CZ283458B6 - Antitrombinové polypeptidy - Google Patents

Abstract

Antitrombinové polypeptidy isolované z pijavice Hirudinaria manillensis a způsob jejich přípravy. Polypeptidy mohou být modifikovány tak, že dojde k prodloužení o aminokyselinu na jednom nebo na obou koncích, a dále tím, že se podrobí post-translační modifikaci. Antitrombinové polypeptidy se mohou připravovat isolací z tkáně nebo sekretů pijavice Hirudinaria manillensis, ale mohou se také syntetizovat způsobem rekombinace DNA. Podle posledně uvedeného aspektu tento vynález poskytuje DNA sekvence, expresní vektory a hostitelské buněčné linie pro rekombinantní přípravu polypeptidů. Antitrombinové polypeptidy podle vynálezu nalézají užitečné použití při léčení žilní trombosy, vmetků v umělých cévách a trombinem indukovaného rozsetí intravaskulární koagulace.ŕ

Description

Izolovaný a čištěný polypeptid, způsob jeho přípravy, farmaceutický prostředek jej obsahující a DNA sekvence kódující polypeptid

Oblast techniky

Vynález se týká izolovaného a čištěného polypeptidu, způsobu jeho přípravy, farmaceutického prostředku jej obsahujícího, expresního vektoru obsahujícího DNA sekvenci kódující polypeptid a DNA sekvence kódující polypeptid. Tyto polypeptidy byly izolovány z pijavice Hirudinaria manillensis a mají protitrombinové vlastnosti.

Dosavadní stav techniky

Nejznámější antikoagulační peptidy jsou pravděpodobně ty, které náležejí do skupiny hirudinů. Hirudin, který byl původně izolován z pijavice lékařské. Hirudo medicinalis, je dobře známý a dobře charakterizovaný polypeptidový inhibitor trombinu [Markwardt F.: Methods in Enzymology 19, 924 (1970), Markwardt F.: Biomed. Biochem. Acta 44, 1007 (1985)]. Hirudin váže trombin iontovými interakcemi. Zabraňuje tak štěpení fibrinogenu na fíbrin a následné tvorbě fibrinových shluků. Při studiích na zvířatech byla dokázána účinnost hirudinu při prevenci žilní trombózy, vmetků umělých cévek a trombinem indukovaných rozšířených intravaskulámích sraženin. Navíc má hirudin nízkou toxicitu, malou nebo žádnou antigeničnost a velmi krátkou dobu, po kterou se nachází v oběhu [Markwardt F., Hauptmann J., Nowak G., Klessen C. a Walsmann P.: Thromb. Haemostatis 47, 226 (1982) ].

Polypeptidy s protisrážlivými vlastnostmi byly izolovány z různých druhů pijavic Hirudinaria manillensis (evropská patentová přihláška 0347376 a patent světového úřadu WO 90/05143). Tato pijavice je evolučně pokročilejší než Hirudo medicinalis a mohla by tedy syntetizovat antikoagulační peptidy, jejichž sekvence mohou být odlišné od sekvencí aminokyselin hirudinu a jiných známých variant hirudinu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je izolovaný a čištěný polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin obecného vzorce Π

Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Tyr Cys Leu

1015

Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gin Leu

2530

Ser Ser Ser Gly Asn Gin Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro Lys

4045

Pro Lys Ser Gin Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu

50	55	60
Yaa Ile Leu Asn Zaa
65			(Π),

v němž Yaa znamená Asp nebo Tyr aZaa znamená skupinu -OH, -NH₂ nebo Gly-OH, a jeho farmaceuticky přijatelné soli. Předmětem vynálezu je také způsob přípravy shora uvedeného polypeptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí, jehož podstata je v tom, že se

a) připraví DNA sekvence kódující polypeptid ve formě pre-proteinu, v němž vedoucí peptid je přítomný na NH₂ konci polypeptidu,

- 1 CZ 283458 B6

b) DNA se vloží do expresního vektoru,

c) vhodný hostitel se transformuje expresním vektorem,

d) transformovaný hostitel se kultivuje ve vhodném kultivačním prostředí k expresi genu kódujícího polypeptid a

e) takto získaný polypeptid nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl se izolují.

Jako hostitel se používá bakterie, kvasinka, savčí buněčná linie nebo hmyzí buněčná linie.

S výhodou se jako hostitel používá E. coli typ B nebo buněčná linie Spodoptera frugiperda.

Při přípravě uvedeného polypeptidu, nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí, lze podle vynálezu postupovat tak, že se

a) chemicky syntetizuje polypeptid a

b) takto získaný polypeptid nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl se izolují.

c) Stupeň a) se s výhodou provádí syntézou v tuhé fázi. Při způsobu přípravy polypeptidu majícího sekvenci aminokyselin vzorce II, v němž Yaa značí Asp aZaa značí -OH, nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí, se postupuje tak, že se

a) hlavy pijavic rodu Hirudinaria manillensis extrahují acetonem,

b) aktivní frakce acetonového extraktu se chromatografují na měniči iontů,

c) takto získaný částečně vyčištěný materiál se podrobí thrombin-sepharosové chromatografii a

d) polypeptid se vyčistí vysokovýkonnou reverzní chromatografii v kapalné fázi.

Předmětem vynálezu je dále farmaceutický prostředek s protitrombinovými účinky pro parenterální podávání, který jako účinnou látku obsahuje shora definovaný polypeptid, nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

Dalším předmětem vynálezu je expresní vektor obsahující DNA sekvenci kódující polypeptid uvedený shora.

Jiným provedením vynálezu je expresní vektor obsahující DNA sekvenci kódující polypeptid podle vynálezu, kde, vektorem je plasmid obsahující gen pro antibiotickou resistenci a Ptrp promotor.

Další možností je expresní vektor obsahující DNA sekvenci kódující polypeptid podle vynálezu, kde vektorem je rekombinantní baculovirus, v němž je polyhedrinový promotor operativně vázaný na DNA sekvenci.

Ještě dalším provedením je expresní vektor podle vynálezu, kterým je rekombinantní baculovirus, v němž je polyhedronový promotor odštěpitelně napojen na DNA sekvenci.

Je též možné provedení expresního vektoru, v němž DNA sekvence dále kóduje vedoucí peptid, který je schopný řídit sekvenci polypeptidu z buněk, v nichž dochází k expresi polypeptidu.

-2CZ 283458 B6

Dalším předmětem vynálezu je DNA sekvence kódující polypeptid podle vynálezu.

DNA sekvence podle vynálezu je syntetická DNA sekvence sestávající z

GTTTCTTACACCGACTGCACCGAATCTGGCCAGAACTACTGCCTGTGCGTTGGTT CTAACGTTTGCGGTGAAGGTAAAAACTGCCAGCTGTCTTCTTCTGGTAACCAGTG CGTTCACGGTGAAGGTACCCCGAAACCGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAA GAAATTCCGGACGAAGACATCCTGAACTAG.

DNA sekvencí podle vynálezu může být cDNA sestávající z

GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAA TCA GGT CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA AGT AAT GTC TGC GGT GGA GGC AAA AAT TGT CAA CTG AGC AGT TCT GGA AAT CAG TGC GTC CAT GGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT TTC GAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT TAA.

Jinou možností je zde DNA sekvence, která dále kóduje vedoucí peptid, který je schopný řídit sekreci polypeptidu z buněk, v nichž dochází k expresi polypeptidu.

Konečně je možné provedení DNA sekvence podle vynálezu, v níž uvedenou sekvenci předchází sekvence ATG TTC TCT CTC AAG TTG TTC GTT GTC TTC CTG GCT GTT TGC ATC TGC GTG TCT CAA GCA.

Zbytky aminokyselin jsou označovány třípísmenkovým kódem (Eur. J.Biochem. 138, 9 až 37 /1984/). Zbytek Yaa znamená zbytek Asp nebo Tyr a zbytek Zaa znamená hydroxylovou skupinu, aminovou skupinu nebo skupinu Gly-OH. Solemi mohou být soli kyselin. Může jít o soli s anorganickými kyselinami, jako jsou například kyseliny halogenovodíkové, jako je například kyselina chlorovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná nebo kyselina pyrofosforečná. Solemi mohou být také soli s organickými kyselinami, jako jsou například benzensulfonová kyselina, p-toluensulfonová kyselina, methansulfonová kyselina, kyselina octová, mléčná, palmitová, stearová, jablečná, vinná, askorbová nebo citrónová. Polypeptidy mohou obsahovat také volné karboxylové skupiny a mohou být tedy přítomny jako sodné, vápenaté, draselné, hořečnaté nebo amonné soli nebo jako soli s fyziologicky tolerovatelnými, organický dusík obsahujícími, bázemi. Polypeptidy mohou existovat také jako vnitřní soli.

Polypeptidy mohou být produkovány tak, že jim předchází celá nebo část vedoucí sekvence. Vedoucí sekvencí může být přírodní nebo cizí vedoucí sekvence, vzhledem k buňce, v níž se polypeptid získává. Vedoucí sekvence je schopna řídit sekreci polypeptidu z buňky. Dva z přírodních polypeptidů podle tohoto vynálezu se získávají expresí s vedoucí sekvencí, která se následovně štěpí. Může být tedy přítomna celá nebo část této vedoucí sekvence. Touto sekvencí je sekvence: Met Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val Cys Ile Cys Val Ser Gin Ala.

Přírodní polypeptid podle tohoto vynálezu nebo jeho soli se mohou připravovat tak, že se izoluje uvedený polypeptid nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl z tkáně nebo sekrecí z pijavice druhu Hirudinaria manillensis. Podrobněji uvedeno se tento polypeptid může získat přípravou podle patentu světového úřadu WO 90/05143 a získaný prostředek se podrobí vysokotlaké kapalinové chromatografii.

Způsob přípravy polypeptidu podle tohoto vynálezu nebo jeho soli zahrnuje:

a) získání expresního vektoru obsahujícího DNA sekvenci kódující polypeptid,

-3CZ 283458 B6

b) transformaci vhodného hostitele uvedeným expresním vektorem,

c) kultivaci transformovaného hostitele ve vhodném kultivačním mediu takže se polypeptid exprimuje v hostiteli a

d) izolaci takto získaného polypeptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli.

Tento přístup je typicky založen na tom, že se získá sekvence nukleotidů, která kóduje polypeptid, který si přejeme připravit expresí, a polypeptid se získává expresí v rekombinantních 10 mikroorganismech. Kultivace geneticky modifikovaných organismů vede k přípravě žádaného produktu, který vykazuje plnou biologickou aktivitu. Podle tohoto vynálezu se tedy získává:

- expresní vektor obsahující DNA sekvenci kódující polypeptid podle tohoto vynálezu,

- hostitel transformovaný slučitelným expresním vektorem podle tohoto vynálezu a

- DNA sekvence kódující plasmid podle tohoto vynálezu.

Hostitel, v němž je možno polypeptid podle tohoto vynálezu získávat expresí, se připravuje 20 transformací hostitele slučitelným expresním vektorem podle tohoto vynálezu. Tento expresní vektor se může připravit.

a) chemickou syntézou DNA sekvence kódující polypeptid podle tohoto vynálezu a

b) vložením uvedené DNA sekvence do expresního vektoru.

Expresní vektor se může připravit také:

a) přípravou a izolací cDNA kódující polypeptid podle tohoto vynálezu zmRNA pijavice rodu 30 Hirudinaria manillensis a

b) vložením izolované cDNA do expresního vektoru.

Polypeptid podle tohoto vynálezu se připravuje tak, že se získá transformovaný hostitel za 35 takových podmínek, že v něm dochází k expresi uvedeného polypeptidu. Jestliže se používá eukaryotický hostitel, polypeptid se může získat glykosylací. Polypeptid lze izolovat jako takový nebo jako farmaceuticky přijatelnou sůl. Tímto způsobem lze získat polypeptid podle tohoto vynálezu v čisté formě.

Polypeptid podle tohoto vynálezu se může modifikovat tím, že se na jednom nebo na obou koncích může prodloužit o aminokyselinu (aminokyseliny). Polypeptidy sestávající z takové prodloužené sekvence musí ovšem ještě vykazovat antitrombinovou aktivitu. Například na jeden nebo na oba konce lze přidat krátkou sekvenci s až 30 zbytky aminokyselin.

Polypeptidy podle tohoto vynálezu se mohou podrobit jedné nebo více posttranslační modifikaci, jako je například sulfatace, amidace COOH skupiny, acylace nebo chemická změna polypeptidového řetězce. Například polypeptid s glycinovým zbytkem na karboxylovém konci se může podrobit enzymatické amidaci peptidylglycin-a-amidační monooxygenasou (PAM enzym).

Aby se technologií rekombinantní DNA připravil antitrombinový polypeptid, připraví se gen kódující polypeptid podle tohoto vynálezu. Tato DNA kódující sekvence typicky nezahrnuje introny. DNA sekvence se izoluje a vyčistí. Gen se vloží do expresního vektoru, který je schopen řídit produkci rekombinantního produktu. DNA sekvencí může být cDNA sekvence. DNA

-4CZ 283458 B6 sekvencí může být syntetická DNA sekvence. Syntetický gen se typicky připravuje chemickou syntézou oligonukleotidů, které společně odpovídají žádanému genu. Sestavením oligonuklotidů se tak získá gen. Gen se tedy může zkonstruovat ze šesti chemicky syntetizovaných oligonukleotidových jednotek, kde každý oligonukleotid představuje asi jednu třetinu genu jednovláknové nebo dvouvláknové DNA. Oligonukleotidy se ligují aanelují tak, aby se získal žádaný gen. Jestliže je to žádoucí, sekvence genu se může modifikovat místně řízenou mutagenesí, čímž se zavede jedna nebo více změn kodonů. Gen se typicky zkonstruuje tak, aby na obou koncích byla tedy restrikční místa. Tím se usnadní následná manipulace.

Může se získat DNA sekvence, která tedy kóduje vedoucí peptid jak shora uvedeno. Vedoucí peptid má schopnost řídit sekreci polypeptidu z buněk, v nichž dochází k expresi polypeptidu. Sekvence, která kóduje vedoucí peptid, je typicky navázána na 5'-konci DNA sekvence, která kóduje tento polypeptid. Vedoucím peptidem může být OmpA vedoucí peptid, jestliže k expresi dochází v bakteriálním hostiteli, jako je například E. coli tehdy, jestliže je vyžadována. Vedoucím peptidem může být vedoucí peptid proteinu viru G vesikulámí stomatitidy (VSV G protein). Příslušnými DNA sekvencemi, které kódují OmpA a VSV G vedoucí sekvence proteinu, jsou:

OmpA leader:

ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT 42

TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC 63

VSV G proteinový leader:

ATG AAG TGC CTT TTG TAC TTA GCC TTT TTA TTC ATT GGG GTG 42

AAT TGC 48

Lze získat DNA sekvencí, která kóduje napojený protein, který štěpením uvolňuje polypeptid podle tohoto vynálezu. Může se používat DNA sekvence, která kóduje nosnou polypeptidovou sekvenci napojenou odštěpitelnou vazbou na N-konec polypeptidu podle tohoto vynálezu. Tato štěpitelná vazba může znamenat vazbu, která je štěpitelná bromkyanem.

Pro expresi polypeptidu se zkonstruuje expresní vektor, který obsahuje DNA sekvenci kódující polypeptid a která je schopna ve vhodném hostiteli poskytovat expresí polypeptid. Získají se příslušné transkripční a translační regulační prvky včetně promotoru pro DNA sekvenci, místa terminace transkribce a kodonů počátku a konce translace. Získá se DNA sekvence ve správné fázi, jako je například schopnost, aby byl polypeptid získáván expresí v hostiteli slučitelném s vektorem.

Expresní vektor typicky obsahuje počátek replikace, a jestliže je to žádoucí selektovatelný gen markéru, jako je například gen antibiotické resistence. Promotor je odštěpitelně napojen na DNA sekvenci kódující polypeptid. Expresním vektorem může být plasmid. V takovém případě se promotor vybere z promotorů a P|_cc/i_ac odštěpitelně napojených na DNA sekvenci. Expresním vektorem může být také virus. Virem může být rekombinantní baculovirus, v němž je polyhedrinový promotor odštěpitelně napojen na DNA sekvenci kódující polypeptid.

Expresní vektor, který je schopen expresí poskytovat polypeptid, se může připravovat jakýmkoliv vhodným způsobem. DNA fragment kódující polypeptid může být vložen do příslušného restrikčního místa expresního vektoru, například plasmidového vektoru. Rekombinantní virus (baculovirus) se může připravit:

i) klonováním genu kódujícího polypeptid do transfemího vektoru baculoviru v restrikčním místě po směru vlákna polyhedrinového promotoru a

-5CZ 283458 B6 ii) kotransfekcí hmyzích buněk citlivých na infekci baculovirem rekombinantním transfemím vektorem ze stupně (i) a neporušenou DNA baculoviru přírodního typu.

Dochází khomologní rekombinaci, která vede k rekombinantnímu baculoviru nesoucího gen polypeptidu po směru vlákna polyhedrinového promotoru. Baculovirový transportní vektor může být vektor s jedinečným klonovacím místem po směru vlákna polyhedrinového ATG počátečního kodonu. Produktem, který se pak získá expresí výsledného rekombinantního baculoviru, bude napojený protein, v němž je N-koncová část polyhedrinového proteinu napojena na N-konec polypeptidu. Jak bylo shora uvedeno, štěpitelná vazba se může získat v místě napojení.

Hmyzími buňkami ve stupni (ii) jsou typicky buňky Spodoptera frugiperda. Baculovirem přírodního typuje typicky Autographa califomica jaderny polyhedrosis virus (AcNPV).

Expresní vektor kódující polypeptid se získává v příslušném hostiteli. Buňky se transformují genem polypeptidu.

Transformovaný hostitel se získává za takových podmínek, že v něm dochází k expresi polypeptidu. Transformované buňky se například kultivují tak, aby se umožnila exprese. Používat se může jakýkoliv slučitelný systém hostitel-vektor.

Transformovaným hostitelem může být prokaryotický nebo eukaryotický hostitel. Může se používat bakteriální nebo kvasinkový hostitel, například E. coli nebo S. cerevisiae. Mohou se používat grampositivní bakterie. Výhodným bakteriálním hostitelem je kmen E. coli typu B. Lze používat také hmyzí buňky. V takovém případě je vhodným expresním systémem baculovirový expresní systém. Typickými hmyzími buňkami jsou buňky Spodoptera frugiperda. Jako jiná možnost existuje používání buněk savčí buněčné linie, kterou lze transformovat. Lze tak získat transgenního živočicha, například jakéhokoliv savce kromě člověka.

Polypeptid, který se získává expresí, se může izolovat a čistit. Může se tak získat polypeptid, který má sekvenci aminokyselin shora uvedených obecného vzorce II, kterou předchází zbytek Met příslušný kodonu počátku translace. Také se může získat napojený protein, který obsahuje sekvenci aminokyselin polypeptidu podle tohoto vynálezu, tj. sekvence shora uvedených obecného vzorce II a který je napojen na nosnou sekvenci. Když se získá vhodná vazba při napojení proteinu mezi sekvencí aminokyselin obecného vzorce II a nosnou sekvencí, polypeptid se sekvencí aminokyselin obecného vzorce II se může uvolnit štěpením vhodným činidlem.

Polypeptid podle tohoto vynálezu nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl se může připravovat také:

a) chemickou syntézou uvedeného polypeptidu a

b) izolací takto získaného uvedeného polypeptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli.

Polypeptidy se tedy mohou sestavovat chemickou syntézou z jednotlivých aminokyselin a/nebo předem vytvořených peptidů ze dvou nebo více aminokyselin v pořadí podle sekvence žádaného polypeptidu. Mohou se používat způsoby pracující v roztoku nebo v pevné fázi. Výsledný polypeptid se pak může převést na farmaceuticky přijatelnou sůl, jestliže je to žádoucí.

Při syntéze v pevné fázi se sekvence aminokyselin žádaného polypeptidu sestavuje postupně od C-koncové aminokyseliny, která je navázána na nerozpustnou pryskyřici. Když se produkuje žádaný polypeptid, provede se to odštěpením od pryskyřice. Jestliže se používá syntéza v pevné fázi, žádaný polypeptid se může vystavět od C-koncové aminokyseliny. Karboxylová skupina této aminokyseliny zůstává zablokována vhodnou chránící skupinou, která se odstraní na konci

-6CZ 283458 B6 syntézy. Ať se používá jakýkoliv způsob, způsob v pevné fázi nebo v roztoku, každá aminokyselina, která se přidává do reakčního systému, má typicky chráněnou aminovou skupinu a aktivovanou karboxylovou skupinu. Funkční skupiny v postranních řetězcích jsou rovněž chráněny. Po každém stupni syntézy se odstraní chránící skupiny aminové skupiny. Chrániči skupiny funkčních skupin v postranních řetězcích se obvykle odstraní až na konci celé syntézy.

Polypeptid se může převádět na farmaceuticky přijatelné soli. Může se převádět na adiční soli s kyselinou reakcí s organickou nebo anorganickou kyselinou. Mezi vhodné kyseliny patří kyselina octová, kyselina jantarová a kyselina chlorovodíková. Peptidy se mohou převést také na soli karboxylových skupin, jako je například amonná sůl nebo sůl alkalického kovu, jako je například sodná nebo draselná sůl.

Polypeptid nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl se může používat ve farmaceutickým prostředku společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem. Takový prostředek je typickým prostředkem pro intravenosní podávání (kde nosičem je obvykle sterilní solný roztok nebo voda přijatelné čistoty). Polypeptid podle tohoto vynálezu je protitrombinovým činidlem. Je vhodný pro léčení tromboembolických příhod, jako je například koagulace krve, typicky u člověka.

Polypeptid se tedy může používat při léčení a profylaxi trombos a tromboembolií včetně profylaxe po-operačních trombóz, při akutní terapii šoku (například při septickém nebo polytraumatickém šoku), při terapii souchotinové koagulopathie, při hemodialyse, hemoseparacích a u mimotělního krevního oběhu. V jednom uspořádání podle vynálezu se polypeptid nebo jeho sůl může podávat společně s aktivátorem plasminogenu, jako je například aktivátor tkáňového plasminogenu.

Dávkování závisí na způsobu podávání a na účelu léčení nebo profylaxe. Velikost jednotlivých dávek a režimu dávkování lze určit nejlépe způsobem jednotlivého posouzení každého případu onemocnění. Způsoby stanovení příslušných krevních faktorů vyžadovaných pro tento účel jsou zřejmá odborníkovi. Normálně je v případě injekčního podávání terapeuticky efektivním množstvím sloučeniny podle tohoto vynálezu dávka v rozmezí od přibližně 0,005 do přibližně 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti. Výhodným dávkováním je dávka od přibližně 0,01 do přibližně 0,05 mg/kg tělesné hmotnosti. Podávání se provádí intravenosní, intramuskulámí nebo subkutánní injekcí. Podle toho pak množství farmaceutických prostředků pro parenterální podávání v jednotlivé dávkové formě závisí na způsobu podávání od přibližně 0,4 do přibližně

7.5 mg sloučeniny podle tohoto vynálezu v jedné dávce. Vedle aktivní složky obsahují tyto farmaceutické prostředky také pufr, například fosforečnanový pufr, který by měl udržovat pH mezi přibližně 3,5 a 7, dále pak chlorid sodný, manitol nebo sorbitol pro úpravu isotoničnosti roztoku. Mohou existovat ve vysušené (vymrazením) formě nebo v rozpuštěné formě. Je možné, aby roztoky s výhodou obsahovaly protibakteriální aktivní ochranná činidla, například od 0,2 do 0,3 % methylesteru nebo ethylesteru 4-hydroxybenzoové kyseliny.

Prostředek pro povrchovou aplikaci může existovat ve formě vodného roztoku, omývadla (lotionu) nebo gelu, olejového roztoku, suspense nebo ve formě, která obsahuje tuk, zvláště jako emulgovatelné masti. Prostředek ve formě vodného roztoku se získává například tak, že se účinné složky podle tohoto vynálezu nebo jejich terapeuticky přijatelné sůl rozpustí ve vodném pufrovaném roztoku o pH např. 4 až 6,5. Jestliže je to žádoucí, přidá se další účinná složka, například protizánětlivé činidlo a/nebo polymemí vazebné činidlo, například polyvinylpyrrolidon, a/nebo ochranné činidlo. Koncentrace aktivní složky je od přibližně 0,1 do přibližně

1.5 mg, s výhodou od 0,25 do 1,0 mg, v 10 ml roztoku nebo 10 g gelu.

Olejová forma pro povrchové podávání se získá například tak, že se účinné složky podle tohoto vynálezu nebo jejich terapeuticky přijatelná sůl suspenduje voleji, popřípadě se přidá bobtnací činidlo, jako je například stearát hlinitý a/nebo povrchově aktivní činidlo (tensid), které má

-7CZ 283458 B6 hodnotu HLB (hydrofilní-lipofilní rovnováha) pod 10, jako je například monoester polyhydroxyalkoholů s mastnými kyselinami, například monostearát glycerinu, monolaurát sorbitanu, monostearát sorbitanu nebo monooleát sorbitanu. Masti, které obsahují tuk, ze získávají například tak, že se účinné složky podle tohoto vynálezu nebo jejích terapeuticky 5 přijatelná sůl suspenduje v masťovém základu, popřípadě se přidá tensid s hodnotou HLB pod

10. Emulgovatelná mast se získá například tak, že se vodný roztok účinné složky podle tohoto vynálezu nebo její soli rozmíchá s měkkým masťovým základem s přidáním tensidu s hodnotu HLB pod 10. Všechny tyto formy pro povrchovou aplikaci mohou také obsahovat ochranná činidla. Koncentrace aktivní složky je od přibližně 0,1 do přibližně 1,5 mg, s výhodou od 10 0,25 mg do 1,0 mg, v přibližně 10 gramech základu.

Vedle shora popsaných prostředků a farmaceutických prostředků analogických těmto prostředkům, které jsou určeny pro přímé lékařské používání v těle člověka nebo savce, se tento vynález týká také farmaceutických prostředků pro lékařské použití mimo živé tělo lidí nebo 15 savců. Takové prostředky jsou používány zvláště jako antikoagulační aditiva (přísady) ke krvi, která je nucena obíhat mimo tělo nebo která je léčena mimo tělo (například při mimotělním oběhu nebo při dialýze v umělých ledvinách), ochraně nebo modifikaci (nebo hemoseparaci). Takové prostředky, jako jsou na příklad zásobní roztoky nebo jiné prostředky v jednotkové dávkové formě jsou ve svém složení podobné shora popsaným prostředkům pro injekční 20 podávání. Množství nebo koncentrace účinné složky s výhodou odpovídá objemu krve, která je léčena, nebo přesněji obsahu trombinu v této krvi. V této souvislosti je třeba si uvědomit, že účinná složka podle tohoto vynálezu (ve volné formě) úplně deaktivuje přibližně pětinásobek množství (hmotnostní) trombinu, je fysiologicky neškodná dokonce v relativně vysokých množstvích a lze ji z krevního oběhu rychle odstranit dokonce ve vysokých koncentracích, takže 25 neexistuje risiko předávkování, například během transfuse. Podle specifického účelu je vhodnou dávkou množství od přibližně 0,01 do 1,0 mg účinné složky na litr krve, i když stále ještě lze bez risika překročit horní limit.

Následující příklady ilustrují tento vynález. V doprovázejících příkladech a výkresech:

Obrázek 1 je chromatogram výsledků HPLC analýzy z příkladu 1. PÍ až P3 označují tři různá maxima získaná z přípravku podle příkladu 1. FT znamená průtok a 4-AB znamená 4aminobenzamidin.

Obrázek 2 ukazuje eluční profily získané v příkladu 2(b) pro trypsinem rozštěpený PE-P1 (A) a PE-P2 (B).

Obrázek 3 ukazuje sekvenci nukleotidů šesti oligonukleotidů kódujících většinu proteinu odpovídajícího maximu 2 (P2), v němž zbytek aminokyseliny v poloze 61 znamená Asp 40 a poslední aminokyselinou polypeptidové řetězce je Asn64. Sekvence, která je vytištěna tučnými písmeny, označuje místo Balí, které bylo použito pro další konstrukce. Dolní část Obrázku ukazuje způsob sestaveni šesti oligonukleotidových řetězců. Jsou zde zahrnuta rovněž místa HindlII a Pstl, která umožňují následné manipulace.

Obrázek 4 ukazuje schéma konstrukce meziproduktového plasmidu M13-P2, který je zdrojem Ball-BamHI DNA fragmentu pro všechny další P2 konstrukce.

Obrázek 5 ukazuje schéma konstrukce nového rekombinantuM13, pojmenovaného OMP-P2, který nese úplný gen P2 napojený na OmpA leader peptid. Vedoucí (leader) peptidová sekvence 50 je vytištěna tučnými písmeny, zatímco zarovnaný konec Balí a přečnívající konec HindlII jsou podtrženy.

Obrázek 6 ukazuje schéma konstrukce pFC-P2, což je plasmid použitý pro přípravu proteinu P2 v E. coli.

-8CZ 283458 Β6

Obrázek 7 ukazuje obecnou strukturu plasmidu poMPA-P2 použitou pro přípravu P2 v E. coli. Používá se trediční technika manipulace s geny pro přípravu tohoto nového plasmidu, kdy gen P2 je pod transkribční kontrolou hybridového promotoru P|_pp^_ac. Dokonce i v tomto případě OmpA vedoucí peptid řídí sekreci P2 do periplasmy E. coli.

Obrázek 8 ukazuje sekvenci nukleotidů a uspořádání syntetických oligonukleotidů pro sekreci P2 z hmyzích buněk. Sekvence uvedená tučným písmem označuje VSV G proteinový leader peptid.

Obrázek 9 ukazuje schéma konstrukce nového rekombinantu Ml3, nazvaného VSV-P2, kde úplný gen P2 je navázán na VSV G proteinový leader peptid.

Obrázek 10 ukazuje schéma konstrukce pAc-P2, který byl použit jako transfemí vektor na genom baculoviru, pAcYMl je výchozí plasmid široce používaný jako akceptor heterologních sekvencí, které se mají přenést na vir.

Obrázek 11 ukazuje sekvenci nukleotidů a uspořádání syntetických oligonukleotidů kódujících začátek P2 řetězce. ATG kodon kódující další methioninový zbytek je uveden tučnými písmeny.

Obrázek 12 ukazuje schéma konstrukce pAcFTl, který byl použit pro intracelulámí expresi.

Obrázek 13 ukazuje schéma nového transfemího plasmidu pojmenovaného pAcFTl-P2, který nese sekvenci úplného P2 napojenou na prvních 18 aminokyselin polyhedrinu. Tento plasmid byl použit pro přenos heterologní sekvence na genom baculoviru.

Obrázek 14 ukazuje schéma sekvence RAE protokolu pro amplifikaci 3' konců. V obrázku ***TTTT.... znamená dtl7 adaptorový primer. V každém stupni tohoto diagramu je zjednodušeně ilustrováno pouze to, jak se používá nový produkt vytvořený v předcházejícím stupni.

Obrázek 15 ukazuje schéma RACE protokolu pro amplifikaci 5' konců. V Obrázku ***TTTT.... a *** znamená dT17 adaptorový primer a adaptorový primer. V každém stupni tohoto diagramu je zjednodušeně ilustrováno pouze to, jak se používá nový produkt vytvořený v předcházejícím stupni.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Antitrombinový prostředek byl připraven z pijavic Hirudinaria manillensis podle spisu světového úřadu WO 90/05143 podle následujících postupů ilustrovaných pod ad a) a ad b).

a) Extrakce acetonem

Ethanolem vysušené hlavičky pijavic (2920 g) byly je mně nakrájeny na malé kousky a smíchány se směsí 7,5 litru acetonu s vodou v poměru 40:60. Po zhomogenizování za míchání za teploty místnosti byla směs odstřeďována patnáct minut při 2700 otáčkách za minutu. Supematant byl dekantován. Pelety byly opět resuspendovány ve směsi acetonu s vodou v poměru 40:60, míchány 30 minut a výsledná směs byla odstřeďována 15 minut při 2700 otáčkách za minutu. Supematant byl spojen s původním supematantem a okyselen ledovou kyselinou octovou na pH

4,5 (objem 8,5 1). Tato směs byla odstřeďována 15 minut při 2700 otáčkách za minutu, potom byl

-9CZ 283458 B6 supematant dekantován a pH roztoku bylo upraveno na 6,0 přidáním 30 % amoniaku. Výsledný roztok byl odpařen na rotačním odpařováku při 35 °C, pH zahuštěného roztoku bylo sníženo na 1,8. Vysrážené znečištěniny byly odstraněny odstřeďováním a surový antitrombinový materiál byl vysrážen ze směsi 9-násobným přebytkem acetonu. Tato směs se pak znovu odstřeďuje, pelety se resuspendují v acetonu a opět odstřeďují. Vysrážený materiál se pak lyofilizuje.

b) Čištění na ionexu

Surový protitrombinový materiál se rozmíchá ve vodě, dialyzuje se proti lOmM pufru octanu amonného při pH 4,0, nanese se na kolonu s karboxymethyl-Sepharosou (CM Sepharose, Pharmacia, 2,6 x 30 cm), která byla předem ekvilibrována ve stejném pufru. Následuje promytí 100 ml původního pufru. Antitrombinově aktivní frakce byly eluovány 20mM octanem amonným opH 4,5, spojeny (1,3 1) a pro další čisticí stupně byly zahuštěny na 0,5 litru přístrojem Minitan (Millipore). Zkoncentrovaný roztok byl zneutralizován hydroxidem sodným, potom byl nanesen na kolonu s Q Sepharosou ve 20mM Tris-HCl o pH 7,0. Navázaný materiál byl eluován lineárním gradientem 0 až 1M chloridu sodného ve výchozím pufru. Ty frakce, které obsahují antitrombinovou aktivitu, se spojí, zahustí aodsolí na koloně Superdex-S-200, eluce 20mM Tris-HCl o pH 7,5 při průtoku 4 ml za minutu. Aktivní podíl z gelové filtrace byl zahuštěn na přístroji Minitan a dále přečištěn chromatografií na slabém anexu (DEAE FPLC). Aktivní materiál byl nanesen na kolonu Protein Pak DEAE-5PW (Waters) a eluován gradientem 0 až 1M chloridu sodného ve 20mM Tris-HCl o pH 6,5 při průtoku 1,0 ml za minutu. Aktivní frakce byly spojeny, charakterizovány na obsah proteinu a na aktivitu (specifická aktivita: 800 ATU/mg), načež byly vysušeny vymrazením v přístroji SpeedVac concentrator (Savant).

Takto získaný částečně vyčištěný materiál (specifická aktivita 800 ATU/mg) byl pak podroben dalším dvěma chromatografickým stupňům, aby se získaly homogenní polypeptidy, postupem popsaným níže v odstavcích ad c) a ad d).

c) Trombin-Sepharosa

Komerční hovězí trombin (Sigma) byl dále čištěn podle postupu popsaného Lundbladem (Lundlblad R. L.: Biochemistry 10, 2501 až 2506 (1971).). Potom byl nanesen na aktivovanou Sepharosu CL 6B (Phamracia) podle pokynů výrobce. Kolona byla ekvilibrována (kolona 1,7 ml) 50mM Tris-HCl o pH 8,3 a materiál byl vysušen vymrazením (rozmíchaný v pufru) byl nanesen na kolonu (DEAE-FPLC). Tato kolona byla třikrát promyta výchozím pufrem, potom stejným pufrem obsahujícím 3,0 M chlorid sodný a opět výchozím pufrem (každé promývání bylo děláno trojnásobkem objemu kolony). Průtok byl 0,3 ml za minutu. Navázaný materiál byl eluován 10 ml 0,lM 4-aminobenzamidinu ve 25mM chlorovodíkové kyselině. Aktivní frakce se spojí a promyjí se kolonou PD-10 (Pharmacia) s iontoměničem v pufru (50mM Tris-HCl, pH 8,3).

Nenavázaný materiál se eluoval z kolony promýváním počátečním pufrem. Stále však obsahoval antitrombinovou aktivitu. Tento materiál byl znovu nanesen na kolonu a tento postup byl opakován tak dlouho, dokud všechny aktivita nebyla navázána na kolonu. Potom byl chromatografován.

d) RP-HPLC

Materiál, který byl získán afinitiní chromatografií, byl nakonec čištěn vysokoúčinnou chromatografií na obrácených fázích (RP-HPLC) na koloně C4 Vydac (4,6 x 250 mm, 5 /um). Kolona byla eluována 20mM fosforečnanem sodným (pH 7,5) jako prvním eluentem a potom 50 % acetonitrilem ve vodě podle potřeby. Antitrombinová aktivita byla elluována lineárním gradientem od 5 % do 55 % eluentu B během 45 minut za teploty místnosti při průtoku 1,0 ml za minutu. Výsledný chromatogram je uveden na obrázku 1.

- 10CZ 283458 B6

Maxima proteinu (detegováno při 220 nm) byla ručně spojena, zahuštěna ve vakuu a rechromatografována za stejných podmínek. Čisté antitrombinové polypeptidy po C4 HPLC byly charakterizovány na obsah proteinu, složení aminokyselin, sekvenci na N-konci a na Ckonci a na jejich aktivitu stanovovanou in vitro analýzami (test ATU/NIH atest trombine time). Bylo zjištěno, že každé ze tří maxim proteinu má v sobě protitrombinovou aktivitu.

Úplné sekvence aminokyselin polypeptidů označených PÍ a P2 na obrázku 1 byly stanoveny Nkoncovým sekvenováním peptidů získaných štěpením trypsinem aV8 proteasou. Částečná sekvence aminokyselin dalšího polypeptidů (P3) je shora uvedena pod vzorcem III.

Příklad 2

Tryptické štěpení a mapování pyridylethylovaných (PE) PÍ a P2

a) Redukce/alkylace - Aktivní frakce vyčištěné afinitní chromatografií na Thrombin-Sepharose (příklad lc) se spojí a nechají se projít kolonou PD-10 s iontoměničem v pufru (lOmM Tris-ElCl, pH 8,3). Aktivní podíl (asi 50 pg) se zahustí na odstředivce Dpeed-Vac (Savant) a nechá se zreagovat se 100 μΐ 1 % β-merkaptoethanolu v 6 M hydrochloridu guanidinu (50mM Tris-HCl, pH 8,5, pod dusíkem, ve tmě, dvě hodiny za teploty místnosti). Potom se přidají 4 mikrolitry 4vinyl-pyridinu (čistý) a směs se inkubuje opět dvě hodiny jak shora uvedeno (citace: Dupont D., Keim P., Chui A., Bello R. a Wilson K..: Derivatizer-Analyser User Bulletio No. 1, Applied Biosystems lne., 1987.).

Pyridylethylované polypeptidy se nejdříve izolují z reakční směsi RP-HPLC na koloně C4 (4,6 x 250 mm, 5 pm) eluované 90 minut lineárním gradientem od 5 do 65 % acetonitrilu v 0,1 % TFA při průtoku 1,0 ml za minutu. Za těchto podmínek došlo ke špatnému rozdělení protitrombinových polypeptidů, takže se musely rechromatografovat na stejné koloně, eluce systémem fosforečnan sodný/acetonitril za podmínek již popsaných v příkladu ld.

b) Štěpení trypsinem a mapování peptidů PE-P1 a PE-P2 - Vyčištěné PE-P1 a PE-P2 (10 a 20 pg) se rozštěpí TPCK-zpracovaným trypsinem (Sigma) ve 200 pl 1 % hydrogenuhličitanu amonného, pH 8,0, v přítomnosti 0,2 M fosforečnanu sodného. Trypsin se přidá v poměru 1:20 (hmotnostní díly; poměr enzymu k substrátu) a směs se inkubuje čtyři hodiny při 37 °C. Štěpení se zastaví vysušením vy mrazením v Savantu.

Peptidy, které byly získány štěpení trypsinem, se rozdělí na koloně Cl8 pBondapack (3,9 x 300 mm, 10 pm. Waters) nebo na koloně C4-Vydac (4,6 x 250 mm, 5 pm). Eluce šedesát minut lineárním gradientem od 5 do 65 % acetonitrilu v 0,1 % TFA pri průtoku 1,0 ml za minutu (obrázek 2). Eluovaná maxima byla ručně spojena, zahuštěna v Savantu a podrobena analýze aminokyselin aN-koncové sekvenační analýze na pulsním sekvenátoru model 477A (Applied Biosystems) v kapalné fázi. Výsledky C4-HPLC mapování trypsinem rozštěpené ho PE-P1 (A) a PE-P2 (B) jsou uvedeny níže.

Fragment	sekvence aminokyselin
1-13	VSYTDCTESGQNY (A)
14-26	CLCVGGNLCGGGK
27-36	HCEMDGSGNK.
37-47	CVDGEGTPKPK
37-47(+)	CVDGEHX+PK.PK.
48-64	SQTEGDFEEIPDEDILN

- 11 CZ 283458 B6

Fragment sekvence aminokyselin

1-13

14-26

27-47

48-64

VSYTDCTESGQNY CLCVGSNVCGEGK NCQLSSSGNQCVHGEGX+PKPK SQTEGDFEEIPDEDILN (+) X znamená zbytek, který nebyl detegován sekvenováním aminokyselin; X znamená T podle aminokyselinové analýzy.

Úplné sekvence amibokyselin Pia P2 jsou tedy:

(Pl)

Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Tyr Cys Leu Cys Val Gly Gly Asn Leu Cys Gly Gly Gly Lys His Cys Glu Met Asp Gly Ser Gly Asn Lys Cys Val Asp Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Lys Ser Gin Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu Asp Ile Leu Asn (P2)

Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Tyr Cys Leu Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gin Leu Ser Ser Ser Gly Asn Gin Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Lys Ser Gin Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu Asp Ile Leu Asn

Příklad 3

Chemická syntéza genu P2

Sekvence nukleotidů byla navržena na základě Escherichia coli výhodných kodonů (Grosjeans H. a Fiers W.: Gene 18. 199 (1982).). Navíc bylo připraveno restrikční místo Balí velice blízko 5'konci syntetického genu, aby byla umožněna iserce takové sekvence do různých expresních vektorů. Skutečně byl pak stejný syntetický gen použit pro expresi rekombinantního P2 proteinu v bakteriálních i hmyzích buňkách. V případě hmyzích buněk byl vyvinut způsob, který poskytoval protein P2 jako sekretovaný nebo cytoplasmový produkt.

Všechny manipulace s plasmidovou DNA se provádějí způsobem podle Maniatise a spol. (Maniatis T., Fritsch E. F. a Sambrook J.: Cold Spring Harbor. NY, 1982).

Šest syntetických komplementárních oligonukleotidů se připraví automatickým DNA syntetizátorem (Applied Biosystems). Jejich sekvence jsou uvedeny na obrázku 3. Těchto šest olinukleotidů bylo uspořádáno pro enzymatické fosforylaci DNA ligasou. Výsledná dvouvláknová sekvence byla vložena do Ml3 fágového vektoru mpl8 obsahující rekombinantní plasmid M13-P2, který je uveden na obrázku 4. Aby se umožnila inserce genu P2 do vektoru M13, přidají se do syntetických oligonukleotidů také místa Hind III a Pst 1. Správná nukleotidová sekvence byla ověřena způsobem podle Sangera na jedno vláknové fágové DNA (Sanger F., Nicklen S. a Coulson A. R.: Proč. Nati, sci. Acad. USA 74, 5463 (1977).).

Ve všech příkladech pro všechny expresní vektory byl použit rekombinantní plasmid M13-P2.

- 12CZ 283458 B6

Příklad 4

Exprese a sekrece P2 z buněk E. coli

Aby se získala sekrece rekombinantního produktu do periplasmového prostoru, je nutné syntetizovat molekulu P2 ve formě pre-proteinu. Podrobněji uvedeno - sekvence aminokyselin nazývaná leader peptid (vedoucí peptid), která je odpovědná za účinnou sekreci, musí být přítomna na aminovém konci P2 (Blobel G. aDobberstain B.: J. Cell. Biology 67, 83 (1975); Pages J. M.: Biochimie 65, 531 (1983).).

Tato sekvence navíc se pak odštěpí in vivo během sekrece specifickou E. coli leader peptidasou. Získá se tak správná maturovaná sekvence (Wolfe P. B.: J. Biol. Chem. 258, 12073 (1983).).

V literatuře je popsáno mnoho příkladů sekrečních systémů (Talmadge K., Stáhl S. a Gilbert W: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77. 3369 (1980), Oka T., Sakamoto S., Miyoshi K., Fuwa T., Yoda K., Yamasaki M., Tamura G. aMiyake K.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, 7212 (1985).). Z těchto sekrečních systémů byl vybrán systém, který je založený na sekrečním signálu proteinu vnější membrány E. coli (Omp A), který byl již dříve publikován (Henning V., Royer H. D., Teather R. M., Hindennach I. a Hollenberg C. P.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76, 4360 (1979).). Navrhli jsme proto dva další komplementární oligonukleotidy kódující OmpA leader peptid předcházený OmpA Shine-Dalgamovou sekvencí, o níž je známo, že je zodpovědná za efektivní translaci informační RNA (Isacchi A., Sarmientos P., Lorenzetti R. a Soria M: Gene 81, 129 (1989).).

Jejich sekvence, které jsou uvedeny na obrázku 5, zahrnují také počátek genu P2 kódující prvních deset aminokyselin. Přítomnost Balí místa umožňuje připojení tohoto syntetického kousku ke zbytku P2 kódující sekvence, zatímco přítomnost místa HindlII proti směru vlákna umožňuje připojení kM13 vektoru. Syntetický HindlII-Ball fragment se tedy liguje s kouskem Ball-BamHI z M13-P2 a vkládá se do M13mpl8. Získá se tak nový plasmid nazvaný OMP-P2. Schematické znázornění konstrukce tohoto nového plasmidu je rovněž uvedeno na obrázku 5.

Z OMP-P2 se může vyštípnout gen P2 jako HindlII-BamHI fragment, který kóduje OmpA ShineDalgamovu sekvenci a leader peptid následované P2 kódující sekvencí. Tento restrikční fragment je nyní připraven pro vložení do příslušného expresního vektoru. Pro získání vysokých úrovní produkce heterologních proteinů v bakteriích lze teoreticky použít několik expresních systémů. V naší laboratoři byl v minulosti (Isacchi A., Sarmientos P., Lorenzetti R. a Soria M: Gene 81, 129 (1989).) s úspěchem použit systém založený na promotoru Ptrp. Opět, dokonce i v případě vybraného promotoru nemohou být předpovězeny úrovně exprese daného polypeptidu.

Plasmid pFC33, který je uveden na obrázku 6, byl již v literatuře popsán (Isacchi A., Sarmientos P., Lorenzetti R. a Soria M.: Gene 81, 129 (1989).). Nese resistenci na antibiotikum penicilín a bakteriální promotor P_trp, který řídí expresi proapolipoproteinu AI. Následuje štěpení pFC33 působením HindlII a BamHI. Velký HindlII-BamHI fragment, který nese gen antibiotické resistence a promotor se izoluje a spojí se s HindlII-BamHI fragmentem zOMP-P2 kódujícím gen P2. Podrobnosti této konstrukce jsou uvedeny na obrázku 6. Byl tak izolován nový plasmid, nazvaný pFC-P2, který je konečným plasmidem pro produkci P2 v E. coli.

Předmětem tohoto vynálezu je použití E. coli kmenů typu B pro expresi a sekreci P2 a dalších antitrombinových polypeptidů podle vynálezu do periplasmy. Skutečně bylo zjištěno, že inserce plasmidu pFC-P2 do kmenů typu B bakterie E. coli přináší vysokou úroveň produkce P2. Je zajímavé, že různé kmeny typu E. coli nepracují tak účinně. Zdá se tedy, že typ kmene hostitele je rozhodující pro úspěšnou produkci bufrudinu.

- 13 CZ 283458 B6

Pro přípravu P2 je dostupných a může být používáno několik E. coli kmenů typu B. Výhodnými kmeny jsou ATCC č. 12 407, ATCC 11 303 aNCTC 10 537. Níže bude uveden příklad transformace kmene NCTC 10 537 plasmidem pFC-P2 a následná kultivace transformantu.

Příslušné buňky kmene NCTC 10 537 se připraví postupem s chloridem vápenatým podle Mandela aHiga (Mandel M. a Higa A. J.: J. Mol. Biology 53, 154 (1970).). Přibližně 200 μΐ přípravku těchto buněk v množství 1.10⁹ buněk na mililitr se transformuje 2 μΙ plasmidové DNA (přibližná koncentrace 5 pg/ml). Transformanty byly vybrány na deskách L-agaru obsahujících 10 100 pg/ml ampicilinu. Dvě malé kolonie se přenesou dřevěnou zubařskou špachtlí (vždy jako 3 proužky, dlouhé asi jeden cm) na L-agar obsahující stejné antibiotikum. Po dvanácti hodinách inkubace při 37 °C se části proužků testují na produkci proteinu P2; naočkují se do 10 ml média LB (obsahující ampicilin v koncentraci 150 pg/ml) a inkubují se přes noc při 37 °C. Následující den se kultury zředí mediem M9 v poměru 1:100 (medium M9 obsahuje stejnou koncentraci 15 ampicilinu) a inkubují se šest hodin při 37 °C.

Dvacet ml této kultury se odstřeďuje při 12 000 x g při 4 °C deset minut. Bakteriální peleta se resuspenduje ve dvou ml 33mM Tris-HCI, pH 8, potom se přidá stejný objem druhého roztoku (33mM EDTA, 40 % sacharóza) a celá směs se inkubuje za mírného třepání deset minut při 20 teplotě 37 °C. Po odstřeďování se permeabilizované buňky resuspendují ve 2 ml studené vody a ponechají se deset minut v ledu. Výsledný supernatant se izoluje odstřeďováním. Tento supematant představuje periplasmovou frakci bakteriální buňky.

Chromogenní analýza, která je založena na inhibici schopnosti trombinu štěpit syntetický 25 substrát S-2238 (Krstenansky J. K. aMao S. J. T.: FEBS Lett. 211, 10 (1987).), se použije pro měření přítomnosti anti-trombinové aktivity v periplasmové frakci buněk produkujících P2, ale ne pro kontrolu periplasmových frakcí.

Podobným způsobem se zkonstruuje také nový expresní/sekreční plasmid pro P2, v němž místo 30 promotoru P_trp je přítomen promotor P|p_p/i_ac (Ghrayeb J., Kimura H., Takahara M., Hsiung H.,

Masui Y. a Inouye Μ.: EMBO Joumal 3, 2437 (1984).). Tento odlišný plasmid, pojmenovaný poMP-P2, je uveden na obrázku 7. Po inserci tohoto plasmidu do E. coli kmenů typu B byly získány také vysoké hladiny aktivního P2. Jako výchozí plasmid pro konstrukci pOMP-P2 byl použit plasmid pIN-III-ompA3 popsaný Ghraybem a spol. (Ghrayeb J., Kimura H., Takahara M., 35 Hsiunggg H., Masui Y. a Inouye M.: EMBO Joumal 3, 2437 (1984).).

Podmínky pro kultivaci a indukci exprese isopropyl-fL-D-thiogalaktopyranosidem (IPTG) byly již dříve popsány.

Příklad 5

Exprese a sekrece proteinu P2 z hmyzích buněk

Aby se dosáhlo sekrece proteinu P2 z rekombinantních hmyzích buněk, musí se spojit P2 kódující sekvence s leader peptidem, který je efektivně rozpoznáván těmito buňkami. Pro tento účel byl použit leader peptid proteinu vesikulámí stomatitidy (VSV) G (Bailey M. J., McLeod D. A., Kang C., a Bishop D. H. L.: Virology 169, 323 (1989)). Podobně jako bylo shora popsáno se připraví syntetická DNA sekvence kódující VSV G proteinový leader peptid následovaný 50 počátkem genu P2. Tato sekvence nukleotidů je uvedena na obrázku 8. Také v tomto případě se vhodná restrikční místa (Hind III, BamHI a Balí) napojí na zbytek genu P2 a na expresní vektor.

- 14CZ 283458 B6

Syntetický HindlII-Ball fragment se napojí na vyčištěný Ball-BamHI fragment zM13-P2 nesoucím gen P2 a vloží se do M13mpl8, předem rozštěpeného působením HindlII aBamHI. Tato konstrukce, která poskytla nový plasmid nazvaný VSV-P2, je schematicky uvedena na obrázku 9. Z VSV-P2 se vyštípne BamHI-BamHI fragment DNA nesoucí gen P2 napojený na VSV leader peptid. Ten se pak vloží do vektoru pAcYMl (Matsuura Y., Possee R. D., Overton H. A. aBishop D. H. L.: J. Gen. Virol. 68, 1233 (1987).), jak ukazuje obrázek 10. Výsledný plasmid byl pojmenován pAc-P2.

Aby došlo k expresi v hmyzích buňkách. VSV-P2 kódující sekvence se musí přenést na genom baculoviru za podmínek, kdy je transkripce regulována polyhedrinovým promotorem. Pro tento účel se kontransfektují hmyzí buňky DNA baculoviru přírodního typu atransfemím vektorem pAc-P2. Jako hostitelské buňky byly vybrány buňky hmyzí - buňky Spodoptera frugiperda. Podrobnosti provedeného pokusu jsou následující: Buňky Spodoptera frugiperda se transfektují směsí infekční AcNPV DNA a plasmidové DNA, representující jednotlivé rekombinantní transferové vektory, modifikací postupu, který popsali Summers a spol. (Summers M. D. a Smith G. E.: Texas Agricultural Experiment Station Bulletin N. 1555 (1987).).

Jeden mikrogram virové DNA se smíchá s 25 až 100 mikrogramy plasmidové DNA a vysráží se (konečné koncentrace) 0,125M chloridem vápenatým v přítomnosti 20mM pufru HEPES, pH 7,5, lmM hydrogenorthofosforečnanu sodného, 5mM chloridu draselného, 140mM chloridu sodného a lOmM glukózy (celý objem 1 ml).

DNA suspense se naočkuje na monovrstvu 106 buněk S. frugiperda ve 35 mm misce pro tkáňové kultury, nechá se absorbovat buňkami hodinu za teploty místnosti, potom se nahradí 1 ml média. Po třech dnech inkubace při 28 °C se kapaliny supematantu seberou a použijí se pro přípravu plaků v monovrstvách buněk S. frugiperda. Plaky, které obsahují rekombinantní virus, se identifikují podle nepřítomnosti polyhedra při zkoumání světelným mikroskopem. Virus z takových plaků se izoluje a po dalším přečištění přes plaky se použije k přípravě zásob viru negativního na polyhedrin.

Shora uvedený postup umožňuje izolovat rekombinantní baculovirus, jehož genom nese gen P2 pod kontrolou polyhedrinového promotoru a VSV G proteinového leader peptidu. Tento virus byl použit pro infektování buněk S. frugiperda podle dobře známých postupů (Summers M. D. a Smith G. E.: Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987).), při multiplicitě infekce 10. Infektované buňky byly pak kultivovány buď vmíchané kultuře, nebo v monovrstvách v přítomnosti 10% plodového telecího séra podle publikovaného způsobu (Summers - viz shora uvedená citace.). V obou případech S-2238 chromogenní analýza ukázala přítomnost anti-trombinové aktivity v kultuře supematantů infektovaných buněk.

Příklad 6

Exprese proteinu P2 v cytoplasmě hmyzích buněk

Protein P2 se může produkovat také (a akumulovat) v cytoplasmě buněk S. frugiperda. Tento přístup poskytuje obvykle lepší výtěžek heterologních proteinů, jelikož využívá expresní signály polyhedrinu, který je nesekretovaným virovým proteinem.

Náš přístup získávání velkých množství rekombinantního proteinu P2 je založen na expresi napojeného polypeptidu, kde prvních 18 aminokyselin polyhedrinu je napojeno ve fázi se 64 aminokyselinami P2. Přítomnost aminové koncové sekvence polyhedrinu umožňuje vysokou hladinu exprese (Luckow V. A. a Summers M. D.: Virology 167, 56 (1988).). Mezi

- 15CZ 283458 B6 polyhedrinovou část a sekvenci P2 byl vložen methioninový zbytek, který umožňuje uvolnění zbytku P2 zpracováním hybridního proteinu s bromkyanem.

Podobně jako v předchozích přístupech se připraví syntetický DNA fragment, který umožňuje 5 napojení Ball-BamHI fragmentu z M13-P2 na příslušný transfemí vektor. Tento nový syntetický kousek, který je uveden na obrázku 11, zahrnuje také místo BamHI a Balí pro následné manipulace.

Byl získán jiný transfemí vektor, pAcFTl, nesoucí sekvenci nukleotidů, která kóduje prvních 18 10 aminokyselin polyhedrinu (obrázek 12). Ve stručnosti - EcoRV-BamHI fragment zpAcYMl (Matsuura Y., Possee R. D., Overton H. A. a Bishop D. H. L.: J. Gen. Virol. 68, 1233 (1987).) se nahradí syntetickým oligonukleotidem, který obsahuje sekvence polyhedrinového genu od nukleotidu -92 k nukleotidu +55. Po této sekvenci je přítomno vhodné místo BamHI. Toto místo se použije pro vložení úplné P2 kódující sekvence podle schématu uvedeného na obrázku 13.

Touto konstrukcí jsme získali nový plasmid, nazvaný pAcFTl-P2, který se použije pro přenos hybridního genu na genom baculoviru.

Takto získaný rekombinantní baculovirus je popsán v příkladu 5. Infekce buněk S. frugiperda se provádí podle standardních postupů (Summers M. D. a Smith G. E.: Texas Agricultural 20 Experiment Station Bulletion č. 1555 (1987).). Kultivace infektovaných hmyzích buněk vede k akumulaci napojeného proteinu v cytoplasmě. Tento hybridní protein je zdrojem rekombinantního proteinu P2. V literatuře je známo několik způsobů, které lze použít pro štěpení hybridu působením bromkyanu (Gross E.: Methods in Enzymology 11, 238 (1967); Olson H., Lind P., Pohl C., Henrichson C., Mutt V.,Jomvall H., Josephson S., Uhlen M. a Lake M.: 25 Peptides 9, 301 (1987).). Aplikace způsobu podle Olsona aspol. (viz výše) umožnila získat správnou polypeptidovou sekvenci P2. Tato molekula vykazuje antitrombinovou aktivitu.

Příklad 7

Aby se získala Tyr₆i varianta proteinu P2, oligonukleotidy č. 5 a 6 (shora popsané v příkladu 3 a uvedené na obrázku 3) byly substituovány následujícími oligonukleotidy: oligo 5-Tyr

5'CGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAAGAAATTCCGGACGAATACATCCCTG

AACTAGTAACTGCA 3’ oligo 6-Tyr 5'-GTTACTAGTTCAGGATGTATTCGTCCGGAATTTCTTCGAAGTCACCTTCA 3'.

Triplet TAC v oligo 5-Tyr, který je podtržen, kóduje tyrosinový zbytek a substituuje GAC triplet, který kóduje původně přítomnou kyselinu asparagovou. Oligo 6-Tyr byl opraven tak, aby se získala úplná komplementarita mezi těmito dvěma vlákny. Následující stupně, které vedou k expresi a/nebo sekreci varianty v hmyzích buňkách nebo v E. coli, jsou stejné jako stupně shora popsané v příkladech 4 až 6.

Příklad 8

Aby se získal o glycin prodloužený derivát P2 proteinu, oligonukleotidy č. 5 a 6 (shora popsané 50 v příkladu 3 a uvedené na obrázku 3) byly substituovány následujícími oligo nukleotidy:

oligo 5-Gly 5'CGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAAGAAATTCCGGACGAAGACATCCTGAACGGTTAGTAACTGCA 3'

- 16CZ 283458 B6 oligo 6-Gly

5GTTACTAACCGTTCAGGATGTCTTCGTCCGGAATTTCTTCGAAGTCACCTTCA 3’

Triplet GGT v oligo 5-Gly, který je podtržen, kóduje glycin, který je vložen před stop kodon. Oligo 6-Gly byl opraven tak, aby se získala úplná komplementarita mezi těmito dvěma vlákny. Následující stupně, které vedou k expresi a/nebo sekreci derivátu prodlouženého o Gly v hmyzích buňkách nebo v E. coli, jsou stejné jako stupně shora popsané v příkladech 4 až 6.

Příklad 9 cDNA klonování PÍ a P2 (a) Celková RNA z hlaviček Hirudinaria manillensis byla připravena způsobem podle Cathala a spol. (Cathala G., Savou ret J. F., Mendez B., West B. L., Karin M., Martial J. A. a Baxter J. D.: DNA 2(4).329 až 335 (1983).).

(b) Reversní transkripční reakce byla provedena následujícím způsobem:

pg celkové RNA z hlaviček pijavic, pg adaptorového primeru dT17, pl 5mM směsi dNTP, pl AMV pufru 5 x, doplněno vodou na 40 pl se dá do ledu, smíchá se a směs se zahřívá dvě minuty na 65 °C, načež se znovu vloží do ledu. Přidá se 10 jednotek RNAsinu (Promega) a 20 jednotek AMV reversní transkriptasy (Boehringer Mannheim). Směs se inkubuje dvě hodiny při 42 °C. Reakční směs se pak extrahuje směsí fenolu s chloroformem a vysráží se isopropanolem.

(c) Polymerasová řetězová reakce (PCR) se provádí podle obecného schématu jak dále uvedeno: PCR směs obsahuje:

pl reversní transkribované RNA, pl 10 x PCR pufru (Cetus/Perkin Elmer), pl směsi dNTP (1,25 mM každé dNTP), pl 0,lMchloridu hořečnatého, až 500 pikomolů každého primeru, doplněno vodou na 100 pl.

Reakční směs se denaturuje pět minut při 95 °C před tím, než se přidá 2,5 jednotky Taq polymerasy (Cetus/Perkin-Elmer). Potom se převrství 80 pl minerálního oleje. Cykly reakce se provedou v přístroji Cetus/Perkin Elmer DNA Thermal Cycler. Postup cyklů je následující:

minuty minuty minuty 30 sek.

minuta minuty minuty 30 sek.

minuta minuty °C °C °C °C °C °C °C °C cyklus cyklů

- 17CZ 283458 B6

5 minut	72 °C	1 cyklus
7 minut	72 °C
ponechat na	25 °C

Zbývající Taq polymerasa se deskativuje směsí fenolu s chloroformem a vysrážením ethanolem. Vzorky lze skladovat při - 20 °C. Aby se získaly úplné sekvence PÍ a P2 cDNA, provedou se tři kola PCR amplifikace. Sekvence každého primeru jsou uvedeny níže. Polohy, do nichž byla zavedena degenerace v oligonukleotidové sekvenci, jsou označeny alternativními nukleotidy, které jsou uvedeny pod sekvencí primerů (písmeno N znamená, že byly použity všechny čtyři nukleotidy). Restrikční místa, která byla přidána pro usnadnění klonování aplifikačních produktů, jsou podtržena.

dT17 adaptorový primer:

5’GAC TCG AGT CGA CAT CGA TTT TTT TTT TTT TTT TT 3'

Xhol Sáli adaptorový primer:

5'GAC TCG AGT CGA CAT CG 3'

Xhol Sáli primer 3-8:

5'ATC GAA GCT TTA TAC CGA TTG TAC NGA 3'

HindHI C A C C

T primer 52-56:

5'CTA AGG ATC CTT CTT CGA AGT CNC C 3'

BamHI C A A primer 32 až 37:

5’ATC GGA ATT CAG TTC TGG AAA TCA GTG CGT 3'

EcoRI primer 5Ί:

5'CTA AGA ATT CTT CGC AAC TTA TAT GCG TT 3’

EcoRI primer 5' II:

5'ATC GGA ATT CTT AAT TCA ATA TAT CTT CAT 3’

EcoRI

První kolo amplifikace

500 pmolů plaků plně degenerovaných primerů, od zbytku 3 do 8 a od zbytku 56 do 52 sekvence aminokyselin P2 byly použity jako protilehlé primery při PCR reakci.

Amplifikace cDNA 3'konců (RACE protokol) (Frohman M. A., Dush Μ. K. a Martin G. R.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 8998 až 9002 (1988).)

Primer specifický pro gen, od zbytku 32 do 37, byl navržen na základě sekvence nukleotidů P2 stanovené v prvém kole amplifikace. Tento primer byl použit společně s dT adaptorovým primerem pro amplifikaci cDNA (obrázek 14).

Amplifikace cDNA 5'konců (RACE protokol) (Frohman a spol.: shora uvedená citace)

- 18CZ 283458 B6 pg celkové RNA z hlaviček pijavic bylo reversně transkribováno jak shora popsáno až na to, že místo dT17 adaptorového primeru byl použit 1 pg primeru specifického pro gen (5' I) (viz obrázek 15). Reakční směs se pak vysráží působením isopropanolu. První vlákno cDNA produktů se polyadenyluje na 5' koncích koncovou deoxynukleotidyltransferasou (TdT) následujícím způsobem:

μΙ cDNA, μΐ 6mM dATP, μΐ 5 x TdT pufru (BRL) a

1,1 μΐ TdT (BRL).

Vzorky se inkubují 10 minut při 37 °C a zahřívají se 16 minut na 65 °C. Reakční směs se pak zředí destilovanou vodou na 500 μΐ.

μΐ polyadenylovaných produktů se amplifikuje 10 pikomoly dT17 adaptorového primeru, 25 pikomoly adaptorového primeru a 25 pikomoly druhého genově-specifického primeru proti směru vlákna k prvnímu použitému pro transkripci (5' Π, viz obrázek 15).

d) Analýza PCR produktů - Amplifikované produkty se rozštěpí v restrikčních místech přítomných v každém primeru. Rozštěpený produkt se vyčistí na gelu a subklonuje se do vektoru pUC13, předem rozštěpeného stejnými restrikčními enzymy. Plasmidy, které nesou insert, o který nám jde, se identifikují restrikční analýzou. Plasmidová DNA se sekvenuje sekvenasou (USB) podle pokynů dodavatele. Takto získané cDNA sekvence PÍ aP2 a odvozené sekvence aminokyselin jsou následující (vedoucí (leader) sekvence jsou podtrženy):

PÍ cDNA

tca

aaa

ATG Met

TTC Phe

TCT Ser

CTC Leu

AAG Lys

TTG Leu

TTC Phe

GTT Val

GTC Val

TTC Phe

CTG Leu

GCT Ala

GTT Val

TGC

ATC

TGC

GTG

TCT

CAA

GCA

GTG

AGC

TAC

ACT

GAT

TGT

ACG

GAA

Cys

Ile

Cys

Val

Ser

Gin

Ala

Val

Ser

Tyr

Thr

Asp

Cys

Thr

Glu

TCA

GGC

CAG

AAT

TAT

TGT

CTA

TGC

GTG

GGA

GGT

AAT

CTC

TGC

GGT

Ser

Gly

Gin

Asn

Tyr

Cys

Leu

Cys

Val

Gly

Gly

Asn

Leu

Cys

Gly

GGA

GGC

AAA

CAT

TGT

GAA

ATG

GAC

GGT

TCT

GGA

AAT

AAA

TGC

GTC

Gly

Gly

Lys

His

Cys

Glu

Met

Asp

Gly

Ser

Gly

Asn

Lys

Cys

Val

GAT

GGG

GAA

GGT

ACT

CCG

AAG

CCT

AAG

AGC

CAG

ACT

GAA

GGC

GAT

Asp

Gly

Glu

Gly

Thr

Pro

Lys

Pro

Lys

Ser

Gin

Thr

Glu

Gly

Asp

TTC

GAA

GAA

ATC

CCA

GAT

GAA

GAT

ATA

TTG

AAT

TAA

Phe

Glu

Glu

Ile

Pro

Asp

Glu

Asp

Ile

Leu

Asn

Konec

P2 cDNA

aaa

ATG

TTC

TCT

CTC

AAG

TTG

TTC

GTT

GTC

TTC

CTG

GCT

GTT

TGC

Met

Phe

Ser

Leu

Lys

Leu

Phe

Val

Val

Phe

Leu

Ala

Val

Cys

ATC

TGC

GTG

TCT

CAA

GCA

GTG

AGC

TAC

ACT

GAT

TGT

ACG

GAA

TCA

Ile

Cys

Val

Ser

Gin

Ala

Val

Ser

Tyr

Thr

Asp

Cys

Thr

Glu

Ser

GGT

CAG

AAT

TAT

TGT

CTA

TGC

GTG

GGA

AGT

AAT

GTC

TGC

GGT

GGA

Gly

Gin

Asn

Tyr

Cys

Leu

Cys

Val

Gly

Ser

Asn

Val

Cys

Gly

Glu

GGC

AAA

AAT

TGT

CAA

CTG

AGC

AGT

TCT

GGA

AAT

CAG

TGC

GTC

CAT

Gly

Lys

Asn

Cys

Gin

Leu

Ser

Ser

Ser

Gly

Asn

Gin

Cys

Val

His

GGG

GAA

GGT

ACT

CCG

AAG

CCT

AAG

AGC

CAG

ACT

GAA

GGC

GAT

TTC

Gly

Glu

Gly

Thr

Pro

Lys

Pro

Lys

Ser

Gin

Thr

Glu

Gly

Asp

Phe

GAA

GAA

ATC

CCA

GAT

GAA

GAT

ATA

TTG

AAT

TAA

cgaacgcatataagt

Glu

Glu

Ile

Pro

Asp

Glu

Asp

Ile

Leu

Asn

Konec

-19CZ 283458 B6 tgcgaataattctgattttaagacattcccatcgcagctatggctatttacagtatatta ttataaataaagaattgaacgtttacgttgattgta.

Antitrombová účinnost polypeptidu obsahujícího sekvenci obecného vzorce Π, Jištěná fibrinovým testem srážlivosti, je 11000 ATU/mg, tedy přibližně stejná jako u rHVl (11500 ATU/mg).

Průmyslová využitelnost

Polypeptidy podle vynálezu mají využití při léčení žilní trombosy, vmetků v umělých cévách a trombinem indukovaného rozsetí intravaskulámí koagulace.

Claims (13)

1. Izolovaný a čištěný polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin obecného vzorce Π

Val Ser Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Tyr Cys Leu

1 5 10 15 Cys Val Gly Ser Asn Val Cys Gly Glu Gly Lys Asn Cys Gin Leu 20 25 30 Ser Ser Ser Gly Asn Gin Cys Val His Gly Glu Gly Thr Pro Lys 35 40 45 Pro Lys Ser Gin Thr Glu Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Asp Glu 50 55 60 Yaa Ile Leu Asn Zaa 65 (Π),

v němž Yaa znamená Asp nebo Tyr aZaa znamená skupinu -OH, -NH₂ nebo Gly-OH, a jeho farmaceuticky přijatelné soli.

2. Způsob přípravy polypeptidu podle nároku 1, nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí, vyznačující se tím, že se

a) připraví DNA sekvence kódující polypeptid ve formě pre-proteinu, v němž vedoucí peptid je přítomný na NH₂ konci polypeptidu,

b) DNA se vloží do expresního vektoru,

c) vhodný hostitel se transformuje expresním vektorem,

d) transformovaný hostitel se kultivuje ve vhodném kultivačním prostředí k expresi genu kódujícího polypeptid a

e) takto získaný polypeptid nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl se izolují.

-20CZ 283458 B6

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se jako hostitel používá bakterie, kvasinka, savčí buněčná linie nebo hmyzí buněčná linie.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se jako hostitel používá E. coli typ B nebo buněčná linie Spodoptera frugiperda.

5. Způsob přípravy polypeptidu podle nároku 1, nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí, vyznačující se tím, že se

a) chemicky syntetizuje polypeptid a

b) takto získaný polypeptid nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl se izolují.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se stupeň a) provádí syntézou v tuhé fázi.

7. Způsob přípravy polypeptidu podle nároku 1, majícího sekvenci aminokyselin vzorce Π, v němž Yaa značí Asp aZaa značí -OH, nebo jeho farmaceuticky přijatelných solí, vyznačující se tím, že se

a) hlavy pijavic rodu Hirudinaria manillensis extrahují acetonem,

b) aktivní frakce acetonového extraktu se chromatografiijí na měniči iontů,

c) takto získaný částečně vyčištěný materiál se podrobí thrombin-sepharosové chromatografii a

d) polypeptid se vyčistí vysokovýkonnou reverzní chromatografii v kapalné fázi.

8. Farmaceutický prostředek s protitrombinovými účinky pro parenterální podávání, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje polypeptid podle nároku 1, nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

9. DNA sekvence kódující polypeptid podle nároku 1.

10. DNA sekvence podle nároku 9, kterou je syntetická DNA sekvence sestávající z

GTTTCTTACACCGACTGCACCGAATCTGGCCAGAACTACTGCCTGTGCGTTGGTT CTAACGTTTGCGGTGAAGGTAAAAACTGCCAGCTGTCTTCTTCTGGTAACCAGTG CGTTCACGGTGAAGGTACCCCGAAACCGAAATCTCAGACTGAAGGTGACTTCGAA GAAATTCCGGACGAAGACATCCTGAACTAG.

11. DNA sekvence podle nároku 9, kterou je cDNA sestávající z

GTG AGC TAC ACT GAT TGT ACG GAA TCA GGT CAG AAT TAT TGT CTA TGC GTG GGA AGT AAT GTC TGC GGT GGA GGC AAA AAT TGT CAA CTG AGC AGT TCT GGA AAT CAG TGC GTC CAT GGG GAA GGT ACT CCG AAG CCT AAG AGC CAG ACT GAA GGC GAT TTC GAA GAA ATC CCA GAT GAA GAT ATA TTG AAT TAA.

12. DNA sekvence podle kteréhokoliv z nároků 9 až 11, která dále kóduje vedoucí peptid, který je schopný řídit sekreci polypeptidu z buněk, v nichž dochází k expresi polypeptidu.

-21 CZ 283458 B6

13. DNA sekvence podle nároku 10 nebo 11, v níž uvedenou sekvenci předchází sekvence ATG TTC TCT CTC AAG TTG TTC GTT GTC TTC CTG GCT GTT TGC ATC TGC GTG TCT CAA GCA.