CN104004807B - 一种具有抗凝血土元多肽及其酶解制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗凝血土元多肽及其酶解制备方法与应用，制备方法包括：土元干体清洗干燥，粉粹成粉末；加入水均匀搅拌，匀速搅拌0.5h~4h，离心，得到蛋白沉淀，干燥；将蛋白加水溶解，比例为4~25g：100mL，pH调至7.0~11，加入碱性蛋白酶，该酶与蛋白重量之比0.1~5mL：100g，温度30~70℃，搅拌；将酶解液通过大孔吸附树脂交换柱，分离纯化，收集干燥，得土元抗凝血肽粉。本发明为抗凝血类活性物质增加了新来源，实现了原料的充分利用，且产品活性高、制备过程方便可行、环保等优点，用途广泛，可作为预防血栓、溶血栓、降血稠类食品的原料，辅以乳糖、甘露醇等，制成粉剂、片剂、胶囊或口服液。
Description
技术领域
本发明涉及生物肽及其制备方法与应用，具体涉及一种具有抗凝血土元多肽及其酶解制备方法与应用。
背景技术
土元，又名地鳖(ground beetle)、土鳖虫，系鳖蠊科昆虫地鳖(Eupolyphagasinesis Walker)或冀地鳖(Steleophage plancyi(Boleny))的雌虫干燥体，是一种传统中药，临床应用很广泛，最早记载于秦汉著作《神农本草经》，具有散血瘀、接骨续筋、消肿止痛、下乳通经等功效。
土元传统的入药为原药材粉碎直接服用或加热水提、醇提后服用，其利用率低，且进入人体后带来的活性不高。目前，有人从土元中提取单一的蛋白制成制剂，但制成的口服制剂经过胃肠道，容易被胃酶、胰酶酶解掉，活性大大降低；而制成注射液，大分子蛋白类又容易引起免疫原性，存在安全隐患。市面上已有治疗带状疱疹的土元干粉，用以镇痛，还尚未出现具有显著抗凝血活性的土元功能性产品，因此开发出一种低成本、高活性的土元产品具有广阔的市场经济效益。
本发明采用可控酶解的方法，通过生物蛋白酶对土元躯体蛋白进行水解催化作用，把其中隐藏的抗凝血活性肽片段释放出来，从而制备具有抗凝血活性的多肽。目前，对于生物活性肽的开发在国内外已成为热点研究领域，多肽高活性、快吸收、安全健康的特点广受产品开发者的青睐，目前已从可食蛋白中水解分离得到的有高F值寡肽、抗氧化肽、ACE抑制肽等，且多肽的开发所需仪器设备、生产条件简单可行，所以，酶解土元蛋白制备抗凝血活性肽具有很高的可行性和广阔的市场经济效应。
经查阅已有专利，申请号为“200810118148.X”的专利，其权利要求为一种土鳖虫的仿生酶解产物及其用途，将土鳖虫，加水匀浆，调节pH至1.0～3.0，加入胃蛋白酶于35～45℃保温酶解0.5～4小时，再调节pH至7.5～8.5，加入胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保温酶解2～8小时，即可得到产物。此专利中的发明主要采用胃蛋白酶和胰酶仿生酶解，制得用于治疗心脑血管、肿瘤、跌打损伤等的混合多肽类物质，未进行进一步地分离纯化，且对抗凝血活性的测定只用了PT单一指标。本专利采用高效的Alcalase2.4L碱性蛋白酶，酶解得到高水解度的活性多肽，并用DA201-C大孔吸附树脂交换柱进行分离纯化，采用ATPP、PT、TT、FIB四项指标对多肽的抗凝血活性进行比较，活性检测更全面，所得多肽更纯，具有一定疏水性，分子量更小，与上述专利得到的多肽群不同，故并不影响本专利的申请。
申请号为“200610140160.1”和“200710046247.7”的专利，都是将土元干粉溶于水，加入模拟胃液进行酶解，酶解液过葡聚糖凝胶Sephadex G25层析柱，冷冻干燥，得多肽组分。此者主要采用模拟胃液将土元酶解，得到的酶解液经Sephadex G25柱分离后得到的产物体现出对带状疱疹的治疗功效，后者提出了一定的镇痛活性。本专利采用高效的Alcalase2.4L碱性蛋白酶，酶解得到高水解度的活性多肽，过DA201-C大孔吸附树脂柱，得到的多肽产物表现出抗凝血活性，与上述专利得到的多肽群不同，并不影响本专利的申请。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗凝血土元多肽及其酶解制备方法与应用。本发明方法能够实现原料的高效利用，具有高活性、高安全、简单可控、环境温和的制备特点。
本发明的目的由以下方案实现：
(1)取土元洗净干燥，粉碎成细粉；加水溶解，细粉与水的比例为10～20g：100mL，pH调至8.0～11.0，以100～400r/min的速度均匀搅拌0.5h～4h以加速溶解，取上清液调pH至2～6，制得土元蛋白，再将pH调至4～8，干燥；(2)将步骤(1)得到的蛋白加水溶解，比例为5～20g：100mL，控制pH值在7.5～10，再加入碱性蛋白酶为生物催化剂，反应温度为30～70℃，以100～300r/min匀速搅拌1～4h；煮沸5～30min，灭酶活，结束反应；5000～10000r/min离心，收集上清液，干燥，得到粗多肽粉末。
(3)装柱：根据层析柱体积称取适量DA201-C大孔吸附树脂进行预处理后，装柱，层析柱规格2.6×60cm，待稳定后，用3倍柱体积纯净水(条件与洗脱时的相同)冲柱。
(4)多肽粉加水溶解，倒入DA201-C大孔吸附树脂交换柱，分别以质量百分比浓度为0,25,50,75,100％乙醇溶液梯度洗脱，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集洗脱液，目的在于将粗多肽进一步纯化，去除偏亲水性的多肽组分、色素及其它杂质，富集洗脱下来的疏水性的多肽组分，浓缩干燥，得具有抗凝血土元多肽。
对土元多肽的抗凝血活性指标评价。采用凝血四项基本指标(APTT、PT、TT、FIB)对多肽的抗凝血性能进行评价。
优选地，步骤(1)中土元干燥为干燥至含水量小于3％。
优选地，步骤(2)所述碱性蛋白酶为Alcalase2.4L，酶的活力为2.4AU/mL。
优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述pH分别调至8.0～11.0，控制pH值在7.5～10具体为：用0.1～2.0mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液将pH调至所需pH值；所述取上清液调pH至2～6具体为：用0.1～2.0mol/L的盐酸(HCl)溶液将pH调至2～6。
优选地，步骤(2)中所述碱性蛋白酶与土元蛋白比为0.1～5mL：100g，优选0.1～3mL：100g。
优选地，步骤(2)中所述大孔吸附树脂为DA201-C，所述富集为富集大孔吸附树脂柱中75％乙醇洗脱下来组分，即第4洗脱组分。
一种具有抗凝血土元多肽，所述具有抗凝血的土元多肽的分子量范围为320—2500Da；所述具有抗凝血的土元多肽为疏水性多肽。
一种土元多肽应用于具有抗凝血与溶血栓功效的功能性食品，所述功能性食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。
本发明的原理：在碱性条件下，以水解酶为催化剂，使土元蛋白进行水解，将酶解液进行分离纯化，以抗凝血四指标为依据，得到土元活性多肽。
土元多肽产品以口服的形式进入体内，经人体消化酶：胃蛋白酶、胰蛋白酶的酶解消化，在小肠被吸收利用，发挥功效。对产品多肽进行体外消化模拟实验，模拟人体内酶的消化环境，先后将分离纯化后的活性多肽经过胃蛋白酶、胰蛋白酶的消化，消化后的多肽活性无明显降低。
本发明所制备的土元酶解多肽液，可直接喷雾干燥，制成抗凝血多肽粉，也可加入乳糖、甘露醇等，混合均匀，分装，冷冻干燥，制成冻干粉剂、片剂，也可制成口服液方便人体快速吸收，还可制成胶囊，直接透过胃消化液进入小肠，更好的保护多肽的活性，发挥高抗凝血功效。
与现有的技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
1.本发明提高了土元的生物利用率。在体外对比六种工业常用蛋白酶的酶解情况，选定简便可控的Alcalase2.4L碱性蛋白酶，将土元蛋白进行酶解利用。蛋白质中肽链打开，获得小分子活性多肽。此蛋白酶相比于传统的催化用酶，具有高效的酶解能力，在较短时间内即可完成对底物蛋白的高度水解，方便针对任一水解段地目标多肽进行分离筛选，可控性高。六种酶的酶解对比见图1。此法制备活性多肽突破了传统的提取方法，如：直接口服，水煮提药、醇提给药等，与传统的方法相比，多肽的结构简单易知，产物易分离，且能高效被人体吸收，安全可靠。
2.产品的活性高。本发明采用酶解法得到多肽，再通过分离纯化得到疏水性的活性肽类，采用抗凝血四项指标进行活性测定，见表1和图2。表1可以看出，阳性对照比伐卢定为公认的高抗凝血药物，当样品和对照品浓度在0.01mg/mL，样品的PT、FIB与阳性对照相当；0.2mg/mL的样品的四项活力指标已明显高于0.01mg/mL的比伐卢定。所得的高抗凝血活性土元多肽为功能食品领域提供了一种新型的功能性原料。
3.此土元多肽表现出一定的疏水性特征，与经典的抗凝血药物水蛭素相似，水蛭素的结构头部有三个半胱氨酸连成三个环状结构，也表现出疏水性。同时，具有一定疏水性的多肽较易穿过小肠壁细胞膜，便于人体快速吸收，发挥功效。
4.多肽为小分子肽类，进入人体被吸收后，可以直接穿过小肠壁进入血液发挥作用，活性几乎不变，稳定性高。
5.用途广泛，可作为预防血栓、溶血栓、降血稠类食品的原料，辅以乳糖、甘露醇等，制成粉剂、片剂、胶囊或口服液。目前没有土元多肽应用于功能性食品的报道。
附图说明
图1为采用不同酶对土元蛋白酶解所得酶解物最高活性比较情况图；
图2为酶解产物过大孔吸附树脂交换柱的分离峰情况图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例1
取500g干净土元干粉，干粉与水的比例为10g：100mL，pH调至9.0，以200r/min的速度均匀搅拌3h，取上清液，再将pH调至4，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白。将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为10g：100mL，控制pH值在10，再加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与土元蛋白重量之比为1mL：100g，反应温度为50℃，搅拌速度为200r/min，反应时间3h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂DA201-C交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同质量百分比浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：82.14s，PT：32.42s，TT：44.53s，FIB：1.21g/L的抗凝血土元肽粉。
实施例2
取500g干净土元干粉，干粉与水的比例为15g：100mL，pH调至9.5，以100r/min的速度均匀搅拌4h，取上清液，再将pH调至4.5，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白。将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为15g：100mL，控制pH值在9，再加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与土元蛋白重量之比为1.5mL：100g，反应温度为60℃，搅拌速度为150r/min，反应时间3.5h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂DA201-C交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：89.35s，PT：37.47s，TT：52.56s，FIB：0.95g/L的抗凝血土元肽粉。
实施例3
取500g干净土元干粉，干粉与水的比例为20g：100mL，pH调至10，以300r/min的速度均匀搅拌5h，取上清液，再将pH调至5.0，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白。将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为20g：100mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与土元蛋白重量之比为3mL：100g，反应温度为65℃，搅拌速度为250r/min，反应时间2h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂DA201-C交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：90.26s，PT：38.55s，TT：54.85s，FIB：0.89g/L的抗凝血土元肽粉。
实施例4
取500g干净土元干粉，干粉与水的比例为18g：100mL，pH调至9，以100r/min的速度均匀搅拌5h，取上清液，再将pH调至3.5，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白。将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为20g：100mL，控制pH值在9.0，再加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与土元蛋白重量之比为1mL：100g，反应温度为40℃，搅拌速度为150r/min，反应时间3h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂DA201-C交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：75.22s，PT：32.56s，TT：52.46s，FIB：1.11g/L的抗凝血土元肽粉。
实施例5
取500g干净土元干粉，干粉与水的比例为10g：100mL，pH调至9.5，以150r/min的速度均匀搅拌5h，取上清液，再将pH调至4.5，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白。将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为20g：100mL，控制pH值在9.0，再加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与土元蛋白重量之比为2.5mL：100g，反应温度为70℃，搅拌速度为200r/min，反应时间4h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂DA201-C交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：90.28s，PT：36.37s，TT：50.21s，FIB：0.98g/L的抗凝血土元肽粉。
实施例6
取500g干净土元干粉，干粉与水的比例为15g：100mL，pH调至11，以250r/min的速度均匀搅拌3h，取上清液，再将pH调至4.0，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白。将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为15g：100mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与土元蛋白重量之比为0.6mL：100g，反应温度为65℃，搅拌速度为300r/min，反应时间3.5h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂DA201-C交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：85.66s，PT：32.56s，TT：48.18s，FIB：1.02g/L的抗凝血土元肽粉。
实施例7
取500g干净土元干粉，干粉与水的比例为20g：100mL，pH调至9.5，以400r/min的速度均匀搅拌2h，取上清液，再将pH调至5.0，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白。将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为5g：100mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与土元蛋白重量之比为1.8mL：100g，反应温度为55℃，搅拌速度为150r/min，反应时间3h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂DA201-C交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：78.65s，PT：30.56s，TT：38.26s，FIB：1.12g/L的抗凝血土元肽粉。
实施例8
取500g干净土元干粉，干粉与水的比例为15g：100mL，pH调至9.0，以300r/min的速度均匀搅拌2h，取上清液，再将pH调至4.6，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白。将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为10g：100mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与土元蛋白重量之比为2.0mL：100g，反应温度为60℃，搅拌速度为200r/min，反应时间2.5h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂DA201-C交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：95.40s，PT：41.70s，TT：56.20s，FIB：0.82g/L的抗凝血土元肽粉。
实施例9
取500g干净土元干粉，干粉与水的比例为20g：100mL，pH调至9.6，以220r/min的速度均匀搅拌3.5h，取上清液，再将pH调至4.8，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白。将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为18g：100mL，控制pH值在8.6，再加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与土元蛋白重量之比为2.2mL：100g，反应温度为65℃，搅拌速度为200r/min，反应时间2h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂DA201-C交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：90.65s，PT：37.33s，TT：50.78s，FIB：0.93g/L的抗凝血土元肽粉。
实施例10
取500g干净土元干粉，干粉与水的比例为12g：100mL，pH调至9.3，以200r/min的速度均匀搅拌3h，取上清液，再将pH调至4.4，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白。将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为16g：100mL，控制pH值在9.2，再加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与土元蛋白重量之比为3mL：100g，反应温度为55℃，搅拌速度为250r/min，反应时间2h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂DA201-C交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：88.38s，PT：37.26s，TT：45.46s，FIB：1.05g/L的抗凝血土元肽粉。
实施例11
取500g干净土元干粉，干粉与水的比例为18g：100mL，pH调至9.6，以100r/min的速度均匀搅拌6h，取上清液，再将pH调至4.0，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白。将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为6g：100mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与土元蛋白重量之比为2.5mL：100g，反应温度为60℃，搅拌速度为200r/min，反应时间2.2h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂DA201-C交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：91.63s，PT：35.15s，TT：51.35s，FIB：0.90g/L的抗凝血土元肽粉。
实施例12
取500g干净土元干粉，干粉与水的比例为12g：100mL，pH调至9.0，以200r/min的速度均匀搅拌3h，取上清液，再将pH调至5.2，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白。将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为8g：100mL，控制pH值在8.6，再加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与土元蛋白重量之比为1.8mL：100g，反应温度为60℃，搅拌速度为250r/min，反应时间2.5h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂DA201-C交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：88.45s，PT：34.57s，TT：44.26s，FIB：1.17g/L，溶血栓活性(样品：1mg/mL)为128.62mm2的抗凝血土元肽粉。
实施例13
取500g干净土元干粉，干粉与水的比例为15g：100mL，pH调至9.5，以200r/min的速度均匀搅拌4h，取上清液，再将pH调至4.5，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白。将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为10g：100mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)，酶体积与土元蛋白重量之比为1.5mL：100g，反应温度为60℃，搅拌速度为200r/min，反应时间3h。煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂DA201-C交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0,25,50,75,100％不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集75％乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血活性(样品：0.1mg/mL)四项指标分别为APTT：94.56s，PT：39.82s，TT：54.58s，FIB：0.88g/L的抗凝血土元肽粉。
实施例14
取500g干净土元干粉，干粉与水的比例为15g：100mL，pH调至9.0，以300r/min的速度均匀搅拌2h，取上清液，再将pH调至4.6，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白。将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为10g：100mL，分别控制pH值在8.5,8.0,2.0,7.0,6.5,7.0，再分别加入Alcalase2.4L碱性蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)、胰蛋白酶(Sigma公司，美国)、胃蛋白酶(Sigma公司，美国)、木瓜蛋白酶(Sigma公司，美国)、复合蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)、风味蛋白酶(Novozymes公司，丹麦)进行酶解，对应的酶体积(重量)与土元蛋白重量之比为2.0/2.5/2.5/3.0/2.5/2.5mL(g)：100g，反应温度为60℃,40℃,37℃,65℃,50℃,50℃，搅拌速度均为200r/min，反应时间分别为2.5h,2.5h,2.5h,3.0h,3.5h,3.5h。煮沸10min，冷冻干燥得粗土元肽粉；本实施例中所得的粗土元肽粉的抗凝血酶活性分别为878ATU/mg,536ATU/mg,358ATU/mg,330ATU/mg,382ATU/mg,275ATU/mg(如图1所示)。
本发明以同一批次的土元为原料，以体外抗凝血活性为指标，考察了胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶Alcalase2.4L、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶六种常用酶对土元蛋白的酶解情况，发现除了Alcalase酶外的五种酶做催化剂时，所能得到的不同水解度的酶解物的最高抗凝血活性均低于550ATU/mg，Alcalase2.4L对底物蛋白的DH在23％时，抗凝血活性可达878ATU/mg。所以，确定采用Alcalase2.4L碱性蛋白酶酶解土元蛋白，DA201-C大孔吸附树脂柱分离纯化，以获得高活性多肽的最佳工艺条件。酶解产物过大孔吸附树脂柱的分离峰情况，见图2。从图中可以看出，经碱性蛋白酶酶解后的土元粗多肽经大孔吸附树脂交换柱柱分成了5个组分(A,B,C,D,E)。经测定，当样品浓度为0.1mg/mL，A组分的抗凝血四项指标为APTT：52.46s，PT：22.51s，TT：23.68s，FIB：2.08g/L；B组分：APTT：65.46s，PT：30.02s，TT：35.18s，FIB：1.68g/L；C组分：APTT：89.15s，PT：38.62s，TT：39.57s，FIB：1.25g/L；D组分：APTT：102.25s，PT：45.53s，TT：48.18s，FIB：0.96g/L；E组分：APTT：92.32s，PT：37.23s，TT：36.48s，FIB：1.36g/L；可以看出，D组分的活性最高，干燥收集。
实施例15
本发明采用体外凝血活性四指标对活性成分的抗凝血效果进行评价，评价方法如下：(以下的体外抗凝血活性试验所用到的土元多肽是用实施例8所制备得到的产物进行试验的)
一.体外抗凝血活性四项指标试验
1.材料：APTT(活化部分凝血酶时间)试剂、PT(凝血酶原时间)试剂、TT(凝血酶时间)试剂、FIB(纤维蛋白原浓度)试剂、CaCl2溶液，均购于上海太阳生物试剂公司；血浆，购于广州健阳生物试剂公司；比伐卢定，购于美国Sigma公司。
2.步骤：APTT检测：将100μL APTT试剂、100μL血浆、20μL多肽样品置入比色杯，混匀5s，37℃预热5min，再加入100μL浓度为0.025mol/L的CaCl2溶液，记录凝结时间。将样品分别换成同体积浓度的生理盐水和比伐卢定做阴性和阳性对照。
PT检测：将200μL PT试剂和20μL多肽样品放入比色杯中，37℃预热5min，再加入100μL已经预热好的37℃血浆，记录凝结时间。将样品分别换成同体积浓度的生理盐水和比伐卢定做阴性和阳性对照。
TT检测：将100μL TT试剂和20μL多肽样品放入比色杯中，加入37℃预热好的100μL血浆，记录凝结时间。将样品分别换成同体积浓度的生理盐水和比伐卢定做阴性和阳性对照。
FIB检测：将血浆和生理盐水按1:9的体积比例稀释，取稀释过的血浆200μL和20μL多肽样品放入比色杯中，再加入100μL FIB试剂,记录下屏幕上的FIB浓度。将样品分别换成同体积浓度的生理盐水和比伐卢定做阴性和阳性对照。
以上四项指标的测定，每个样品平行做6份，具体结果见表1。
表1多肽样品在5种不同浓度下的抗凝血活性考察
通过不同浓度土元多肽液的抗凝血活性比较，结果表明，阳性对照比伐卢定为公认的高抗凝血药物，当样品和对照浓度在0.01mg/mL，样品PT与阳性对照相当；0.2mg/mL的样品活力已高于0.01mg/mL的比伐卢定。土元多肽具有较好的抗凝血活性，随样品浓度增加，活性增强，证明用此法获得抗凝血多肽的方法可行。
上述体外抗凝血活性试验表明，通过本发明制得的土元多肽具备抗凝血的显著功效。土元多肽在抗凝血APTT、TT、PT、FIB四指标上均有良好的表现，与阳性对照相比，尤其对PT、FIB有显著贡献。
上述实施例为本发明较佳的方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种具有抗凝血土元多肽的酶解制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
取500g土元干粉，干粉与水的比例为15g：100 mL，pH调至9.0，以300r/min的速度均匀搅拌2h，取上清液，再将pH调至4.6，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得土元蛋白；将土元蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为10 g：100 mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase 2.4L碱性蛋白酶，酶体积与土元蛋白重量之比为2.0 mL：100 g，反应温度为60℃，搅拌速度为200 r/min，反应时间 2.5h；煮沸10min，将酶解液过大孔吸附树脂DA 201-C交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0, 25, 50, 75, 100%不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0 mL/min，在波长214 nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集75%乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得抗凝血的土元多肽。
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