KR100218818B1 - 항-트롬빈 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 거머리 히루디나리아 마닐렌시스(Hirudinaria manillensis)로부터 분리된 항-트롬빈 폴리펩타이드 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 양쪽 말단 또는 어느 한쪽에서 아미노산 연장에 의해 변형될 수 있고 해독후 변형될 수 있다.
항-트롬빈 폴리펩타이드는 거머리 히루디나리아 마닐렌시스의 조직 또는 분비물로부터 이를 분리시켜 제조될 수 있으나 또한 DNA재조합 방법으로도 합성될 수 있다.
하기 양태에 따르면, 본 발명은 폴리펩타이드의 DNA 서열, 발현 벡터 및 재조합 제조를 위한 숙주 세포주를 제공한다.
본 발명의 항-트롬빈 폴리펩타이드는 정맥 혈전증, 혈관 문합 폐색증 및 트롬빈-유도 전염된 혈관내 응고의 치료에 유용하게 적용될 수 있음이 밝혀졌다.

Description

항-트롬빈 폴리펩타이드
제1도는 본 발명의 항트롬빈 폴리펩타이드의 고성능 액체 크로마토그래피 분석결과를 나타내는 크로마토그래피도이다.
제2도는 트립신-분해된 PE-P1(A) 및 PE-P2(B)의 용출 특성을 도시한 것이다.
제3도는 피크 2(P2)에 상응하는 단백질 대부분을 암호화하는 6개의 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다.
제4도는 플라스미드 M13-P2의 작제도이다.
제5도는 OMP-P2의 작제도이다.
제6도는 플라스미드 pFC-P2의 작제도이다.
제7도는 플라스미드 pOMPA-P2의 구조이다.
제8도는 곤충세포로부터 P2의 분리에 사용된 합성 올리고의 뉴클레오타이드 서열 및 이의 어셈블리를 도시한 것이다.
제9도는 VSV-P2의 작제도이다.
제10도는 pAc-P2의 작제도이다.
제11도는 P2쇄의 개시부를 암호화하는 합성 올리고의 뉴클레오타이드 서열 및 이의 어셈블리를 도시한 것이다.
제12도는 세포내 발현에 사용되는 pAcFT1의 작제도이다.
제13도는 플라스미드 pAcFT1-P2의 작제도이다.
제14도는 3' 말단의 증폭을 위한 RACE 프로토콜을 도시한 것이다.
제15도는 5' 말단의 증폭을 위한 RACE 프로토콜을 도시한 것이다.
본 발명은 항-트롬빈 폴리펩타이드 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 폴리펩타이드는 거머리 히루디나리아 마닐렌시스(Hirudinaria manillensis)로부터 분리되어 왔다. 이 폴리펩타이드는 항-트롬빈 특성을 갖는다.
가장 보편적인 항응고 펩타이드는 아마도 히루딘 계열에 속하는 펩타이드일 것이다. 본래 의약으로 쓰이는 거머리 히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)로부터 분리된 히우딘은 널리 공지되고 특성화되어 있는 트롬빈의 폴리펩타이드 억제제이다[참조:Markwardt, F. 1970, Methods in Enzymology, 19, p.924; Markwardt, F. 1985, Biomed. Biochim. Acta. 44, p. 1007]. 보다 구체적으로, 이것은 이온적 상호작용에 의해 트롬빈에 결함함으로써 피브리노겐이 절단되어 피브린으로 되는 것을 방지하여 결과적으로 피브린 응괴(fibrin clot)를 형성시키지 않는다. 동물 연구에서, 정맥 혈전증, 혈관 문합 폐색증 및 트롬빈-유도 전염된 혈관내 응고를 방지하는 히루딘의 효능이 입증되었다. 또한, 히루딘은 독성이 낮고, 항원성이 거의 없거나 전혀 없으며 순환시 정화시간(clearance time)이 매우 짧게 나타난다[참조:Markwardt, F. Hauptmann, J., Nowak, G., Klessen, C., and Walsmann, P. 1982. Thromb. Haemostasis 47, p. 226].
항응고 특성을 갖는 폴리펩타이드는 상이한 거머리종 히루디나리아 마닐렌시스로부터 분리된다(EP-A-0347376 및 WO 90/05143). 이 거머리종은 히루도 메디시날리스보다 진화된 형태이므로 아미노산 서열이 히루딘 및 기타 공지된 히루딘 변이체의 아미노산 서열과 상이할 수 있는 항응고 펩타이드를 합성할 수 있다.
본 발명자들은 히루디나리아 마닐렌시스 거머리로부터 수득한 제제를 분석하였다. 여기서 항-트롬빈 활성을 갖는 세 개의 신규한 폴리펩타이드를 발견했다. 따라서, 본 발명은 하기 아미노산 서열(i), (ii) 또는 (iii)을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩타이드 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
(i) P1
(ii) P2
(iii) P3
아미노산 잔기는 삼문자 코드에 따라 표현된다[참조:Eur. J. Biochem. 138, 9-37, 1984]. 잔기 Yaa는 Asp 또는 Tyr 잔기를 나타내고 Zaa는 -OH, -NH2또는 Gly-OH이다. 염은 산부가염일 수 있다. 이들은 하이드로할산(예:염산); 황산; 인산; 또는 피로인산과 같은 무기산과의 염일 수 있다. 염은 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 아세트산, 락트산, 팔미트산, 스테아르산, 말산, 타르타르산, 아스코르브산 또는 시트르산과 같은 유기산과의 염일 수도 있다. 폴리펩타이드는 또한 유리 카복실 그룹을 함유함으로 나트륨, 칼슘, 칼륨, 마그네슘 또는 암모늄염 또는 생리적으로 허용되는 유기 질소-함유 염기와의 염으로서 존재할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 내부염 형태일 수 있다.
따라서 본 발명의 폴리펩타이드는 필수적으로 아미노산 서열 (i) 내지 (iii) 으로 이루어진다. 히루디나리아 마닐렌시스 거머리로부터 분리한 천연 폴리펩타이드는, Yaa가 Asp이고 Zaa가 -OH인 아미노산 서열(i) 또는 (ii) 또는 부분 아미노산 서열(iii)을 갖는다. 본 발명의 폴리펩타이드는 항-트롬빈 제제로서 사용하기 위해 분리되어 정제될 수 있다.
모든 또는 일부 리더 서열이 선행되는 폴리펩타이드가 생산될 수 있다. 리더 서열은 폴리펩타이드가 수득되는 세포에 대해 천연 또는 외래 리더 서열일 수 있다. 리더 서열은 세포로부터 폴리펩타이드의 분비를 유도할 수 있다. 본 발명의 천연 폴리펩타이드 중 두 개는 후속적으로 절단되는 리더 서열과 함께 발현된다. 따라서 모든 또는 부분적인 이러한 리더 서열은 하기 서열로 존재할 수 있다:
Met Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val Cys Ile Cys Val Ser Gln Ala
본 발명에 따른 천연 폴리펩타이드 또는 이의 염은 히루디나리아 마닐렌시스 거머리종의 조직 또는 분비물로부터 상기 폴리펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 분리시켜 제조할 수 있다. 보다 특정하게, 본 발명의 폴리펩타이드는 문헌 WO 90/05143에 따른 제제를 수득하고 이를 고압 액체 크로마토그래피함으로써 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 이의 염은 또한 (a) 폴리펩타이드가 발현되는 조건하에서, 이를 암호화하는 DNA 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨 숙주를 제공하고, (b) 이와 같이 수득된 상기 폴리펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 분리함으로써 제조될 수 있다.
이러한 접근법은 통상적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 수득함을 기초로 하므로 재조합 유기체내에서 폴리펩타이드를 발현시킬 것이 요구된다. 유전공학적으로 변형된 유기체를 배양하여 완전한 생물학적 활성을 나타내는 목적 생성물을 생성시키게 된다. 따라서 본 발명은 추가로, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터; 본 발명에 따른 혼화성 발현 벡터로 형질전환시킨 숙주; 및 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 제공한다.
본 발명의 폴리펩타이드가 발현될 수 있는 숙주는 숙주를 본 발명의 혼화성 발현 벡터로 형질전환시킴으로써 제조된다. 발현 벡터는 (a) 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 화학적으로 합성하고, (b) 상기 DNA를 발현 벡터내로 삽입함으로써 제조할 수 있다.
대안적으로, 발현 벡터는 (a) 히루디나리아 마닐렌시스 거머리종의 mRNA로부터 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA를 제조하고 분리하여, (b) 분리된 cDNA를 발현 벡터 내로 삽입시킴으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 폴리펩타이드가 발현되는 조건 하에서 형질전환된 숙주를 제공함으로써 제공된다. 진핵세포 숙주가 사용되는 경우, 폴리펩타이드는 글라이코실화되어 수득될 수 있다. 폴리펩타이드는 그대로 또는 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 분리될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 염은 순수한 형태로 수득될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 각각의 말단 또는 한쪽 말단에 아미노산을 연장시켜 변형시킬 수 있다. 이러한 연장된 서열로 구성된 폴리펩타이드는 물론 여전히 항-트롬빈 활성을 나타낸다. 예를 들면, 30개 이하의 아미노산 잔기로 된 단서열이 한쪽 또는 각각의 말단에 제공될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는, 황산화, COOH-아미드화, 아실화 또는 폴리펩타이드쇄의 화학적 변형과 같은 하나 이상의 방법으로 해독후 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 카복시 말단에 글리신 잔기를 갖는 폴리펩타이드를 펩티딜-글리신 α-아미드화 모노옥시게나제(PAM 효소)로 효소적 아미드화시킬 수 있다.
재조합 DNA 기술로 항-트롬빈 폴리펩타이드를 제조하기 위하여, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 제조한다. DNA 암호화 서열은 통상적으로 인트론을 포함하지 않는다. DNA 서열을 분리하여 정제한다. 재조합 생성물을 생성시킬 수 있는 발현 벡터내에 유전자를 삽입한다. DNA 서열은 cDNA 서열일 수 있다. DNA 서열은 합성 DNA 서열일 수도 있다. 합성 유전자는 통상적으로, 전체가 목적 유전자에 상응하는 올리고뉴클레오타이드를 화학적으로 합성하여 제조될 수 있다. 이후 올리고뉴클레오타이드를 어셈블리하여 유전자를 수득한다.
따라서 유전자를 6개의 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드로부터 작제할 수 있는데, 각각의 올리고뉴클레오타이드는 이본쇄 DNA 유전자의 한쪽 쇄의 약 1/3을 나타낸다. 올리고뉴클레오타이드를 연결하고 어닐링시켜 목적 유전자를 수득한다. 경우에 따라, 유전자 서열을 부위-지시된 돌연변이유발로 변형시켜 하나 이상의 코돈 변화를 일으킨다. 통상적으로, 후속적 조작을 촉진시키기 위해 각각의 말단에 제한부위를 가진 유전자를 작제한다.
추가로 상기 리더 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 리더 펩타이드는 폴리펩타이드가 발현될 수 있는 세포로부터 폴리펩타이드의 분비를 유도할 수 있다. 리더 펩타이드를 암호화하는 서열은 통상적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 5' 말단에 연결된다.
이.콜라이와 같은 세균 숙주내에서의 발현이 요구되는 경우 리더 펩타이드는 OmpA 리더 펩타이드일 수 있다. 발현이 곤충 세포내에서 이루어지는 경우 리더 펩타이드는 수포성 구내염 바이러스 G 단백질(VSV G 단백질)의 리더 펩타이드일 수 있다. OmpA 및 VSV G 단백질 리더 서열을 암호화하는 적절한 DNA 서열은 하기와 같다:
OmpA 리더 :
VSV G 단백질 리더 :
절단되어 본 발명의 폴리펩타이드를 방출할 수 있는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이 제공될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 N-말단에 절단가능하게 연결되어 융합되는 캐리어 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 DNA 서열이 사용될 수 있다. 절단 가능한 연결은 브롬화시안에 의해 절단가능한 연결일 수 있다.
폴리펩타이드의 발현을 위해, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하며 적합한 숙주 내에 제공되는 경우 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 작제한다. DNA 서열에 대한 프로모터, 전사 종결 부위 및 해독 개시 및 종결 코돈을 포함하는 적절한 전사 및 해독 조절 요소가 제공된다. 벡터 혼화성 숙주내에서 폴리펩타이드의 발현이 가능케 되는 정확한 프레임내로 DNA 서열이 제공된다.
발현 벡터는 통상적으로 복제오리진 및, 필요한 경우 항생제 내성 유전자와 같은 선별가능한 마커 유전자를 포함한다. 프로모터는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 연결된다. 발현 벡터는 플라스미드일 수 있다. 이러한 경우, 바람직하게는 Ptrp및 Plcc/lac프로모터로부터 선택된 프로모터가 DNA 서열에 작동적으로 연결된다. 대안적으로, 발현 벡터는 바이러스일 수 있다. 바이러스는 폴리헤드린 프로모터가 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열에 작동적으로 연결되는 재조합 바큘로바이러스 일 수 있다.
폴리펩타이드를 발현할 수 있는 발현 벡터는 임의의 편리한 방식으로 제조될 수 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편을, 예를 들면 플라스미드 벡터와 같은 발현 벡터의 적절한 제한부위로 삽입할 수 있다. 재조합 바큘로바이러스 전이 벡터의 폴리헤드린 프로모터의 하부 제한부위에 클로닝시키고, (ii) (i)의 재조합 전이 벡터 및 완전한 야생형 바큘로바이러스 DNA로 바큘로바이러스 감염성 곤충 세포를 공-형질감염시킴으로써 제조될 수 있다.
상동적 재조합이 일어나, 폴리헤드린 프로모터 하부에 폴리펩타이드 유전자를 지닌 재조합 바큘로바이러스가 생성된다. 바큘로바이러스 전이 벡터는 폴리헤드린 ATG 개시 코돈의 하부에 단일 클로닝 부위를 갖는 벡터이다. 이후 수득된 재조합 바큘로바이러스에 의해 발현되는 생성물은 폴리헤드린 단백질의 N-말단 부위가 폴리펩타이드 N-말단부와 융합된 융합 단백질이다. 상기 지시한 바와 같이 융합 접합부에는 절단성 연결부가 제공될 수 있다.
단계(ii)에서 사용된 곤충 세포는 통상적으로 스포돕테라 프러지퍼다(Spodoptera frugiperda)세포이다. 야생형 바큘로바이러스는 일반적으로 오토그래파 캘리포니카(Autographa californica) 다면체핵 바이러스(AcNPV)이다.
폴리펩타이드 암호화 발현 벡터는 적절한 숙주내에 제공된다. 세포는 폴리펩타이드 유전자로 형질전환된다. 폴리펩타이드가 발현되는 조건하에 형질전환된 숙주를 제공한다. 예를 들면, 형질전환된 세포를 배양하여 발현이 일어나도록 한다. 어떠한 혼화성 숙주-벡터 시스템도 사용될 수 있다.
형질전환된 숙주는 원핵세포 또는 진핵세포 숙주일 수 있다. 세균 또는 효모 숙주, 예를 들면 이.콜라이 또는 에스. 세레비지에(S. cerevisiae)가 사용될 수 있다. 그램 양성 세균이 사용될 수 있다. 바람직한 세균 숙주는 이.콜라이 타입 B(E. coli type B) 균주이다. 바큘로바이러스 발현 시스템이 적절한 경우 곤충세포가 다른 방편으로 사용될 수 있다. 곤충 세포는 통상적으로 스포돕테라 프러지퍼다 세포이다. 또다른 대안으로서, 포유동물 세포주의 세포도 형질전환 시킬 수 있다. 예를 들면 비-사람 포유동물과 같은 유전자전이성(transgenic) 동물이 제공되어 여기서 폴리펩타이드가 생성될 수 있다.
발현된 폴리펩타이드는 분리 및 정제될 수 있다. 해독 개시 코돈에 관련되는 Met 잔기 뒤에 상기 아미노산 서열(i), (ii) 또는 (iii)중 어느 하나를 갖는 폴리펩타이드가 수득될 수 있다. 달리는, 상기한 바와 같이, 캐리어 서열과 융합된 본 발명의 폴리펩타이드 아미노산 서열, 즉, 상기 서열(i), (ii) 또는 (iii)을 포함하는 융합단백질이 수득될 수 있다. 융합 단백질내의 아미노산 서열(i), (ii) 또는 (iii)과 캐리어 서열 사이가 적합하게 연결되는 경우, 아미노산 서열(i), (ii) 또는 (iii)을 갖는 폴리펩타이드는 적합한 제제로 절단에 의해 유리될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 또한 (a) 상기 폴리펩타이드를 화학적으로 합성하여, (b) 이같이 수득된 상기 폴리펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 분리하여 제조될 수 있다.
따라서 폴리펩타이드는 목적 폴리펩타이드 서열순으로 아미노산 및/또는 둘 이상의 아미노산으로 된 예비형성된 펩타이드로부터 화학적 합성에 의해 작제될 수 있다. 고체-상 또는 용액 방법이 사용될 수 있다. 수득된 폴리펩타이드는 필요한 경우 약제학적으로 허용되는 염으로 전환될 수 있다.
고체-상 합성법에서, 목적 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 불용성 수지에 결합된 C-말단 아미노산으로부터 연속적으로 작제된다. 목적 폴리펩타이드가 제조되는 경우, 수지로부터 절단된다. 용액-상 합성법이 사용될 때, 목적 폴리펩타이드는 C-말단 아미노산으로부터 재성립된다. 이러한 아미노산의 카복시 그룹은 적합한 보호그룹에 의해 전과정을 통해 차단된 채 잔류하다가 합성 말기에 제거된다.
고체-상 또는 용액-상 중 어떠한 기술에서도 통상적으로 반응시스템에 부가되는 각각의 아미노산은 아미노 그룹이 보호되어 있고 카복시 그룹은 활성화된다. 작용성 측쇄 그룹도 보호된다. 합성의 각 단계 이후, 아미노-보호 그룹이 제거된다. 측쇄 작용성 그룹은 합성 말기에 일반적으로 제거된다.
폴리펩타이드는 약제학적으로 허용되는 염으로 전환될 수 있다. 이는 유기산 또는 무기산을 사용하여 산부가염으로 전환될 수 있다. 적합한 산은 아세트산, 석신산 및 염산을 포함한다. 대안적으로, 펩타이드는 나트륨염 또는 칼륨염 같은 알칼리 금속염 또는 암모늄염과 같은 카복실산 염으로 전환될 수 있다.
폴리펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 이의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물 중에 사용될 수 있다. 이와 같은 제형은 통상적으로 정맥내 투여용이다(이때 담체는 일반적으로 허용되는 순도의 멸균 염수 또는 물이다). 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 항-트롬빈으로, 특히 사람 환자에서의 혈액 응고와 같은 혈전 색전 질환의 치료에 있어 적합하다. 따라서 폴리펩타이드는, 수술후 혈전증의 예방을 포함하여 혈전증 및 혈전색전증의 치료 및 예방, 급성 쇼크의 치료(예:패혈성 또는 다중외상 쇼크), 및 혈액투석, 혈액분리 및 체외 혈액순환에 있어 소비성 응혈이상증의 치료에 사용될 수 있다. 발명의 한 양태에 있어서, 폴리펩타이드 또는 이의 염이 조직 플라스미노겐 활성화제와 같은 플라스미노겐 활성화제와 함께 공동투여될 수 있다.
복용량은 특히 투여의 특정형태 및 치료 또는 예방의 목적에 따라 좌우된다. 개인 용량의 크기 및 투여 섭생은 특정 질환의 경우 개인의 판단에 의해 가장 잘 결정될 수 있는데 이러한 목적에 부합되는 관련된 혈액인자를 결정하는 방법은 당해 분야의 전문가에게 보편적인 것이다. 보통, 주사의 경우 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 약 0.005 내지 약 0.1/(체중)이다. 약 0.01 내지 0.05/(체중)의 범위가 바람직하다. 투여는 정맥내, 근육내 또는 피하내 주사에 의해 이루어진다. 이에 따라, 단일 용량형의 비경구 투여용 약제학적 조성물은 투여방식에 따라, 용량당 본 발명의 호합물 약 0.4 내지 약 7.5을 함유한다. 활성 성분 이외에 이들 약제학적 조성물은 보통, pH 약 3.5 내지 7을 유지하기 위한 인산염 완충액과 같은 완충액 및 또한 등장성을 조절하기 위한 염화나트륨, 만니톨 또는 솔비톨을 함유하기도 한다. 이들은 동결 건조 또는 용해형일 수 있고, 용액인 경우 예를 들면 0.2 내지 0.34-하이드록시벤조산 메틸 에스테를 또는 에틸 에스테르와 같은 항세균성 활성 보존제를 함유하는 것이 유리할 수 있다.
국소 투여용 조성물은 수용액, 로션 또는 겔, 오일성 용액 또는 현택액 또는 지방-함유 또는, 특히 유화된 연고 형태일 수 있다. 수용액 형태의 조성물은, 예를 들면, pH 4 내지 6.5의 완충 수용액중에 본 발명의 활성 성분 또는 이의 치료학적으로 허용되는 염을 용해시키고, 필요한 경우, 추가의 활성 성분, 예를 들면 소염제 및/또는 중합성 결합제(예:폴리비닐피롤리돈) 및/또는 방부제를 가해 수득한다. 활성 성분 농도는 용액 10또는 겔 10g 중에 약 0.1 내지 약 1.5, 바람직하게는 0.25 내지 1.0이다.
국소적 적용에 있어서 오일 형태 투여물은 오일 중에, 임의로 팽윤제(예:알루미늄 스테아레이트), 및/또는 HLB 치("친수성-친유성 평형", hydrophilic- lipophilic balance)가 10 이하인 계면활성제(텐시드:tenside), 예를 들면 다가 알콜의 지방산 모노에스테르(예:글리세린 모노스테아레이트, 솔비탄 모노라우레이트, 솔비탄 모노스테아레이트, 또는 솔비탄 모노올레이트)와 함께, 본 발명의 활성 성분 또는 이의 치료학적으로 허용되는 염을 현탁시켜 수득한다. 지방-함유 연고는 예를 들면, 분산성 지방 기재중에, HLB치가 10 이하인 텐시드를 부가하여, 본 발명의 활성성분 또는 이의 염을 현탁시켜 수득한다. 유화된 연고는, HLB치가 10 이하인 텐시드를 부가한 연질, 분산성 지방 기재에 본 발명의 활성 성분 또는 이의 염의 수용액을 저작시켜 수득한다. 모든 국소 투여 형태는 또한 방부제를 함유할 수 있다. 활성 성분 농도는 약 10g의 기재중 약 0.1 내지 1.5, 바람직하게는 0.25 내지 1.0이다.
상기 조성물 및 사람 또는 포유동물의 체내에 직접적인 의료용의 이의 약제학적 조성물 동족체 이외에, 본 발명은 또한 사람 또는 포유동물의 체외에서 의료용으로 사용하기 위한 약제학적 조성물 및 제제에 관한 것이다. 이와 같은 조성물 및 제제는 특히 체외 순환 또는 처리(예:인공신장에서의 체외 순환 또는 투석)되거나, 보존 또는 변형되는(예:혈액분리) 혈액에 대한 항응고 부가제로서 사용된다. 스톡 용액과 같은 이들 제제 또는 대안적 단일 용량형 제제는 상기한 바와 같은 주사제에 대한 조성과 유사하다; 그러나, 활성 성분의 양 또는 농도는 유리하게는 처리되는 혈액의 용량, 보다 자세히는 이의 트롬빈 함량에 의존한다. 따라서, 본 발명의 활성성분(유리형)은 트롬빈 중량의 약 5배로 완전히 불활성화되고 비교적 다량으로도 생리적으로 무해하고 고농도로도 순환 혈액으로부터 급속히 제거됨으로써, 예를 들면 수혈 동안에 조차 과다용량의 위험은 없음을 명심해야 한다. 특정 목적에 따라, 적합한 용량은 비록 상한치는 유해함없이 초과될 수 있으나 혈액 ℓ당 활성 성분 약 0.01 내지 1.0이다.
하기 실시예는 본 발명을 설명한다.
첨부된 도면에서, 제1도는 실시예 1의 HPLC 분석 결과를 나타내는 크로마토그래피이다. P1 내지 P3은 실시예 1에 따라 제조되어 수득한 세 개의 상이한 피크를 나타내며, FT는 병류(flow through)이고 4-AB는 4-아미노벤즈아미딘을 의미한다.
제2도는 트립신-분해된 PE-P1(A) 및 PE-P2(B)에 대하여 실시예 2B에서 수득한 용출 프로파일을 나타낸다.
제3도는 피크 2(P2)에 상응하는 단백질 대부분을 암호화하는 6개의 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 나타내는데, 여기서 폴리펩타이드 쇄의 61번 아미노산 잔기는 Asp이고 최종 아미노산은 Asn64이다. 굵은 글씨로 나타낸 서열은 추가 작제에 사용되는 BalI 부위를 나타낸다. 도면의 하부는 6개 올리고를 어셈블리하는 방식을 도시한다. HindIII 및 PstI 부위가 포함되어 연속적 조작을 허용한다.
제4도는 중간 플라스미드 M13-P2의 작제도로서, 이는 추가의 모든 P2 작제물에 대한 BalI-BamHI DNA 단편의 공급원이다.
제5도는 OmpA 리더 펩타이드에 결합된 완전한 P2 유전자를 함유하는 신규한 재조합체 M13(OMP-P2로 명칭됨)의 작제도이다. 리더 펩타이드 서열이 굵은 글씨로 도시되어 있고 BalI 평활 말단 및 HindIII 스티키 말단(sticky end)은 밑줄그어져 있다.
제6도는 이.콜라이 내에서 P2 단백질 제조를 위해 사용되는 플라스미드인 pFC-P2의 작제도이다.
제7도는 이.콜라이 내에서 P2 제조에 사용되는 플라스미드 pOMPA-P2의 일반적인 구조도이다. 본 발명자들은 P2 유전자가 하이브리드 프로모터 Plpp/lac전사 조절하에 있는 이와 같은 신규한 플라스미드를 제조하기 위해 통상적인 유전자 조작 기술을 사용하였다. 이러한 경우에서 조차, OmpA 리더 펩타이드는 이.콜라이의 외질로 P2의 분비를 촉진시킨다.
제8도는 곤충 세포로부터 P2의 분리에 사용된 합성 올리고의 뉴클레오타이드 서열 및 이의 어셈블리를 도시한다. 굵은 글씨의 서열은 VSV G 단백질 리더 펩타이드이다.
제9도는 신규한 재조합체 M13(VSV-P2로 명칭됨)의 작제도로서, 여기서 완전한 P2 유전자는 VSV G 단백질 리더 펩타이드에 연결된다.
제10도는 바큘로바이러스 게놈으로의 전이 벡터로서 사용되는 pAc-P2의 작제도이다. pAcYM1는 바이러스에 전이되는 이형 서열의 수용체로서 널리 사용되는 출발 플라스미드이다.
제11도는 P2쇄의 초기부위를 암호화하는 합성 올리고의 뉴클레오타이드 서열 및 어셈블리를 나타낸다. 추가의 메티오닌 잔기를 암호화하는 ATG 코돈이 굵은 글씨로 나타나 있다.
제12도는 세포내 발현에 사용되는 pAcFT1의 작제도이다.
제13도는 폴리헤드린의 처음 18개 아미노산에 연결된 완전한 P2서열을 갖는, pAcFT1-P2로 명명된 신규한 전이 플라스미드의 개략도이다. 이 플라스미드는 바큘로바이러스 게놈에 이형성 서열을 전이시키는데 사용된다.
제14도는 3' 말단의 증폭을 위한 RACE 프로토콜의 개략도이다. "***TTTT…"는 dT17 어뎁터 프라이머를 나타낸다. 각 단계에서 도면은 단순화되어 이전 단계동안 형성된 생성물이 어떻게 사용되는지를 설명하고 있다.
제15도는 5' 말단의 증폭을 위한 RACE 프로토콜을 나타낸다. "***TTTT…" 및 "***"는 각각 dT17 어뎁터 프라이머 및 어뎁터 프라이머를 나타낸다. 각각의 단계에서 도면은 단순화되어 이전 단계동안 형성된 신규한 생성물이 어떻게 사용되는지를 설명하고 있다.
[실시예 1]
하기 a) 및 b)에 설명하는 절차에 따라, WO 90/05143에 따른 히루디나리아 마닐렌시스로부터 항트롬빈 제제를 제조한다:
a) 아세톤 추출
에탄올 건조된 거머리 두부(2920g)를 소형 조각으로 미세하게 절단하여 40:60 아세톤/물(7.5ℓ)혼합물로 처리한다. 실온에서 교반하면서 균질화시킨 후, 혼합물을 15분간 2,700rpm에서 회전시키고 상층액을 붓는다; 펠렛을 다시 40:60 아세톤:물 혼합물내에 재현탁시키고, 30분간 교반하며 혼합물을 15분간 2,700rpm에서 원심분리한다. 상층액을 처음 상층액과 함께 모아 빙초산(8.5ℓ)으로 pH 4.5로 산성화시킨다. 혼합물을 15분간 2,700rpm으로 회전시킨 후, 상층액을 붓고, 30암모니아를 가해 용액의 pH를 6.0으로 조절한다. 35에서 회전 증발시킨 후, 농축된 용액의 pH를 1.8로 저하시킨다; 침전된 오염물은 원심분리하여 제거하고 조 항-트롬빈 물질은 9배 과량의 아세톤을 사용하여 혼합물로부터 침전시킨다. 이후 혼합물을 회전시키고, 아세톤 중에 펠렛을 재현탁시킨 후 재원심분리한다. 그후 침전된 물질을 동결 건조시킨다.
b) 이온교환정제
조 항-트롬빈 물질을 물에 녹이고, pH 4.0의 10mM 아세트산 암모늄 완충액에 대해 투석시킨 후 동일 완충액내에서 예비-평형된 카복시메틸 세파로스 컬럼(CM Sepharose, Pharmacia, 2.6x30)상에 로딩시킨다. 출발 완충액 100로 세척한 후, 항-트롬빈 활성 분획을 pH 4.5의 20mM 아세트산 암모늄으로 용출시키고 수집하여 모은다(1.3ℓ). 추가의 정제 단계에 있어서, 모은 분획을 미니탄 장치(Minitan apparatus, Millipore)내에서 0.5ℓ로 농축시킨다; 농축된 용액을 NaOH로 중화시킨 후 20mM 트리스-HCl(pH 7.0)중에 평형된 Q 세파로스 컬럼에 적용시킨다. 결합된 물질을 출발 완충액내에서 0 내지 세파로스 컬럼에 적용시킨다. 결합된 물질을 출발 완충액내에서 0 내지 1M NaCl 선형구배로 용출시킨다. 항-트롬빈 활성을 갖는 분획을 모으고, 농축시키며, 4/분의 유동률로 20mM 트리스-HCl(pH 7.5)로 용출시킨 슈퍼덱스(Superdex) S-200 컬럼상에서 탈염시킨다. 겔여과로부터의 활성 풀(pool)을 미니탄 장치로 농축시키고 약 음이온 교환 크로마토그래피로 추가로 정제한다(DEAE FPLC). 활성 물질을 Protein Pak DEAE-5PW 컬럼(Waters)상에 로딩시키고 1.0/분의 유동속도로 20mM 트리스-HCl(pH 6.5) 중 0내지 1M NaCl 구배로 용출시킨다. 활성 분획을 모으고, 단백질 함량 및 활성(특이 활성 : 800 ATU/)을 확인하며, Speedvac 농축기 (Savant)내에서 동결건조시킨다.
이같이 수득된 부분 정제된 물질(특이활성 800ATU/)을 이후 추가의 두 크로마토그래피 단계로 진행시켜 하기 c) 및 d)에서 서술하는 바와 같이 동형 포러리펩타이드를 수득하게 된다.
c) 트롬빈-세파로스
ansgjs[참조:Lundblad,R.L., 1971, Biochemistry, 10:2501-2506]에 의해 기술된 방법에 따라 시판되는 소의 트롬빈(Sigma)을 추가로 정제한 후 제조업자의 지시대로 활성화된 세파로스 CL 6B(Pharmacia)에 부착한다. 컬럼(1.7)을 50mM 트리스-HCl(pH 8.3)으로 평형화시키고 DEAE-FPLC로부터의 동결 건조된 물질(완충액 중에 녹인 것)을 로딩시킨다. 컬럼을, 출발 완충액, 이후 3.0M NaCl을 함유하는 동일한 완충액 및 다시 출발 완충액으로 3회 세척한다(각각의 세척물은 컬럼 용적의 3배이다). 유동속도는 0.3/분이다. 결합된 물질을 25mM HCl 중 0.1M 4-아미노벤즈아미딘 10로 용출시킨다. 활성분획을 모으고, 50mM 트리스-HCl(pH 8.3) 중에서 PD-10 컬럼(Pharmacia) 으로 완충액 교환시킨다.
출발 완충액 중에서 세척에 의해 컬럼으로부터 용출된, 여전히 항-트롬빈 활성을 갖는 비결합 물질을, 모든 활성이 결합되어 크로마토그래피 될 때까지 컬럼상에 재로딩시킨다.
d) RP-HPLC
친화성 크로마토그래피 이후 수득된 물질을, 제1 용출제로서 20mM 인산나트륨(pH 7.5) 및 개질된 수중 50아세토니트릴을 사용하여 C4Vydac 컬럼(4.6x250mm, 5μ)상에서 역상 고성능 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 최종적으로 정제한다. 유동속도 1.0/분으로 실온에서 45분간 5내지 55의 용출제 B의 선형구배로 항-트롬빈 폴리펩타이드를 용출시킨다. 수득된 크로마토그래피도가 제1도에 도시되어 있다.
단백질의 피크(220nm에서 검출)를 수동적으로 수집하고, 진공 농축시켜 동일 조건하에 재-크로마토그래피를 실시한다.
C4 HPLC 이후 순수한 항-트롬빈 폴리펩타이드를 시험관내 검정(ATU/NIH 시험 및 "트롬빈 시간"시험)으로 단백질 함량, 아미노산 조성, N-말단 서열, C-말단부 및 이의 활성을 특성화한다. 각각 세 개의 단백질 피크가 항-트롬빈 활성이 있는 것으로 밝혀졌다.
제1도의 폴리펩타이드 표지된 P1 및 P2의 완전한 아미노산 서열을 트립신 및 V8 프로테아제 분해로부터 수득한 펩타이드를 N-말단 서열화시켜 측정한다. 서열은 상기 (i) 및 (ii)에서 기록된다. 기타 폴리펩타이드(P3)의 부분 아미노산 서열이 상기 (iii)으로 기록된다.
[실시예 2]
피리딜에틸화(PE) P1 및 P2의 트립신 분해 및 펩타이드 지도화
a) 환원/알킬화
트롬빈-세파로스(실시예 1c) 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 활성 분획을 모아 PD-10 컬럼상으로 10mM 트리스-HCl(pH 8.3) 중에서 완충액 교환시킨다. 활성 풀(약 50μg)을 Speed-Vac 원심분리기(Savant)중에서 농축시키고, 암실에서 질소하에 2시간 동안 실온에서 6M 구아니딘-HCl/50mM 트리스-HCl(pH 8.5) 중의 1β-머캅토에탄올 100μℓ로 처리한다. 그런 다음(순수한) 4-비닐-피리딘 4μℓ을 가하고 혼합물을 상기한 바와 같이 2시간 동안 재인큐베이션시킨다[참조:Dupont D., Keim P., Chui A., Bello R. and Wilson K., Derivatizer-Analyser User Bulletin No. 1, Applied Biosystems Inc., 1987].
유동속도 1.0/분으로 0.1TFA 중 5 내지 65아세토니트릴의 선형구배에서 90분간 용출되는 C4Vydac(4.6x250mm, 5μm) 컬럼상에서 RP-HPLC에 의해 반응 혼합물로부터 피리딜에틸화 폴리펩타이드를 먼저 회수한다. 이러한 조건하에서 항-트롬빈 폴리펩타이드 혼합물은 잘 용해되지 않으므로, 실시예 1d에 이미 서술한 조건하에 인산나트륨/아세토니트릴의 용출 시스템을 사용하여 동일한 컬럼상에서 재크로마토그래피되어야 한다.
b) PE-P1 및 PE-P2의 트립신 분해 및 펩타이드 지도화
정제된 PE-P1 및 PE-P2(각각 10 및 20μg)를 0.2M 인산나트륨 존재하에 1중탄산 암모늄 (pH 8.0) 200μℓ내에서 TPCK-처리된 트립신(Sigma)으로 분해한다. 트립신을 효소 대 기질 1:20(w/w)의 비로 가하고 37에서 4시간 동안 배양을 수행한다. Savant 내에서 동결-건조시킴으로써 분해를 중단시킨다.
트립신 분해로 수득한 펩타이드를, 유동속도 1.0/분으로 0.1TFA 중에서 5 내지 65아세토니트릴 선형 구배에서 60분간 용출시킨 C4-Vydac (4.6x250mm, 5μm) 컬럼 또는 μBondapak C18 컬럼(3.9x300mm, 10μ Waters)상에서 분리시킨다(제2도). 용출된 피크를 수동적으로 수집하고, Savant 내에서 농축시킨 후 펄스 액상 모드 477A 서열기(Applied Biosystems)상에서 아미노산 분석 및 N-말단 서열 분석을 실시한다.
트립신-분해된 PE-P1(A) 및 PE-P2(B)의 C4-HPLC 펩타이드 지도화의 결과는 하기에 나타낸다.
따라서 P1 및 P2의 완전한 아미노산 서열은 하기와 같다.
[실시예 3]
[P2 유전자의 화학적 합성]
에스케리키아 콜라이 선호 코돈[참조:Grosjeans H. and Fiers W. 1982. Gene, 18, p. 199]을 기초로 뉴클레오타이드 암호화 서열을 고안한다. 더욱이, 합성 유전자의 5' 말단에 매우 근접하게 BalI 제한부위를 조작시켜 상이한 발현 벡터내에서 이러한 서열이 삽입되도록 한다. 사실상, 동일한 합성 유전자가 세균 및 곤충 세포내에서 재조합 P2 단백질의 발현에 사용된다. 곤충 세포 방법에 있어 분비되거나 세포질 생성물로서 단백질 P2가 수득되는 방법을 개발한다.
모든 플라스미드 DNA 조작은 문헌[참조:Maniatis T., Fritsch E.F. and Sambrook J. 1982. Cold Spring Harbor, NY]이 서술한 바대로 실행된다.
자동 DNA 합성기(Applied Biosystems)를 사용하여 6개의 합성 상보성 올리고뉴클레오타이드가 제조되고 이의 서열이 제3도에 도시된다. 효소적 인산화 이후 6개 올리고를 DNA 리가제를 사용하여 어셈블리시키고 수득된 이본쇄 서열을 M13 파지 벡터 mp 18 내에 삽입하여, 제4도에 도시된 재조합 플라스미드 M13-P2를 수득한다. P2 유전자를 M13 벡터내로 삽입가능케 하기 위해, 합성 올리고에 HindIII 및 PstI 부위를 또한 가한다. 정확한 뉴클레오타이드 서열은 일본쇄파지 DNA 상에서 수행된 생거 방법으로 증명한다[참조:Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R. 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, p. 5463].
재조합 플라스미드 M13-P2가 실시예중 사용된 모든 발현 벡터에 있어 P2 유전자의 공급원으로서 사용된다.
[실시예 4]
[이.콜라이 세포로부터 P2의 발현 및 분비]
재조합 생성물을 세포외질로 분비시키기 위하여, 프리-단백질의 형태로 P2 분자를 합성해야 한다. 보다 특정하게, 효과적인 분비와 관련된 "리더 펩타이드"란 명칭의 아미노산 서열이 P2의 NH2말단에 존재해야 한다[참조:Blobel G. and Dobberstain B. 1975. J. Cell Biology, 67, p. 83; Pages J.M. 1983, Biochimie, 65, p. 531]. 이후, 이러한 여분의 서열은, 분비하는 동안 생체 내에서 특이 이.콜라이 리더 펩티다제로 절단되어 정확한 성숙한 서열을 수득한다[참조:Wolfe P. B. 1983. J. Biol. Chem. 258, p. 12073].
많은 예의 분비 시스템이 문헌[참조:Talmadge K., Stahl S. and Gilbert W. 1980. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p 3369; Oka T., Sakamoto S., Miyoshi K., Fuwa T., Yoda K., Yamasaki M., Tamura G. and Miyake K. 1985. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, p. 7212]에 기술되어 있다. 이중, 본 발명자들은 이미 공개된 문헌[참조:Henning V., Royer H.D., Teather R.M., Hindennach I. and Hollenberg C.P. 1979. Proc. Natl. Acad. Sci. Usa, 76, p. 4360]의 이.콜라이의 외막 단백질(OmpA)의 분비 시그날을 기초로 한 시스템을 선정했다. 따라서 본 발명자들은 mRNA의 효율적 해독과 관련된 것으로 공지된 OmpA 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 뒤의 OmpA 리더 펩타이드를 암호화하는 두 개의 추가적 상보성 올리고뉴클레오타이드를 고안했다[참조:Isacchi A., Sarmientos P., Lorenzetti r. and Soria M. 1989, Gene 81, p. 129].
제5도에 도시한 이의 서열은 처음 10개 아미노산을 암호화하는 P2 유전자 개시부를 또한 포함한다. BalI 부위의 존재는 이러한 합성 단편이 P2 암호화 서열의 잔여부로 연결되도록 하며 상부 HindIII 부위의 존재는 M13 벡테내로의 연결을 가능하게 한다. 따라서, 합성 HindIII-BalI 단편을 M13-P2로부터의 BalI-BamHI에 연결하여 M13mp18에 삽입시켜 신규한 플라스미드 OMP-P2를 수득한다. 이 신규한 플라스미드 작제과정이 제5도에 도시되어 있다.
OMP-P2로부터 P2 유전자는 OmpA 샤인-달가르노 및 리더 펩타이드 이후 P2 암호화 서열을 암호화하는 HindIII-BamHI 단편으로서 절제될 수 있다. 이 제한 단편은 이제 적절한 발현 벡터내에 삽입될 준비가 되어 있다. 이론상, 여러개의 발현 시스템이 사용되어 세균 내에서 이형단백질을 높은 수준으로 생성시킬 수 있다. 과거에는 실험실에서 프로모터 Ptrp를 기초로 한 시스템이 성공적으로 사용되었다[참조:Isacchi A., Sarmientos P., Lorenzetti R. and Soria M. 1989, Gene 81, p. 129]. 다시, 선택된 프로모터의 경우에서 조차, 주어진 폴리펩타이드의 발현 수준은 예상될 수 없다.
제6도에 도시된 플라시미드 pFC33은 이미 문헌[참조: Isacchi A., Sarmientos P., Lorenzetti R. and Soria M. 1989, Gene 81, p. 129] 중 기술되어 있다. 이는 항생제 앰피실린 내성이고 프로아폴리포프로테인 A1의 발현을 촉진하는 세균성 프로모터 Ptrp를 갖는다. HindIII 및 BamHI으로 pFC33을 분해한 후, 항생제 내성 유전자 및 프로코터를 갖는 대형 HindIII-BamHi 단편을 분리하여 P2 유전자를 암호화하는 OMP-P2로부터의 HindIII-BamHI 단편에 연결시킨다. 상세한 작제과정은 제6도에 도시되어 있다. 본 발명자들은 신규한 플라스미드 pFC-P2를 분리하였으며, 이는 이.콜라이내에서 P2를 생성시키는 최종 플라시미드이다.
본 발명의 목적은, 본 발명의 P2 및 기타 항-트롬빈 폴리펩타이드를 세포외질로 발현 및 분리하기 위해 타입 B의 이.콜라이 균주종을 사용하는 것이다. 사실상, 세균 이.콜라이의 타입 B 균주에 플라스미드 pFC-P2를 삽입시키면 P2가 높은 수준으로 생성됨이 밝혀졌다. 흥미있는 사실은 상이한 균주 타입의 이.콜라이는 효과적으로 작용하지 않으므로, 브프루딘(bufrudin)의 성공적 생성을 위해서는 숙주 균주 타입이 중요한 것 같다.
이.콜라이의 타입 B 균주중 몇몇은 입수용이하여 P2 생성을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 균주는 ATCC 12407, ATCC 11303, NCTC 10537이다. 하기는 플라스미드 pFc-P2로 균주 NCTC 10537을 형질전환시켜 이를 후속적으로 배양한 실시예이다.
균주 NCTC 10537의 컴피턴트 세포를 문헌[참조:Mandel M. and Higa A.J. 1970. J. Mol. Biology, 53, p. 154]의 염화칼슘 방법을 사용하여 제조한다. 1x109세포/의 이들 세포의 제제 약 200를 플라시미드 DNA 2(dir 5/농도)로 형질전환한다. 형질전환체를 100/앰피실린 함유 L-아가 평판상에서 선별한다. 두 개의 소형 콜로니를 목재 이쑤시개를 사용하여 동일한 항생제를 함유하는 L-아가상에 스트리킹한다(약 1길이로 각각 3회 스트리킹). 37로 12시간 인큐베이션한 후, 스트리킹 분획을 LB 배지(150/농도의 앰피실린 함유) 10상에 접종시켜 밤새 37에서 인큐베이션하여 P2 단백질 생성을 시험한다. 다음날 배양물을, 동일한 농도의 앰피실린 함유 M9 배지에 1:100으로 희석하여 37에서 6시간 동안 인큐베이션한다.
이러한 배양물 20를 12000xg로 4에서 10분간 원심분리한다. 세균 펠렛을 33mM HCl 트리스(pH 8) 2중에 재현탁시킨다. 이후 33mM EDTA, 40슈크로스의 동일 용적의 제2용액을 가하고 전체 혼합물을 온화한 진탕 조건하에서 37로 10분간 인큐베이션한다. 원심분리후, 투과된 세포를 냉수 2에 재현탁시키고 얼음에 10분간 방치시킨다. 생성되는 상층액을 원심분리로 분리하면 세균 세포의 세포외질 분획을 나타낸다.
합성 기질 S-2238을 절단하는 트롬빈 활성의 억제를 기초로 한 발색 검정[참조:Krstenansky, J.K., and Mao, S.J.R. 1987. FEBS. Lett. 211, p. 10]을 실행하여, 본 발명자들은 P2 생성 세포의 세포외질 분획내에 있으나 세포외질 분획의 조절하에 있지 않은 항-트롬빈 활성이 존재함을 측정했다.
유사한 접근방식을 통해, 프로모터 Ptrp대신 프로모터 Plpp/lac 1[참조:Ghrayeb J., Kimura H., Takahara M., Hsiung H., Masui Y. and Inouye M. 1984. EMBO Journal 3, p. 2437]이 존재하는 P2에 대한 신규한 발현/분비 플라스미드를 또한 작제했다. 이 상이한 플라스미드 pOMP-P2가 제7도에 도시되어 있다. 타입 B의 이.콜라이 균주내에 이러한 플라스미드를 삽입한 후, 고주준의 활성 P2가 또한 수득된다. pOMP-P2 작제를 위한 출발 플라스미드로서, 문헌[참조:Ghrayeb J., Kimura H., Takahara M., Hsiung H., Masui Y. and Inouye M. 1984. EMBO Journal 3, p. 2437]이 기술한 플라스미드 pIN-III-ompA3을 사용한다. 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 사용한 발현의 유도 및 배양 조건이 이미 기술되어 있다[참조:Ghrayeb J., Kimura H., Takahara M., Hsiung H., Masui Y. and Inouye M. 1984. EMBO Journal 3, p. 2437].
[실시예 5]
[곤충 세포로부터 단백질 P2의 발현 및 분리]
재조합 곤충 세포로부터 단백질 P2를 분비시키기 위하여 P2 암호화 서열을 곤충세포에 의해 효과적으로 인지되는 리더 펩타이드와 연결한다. 수포성 구내염 바이러스(VSV) G 단백질의 리더 펩타이드[참조:Bailey, M.J., McLeod, D.A., Kang, C., and Bishop. D.H.L. 1989. Virology 169, p. 323]를 사용한다. 상기 기술한 바와 유사하게, VSV G 단백질 리더 펩타이드 뒤에 P2 유전자 개시부를 암호화하는 합성 DNA 서열을 제조하고 이의 뉴클레오타이드 서열을 제8도에 도시한다. 또한 이 경우 P2 유전자 잔여부 및 발현 벡터에 연결시키기 위한 편리한 제한부위(HindIII-BamHI 및 BalI)가 제공된다.
합성 HindIII-BalI 단편을, P2 유전자를 함유하는 M13-P2로부터의 정제된 BalI-BamHI과 연결하여 미리 HindIII 및 BamHI으로 절단한 M13mp18 내로 삽입한다. 신규한 플라스미드 VSV -P2를 수득하는 이 작제과정이 제9도에 도시되어 있다. VSV-P2로부터 VSV 리더 펩타이드에 융합된 P2 유전자를 갖는 BamHI-BamHI DNA 단편을 절제하여 벡터 pAcYM1[참조:Matsuura, Y., Possee, R.D., Orerton, H.A. and Bishop. D.H.L. 1987. J. Gen. Virol. 68, P. 1233]으로 삽입시킨다(제10도). 수득된 플라스미드는 pAc-P2이다.
곤충 세포내에서 발현시키기 위하여, VSV-P2 암호화 서열은 폴리헤드린 프로모터의 전사 조절하에 바큘로바이러스 게놈으로 전이되어야 한다. 이를 위하여, 야생형 바큘로 바이러스 DNA와 전이벡터 pAc-P2로 곤충 세포를 공-형질감영시킨다. 곤충세포로서, 스포돕테라 프러지퍼다 세포를 숙주 세포로서 사용한다. 실험 세부사항은 하기와 같다:
에스. 프러지퍼다 세포를 문헌[참조:Summers, M.D., and Smith, G.E. 1987, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555]의 방법을 변형시켜 개개의 재조합 전이 벡터를 나타내는 플라스미드 DNA 및 감염성 AcNPV DNA의 혼합물로 형질 감염시킨다. 바이러스 DNA 1을 플라스미드 DNA 25 내지 100과 함께 혼합하고, 20mM HEPES 완충액(pH 7.5), 1mM 오르토이인산수소나트륨, 5mM 염화칼륨, 140mM 염화나트륨 및 10mM 글루코스의 존재하에(총 용적 1) 0.125m 염화칼슘(최종 농도)으로 침전시킨다.
35mm 조직배양 디쉬내의 106에스. 프러지퍼다 세포의 단층으로 DNA 현탁액을 접종하여, 세포에 1시간 동안 실온에서 흡착시킨 후, 배지 1로 대체한다. 28에서 3일간 배양한 후 상층액을 수거하여 에스.프러지퍼다 세포 단층에서 플라크를 생성시키는데 사용한다. 재조합 바이러스를 함유하는 플라크는 광학 현미경으로 검경시 다면형의 부재로 확인된다. 이러한 플라크로부터 바이러스를 회수하고 추가적 플라크 정제후 이를 사용하여 폴리헤드린-음성 바이러스 스톡을 제조한다.
상기 방법은 그의 게놈이 폴리헤드린 프로모터 및 VSV G 단백질 리더 펩타이드 조절하의 P2 유전자를 갖는 재조합 바큘로바이러스를 분리시킨다. 이 바이러스를 사용하여 널리 보편화된 방법[참조:Summers, M.D., and Smith, G.E. 1987, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555]에 따라 10회 다중감염시켜 에스.프러지퍼다 세포를 감염시킨다. 이후 감염된 세포를, 공개된 방법[참조:Summers, M.D., and Smith, G.E. 1987, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555]에 따라 10의 태송아지 혈청의 존재하에 회전배양물 또는 단층 배양물내에서 배양한다. 두 경우 모두, S-2238 발색 검정은 감염된 세포의 배양 상층액에서 항-트롬빈 활성을 나타낸다.
[실시예 6]
[곤충세포 세포질에서의 단백질 P2의 발현]
단백질 P2는 또한 에스.프러지퍼다 세포의 세포질 내에서 생성되어 축적될 수 있다. 이러한 방법은 분비되지 않는 바이러스 단백질인 폴리헤드린의 발현 시그날을 사용하므로 일반적으로 이형 단백질의 수율을 우수하게 한다.
다량의 재조합 단백질 P2를 수득하기 위한 이와 같은 방법은 폴리헤드린의 처음 18개 아미노산이 P2의 64개 아미노산 프레임중 연결된 융합 폴리펩타이드의 발현을 기초로 한다. 폴리헤드린의 NH2말단 서열의 존재는 고수준의 발현을 허용한다[참조:Luckow, V.A. and Summers, M.D. 1988, Virology, 167, p. 56]. 또한, 폴리헤드린 부분과 P2 서열 사이에 CNBr로 하이브리드 단백질을 처리하여 P2 잔기를 유리시키는 메티오닌 잔기을 위치시킨다.
상기 방법과 유가하게, M13-P2로부터 BalI-BamHI 단편을 적절한 전이 벡터로 연결시킬 수 있는 합성 DNA 단편을 제조한다. 제11도에 도시된 신규한 합성 단편은 후속 조작을 위한 BamHI 및 BalI 부위를 또한 포함한다.
폴리헤드린의 처음 18개 아미노산을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 상이한 전이 벡터 pAcFT1을 수득한다(제12도). 간단히, pAcYM1[참조:Matsuura, Y., Possee, R.D., Overton, H.A. and Bishop. D.H.L. 1987. J. Gen. Virol. 68, p. 1233]의 EcoRV-BamHI 단편을 뉴클레오타이드-92 내지 뉴클레오타이드+55의 폴리헤드린 유전자 서열을 함유하는 합성 올리고뉴클레오타이드로 대체한다. 이 서열 다음에 BamHI 부위가 존재하여 제13도에 도시된 반응도식에 따라 완전한 P2 암호화 서열의 삽입에 사용된다. 이와 같은 작제를 통해 신규한 플라스미드 pAcFT1-P2를 수득하여 하이브리드 유전자를 바큘로바이러스 게놈에 전이하는데 사용한다.
재조합 바큘로바이러스는 실시예 5에 기술한 바와 같이 수득한다. 에스. 프러지퍼다 세포의 감염은 표준방법[참조:Summers, M.D., and Smith, G.E. 1987, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555]에 따라 수행한다. 감염된 곤충 세포를 배양하여 융합 단백질을 세포질내 축적시킨다. 이 하이브리드 단백질은 재조합 단백질 P2의 공급원이다. 문헌[참조:Grosss E. 1967. Methods in Enzymology, 11, p. 238; Olson H., Ling P., Pohl G., Henrichson C., Mutt V., Jornvall H., Josephson S., Uhlen M. and Lake M. 1987, Peptides, 9, p. 301]의 몇몇 방법이 유용하며 CNBr로 하이브리드를 절단하는데 사용될 수 있다. 상기 문헌 중 올슨(Olson) 등의 방법을 적용시켜 P2의 정확한 폴리펩타이드 서열을 수득하게 한다. 이 분자는 항트롬빈 활성을 나타낸다.
[실시예 7]
P2 단백질의 Tyr61변이체를 수득하기 위하여, 실시예 3 및 제3도에 기술 및 도시된 올리고뉴클레오타이드 5 및 6을 하기의 것으로 치환시킨다:
올리고 5- Tyr
올리고 6-Tyr
올리고 5-Tyr에서 밑줄친 삼중자 TAC는 티로신 잔기를 암호화하며 본래 존재하는 아스파르트산을 암호화하는 GAC 삼중자를 치환한다. 올리고 6-Tyr은 두 쇄간에 완전한 상보성을 수득하기에 상응하도록 수정된다. 곤충세포 또는 이.콜라이내에 변이체의 발현 및/또는 분비를 일어나게 하는 하기 단계는 상기 실시예 4 내지 6에 기술된 바와 동일하다.
[실시예 8]
P2 단백질의 글리신-연장된 유도체를 수득하기 위하여, 실시예 3 및 제3도에 기술 및 도시된 올리고뉴클레오타이드 5 및 6을 하기의 것으로 치환시킨다:
올리고 5-Gly
올리고 6-Gly
올리고 5-Gly에서 글리신을 암호화하는 밑줄친 삼중자 GGT는 종결코돈전에 삽입된다. 올리고 6-Gly는 두 쇄간에 완전한 상보성을 수득하기에 상응하도록 수정된다. 곤충세포 또는 이.콜라이내에 Gly-연장된 변이체의 발현 및/또는 분비를 일어나게 하는 하기 단계는 상기 실시예 4 내지 6에 기술된 바와 동일하다.
[실시예 9]
[P1 및 P2의 cDNA 클로닝]
(a) 문헌[참조:Cathala, G., Savouret, J.-F., Mendez, B., West, B.L., Karin, M., Martial, J.A. and Baxter, J.D.(1983) DNA, 2, 4: 10 329-335]에 따라 히루디나리아 마닐렌시스 두부로부터 총 RNA를 제조한다.
(b) 하기와 같이 역전사 반응을 수행한다:
거머리 두부로부터의 총 RNA 10, dT17 어뎁터 프라이머 1, 5mM dNTPs 혼합물 8, AMV 완충액 5X 8, 및 H2O 40를 얼음상에서 모우고 혼합하고 혼합물을 65에서 2분간 가열후 얼음상에서 급냉시킨다. 10 단위의 RNAsin(Promega) 및 20 단위의 AMV 역전사효소(Boehringer Mannheim)을 가한 후 42에서 2시간 항온처리한다. 이후 반응 혼합물을 페톨-클로로포름 추출 후 이소프로판을 침전시킨다.
(c) 이후 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 실행한다. 각각의 PCR 반응에 대한 일반적인 반응도식은 하기와 같다:
PCR 혼합물:
가 되게한다.
2.5 단위 Taq 폴리머라제(Cetus/Perkin-Elmer)의 부가 이전에 반응 혼합물을 95에서 5분간 변성시킨 후 광유 80로 오버레이(overlay)시킨다. 반응물을 Cetus/Perkin-Elmer DNA 열순환기내에서 순환시킨다.
순환 프로파일은 하기와 같다:
잔류 Taq 폴리머라제를 페놀 클로로포름 및 에탄올 침전으로 불활성화시키고; 샘플은 -20에서 저장한다. P1 및 P2 cDNA의 완전한 서열을 수득하기 위하여, 3회 PCR 증폭을 수행한다. 사용된 각각의 프라이머 서열이 하기에 도시된다. 올리고뉴클레오타이드 서열내로 변성이 도입된 위치는 프라이머 서열 아래 나타낸 또다른 뉴클레오타이드로 지정된다(N은 모든 4개의 뉴클레오타이드가 사용됨을 의미한다). 증폭 생성물의 클로닝을 촉진시키기 위해 가해진 제한부위는 밑줄그었다.
dT17 어뎁터 프라이머:
어뎁터 프라이머:
프라이머 3-8
프라이머 52-56
프라이머 32-37
프라이머 5'I
프라이머 5'II
[1회 증폭]
P2 아미노산 서열의 잔기 3 내지 8 및 잔기 56 내지 52에 이르는 완전히 변성된 프라이머 500pmole을 PCR 반응에 있어 맞은편 프라이머로서 사용한다.
cDNA 3' 말단의 증폭(RACE 프로토콜)[참조:Frohman, M.A., Dush, M.K. and Martin, G.R. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002]
잔기 32내지 37에 이르는 유전자 특이 프라이머를 1회 증폭에서 측정된 P2의 뉴클레오타이드 서열을 기초로 하여 디자인한다. 이는 dT 어뎁터 프라이머와 함께 사용되어 cDNA를 증폭시킨다(제14도).
cDNA 5' 말단의 증폭(RACE 프로토콜)[참조:Frohman, M.A., Dush, M.K. and Martin, G.R. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002]
거머리 두부로부터의 총 RNA 10을 유전자 특이 프라이머(5'I) 1을 dT17 어뎁터 프라이머로 치환시키는 점을 제외하고 상기한 바와 같이 역전사시킨다(제15도). 이후 반응 혼합물을 이소프로판을 침전시키고 제1쇄 cDNA 생성물을 하기와 같이 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT)를 사용하여 이의 5' 말단에서 폴리아데닐화시킨다:
샘플을 37에서 10분간 배양하고 65에서 16분간 가열한다. 이후 반응 혼합물을 증류수 500로 희석시킨다.
폴리아데닐화 생성물 10를 dT17 어뎁터 프라이머 10pmole, 어뎁터 프라이머 25 pmole 및 전사에 사용된 처음 것과 특이적인 상부의 제2 유전자-특이 프라이머 25pmole을 사용하여 증폭시킨다(5'II, 제15도).
d) PCR 생성물의 분석
각각의 프라이머에 존재하는 제한부위에서 증폭 생성물을 절단한다. 분해된 생성물을 겔 정제하고, 동일 제한효소로 미리 분해된 pUC13 벡터로 서브클로닝한다. 대상 삽입물을 함유하는 플라스미드를 제한분석으로 동정한다. 제조업자의 지시대로 플라스미드 DNA를 시쿼나제(Sequenase, USB)로 서열화한다. 이 같이 수득된 P1 및 P2의 cDNA 서열 및 추론된 아미노산 서열은 하기와 같다. 리더 서열은 밑줄 그었다.

Claims (33)

  1. 하기 아미노산 서열 (i), (ii) 또는 (iii)을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩타이드 및 이의 약제학적으로 허용되는 염.
    (i) P1
    (ii) P2
    (iii) P3
    상기식에서, Yaa는 Asp 또는 Tyr이고, Zaa는 -OH, -NH2또는 Gly-OH이다.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 서열 앞에 Met 잔기가 선행되는 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 아미노산 서열앞에 리더 서열 전체 또는 일부가 선행되는 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 하기 서열의 리더 서열 전체 또는 일부가 존재하는 폴리펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 아미노산 서열이 캐리어 서열에 융합된 상태로 존재하는 융합 단백질인 폴리펩타이드.
  6. (a) 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에서 정의한 폴리펩타이드가 발현되는 조건하에, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주를 제공하고, (b) 이로써 수득된 상기 폴리펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 분리함을 특징으로 하여, 상기 폴리펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 숙주가 세균, 효모, 포유동물 세포주, 곤충 세포주 또는 동물인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 숙주가 이.콜라이 타입 B (E. coli type B) 균주 또는 스포돕테라 프러지퍼다(Spodoptera furgiperda) 세포주인 방법.
  9. (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 정의한 폴리펩타이드를 화학적으로 합성하고, (b) 이로써 수득된 폴리펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 분리시킴을 특징으로 하여, 상기 폴리펩타이드 또는 의의 약제학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 단계(a)가 고체-상 합성에 의해 수행되는 방법.
  11. 거머리 히루디나리아 마닐렌시스(Hirudinaria manillensis)종의 조직 또는 분비물로부터, 제1항에서 정의된, Yaa가 Asp이고 Zaa가 -OH인 아미노산 서열(i), (ii) 또는 (iii)을 갖는 폴립펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 분리시킴을 특징으로 하여, 상기 폴리펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법.
  12. 활성 성분으로서, 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에서 정의한 폴리펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함함을 특징으로 하는, 항-트롬빈 활성을 갖는 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 정의한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 플라스미드인 벡터.
  15. 제13항에 있어서, 바이러스인 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 바이러스가, 폴리헤드린 프로모터가 DNA 서열에 작동적으로 연결되어 있는 재조합 바큘로바이러스(baculovirus)인 벡터.
  17. 제13항 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 서열이, 폴리펩타이드가 발현되는 세포로부터 폴리펩타이드를 분비시킬 수 있는 리더 펩타이드를 추가로 암호화하는 벡터.
  18. 제13항 내지 16항중 어느 한 항에 있어서, DNA 서열이, 절단되어 폴리펩타이드를 유리시킬 수 있는 융합 단백질을 암호화하는 벡터.
  19. 제13항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 혼화성 발현 벡터로 형질전환된 숙주.
  20. 제19항에 있어서, 세균, 효모, 포유동물 세포주, 곤충 세포주 또는 동물인 숙주.
  21. 제20항에 있어서, 균주 이.콜라이 타입 B 또는 스포돕테라 프러지퍼다 세포주인 숙주.
  22. 제1항 내지 5항중 어느 한 항에서 정의한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열.
  23. 제22항에 있어서, 합성 DNA 서열인 DNA 서열.
  24. 제22항에 있어서, cDNA인 DNA 서열.
  25. 제22항 내지 24항중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 발현되는 세포로부터 폴리펩타이드를 분비시킬 수 있는 리더 펩타이드를 추가로 암호화하는 DNA 서열.
  26. 제22항 내지 24항중 어느 한 항에 있어서, 절단되어 폴리펩타이드를 유리시킬 수 있는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열.
  27. 제13항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 혼화성 발현 벡터로 숙주를 형질전환시킴을 특징으로 하여, 제1항 내지 5항중 어느 한 항에서 정의한 폴리펩타이드가 발현될 수 있는 숙주를 제조하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 발현 벡터가, (a) 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 화학적으로 합성하고, (b) 상기 DNA 서열을 발현 벡터내로 삽입시킴으로써 제조되는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 발현 벡터가, (a) 거머리 히루디나리아 마닐레시스 종으로부터의 mRNA로부터의 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA를 생성 및 분리시키고, (b) 분리된 cDNA를 발현 벡터 내로 삽입시킴으로써 제조되는 방법.
  30. 제22항에 있어서, 하기 서열로 필수적으로 이루어진 DNA 서열.
  31. 제22항에 있어서, 하기 서열로 필수적으로 이루어진 DNA 서열.
  32. 제22항에 있어서, 하기 서열로 필수적으로 이루어진 DNA 서열.
  33. 제31항 또는 32항에 있어서, 하기 서열이 바로 직전에 선행되는 DNA 서열.
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