白眉蛇毒血凝酶及其提取方法与应用
技术领域
本发明涉及酶及其提取方法与应用,特别是涉及一种来源于白眉蝮蛇蛇毒的血凝酶及其提取方法与其在制备止血药和/或治疗出血性疾病的药物中的应用。
背景技术
凝血是一个比较复杂的生理过程,大体分为三个阶段:第一阶段,凝血因子X(coagulation factor X,Fx)激活;第二阶段,凝血酶原激活;第三阶段,纤维蛋白原变为纤维蛋白。
从蛇毒中提取止血药具有悠久的历史。目前,临床应用较为成功的有瑞士生产的止血药Reptilase,即立止血,它是从巴西矛头腹蛇蛇毒中提取的。国内仿Reptilase的产品有从蛇岛蝮蛇、从圆斑蝰蛇、尖吻蝮蛇以及浙江蝮蛇的蛇毒中提取得到的凝血酶,这些产品和立止血都是类凝血酶和少量的类凝血激酶(一种凝血因子X激活物)的混合物,主要机理是类凝血酶可使纤维蛋白原I单体交联成纤维蛋白,从而形成血凝块实现止血。
发明内容
本发明的目的是提供一种从白眉蝮蛇蛇毒中提取的凝血效果较好的血凝酶。
为解决上述技术问题,本发明采取以下技术方案:一种白眉蛇毒血凝酶,是将长白山白眉蝮蛇蛇毒依次进行DEAE-Sephadex A-50(二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50)离子交换层析、Sephadex G-15凝胶过滤层析、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析后收集的具有凝血活性的蛋白。
所述白眉蛇毒血凝酶具有以下特点:(1)由类凝血酶类物质(分子量为34000D)和类凝血激酶(分子量为69000D)两种成分组成,高效液相色谱测得类凝血酶物质的含量为76-82%,类凝血激酶的含量为18-24%;(2)主要成分类凝血酶类物质N末端的15位氨基酸残基序列如序列表中的序列1所示。
本发明的第二个目的是提供一种上述血凝酶的提取方法。
本发明所提供的上述血凝酶的提取方法,包括以下步骤:
1)将长白山白眉蝮蛇蛇毒溶于pH 7-8、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液中,得到浓度为200-300g/L的白眉蝮蛇蛇毒液;
2)对步骤1)获得的长白山白眉蝮蛇蛇毒液进行离子交换柱层析,固相填充物为DEAE-Sephadex A-50,洗脱液为含0-0.75mol/L NaCl的pH 7-8、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液直线梯度洗脱;
3)收集洗脱液,在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测,得到波长280nm吸收图谱,收集各吸收峰中具有凝血活性的部分;
4)层析除盐:将具有凝血活性的收集液进行凝胶过滤层析,固相填充物为Sephadex G-15,洗脱液为注射用水,再收集洗脱液中具有凝血活性的部分;
5)再层析:调节步骤4)收集的具有凝血活性的收集液的pH值至5.0-5.4,然后对其进行离子交换柱层析,固相填充物为DEAE-Sephadex A-50,洗脱液为含0-0.25mol/L NaCl的pH 5.0-5.4、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液直线梯度洗脱;
6)冻干;
7)将步骤6)获得的冻干粉用注射用水复溶;
8)将复溶液进行凝胶过滤层析,固相填充物为Sephadex G-75,洗脱液为注射用水,收集洗脱液,从中收集具有凝血活性的部分,得到白眉蛇毒血凝酶原液。
在上述血凝酶的提取方法中,步骤1)中用于溶解长白山白眉蝮蛇蛇毒的溶剂优选为pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液;此外,为获得更好的实施效果,可先用离心的方法去除白眉蝮蛇蛇毒液中的杂质,离心条件可根据实际情况进行选择,如在3000rpm下离心10分钟。
步骤2)中的DEAE-Sephadex A-50层析柱在使用前,先用pH 7-8、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时,流速为0.8-1.0mL/min;层析时,待白眉蝮蛇蛇毒液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液一致的缓冲液,然后用pH 7-8、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含0.75mol/L NaCl的pH 7-8、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱,流速为0.8-1.0mL/min;所述步骤2)中的Tris-HCl缓冲液优选为pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液。
步骤3)中的收集方法可为:用自动馏分收集器收集,每管12-15mL;具有凝血活性的收集部分的检测方法可为:将等体积(优选0.5mL)并预热至37℃的收集液和凝血质控血浆混合并在37℃下水浴,能使血浆在20秒内凝固的收集部分为具有凝血活性的。
步骤4)中的Sephadex G-15层析柱在使用前,先用注射水平衡15-20小时,流速为0.8-1.0mL/min;层析时,待上清液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加注射水,然后用注射水洗脱,流速为0.8-1.0mL/min;用与步骤3)相同的方法收集洗脱液中具有凝血活性的部分。
步骤5)中先调节具有凝血活性的收集液的pH值至5.0-5.4;所述DEAE-SephadexA-50层析柱在使用前,先用pH 5.0-5.4、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时,流速为0.8-1.0mL/min;层析时,待收集液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加与平衡液一致的缓冲液,然后用pH5.0-5.4、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含0.25mol/L NaCl的pH 5.0-5.4、0.04-0.06mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱,流速为0.8-1.0mL/min;所述步骤5)中的Tris-HCl缓冲液优选为pH 5.2、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液。
步骤8)中的Sephadex G-75层析柱在使用前,先用注射水平衡15-20小时,流速为0.8-1.0mL/min;层析时,待上清液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加注射水,然后用注射水洗脱,流速为0.8-1.0mL/min;用与步骤3)相同的方法收集洗脱液中具有凝血活性的部分。
所述白眉蛇毒血凝酶在制备止血药和/或治疗出血性疾病药物中的应用也是本发明要保护的。
本发明的另一个目的是提供一种止血和/或治疗出血性疾病的药物。
本发明所提供的药物的活性成分为上述白眉蛇毒血凝酶。
需要的时候,在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料,所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂等。
本发明的药物可以制成干粉针剂、注射液或止血绷带等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述药物的成人用量一般为1-8KU/60kg体重/天,可以一次或多次使用。
本发明提供了一种从长白山白眉蝮蛇蛇毒中提取到的血凝酶。所述白眉蛇毒血凝酶具有以下特点:(1)由类凝血酶类物质(分子量为34000D)和类凝血激酶(分子量为69000D)两种成分组成,高效液相色谱测得类凝血酶物质的含量为76-82%,类凝血激酶的含量为18-24%;(2)主要成分类凝血酶类物质N末端的15位氨基酸残基序列如序列表中的序列1所示;3)该酶的提取方法以常规的层析技术为主,通过变换层析条件和调节技术参数实现精确分离的目的,且可以在常温下进行操作,并具有条件简单容易放大,成本低(选择的层析胶可以反复使用),收率高和产品纯度高(可以达到色谱纯)的优点。基于上述特点,可以本发明的血凝酶为活性成分制备治疗外科出血、内科出血、妇产科出血、五官科出血、儿科出血和组织活检后出血等临床出血及出血性疾病的药物,本发明将在生物制药领域发挥重要作用,应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明白眉蛇毒血凝酶中类凝血酶和类凝血激酶含量的高效液相色谱检测结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、提取白眉蛇毒血凝酶
用下述方法从长白山白眉蝮蛇蛇毒中提取血凝酶,具体过程包括以下步骤:
1)将长白山白眉蝮蛇(Agkistrodon halys(pallas))蛇毒冻干粉(购于沈阳鸿德蛇类养殖有限公司)10g溶于40mL pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液中,得到浓度为250g/L的白眉蝮蛇蛇毒液,再将白眉蝮蛇蛇毒液在3000rpm下离心10分钟,弃去沉淀,保留上清液。
2)对步骤1)获得的长白山白眉蝮蛇蛇毒液进行离子交换柱层析,方法为:层析前先将DEAE-Sephadex A-50层析柱(柱规格100×5cm,购自广州深华生物技术有限公司)用pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时,流速为0.8-1.0mL/min,胶床高≥90cm;层析时,待蛇毒上清液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加pH7.5、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液50mL,然后用1000mL pH7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含NaCl 0.75mol/L的pH 7.5、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱,流速为0.8-1.0mL/min。
3)用自动馏分收集器收集洗脱液,每管12-15mL,在280nm的波长下对洗脱液进行紫外分光光度计检测,得到波长280nm吸收图谱,收集具有凝血活性的部分,方法为:将预热至37℃的0.5mL收集液和0.5mL凝血质控血浆(美国太平洋试剂公司)混合并在37℃下水浴,能使血浆在20秒内凝固的收集部分为具有凝血活性的。收集液量约300mL,总活性约18000单位(KU)。
4)层析除盐:对步骤3)获得的具有凝血活性的收集液进行凝胶过滤层析,方法为:层析前先将Sephadex G-15层析柱(柱的规格为100×5cm,购自广州深华生物技术有限公司)用注射用水平衡15-20小时,流速为0.8-1.0mL/min,胶床高≥80cm;层析时,待上清液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加注射水50mL,然后用2000mL注射水洗脱,流速为0.8-1.0mL/min;用与步骤3)相同的方法收集洗脱液中具有凝血活性的部分,结果获得收集液约180mL,总活性约15000KU。
5)再层析:调节步骤4)收集的具有凝血活性的收集液的pH值至5.2,然后对其进行离子交换柱层析,方法为:层析前先将DEAE-Sephadex A-50层析柱(柱的规格为100×5cm,购自广州深华生物技术有限公司)用pH5.2、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡15-20小时,流速为0.8-1.0mL/min,胶床高≥90cm;层析时,待收集液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加pH5.2、0.05mol/L Tris-HCl缓冲液50mL,然后用1000mL pH5.2、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液和等量的含NaCl 0.25mol/L的pH5.2、0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行直线梯度洗脱,流速为0.8-1.0mL/min;用与步骤3)相同的方法收集洗脱液中具有凝血活性的部分,结果获得收集液约150mL,总活性约14000KU。
6)冻干;将收集液放入冷冻干燥机中冷冻干燥,得到冻干粉。
7)将步骤6)获得的冻干粉用20mL注射用水复溶。
8)对步骤7)获得的复溶液进行凝胶过滤层析,方法为:层析前先将Sephadex G-75层析柱(柱的规格为100×5cm,购自广州深华生物技术有限公司)用注射水平衡15-20小时,流速为0.8-1.0mL/min,胶床高≥90cm;层析时,待上清液完全移动到胶面以下后,在胶面上方加注射水50mL,然后用2000mL注射水洗脱,流速为0.8-1.0mL/min;用与步骤3)相同的方法收集洗脱液中具有凝血活性的部分,得到约100mL白眉蛇毒血凝酶原液,总活性约12000单位。
按照活性【1单位(KU)白眉蛇毒血凝酶的确定:将预热至37℃的1mL白眉蛇毒血凝酶溶液与1mL凝血质控血浆(美国太平洋试剂生产)混合,在37℃下,能使1mL凝血质控血浆在60-80秒内凝固,混合前的1mL溶液中所含的白眉蛇毒血凝酶的量即为1单位(KU)。】,用蒸馏水将原液稀释成40单位(KU)/mL,得到白眉蛇毒血凝酶浓缩液。
实施例2、白眉蛇毒血凝酶的活性测定
一、凝血质控血浆凝固时间测定
将实施例1获得的白眉蛇毒血凝酶浓缩液(40单位(KU)/mL)用蒸馏水稀释成不同的浓度(白眉蛇毒血凝酶含量分别为5、2、1、0.8、0.6和0.4KU/mL),然后分别取37℃下预热的各浓度的稀释液0.2mL,分别与在37℃条件下预热凝血质控血浆(美国太平洋试剂生产)混合,在37℃条件下记录血浆凝固时间。结果如表1所示,再以白眉蛇毒血凝酶含量(KU/mL)的倒数为横坐标,以凝血质控血浆凝固时间为纵坐标绘制标准曲线,计算回归方程,Y=63.365X-0.0264,R2=0.9949。上述检测结果表明,白眉蛇毒血凝酶能使凝血质控血浆凝固,并且在0.4-5KU/mL之间,血凝酶浓度的倒数和人血浆凝固时间有很好的线性关系。
表1不同含量的白眉蛇毒血凝酶稀释液测得的凝血质控血浆凝固时间
二、类凝血酶样活性测定
类凝血酶样活性主要体现在可作用于纤维蛋白原单体,使其交联成纤维蛋白,形成凝块,而DFP(二异丙基氟磷酸)可以抑制类凝血酶样活性。用下述方法检测本发明提取的白眉蛇毒血凝酶的类凝血酶样活性,具体方法为:将实施例1获得的白眉蝮蛇蛇毒血凝酶浓缩液用2×10-3mol/L的DFP溶液分别稀释成0.5KU/mL、1KU/mL和2KU/mL,作用5小时后,不同浓度的稀释液各取1mL,37℃水浴预热5min,然后向其中加入37℃水浴预热的0.1%的牛纤维蛋白原溶液1mL,记录凝固时间。同时以用蒸馏水代替DFP溶液作为对照。实验结果如表2所示,在DFP存在的条件下,本发明的白眉蛇毒血凝酶无法使牛纤维蛋白原溶液凝固,而蒸馏水对照组的牛纤维蛋白原出现凝固现象,证明本发明的白眉蛇毒血凝酶具有类凝血酶样活性,可特异作用于纤维蛋白原。
表2不同含量的白眉蛇毒血凝酶稀释液测得的纤维蛋白原凝固时间
三、类凝血激酶样活性测定
类凝血激酶样活性主要体现在通过激活凝血X因子启动凝血反应,而EDTA可以抑制该类凝血激酶样活性。用下述方法检测本发明提取的白眉蛇毒血凝酶的类凝血激酶样活性,具体方法为:将实施例1获得的白眉蛇毒血凝酶浓缩液用5×10-3mol/L的EDTA溶液分别稀释成0.5KU/mL、1KU/mL和2KU/mL,作用5小时后,不同浓度的稀释液各取1mL,37℃水浴预热5min作为供试品,然后向每一供试品中分别加入37℃水浴预热的凝血质控血浆和缺X因子血浆(均为美国太平洋试剂生产),记录凝固时间。同时,分别用2×10-3mol/L的DFP溶液和蒸馏水代替EDTA溶液作为对照。实验结果如表3所示,在DFP存在的条件下,本发明的白眉蛇毒血凝酶不能使缺X因子血浆凝固,却能使正常的血浆凝,且该活性可受到EDTA的抑制。
表3不同含量的白眉蛇毒血凝酶稀释液的类凝血激酶样活性测定结果
实施例3、白眉蛇毒血凝酶中类凝血酶类物质和类凝血激酶物质含量测定
将实施例1获得的白眉蛇毒血凝酶浓缩液作为供试品,用日本岛津高效液相色谱仪及TKS-G2000swxI凝胶色谱柱(购自翡纳米(天津)科技发展有限公司)检测其中的类凝血酶类物质和类凝血激酶物质的含量,以乙腈∶三氟乙酸∶水(40∶0.1∶60)为流动相,进样量为10μl,流速为0.8mL/min,检测波长为280nm。所得的高效液相色谱扫描图如图1所示,第一峰为类凝血激酶类物质(分子量69000D),第二峰为类凝血酶样物质(分子量为34000D),两者的峰面积比为18.1∶81.9。
实施例4、白眉蛇毒血凝酶的N-末端氨基酸序列测定
用切割分子量60000D的超滤柱对本发明所得的白眉蛇毒血凝酶浓缩液100mL进行超滤,收集超滤液冻干,即得本产品的主要成分:分子量为34000D的类凝血酶样组分;取类凝血酶样组分10μg作为供试品,采用ABI Procise 491型测序仪进行N-末端氨基酸序列测定,按照PVDF程序上样。测序结果表明本发明白眉蛇毒血凝酶N-末端的15位氨基酸残基序列如序列表中的序列1所示。
序列表
<160>1
<210>1
<211>15
<212>PRT
<213>白眉蝮蛇(Agkistrodon halys(pallas))
<400>1
Glu Ile Gly His Arg Glu Cys Asn Ile Asn Glu His Asp Phe Leu
1 5 10 15