CN112480210B - 一种抗凝血活性肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗凝血活性肽及其用途，涉及生物技术领域。该抗凝血活性肽含有如下肽：Phe‑Val‑Asp‑Asp‑Ile‑His‑Ala，Tyr‑Arg‑His‑Ser‑Ile，Cys‑Met‑Asn‑Cys‑Gln，Phe‑Lys‑His‑Met‑Asn‑Glu。本发明制得的抗凝血活性肽具有高抗凝血活性和溶血栓功效；稳定性好，不受人体消化液的影响。

Description

一种抗凝血活性肽及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗凝血活性肽及其用途。
背景技术
心血管疾病(Cardiovascular Disease，CVD)，又称循环系统疾病，居全球死亡率首位，预计到2030年将会有超过2360万人死于心血管疾病。血栓类疾病是典型的心血管疾病，具有高发病率、高死亡率、高致残率及并发症多的特点，它可累及全身各个器官及系统，每年大约有3‰人发生不同形式的血栓性疾病，我国每年死于心脑血管疾病的人数达到300万人以上，它导致的死亡人数占全球每年总死亡人数的51％。存活的患者中75％致残，其中40％以上重残，严重威胁人类健康。
抗凝治疗是预防和治疗血栓的主要手段。目前国内外该类型心血管疾病还没有理想的治疗药物，当前国内外临床上防治血栓性心脑血管疾病的药物只要有肝素和水蛭素。前者疗效低，副作用大，例如引起血小板减少、出血及骨质疏松等；后者虽然疗效高，副作用小，但药价高且只能注射给药，较麻烦，经济压力大。因此急需一种高效，副作用小的，成本低的血栓性心脑血管疾病药物适应上述需求。目前，一些肽类化合物已被报道具有显著的抗凝血活性。同时，食源性生物活性肽凭借其吸收性好、副作用小等优点日益受到研究者的重视。食源性抗凝血肽主要来源于乳类蛋白、蛋清蛋白及水产蛋白等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗凝血活性肽，该抗凝血活性肽具有高抗凝血和溶血栓活性，稳定性好，不受人体消化液的影响。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种抗凝血活性肽，其氨基酸序列为：Phe-Val-Asp-Asp-Ile-His-Ala和/或Tyr-Arg-His-Ser-Ile和/或Cys-Met-Asn-Cys-Gln和/或Phe-Lys-His-Met-Asn-Glu。本发明获得的多肽，提取于鱼糜类食源性蛋白中，提高了食源性蛋白的利用率，具有较高的抗凝血活性，能够用来弥补肝素类药物的缺陷；同时制得的活性肽可以直接透过胃消化液进入小肠，更好的保护多肽的活性，发挥高抗凝血功效；并且能够有效的溶解血栓，当浓度达到1mg/mL及以上时，有明显地溶血栓效果。本发明制得的抗凝血活性肽采用鱼糜为原料，对其深加工及其在功能性食品、保健食品或药品中的开发利用具有重要的指导性意义；且原料来源广泛，价格低廉，可进行地、中、高规模化工业化生产，满足各种规格工厂的加工需要。
优选地，抗凝血活性肽来源于鱼糜。
优选地，抗凝血活性肽具有抗凝血和溶血栓功效。
优选地，抗凝血活性肽的抗凝血活性＞120ATU/mL。
本发明的又一目的在于提供一种抗凝血活性肽在制备血栓性心脑血管疾病药物中的用途。
本发明的又一目的在于提供一种抗凝血活性肽在制备抗凝血产品中的用途。
本发明还公开了抗凝血活性肽在制备抗凝血和/或溶血栓功效的功能性食品中的用途。
优选地，上述功能性食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。
一种抗凝血活性肽酶解物的制备方法，
脱脂，向鱼糜中加入正己烷和无水乙醇混合液进行脱脂；
酶解，采用混合酶或复合酶酶解脱脂后的鱼糜得到酶解液；
优选地，将上述酶解液经1.0kDa超滤膜超滤、离子交换和凝胶过滤层析后得到抗凝血活性肽。
优选地，酶解反应温度为35～60℃，酶解时间为2～5h；酶解的料液比为1：8～12，反应pH为7～8。
优选地，酶解反应所需酶的种类为胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰糜蛋白酶中的一种或多种。
优选地，胰蛋白酶的用量为6000～10000u/mL；所述糜蛋白酶的用量为6000～10000u/mL；所述胰糜蛋白酶的用量为6000～10000u/mL。
优选地，膜分离过程中超滤得到组分分子量＜1.0kDa。
优选地，酶解过程先加入胰糜蛋白酶，再加入糜蛋白酶，最后加入胰蛋白酶。
优选地，离子交换层析为：经过超滤将小于1.0kDa组分配置成40～60mg/mL的溶液，离心，上清液过0.45μm微滤膜，滤液上样至DEAE-52层析柱；然后依次按照Tris-HCl缓冲液、Tris-HCl(含0.1M NaCl)缓冲液、Tris-HCl(含0.25M NaCl)缓冲液、Tris-HCl(含0.5MNaCl)缓冲液、Tris-HCl(含1M NaCl)缓冲液逐级洗脱，洗脱流速为3～5mL/min，并在253nm紫外波长下收集出峰组分，测抗凝血活性。
优选地，凝胶过滤层析为：将DEAE-52层析柱所得抗凝血活性最高的组分以0.3～0.5mL/min流速进行脱盐及分离，洗脱液为去离子水，并在253nm紫外波长下收集各出峰组分，测抗凝血活性，抗凝血活性最好组分即为抗凝血活性肽。
本发明凝胶过滤层析后进行反相高效液相色谱(HPLC)纯化，将上步经SepHadexG-25凝胶过滤层析后的抗凝血活性最好组分利用HPLC进行纯化，收集得到4个组分，经测序得到4条多肽：Phe-Val-Asp-Asp-Ile-His-Ala(PVAAIHA)，Tyr-Arg-His-Ser-Ile(TAHSI)，Cys-Met-Asn-Cys-Gln(CMACG)，Phe-Lys-His-Met-Asn-Glu(PLHMAG)。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明获得了一种抗凝血多肤，来源于鱼糜类食源性蛋白中，提高了食源性蛋白的利用率，具有较高的抗凝血活性，能够用来弥补肝素类药物的缺陷；同时制得的活性肤可以直接透过胃消化液进入小肠，发挥高抗凝血功效，并且具有较好的溶血栓功效。本发明制得的抗凝血活性肤采用鱼糜为原料，来源广泛，价格低廉，可进行地、中、高规模化工业化生产；且对其在功能性食品、保健食品或药品中的开发利用具有重要的指导性意义。
因此，本发明提供了一种抗凝血活性肤，该抗凝血活性肤具有高抗凝血和溶血栓活性，稳定性好，不受人体消化液的影响。
附图说明
图1为本发明实施例1中离子交换层析结果示意图；
图2为本发明实施例1中离子柱纯化组分抗凝血活性测试结果图；
图3为本发明实施例1中组分M1经凝胶过滤层析结果；
图4为本发明实施例1中组分M2经凝胶过滤层析结果；
图5为本发明实施例1中SepHadex G-25纯化后各组分抗凝血测试结果；
图6为本发明实施例1中组分M21的C18反相高效液相的谱图；
图7为本发明实施例1中四条肤的抗凝血测试结果
图8为本发明试验例1中溶血栓功效测试结果对比示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1：
1.1材料与试剂
表1实验试剂
试剂 生产厂家
鱼糜(鲷鱼、腊鱼) 广东永昊食品有限公司
胰蛋白酶 美国GIBCO公司
糜蛋白酶 上海麦克林生化科技有限公司
胰糜蛋白酶 北京谨明生物科技有限公司
Tris 南京建成生物工程
DPPH 美国Sigma公司
氯化钠(分析纯) 国药集团
盐酸(分析纯) 国药集团
DEAE-52 上海麦克林生化科技有限公司
SepHadex G-25凝胶 上海源聚生物工程有限公司
1.2测试方法
用凝血酶滴定改进法测定酶解物的抗凝血酶活力
(1)配置不同浓度的凝血酶溶液
配制含0.05mol/L NaCl的0.05mol/L Tris-HCl溶液，pH7.4，用来配制0.5％纤维蛋白原。配制不同浓度梯度的凝血酶溶液：20NIH/mL(作为基准浓度，即1倍)，该溶液5μL为一个滴定体积，即1V，为0.1ATU：
20NIH÷(1000μL÷5μL)＝20NIH÷200＝0.1NIH，因1NIH＝1ATU，故0.1ATU＝0.1NIH，20NIH/mL(作为基准浓度，即1倍)，40NIH/mL(即2倍)，100NIH/mL(即5倍)，等。
(2)酶解物抗凝血活性测定
取几支7.5mm×100mm的小试管，各加入0.5％纤维蛋白原200μL，再各加入酶解液50μL，放在37℃恒温水浴锅中5min。
①取其中一支滴加5倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明50μL水解提取液中含有的抗凝血活性少于0.5ATU。为了准确知道该水解提取液含有的抗凝血活性，再取一支滴加1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于0.1ATU；若1min内不凝固，说明其中抗凝血活性大于0.1ATU，再滴加1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于0.2ATU；若1min内不凝固，说明其中抗凝血活性大于0.2ATU，再滴加1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，直到凝固出现，从而知道该水解提取液的活性。
②取其中一支滴加5倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内不凝固，说明50μL水解提取液中含有的抗凝血活性多于0.5ATU。再往其中滴加20倍(400NIH/mL)凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于2ATU。此时，应再从水浴锅中取一支试管，滴加5倍凝血酶溶液10μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于1ATU。再取一支滴加5倍凝血酶溶液5μL及1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中抗凝血活性少于0.6ATU；若1min内不凝固，说明其中抗凝血活性多于0.6ATU，往其中滴加1倍凝血酶溶液5μL，迅速摇匀，若1min内凝固，说明其中酶解液活性少于0.7ATU。这样继续下去，直到检测出酶解液的活性为止。
③酶解物活性检测、含量及比活性计算
活性用抗凝血酶活性单位(ATU)表示，检测方法为凝血酶滴定改进法。含量按下式计算：
U＝20C
式中，C为每50μL待测(供试品或对照品)溶液含ATU的单位数，U为每1mL待测溶液含ATU数。
1.3抗凝血活性肽的制备方法
脱脂，向鱼糜加入体积比为1：1的正己烷和无水乙醇混合液脱脂，在50℃温度下萃取4h，重复2次，抽滤，将所得滤饼自然风干、粉碎，得到脱脂鱼糜；
酶解，取脱脂鱼糜按料液比1：10g/mL加入水混合均匀，90℃加热15min，用0.5MHCl调节溶液pH至8.0，然后加入胰糜蛋白酶-糜蛋白酶-胰蛋白酶(加入量为8000u/mL)，40℃、360rpm搅拌酶解2h，100℃加热灭酶10min，12000rpm离心10min后取上清液得到酶解液；测定抗凝血酶活力；
分离纯化，将上述酶解液经超滤膜包，将小于1.0kDa的组分过DEAE-52离子交换层析、SepHadex G-25凝胶过滤层析、反相高效液相色谱纯化后得到抗凝血活性肽。具体为：
①DEAE-52离子交换层析：经过超滤将小于1.0kDa组分配置成40mg/mL的样品液，并将溶液组分以10000r/min离心20min，后取其上清过0.45μm微滤膜，以充分除去不溶性杂质；取5mL左右样品并通过恒流泵恒流上样；最后依次按照Tris-HCl缓冲液、Tris-HCl(含0.1M NaCl)缓冲液、Tris-HCl(含0.25M NaCl)缓冲液、Tris-HCl(含0.5M NaCl)缓冲液、Tris-HCl(含0.75M NaCl)缓冲液、Tris-HCl(含1M NaCl)缓冲液逐级洗脱。每个浓度洗脱体积为500mL，洗脱流速为3.5mL/min，如图1所示，洗脱出2个峰，分别命名为M1、M2；并在253nm紫外波长下检测抗凝血活性，如图2所示(a～c间字母不同时存在显著性差异，p<0.05)，M1组分的螯合活性高于M2；将所得到的单峰组分进行旋蒸浓缩后，进行下一步实验；
②SepHadex G-25凝胶过滤层析：将过DEAE-52离子柱的2个组分，以0.4mL/min流速、10min/管进行脱盐及分离，洗脱液为去离子水，并收集各出峰组分，如图3、图4所示，从图中可以看出M1、M2经SepHadex G-25分别纯化得到M11、M12、M21、M22四个组份。其中，M1组分被SepHadex G-25凝胶过滤层析分离成2个峰，M2组分被分离成2个峰。将上述四个组分冻干后，将其分别配制成样品溶液，测定抗凝血活力，如图5所示(a，b，c，d，p＜0.05，字母间存在显著性差异)：M21组分的抗凝血活力最高。
③反相高效液相色谱(HPLC)纯化：将上步经SepHadex G-25凝胶过滤层析后的组分M21利用HPLC进行纯化(所述HPLC条件为：进样量15μL；色谱柱为Eclipse XDB-C18(9.4mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水；梯度洗脱：30min内乙腈浓度由0匀速升至40％；洗脱速度2mL/min；紫外检测波长253nm)，收集得到4个组分(如图6)，经测序得到4条多肽：Phe-Val-Asp-Asp-Ile-His-Ala(PVAAIHA)，Tyr-Arg-His-Ser-Ile(TAHSI)，Cys-Met-Asn-Cys-Gln(CMACG)，Phe-Lys-His-Met-Asn-Glu(PLHMAG)；测定每条多肽的抗凝血活性，结果如图7所示。从图中可以看出，制得的活性肽的抗凝血活性＞120ATU/mL
实施例2：
酶解过程与实施例1相同得到相应酶解液，其中实施例2～9采用的是混合酶解方式，酶解条件见表1所示：
表1实施例2～9的实验条件
实施例编号 酶的种类 酶解时间/h 温度/℃ pH 酶用量/(u/mL)
实施例2 胰-糜蛋白酶 4 52 7.0 8000
实施例3 胰-胰糜蛋白酶 3 48 8.0 8000
实施例4 糜-胰糜蛋白酶 3 45 7.5 8000
实施例5 糜-胰蛋白酶 4 52 7.0 8000
实施例6 胰糜-胰蛋白酶 3 48 8.0 8000
实施例7 胰糜-糜蛋白酶 3 45 7.5 8000
实施例8 胰-胰糜-糜蛋白酶 2 40 8.0 8000
实施例9 糜-胰-胰糜蛋白酶 2 40 8.0 8000
实施例10～12中采用复合酶解的方式，酶解反应条件如表2所示，以实施例10为例，首先，将胰糜蛋白酶按照8000u/mL的用量在40℃，pH为8.0，酶解2h后，灭酶；然后加入糜蛋白酶按照8000u/mL的用量在50℃，pH为7.0，酶解4h后，灭酶；最后再加入胰蛋白酶按照8000u/mL的用量在40℃，pH为7.5，酶解2h，从而完成整个酶解过程。
表2实施例10～12的实验条件
Figure BDA0002797181040000061
抗凝血活性测定方法与实施例1相同，结果如表3所示：
实施例1～12中的抗凝血活性测定
Figure BDA0002797181040000062
Figure BDA0002797181040000071
从表3中可以得出，实施例1～12制得的抗凝血活性肽酶解物均具有较高的抗凝血活性，其中实施例1制得的活性肽酶解物的抗凝血活性最高。
试验例1：
体外溶血栓活性试验
材料：琼脂糖，购于上海伯奥生物有限公司；CaCl2溶液，购于上海太阳生物试剂公司；血浆，购于广州健阳生物试剂公司；纳豆激酶，购于翔博生物试剂公司。
实验步骤：
将0.1g琼脂糖倒入30mL蒸馏水中，加热煮沸，冷却至50℃，加入0.05mol/L(pH7.4)的磷酸盐缓冲溶液5mL，再加1.5mL血浆，最后加入0.025mol/L CaCl2溶液1.5mL，快速搅拌均匀，启动反应，同时趁温倒入(d＝9cm)培养皿，均匀铺板，厚度约1cm。铺板均匀后，水平放置30min，待板内凝胶冷却凝固后用内径0.45cm的打孔器打孔，取1mg/mL浓度各样品液和空白对照液50μL注入，最后放于37℃的恒温培养箱中。40h后观察溶解圈大小，记录下圈直径，并计算其面积，用溶解圈面积来表示溶栓活性。溶解圈面积计算公式如下：
溶解圈面积(mm2)＝[(d长径+d短径)/4]2×π-0.159(其中0.159为打孔面积)
对实施例1制得的4条活性肽进行上述测试，具体结果如图8所示。可以看出，当各活性肽的浓度为1mg/mL时，有明显溶解圈出现，表明分离纯化后得到的抗凝血活性肽具有显著地溶血栓功效。且本发明制得的活性肽可直接口服，口服后人体消化液对其活性影响较小。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 广东海洋大学
<120> 一种抗凝血活性肽及其用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 鲷鱼和腊鱼(Apogon aureus & Pseudobagrus fulvidraco)
<400> 1
Phe Val Asp Asp Ile His Ala
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 鲷鱼和腊鱼(Apogon aureus & Pseudobagrus fulvidraco)
<400> 2
Tyr Arg His Ser Ile
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 鲷鱼和腊鱼(Apogon aureus & Pseudobagrus fulvidraco)
<400> 3
Cys Met Asn Cys Gln
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 鲷鱼和腊鱼(Apogon aureus & Pseudobagrus fulvidraco)
<400> 4
Phe Lys His Met Asn Glu
1 5

Claims (9)

1.一种抗凝血活性肽，其氨基酸序列为Phe-Val-Asp-Asp-Ile-His-Ala。
2.根据权利要求1所述的一种抗凝血活性肽，其特征在于：所述抗凝血活性肽来源于鱼糜。
3.根据权利要求1所述的一种抗凝血活性肽，其特征在于：所述抗凝血活性肽具有抗凝血和溶血栓功效。
4.根据权利要求1所述的一种抗凝血活性肽，其特征在于：所述抗凝血活性肽的抗凝血活性＞120ATU/mL。
5.权利要求1所述的抗凝血活性肽在制备血栓性心脑血管疾病药物中的用途。
6.权利要求1所述的抗凝血活性肽在制备抗凝血产品中的用途。
7.权利要求1所述的抗凝血活性肽在制备抗凝血和/或溶血栓功效的功能性食品中的用途，所述功能性食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。
8.一种含有权利要求1所述抗凝血活性肽酶解物的制备方法，酶解反应温度为35～60℃，酶解时间为2～5h；酶解的料液比为1：8～12，反应pH为7～8；所述酶解反应所需酶的种类为胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰糜蛋白酶的混合物；所述酶解物为鱼糜。
9.根据权利要求8所述的一种抗凝血活性肽的制备方法，其特征在于：所述胰蛋白酶的用量为6000～10000u/mL；所述糜蛋白酶的用量为6000～10000u/mL；所述胰糜蛋白酶的用量为6000～10000u/mL。
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