpeptidase abgespalten, was die korrekte Reifesequenz ergibt¹&sup0;.
  • Viele Beispiele von Sekretionssystemen wurden in der Literatur beschrieben11,12. Darunter haben wir das System ausgewählt, das auf dem Sekretionssignal des äußeren Membran-Proteins von E. coli ("Outer membrane protein", Omp A) beruht, zuvor veröffentlicht¹³. Wir haben deshalb zwei zusätzliche komplementäre Oligonukleotide entworfen, die für das OmpA- Leitpeptid kodieren, dem die OmpA-Shine-Dalgarno-Sequenz vorangeht, die dafür bekannt ist; daß sie für eine effiziente Translation der Boten-RNA verantwortlich ist¹&sup4;.
  • Ihre Sequenz, gezeigt in Fig. 5, schließt ebenfalls den Anfang der P2-Gen-Kodierung für die ersten 10 Aminosäuren ein. Die Gegenwart der BalI- Stelle erlaubt das Verknüpfen dieses synthetischen Stückes mit dem Rest der P2-kodierenden Sequenz, während die Gegenwart der stromaufwärts liegenden HindIII-Stelle die Verknüpfung an den M13-Vektor erlaubte. Somit wurde das synthetische HindIII-BalI-Fragment an ein BalI-BamHI-Stück aus M13-P2 ligiert und in M13mp18 insertiert, wodurch ein neues Plasmid mit Namen OMP-P2 erhalten wurde. Die schematische Darstellung dieser neuen Plasmid- Konstruktion ist ebenfalls in Fig. 5 gezeigt.
  • Aus OMP-P2 kann das P2-Gen als ein HindIII-BamHI-Fragment herausgeschnitten werden, das für das OmpA-Shine-Dalgarno- und Leitpeptid kodiert, gefolgt von der P2-kodierenden Sequenz. Dieses Restriktionsfragment ist nun bereit, um in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert zu werden. Unterschiedliche Expressionssysteme könnten theoretisch eingesetzt werden, um eine hochgradige Produktion von heterologen Proteinen in Bakterien zu erhalten. Das System auf Basis des Promotors Ptrp wurde mit Erfolg in unserem Labor in der Vergangenheit verwendet¹&sup4;. Selbst im Falle des ausgewählten Promotors können die Expressionsneveaus eines gegebenen Polypeptids wiederum nicht vorhergesagt werden.
  • Das Plasmid pFC33, gezeigt in Fig. 6, wurde schon in der Literatur beschrieben¹&sup4;. Es trägt die Resistenz gegenüber dem antibiotischen Ampicillin und dem bakteriellen Promotor Ptrp, der die Expression von Proapolipoprotein A1 treibt. Im Anschluß an die Verdauung von pFC33 mit HindIII und BamHI wurde das große HindIII-BamHI-Fragment, das das antibiotische Resistenz-Gen und den Promotor trägt, isoliert und an das HindIII-BamHI-Fragment aus OMP-P2 geknüpft, das für das P2-Gen kodiert. Die Einzeilheiten dieser Konstruktion sind in Fig. 6 gezeigt. Wir isolierten ein neues Plasmid, genannt pFC-P2, welches das Endplasmid für die Herstellung von P2 in E. coli ist.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von E. coli- Stämmen des Typs B für die Expression und Sekretion von P2 und den anderen Antithrombin-Polypeptiden der Erfindung in das Periplasma. Tatsächlich haben wir gefunden, daß die Insertion von Plasmid pFC-P2 in Stämme des Bakteriums E. coli vom Typ B eine hochgradige Produktion von P2 liefert. Interessanterweise arbeiten unterschiedliche Stammtypen von E. coli nicht so effizient, und es scheint deshalb, daß der Typ des Wirtstammes wesentlich für die erfolgreiche Produktion von Bufrudin ist.
  • Unterschiedliche Stämme von E. coli Typ B sind erhältlich und können für die Produktion von P2 verwendet werden. Bevorzugte Stämme sind ATCC 12407, ATCC 11303, NCTC 10537. Unten ist ein Beispiel für die Transformation des Stammes NCTC 10537 mit dem Plasmid pFC-P2 und die anschließende Kultivierung der Transformanten gezeigt.
  • Kompetente Zellen des Stammes NCTC 10537 wurden unter Verwendung des Calciumchlorid-Verfahrens von Mandel und Higa¹&sup5; hergestellt. Etwa 200 ul einer Zubereitung dieser Zellen mit 1 · 109 Zellen/ml wurden mit 2 ul Plasmid-DNA (Konzentration etwa 5 ug/ml) transformiert. Die Transformanten wurden auf L-Agar-Platten, die etwa 100 ug/ml Ampicillin enthielten, ausgewählt. Zwei kleine Kolonien wurden mit hölzernen Zahnstochern (jeweils drei Abstriche von etwa 1 cm Länge) auf L-Agar abgestrichen, das das gleiche Antibiotikum enthielt. Nach 12 h Inkubation bei 37ºC wurden Teile der Abstriche auf die P2-Protein-Produktion durch Impfen auf 10 ml LB-Medium (enthaltend Ampicillin mit einer Konzentration von 150 ug/ml) getestet und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Kulturen 1 : 100 in M9-Medium verdünnt, das die gleiche Ampicillin-Konzentration enthielt, und für 6 h bei 37ºC inkubiert.
  • 20 ml einer solchen Kultur wurden bei 12000 xg bei 4ºC für 10 min zentrifugiert. Das bakterielle Pellet wurde in 2 ml 33 mM HCl Tris pH 8 resuspendiert; ein gleiches Volumen einer zweiten Lösung 33 mM EDTA, 40% Saccharose wurde dann hinzugegeben, und die gesamte Mischung wurde unter milden Schüttelbedingungen bei 37ºC für 10 min inkubiert. Im Anschluß an Zentrifugieren wurden die permeabilisierten Zellen in 2 ml kaltem Wasser resuspendiert und für 10 min in Eis belassen. Der resultierende Überstand wurde durch Zentrifugieren isoliert und stellt die periplasmatische Fraktion der bakteriellen Zellen dar.
  • Unter Verwendung eines chromogenen Assays, der auf der Inhibierung der Thrombin-Fähigkeit beruht, ein synthetisches Substrat S-2238 zu spalten16, haben wir die Gegenwart der Antithrombin-Aktivität in der periplasmatischen Fraktion von P2-produzierenden Zellen gemessen, aber nicht in periplasmatischen Kontrollfraktionen.
  • Mit dem gleichen Ansatz haben wir ebenfalls ein neues Expressions/Sekretions-Plasmid für P2 konstruiert, worin der Promotor Pllp/lac¹&sup7; anstelle des Promotors Ptrp vorliegt. Dieses unterschiedliche Plasmid, genannt pOMP-P2, ist in Fig. 7 gezeigt. Im Anschluß an die Insertion dieses Plasmids in E. coli-Stämme vom Typ B wurden ebenfalls hohe Grade an aktivem P2 erhalten. Als Ausgangsplasmid für die Konstruktion von pOMP-P2 verwendeten wird das von Ghrayb et al¹&sup7; beschriebene Plasmid pIN- III-ompA3. Die Bedingungen für die Kultivierung und Einleitung der Expression mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) waren wie zuvor beschrieben¹&sup7;.
    • Beispiel 5: Expression und Sekretion von Protein P2 aus Insektenzellen
  • Um die Sekretion von Protein P2 aus rekombinanten Insektenzellen zu erhalten, mußten wir die P2-kodierende Sequenz an ein Leitpeptid knüpfen, das effizient von diesen Zellen erkannt wird. Wir haben das Leitpeptid des vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) G Proteins¹&sup8; verwendet. In ähnlicher Weise zu dem, was oben beschrieben ist, wurde eine synthetische DNA-Sequenz, die für das VSV G Protein-Leitpeptid kodiert, gefolgt vom Beginn des P2-Gens, hergestellt, und die Nukleotidsequenz ist in Fig. 8 angegeben. In diesem Fall stellten wird ebenfalls zweckmäßige Restriktionsstellen bereit (HindIII, BamHI und BalI), um das Anknüpfen an den Rest des P2-Gens und an den Expressionsvektor zu erlauben.
  • Das synthetische HindIII-BalI-Fragment wurde an ein gereinigtes BalI-BamHI-Fragment aus M13-P2, das das P2-Gen trug, geknüpft und in M13mp18 insertiert, das zuvor mit HindIII und BamHI ausgeschnitten war. Diese Konstruktion, die ein neues Plasmid, genannt VSV-P2, ergab, ist schematisch in Fig. 9 gezeigt. Aus VSV-P2 haben wir ein BamHI-BamHI-DNA- Fragment ausgeschnitten, das das P2-Gen trägt, das an das VSV-Leitpeptid fusioniert ist, das dann in den Vektor pAcYM1¹&sup9; insertiert wurde, wie in Fig. 10 gezeigt. Das resultierende Plasmid wurde pAc-P2 genannt.
  • Um eine Expression in Insektenzellen zu erhalten, muß die VSV-P2- Kodierungssequenz zum Baculovirus-Genom unter transkriptionaler Kontrolle des Polyhedrin-Promotors übertragen werden. Für diesen Zweck co-transfizierten wird Insektenzellen mit einer Baculovirus-DNA von Wild-Typ und mit dem Transfervektor pAc-P2. Als Insektenzellen wurden Spodoptera frugiperda-Zellen als Wirtzellen ausgewählt. Die experimentellen Einzelheiten sind wie folgt:
  • S. frugiperda-Zellen wurden mit einer Mischung aus infektiöser AcNPV- DNA und Plasmid-DNA, die die individuellen rekombinanten Transfervektoren darstellen, durch eine Modifizierung des von Summers et al.20 beschriebenen Verfahrens transfiziert. Ein Mikrogramm viraler DNA wurde mit 20-100 ug Plasmid-DNA vermischt und mit (Endkonzentrationen) 0,125 M Calciumchlorid in Gegenwart von 20 mM HEPES-Puffer, pH 7,5, 1 mM Dinatriumhydrogenorthophosphat, 5 mM Kaliumchlorid, 140 mM Natriumchlorid und 10 mM Glucose (Gesamtvolumen 1 ml) ausgefällt.
  • Die DNA-Suspension wurde auf eine Monoschicht von 10&sup6; S. frugiperda- Zellen in einer 35 mm-Gewebekulturschale geimpft, für 1 h bei Raumtemperatur an die Zellen adsorbieren gelassen und dann mit 1 ml Medium ausgetauscht. Nach Inkubieren bei 28ºC für 3 Tage wurden die überstehenden Flüssigkeiten geernetet und zur Herstellung von Belägen in S. frugiperda- Zellmonoschichten verwendet. Die rekombinantes Virus enthaltenden Beläge wurden durch ihren Mangel an Polyedern identifiziert, wenn sie im Lichtmikroskop betrachtet wurden. Das Virus aus solchen Belägen wurden gewonnen und wurde nach weiterer Belagsreinigung zur Herstellung von Polyhedrinnegativen Virusvorräten verwendet.
  • Das obige Verfahren erlaubte es uns, ein rekombinantes Baculovirus zu isolieren, dessen Genom das P2-Gen unter Kontrolle des Polyhedrin-Promotors und der VSV G-Protein-Leitpeptids trug. Wir verwendeten dieses Virus, um S. frugiperda-Zellen gemäß anerkannten Verfahren²&sup0; mit einer Multiplizität der Infektion von 10 zu infizieren. Die infizierten Zellen wurden dann in einer Rotationskultur oder in Monoschichten in Gegenwart von 10% Kalbfötusserum gemäß veröffentlichten Verfahren²&sup0; kultiviert. In beiden Bedingungen zeigte der chromogenische S-2238-Assay die Gegenwart einer Antithrombin-Aktivität in den Kulturüberständen der infizierten Zellen an.
    • Beispiel 6: Expression von Protein P2 im Cytoplasma von Insektenzellen
  • Das Protein P2 konnte ebenfalls im Cytoplasma von S. frugiperda- Zellen hergestellt und angereichert werden. Dieser Ansatz ergibt im allgemeinen eine bessere Ausbeute an heterologen Proteinen, da er die Expressionssignale von Polyhedrin verwendet, welches ein nicht-sekretiertes virales Protein ist.
  • Unser Ansatz zum Erhalt großer Mengen des rekombinanten Proteins P2 beruht auf der Expression eines Fusions-Polypeptids, worin die 18 ersten Aminosäuren des Polyhedrins in einem Rahmen an 64 Aminosäuren von P2 geknüpft sind. Die Gegenwart der NH&sub2;-Endsequenz von Polyhedrin erlaubt eine hochgradige Expression²¹. Zusätzlich fügten wir einen Methionin-Rest zwischen den Polyhedrin-Anteil und die P2-Sequenz, was die Freisetzung der P2- Einheit durch Behandlung des Hybrid-Proteins mit CNBr erlaubt.
  • Ähnlich zu den vorhergehenden Ansätzen stellten wir ein synthetisches DNA-Fragment her, welches das Knüpfen des BalI-BamHI-Fragments von M13-P2 an einen geeigneten Transfervektor erlauben konnte. Das neue synthetische Stück, gezeigt in Fig. 11, schließt ebenfalls BamHI- und BalI-Stellen für anschließende Manipulationen ein.
  • Ein unterschiedlicher Transfervektor, pAcFTl, der die Nukleotidsequenz trägt, die, für die ersten 18 Aminosäuren von Polyhedrin kodiert, wurde erhalten (Fig. 12). Kurz gesagt, wurde das EcoRV-BamHI-Fragment von pAcYM1¹&sup9; durch ein synthetisches Oligonukleotid ersetzt, das die Polyhedrin-Gensequenz von Nukleotid -92 bis Nukleotid +55 enthält. Eine zweckmäßige BamHI-Stelle ist nach dieser Sequenz vorhanden, und sie wurde zur Insertion der vollständigen P2-Kodierungssequenz gemäß dem in Fig. 13 erläuterten Schema verwendet. Durch diese Konstruktion erhielten wir ein neues Plasmid, genannt pAcFT1-P2, das zur Übertragung des Hybrid-Gens zum Baculovirus-Genom verwendet wurde.
  • Das rekombinante Baculovirus wurde wie in Beispiel 5 beschrieben erhalten. Die Infizierung von S. frugiperda-Zellen würde gemäß Standardverfahren²&sup0; durchgeführt. Die Kultivierung von infizierten Insektenzellen führte zur cytoplasmatischen Anreicherung des Fusionsproteins. Dieses Hybridprotein war die Quelle von rekombinantem Protein P2. Mehrere Verfahren sind aus der Literatur erhältlich, die zur Abspaltung des Hybrids mit CNBr verwendet werden können22,23. Die Anwendung des Verfahrens von Olson et al²³ hat es uns erlaubt, die korrekte Polypeptidsequenz von P2 zu erhalten. Dieses Molekül zeigte Antithrombin-Aktivität.
    • Beispiel 7
  • Um die Tyr&sub6;&sub1;-Variante des P2-Proteins zu erhalten, wurden die oben in Beispiel 3 beschriebenen und in Fig. 3 gezeigten Oligonukleotide Nr. 5 und 6 durch die folgenden substituiert: Oligonukleotid 5-Tyr (SEQ ID NO: 18) Oligonukleotid 6-Tyr (SEQ ID NO: 19)
  • Im Oligonukleotid 5-Tyr kodiert das unterstrichene Triplett TAC für einen Tyrosin-Rest und substituiert das ursprünglich vorhandene, für Asparaginsäure kodierende GAC-Triplet. Das Oligonukleotid 6-Tyr wurde entsprechend korrigiert, um eine vollständige Komplementärität zwischen den zwei Strängen zu erhalten. Die folgenden Schritte, die zur Expression und/oder Sekretion der Variante in Insektenzellen oder in E. coli führen, sind die gleichen, wie oben in den Beispielen 4 bis 6 beschrieben.
    • Beispiel 8
  • Um ein Glycin-verlängertes Derivat des P2-Proteins zu erhalten, wurden die oben in Beispiel 3 beschriebenen und in Fig. 3 gezeigten Oligonukleotide 5 und 6 mit den folgenden substituiert: Oligonukleotid 5-Gly (SEQ ID NO: 20) Oligonukleotid 6-Gly (SEQ ID NO: 21)
  • Im Oligonukleotid 5-Gly wurde das unterstrichene Triplett GGT, das für Glycin kodiert, vor dem Stop-Kodon insertiert. Das Oligonukleotid 6-Gly wurde entsprechend korrigiert, um eine vollständige Komplementärität zwischen den zwei Strängen zu erhalten. Die folgenden Schritte, die zur Expression und/oder Sekretion des Gly-verlängerten Derivats in Insekten- Zellen oder in E. coli führen, sind die gleichen, wie oben unter den Beispielen 4 bis 6 beschrieben.
    • Beispiel 9: cDNA-Klonierung von P1 und P2
  • (a) Gesamt-RNA aus Hirudinaria manillensis-Köpfen wurden gemäß Cathala et al²&sup4; hergestellt.
  • (b) Die umgekehrte Transkriptionsreaktion wurde wie folgt durchgeführt:
  • 10 ug Gesamt-RNA aus Blutegelköpfen
  • 1 ug dTl7-Adapter-Primer
  • 8 ul 5 mM dNTPs-Mischung
  • 8 ul AMV Puffer 5X
  • H&sub2;O auf 40 ul
  • wurden auf Eis vereinigt, vermischt, und die Mischung wurde für 2 min auf 65ºC erhitzt, gefolgt von Löschen auf Eis. 10 Einheiten RNAsin (Promega) und 20 Einheiten AMV reverse Transkriptase (Boehringer Mannheim) wurden hinzugegeben, gefolgt von Inkubieren bei 42ºC für 2 h. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Phenol-Chloroform extrahiert und in Isopropanol ausgefällt.
  • c) Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) wurden dann durchgeführt. Das allgemeine Schema für jede PCR-Reaktion ist unten aufgeführt:
  • PCR-Mischung:
  • 5 ul revers transkribierte RNA
  • 10 ul 10X PCR-Puffer (Cetus/Perin Elmer)
  • 16 ul dNTPs-Mischung (1,25 mM von jedem dNTP)
  • 2 ul MgCl&sub2; 0,1 M
  • 25-500 umol von jedem Primer
  • H&sub2;O auf 100 ul
  • Die Reaktionsmischung wurde bei 95ºC für 5 min vor der Zugabe von 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Cetus/Perkin-Elmer) denaturiert und dann mit 80 ul Mineralöl überschichtet. Die Reaktion wurde in einem Cetus/Perkin- Elmer DNA Thermal Cycler im Kreis gefahren.
  • Das Zyklusprofil war:
  • 3 min. 94ºC
  • 2 min 60ºC
  • 2 min 30 s 72ºC 1 Zyklus
  • 1 min 94ºC
  • 2 min 60ºC
  • 3 min 30 s 72ºC 30 Zyklen
  • 1 min 94ºC
  • 2 min 60ºC
  • 5 min 72ºC 1 Zyklus
  • 7 min 72ºC
  • belassen bei 25ºC
  • Die zurückbleibende Taq-Polymerase wurde mit Phenol-Chloroform und Ethanol-Ausfällung inaktiviert; Proben konnten bei -20ºC gelagert werden. Um die vollständigen Sequenzen von der P1- und P2-cDNAs zu erhalten, wurden drei Runden von PCR-Amplifizierung durchgeführt. Die Sequenzen jedes der verwendeten Primer sind unten gezeigt. Die Positionen, an denen eine Degeneration in die Oligonukleotid-Sequenz eingeführt wurde, sind durch die unter der Primer-Sequenz gezeigten alternativen Nukleotide angegeben (N bedeutet, daß alle vier Nukleotide verwendet wurden). Die zur Erleichterung der Klonierung der Amplifizierungsprodukte hinzugegebenen Restriktionsstellen sind unterstrichen. dT17-Adapter-Primer (SEQ ID NO: 22): Adapter-Primer (SEQ ID NO: 23) Primer 3-8 (SEQ ID NO: 24): Primer 52-56 (SEQ ID NO: 25): Primer 32-37 (SEQ ID NO: 26): Primer 5' I (SEQ ID NO: 27): Primer 5' II (SEQ ID NO: 28):
    • Erste Runde der Amplifizierung
  • 500 umol von vollständig degenerierten Primern, die sich von Rest 3 bis 8 und von Rest 56 bis 52 der P2-Aminosäuresequenz ausdehnen, wurden als entgegengesetzte Primer in der PCR-Reaktion verwendet.
  • Amplifizierung von cDNA 3'-Enden (RACE-Protokoll), Frohman et al²&sup5;.
  • Ein Gen-spezifischer Primer, der sich von Rest 32 bis 37 ausdehnte, wurde auf der Grundlage der Nukleotidsequenz von P2, bestimmt in der ersten Runde der Amplifizierung, entwickelt. Dieser wurde zusammen mit dem dT- Adapter-Primer verwendet, um die cDNA zu amplifizieren (Fig. 14).
  • Amplifizierung von cDNA 5'-Enden (RACE-Protokoll), Frohman et al²&sup5;.
  • 10 ug Gesamt-RNA aus Blutegelköpfen wurde wie zuvor beschrieben umgekehrt transkribiert, außer daß der dT17 Adapter-Primer gegen 1 ug eines Gen-spezifischen Primers (5'I) substituiert wurde (siehe Fig. 15). Die Reaktionsmischung wurde dann in Isopropanol ausgefällt, und die Erststrang- cDNA-Produkte wurden an ihren 5'-Enden unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidyltransferase (TdT) wie folgt polyadenyliert:
  • 22 ul cDNA
  • 1 ul 6 mMdATP
  • 6 ul 5X TdT-Puffer (BRL)
  • 1,1 ul TdT (BRL)
  • Die Proben wurden für 10 min bei 37ºC inkubiert und für 16 min auf 65ºC erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde dann auf. 500 ul in destilliertem Wasser verdünnt.
  • 10 ul der polyadenylierten Produkte wurden unter Verwendung von 10 umol des dT17-Adapter-Primers, 25 umol des Adapter-Primers und 25 umol eines zweiten Gen-spezifischen Primers stromaufwärts des ersten, spezifisch für die Transkription verwendeten (511, siehe Fig. 15) amplifiziert.
    • d) Analyse der PCR-Produkte
  • Die amplifizierten Produkte wurden an den in jedem Primer vorhandenen Restriktionsstellen abgespalten. Das verdaute Produkt wurde Gel-gereinigt und in einen pUC13-Vektor subkloniert, der zuvor mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut wurde. Plasmide, die die interessierende Insertion trugen, wurden durch Restriktionsanalysen identifiziert. Die Plasmid-DNA wurde mit Sequenase (USB) unter Verwendung der Empfehlungen des Lieferanten sequenziert. Die so erhaltenen cDNA-Sequenzen von P1 und P2 und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind wie folgt. Leitsequenzen sind unterstrichen. P1 cDNA (SEQ ID NOS: 29 UND 30) P2 cDNA (SEQ ID NOS: 31 UND 32}
    • Literaturverweise:
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  • 25) Frohman, M.A., Dush, M.K. und Martin, G.R. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 8998-9002
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  • (A) ORGANISM: Hirudinaria manillensis
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  • (A) ORGANISM: Hirudinaria manillensis
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  • (A) ORGANISM: Hirudinaria manillensis
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  • (A) ORGANISM: Hirudinaria manillensis
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  • (A) ORGANISM: baculovirus
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  • (B) CLONE: oligo 2 polyhedrin (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 50:

Claims (33)

1. Polypeptid mit Antithrombin-Aktivität, welches die Aminosäuresequenz umfaßt:
(i) P1 (SEQ ID NO: 1, worin Xaa in den Positionen 61 und 65 Yaa bzw. Zaa anzeigen)
(ii) P2 (SEQ ID NO: 2, worin Xaa in den Positionen 61 und 65 Yaa bzw. Zaa anzeigen)
oder
(iii) P3 (SEQ ID NO: 3)
und pharmazeutisch akzeptable Salze davon, und worin Yaa Asp oder Tyr ist und Zaa -OH, -NH&sub2; oder Gly-OH ist.
2. Polypeptid gemäß Anspruch 1 mit einer der in Anspruch 1 gezeigten Aminosäuresequenzen, denen ein Met-Rest vorangeht.
3. Polypeptid gemäß Anspruch 1 mit einer der in Anspruch 1 gezeigten Aminosäuresequenzen, denen alles oder ein Teil einer Leitsequenz vorangeht.
4. Polypeptid gemäß Anspruch 3, worin alles oder ein Teil der folgenden Leitsequenz vorliegt:
5. Polypeptid gemäß Anspruch 1, das ein Fusionsprotein ist, worin eine der in Anspruch 1 gezeigten Aminosäuresequenzen an eine Trägersequenz fusioniert ist.
6. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definiert, oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Bereitstellen eines Wirtes, der mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der eine DNA-Sequenz umfaßt, die das Polypeptid kodiert, unter solchen Bedingungen, daß das Polypeptid darin exprimiert wird; und
(b) Isolieren des so erhaltenen Polypeptids oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, worin der Wirt ein Bakterium, Hefe, eine Säugetier-Zellinie, ein Insekten-Zellinie oder ein Tier ist.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin der Wirt ein Stamm von E. coli Typ B oder eine Spodoptera frugiperda-Zellinie ist.
9. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert, oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) chemisches Synthetisieren des Polypeptids; und
(b) Isolieren des so erhaltenen Polypeptids oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, worin Schritt (a) durch Festphasen- Synthese bewirkt wird.
11. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wie in Anspruch 1 definiert, mit der Aminosäuresequenz (i), (ii) oder (iii), worin Yaa Asp anzeigt und Zaa -OH anzeigt, oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon, wobei das Verfahren die Isolierung des Polypeptids oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon aus dem Gewebe oder Sekretionen eines Blutegels der Art Hirudinaria manillensis umfaßt.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein Verdünnungsmittel und, als Wirkstoff, ein Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
13. Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert, kodiert.
14. Vektor gemäß Anspruch 13, welcher ein Plasmid ist.
15. Vektor gemäß Anspruch 13, welcher ein Virus ist.
16. Vektor gemäß Anspruch 15, worin das Virus ein rekombinantes Baculovirus ist, in dem der Polyhedrin-Promotor funktionsfähig an die DNA- Sequenz geknüpft ist.
17. Vektor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, worin die DNA- Sequenz zusätzlich ein Leitpeptid kodiert, das die Sekretion des Polypeptids aus Zellen, in denen das Polypeptid exprimiert wird, dirigieren kann.
18. Vektor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17, worin die DNA- Sequenz ein Fusionsprotein kodiert, das zur Freisetzung des Polypeptids abspaltbar ist.
19. Mit einem kompatiblen Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18 transformierter Wirt.
20. Wirt gemäß Anspruch 19, welcher ein Bakterium, Hefe, eine Säugetier-Zellinie, eine Insekten-Zellinie oder ein Tier ist.
21. Wirt gemäß Anspruch 20, welcher ein Stamm von E. coli Typ B oder eine Spodoptera frugiperda-Zellinie ist.
22. DNA-Sequenz, die ein Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert, kodiert.
23. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 22, die eine synthetische DNA- Sequenz ist.
24. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 22, die eine cDNA ist.
25. DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 22 bis 24, die zusätzlich ein Leitpeptid kodiert, das die Sekretion des Polypeptids aus Zellen, in denen das Polypeptid exprimiert wird, dirigieren kann.
26. DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 22 bis 25, die ein Fusionsprotein kodiert, das zur Freisetzung des Polypeptids abspaltbar ist.
27. Verfahren zur Herstellung eines Wirtes, in dem ein Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert, exprimiert werden kann, wobei das Verfahren das Transformieren eines Wirtes mit einem kompatiblen Expressionsvektor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18 umfaßt.
28. Verfahren gemäß Anspruch 27, worin der Expressionsvektor hergestellt wurde durch:
(a) chemisches Synthetisieren einer DNA-Sequenz, die das Polypeptid kodiert; und
(b) Insertieren der DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor.
29. Verfahren gemäß Anspruch 27, worin der Expressionsvektor hergestellt wurde durch;
(a) Herstellen und Isolieren einer cDNA, die das Polypeptid aus mRNA kodiert, aus einem Blutegel der Art Hirudinaria manillensis; und
(b) Insertieren der isolierten cDNA in einen Expressionsvektor.
30. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 22, die im wesentlichen besteht aus (SEQ ID: NO: 33):
31. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 22, die im wesentlichen besteht aus (SEQ ID NO: 34):
32. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 22, die im wesentlichen besteht aus (SEQ ID NO: 35):
33. DNA-Sequenz gemäß Anspruch 31 oder 32, worin die angegebene Sequenz direkt von der Sequenz (SEQ ID NO: 36) angeführt wird:
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