CN114689703B - 长白山白眉蝮蛇蛇毒的反相hplc指纹图谱检测方法 - Google Patents

长白山白眉蝮蛇蛇毒的反相hplc指纹图谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及长白山白眉蝮蛇蛇毒指纹图谱的检测方法，其步骤：(1)供试品和对照品溶液制备：分别取长白山白眉蝮蛇蛇毒供试品和长白山白眉蝮蛇蛇毒对照品，用溶剂溶解并稀释，离心，取上清液，过滤；(2)指纹图谱检测：分别取步骤(1)所得供试品和对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算相似度。本发明长白山白眉蝮蛇蛇毒指纹图谱的检测方法，具有操作性强、重现性好、专属性高，该方法可作为长白山白眉蝮蛇蛇毒的检测鉴别的标准方法，能提供更全面的长白山白眉蝮蛇蛇毒的质量信息。

Description

长白山白眉蝮蛇蛇毒的反相HPLC指纹图谱检测方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种长白山白眉蝮蛇蛇毒指纹图谱的检测方法。
背景技术
长白山白眉蝮蛇蛇毒系自长白山白眉蝮蛇[Agkistrodon，halys(pallas)]腮腺中，以挤压刺激的方法采集蛇毒毒液，并经冷冻干燥制得，主要成份是蛋白、多肽及酶类等生物活性物质，其本质是由氨基酸所组成的蛋白质。蛇毒成分十分复杂，不同的蛇种、亚种、甚至同一种蛇因季节、产地、性别、蛇龄等不同所分泌的毒液，其毒性成分仍存在一定的差异。
指纹图谱源于指纹鉴定学，常用于中药研究，是一种综合的、宏观的和可量化的鉴别手段。它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性，其基本属性是“整体性”和“模糊性”。“整体性”是指完整地比较色谱的特征“面貌”；“模糊性”强调的是对照品与待测样品指纹图谱的相似性。
目前蛇毒指纹图谱检测方法主要有RP-HPLC法、凝胶色谱法、毛细管电泳法等。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点。因此高效液相色谱法已成为蛇毒指纹图谱技术的首选方法。
专利CN101539555A公开了一种蛇毒指纹图谱的建立方法，该方法采用毛细管电泳进行分离检测。但是，该方法重现性差、灵敏度低、操作繁琐。
Andrei/>Florea等人("New RP-HPLC Method for Separation ofNaja haje haje Venom and Studies of its Bactericidal Effect."Acta MedicaMarisiensis 62.1(2016).)公开了一种分离眼镜蛇毒的RP-HPLC方法，但该方法检测耗时较长、峰形及分离度较差。
因此，为了更好地检测鉴别长白山白眉蝮蛇蛇毒产品的质量，提供更全面的产品质量信息，有必要提供一种操作性强、重现性好的长白山白眉蝮蛇蛇毒的检测方法。
发明内容
针对以上技术现状，本发明提供一种长白山白眉蝮蛇蛇毒指纹图谱的检测方法，所述方法包括如下步骤：
(1)供试品和对照品溶液的制备：分别取长白山白眉蝮蛇蛇毒供试品和长白山白眉蝮蛇蛇毒对照品，用溶剂溶解并稀释，离心，取上清液，过滤，得供试品和对照品溶液；
(2)指纹图谱检测：分别取步骤(1)所得供试品和对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算相似度，
其中所述液相色谱条件包括：
色谱柱用辛烷基硅烷键合硅胶(C8)或十八烷基硅烷键合硅胶(C18)为填充剂，优选辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱(C8柱)；
流动相：A-0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液、B-0.1％TFA乙腈溶液，或A-0.1％TFA水溶液、B-乙腈，优选A-0.1％TFA水溶液、B-0.1％TFA乙腈溶液；
进行梯度洗脱。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(1)进一步包括：所述溶剂为水或0.1％TFA溶液，优选水；溶解并稀释制成每1ml中含1～30mg、优选2～20mg、最佳为10mg的溶液。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(1)进一步包括：离心条件为3000～10000rpm、优选3000rpm，8～16℃、优选8℃，离心15～20min、优选15min。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(2)中洗脱梯度包括：10～90％B60min、或10～70％B 60min、或10～70％B 45min、或10～60％B 45min、或10～70％B30min、或10～70％B 43min、或10～70％B 47min、或9～69％45min、或11～71％45min，优选10～70％B 45min。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(2)色谱条件进一步包括：检测波长为214或280nm，优选280nm。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(2)色谱条件进一步包括：所述辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱(C8柱)包括YMC-C8柱、安捷伦C8柱、或Kromasil-C8柱，优选安捷伦C8柱，规格为4.6×250mm，5um；孔径300A。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(2)色谱条件进一步包括：柱温为20～30℃，优选25℃。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(2)色谱条件进一步包括：上样量为20μl，样品盘温度为8-25℃、优选8-16℃、最佳8℃，流速为1ml/min。
本发明方法中，作为实施方案之一，所述长白山白眉蝮蛇蛇毒指纹图谱的检测方法进一步包括：
(1)供试品和对照品溶液的制备：取长白山白眉蝮蛇蛇毒供试品及长白山白眉蝮蛇蛇毒对照品，用水溶解并稀释制成每1ml中含10mg的溶液，3000rpm、8℃离心15分钟，取上清液，过滤，即得供试品和对照品溶液；
(2)指纹图谱检测：分别取20μl供试品和对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算供试品图谱与对照品图谱相似度；
所述色谱条件包括：
色谱柱：C8(安捷伦)柱；
进样体积：20μl；
检测波长：280nm；
流速：1ml/min；
样品盘温度：8℃，柱温：25℃；
流动相：A-0.1％TFA的水溶液，B-0.1％TFA的乙腈溶液；
按下表进行梯度洗脱：
本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(2)对照品的指纹图谱包括9个特征峰，相对保留时间的规定值为：0.4337(峰1)、0.4466(峰2)、0.4648(峰3)、1.1912(峰5)、1.5852(峰6)、1.5997(峰7)、1.7864(峰8)、1.8244(峰9)，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。
本发明中，作为实施方案之一，所述步骤(2)指纹图谱检测进一步包括：采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行计算，供试品图谱应与对照品图谱相似度不得低于0.90；作为实施方案之一，所述供试品图谱与对照品图谱相似度不得低于0.95。
相对于现有长白山白眉蝮蛇蛇毒的检测方法，本发明建立了反相HPLC指纹图谱检测方法，本发明方法具有操作性强、重现性好、专属性高，可作为长白山白眉蝮蛇蛇毒的检测鉴别的标准方法，能提供更全面的产品质量信息。
附图说明
图1为实施例2中不同供试液制备方法的样品层叠对照色谱图。
图2为实施例3中的样品层叠对照色谱图-安捷伦C18色谱柱。
图3为实施例3中的样品层叠对照色谱图-安捷伦C8色谱柱。
图4为实施例4中的280nm与214nm下蛇毒指纹图谱比较叠加图。
图5为实施例5中的不同流动相对比叠加色谱图。
图6为实施例6中的不同洗脱梯度样品层叠色谱图。
图7为实施例7中的不同柱温实验图谱。
图8为实施例8中专属性实验的对比叠加色谱图。
图9为实施例8中精密度实验的实验图谱。
图10为实施例8中重复性实验的实验图谱。
图11为实施例8中稳定性实验的实验图谱-低温(8℃)放置。
图12为实施例8中稳定性实验的实验图谱-室温放置。
图13为实施例8中方法耐用性实验色谱图-色谱柱。
图14为实施例8中方法耐用性实验图谱-有机相起止比例、洗脱时间。
图15为实施例8中范围考察的实验图谱。
图16为实施例9中的特征图谱对比叠加图。
图17为实施例9中的白眉蝮蛇蛇毒HPLC特征图谱共有模式(对照图谱)。
具体实施方式
以下实施例和试验例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。
仪器：
试剂：
序号 试剂名称 规格 生产厂家
1 乙腈 4L/瓶 Fisher
2 甲醇 4L/瓶 Fisher
3 三氟乙酸 100ml/瓶 麦克林
4 纯化水 —— 自制
供试品：
对照品：长白山白眉蝮蛇蛇毒，自制。
实施例1长白山白眉蝮蛇蛇毒指纹图谱的检测方法
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒(批号：20171207-4)
对照品：长白山白眉蝮蛇蛇毒对照品(自制)
(1)供试品和对照品溶液的制备：取长白山白眉蝮蛇蛇毒供试品及长白山白眉蝮蛇蛇毒对照品，用水溶解并稀释制成每1ml中含10mg的溶液，3000rpm、8℃离心15分钟，取上清液，过滤，得供试品和对照品溶液；
(2)指纹图谱检测：分别取20μl供试品和对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行计算，供试品图谱应与对照品图谱相似度不得低于0.90；
色谱条件：
色谱柱：C8(安捷伦)柱；
进样体积：20μl；
检测波长：280nm；
流速：1ml/min；
样品盘温度：8℃，柱温：25℃；
流动相：A-0.1％TFA的水溶液，B-0.1％TFA的乙腈溶液；
按下表进行梯度洗脱：
实施例2供试品溶液制备条件的筛选
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒(批号：20171207-4)
(1)供试品和对照品溶液的制备：除以下条件改变外，其余方法同实施例1步骤(1)。
(2)指纹图谱检测：同实施例1步骤(2)。
结果分析
样品层叠对照色谱图参见附图1，结果表明，溶剂为纯水或0.1％TFA溶液、及上述各离心条件下制备的供试品溶液色谱行为基本无差别。
实验结论
考虑到实验的简便性，确定蛇毒供试品溶液制备方法为：蛇毒约20mg+水→3000rpm，低温(8℃)离心15min→取上清，滤过，即得。
实施例3色谱柱的选择
实验方法
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒(批号：20171207-4)
(1)供试品和对照品溶液的制备：同实施例1步骤(1)
(2)指纹图谱检测：色谱条件调整如下，其余同实施例1步骤(2)
色谱条件：
①安捷伦C18柱(规格为4.6×250mm，5um；孔径300A)，1ml/min，20μl，25℃，280nm，流动相：A-0.1％TFA，B-乙腈+0.1％TFA，10％～90％B，60min；样品盘温度：8℃。
②安捷伦C8柱(规格为4.6×250mm，5um；孔径300A)，1ml/min，20μl，25℃，280nm，流动相：A-0.1％TFA，B-乙腈+0.1％TFA，10％～90％B，60min；样品盘温度：8℃。
结果分析
实验结果见图2～3，C8与C18柱检测蛇毒时色谱行为基本一致，考虑到文献报道C8略优于C18，且考虑到前期研究结果及实验室现有条件，选择C8柱为蛇毒指纹图谱研究用色谱柱。
实施例4检测波长的选择
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒(批号：20171207-4)
(1)供试品和对照品溶液的制备：同实施例1步骤(1)
(2)指纹图谱检测：检测波长为280nm、214nm；其余同实施例1步骤(2)
结果分析
结果可以看出(见图4)，蛇毒指纹图谱在280nm和214nm波长下检测整体表观基本无差，280nm基线较稳，214nm峰的检测限较低；蛇毒样品进行紫外-可见光光谱扫描，279nm为波峰，214nm为末端吸收。
实施例5流动相的选择
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒(批号：20171207-4)
(1)供试品和对照品溶液的制备：同实施例1步骤(1)
(2)指纹图谱检测：流动相调整如下，其余同实施例1步骤(2)
流动相Ⅰ:A-0.1％TFA水溶液，B-0.1％TFA乙腈溶液，10～90％B，60min
流动相Ⅱ:A-水，B-乙腈，10～90％B，60min
流动相Ⅲ：A-0.1％TFA水溶液，B-乙腈，10～90％B，60min
结果分析
实验结果见图5，流动相Ⅲ与流动相Ⅰ色谱行为差别不大，但流动相Ⅰ条件下，峰数较多些，且峰形优于流动相Ⅲ，故选取流动相Ⅰ为后续研究的流动相体系。
实施例6洗脱梯度筛选
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒(批号：20171207-4)
(1)供试品和对照品溶液的制备：同实施例1步骤(1)
(2)指纹图谱的检测：洗脱条件调整如下；其余同实施例1步骤(2)
梯度01：10～90％B 60min
梯度02：10～70％B 60min
梯度03：10～70％B 45min
梯度04：10～60％B 45min
梯度05：10～70％B 30min
结果分析
实验结果见图6，考虑到既能表观蛇毒的指纹特征，又符合试验的简便性，故选取梯度03作为本蛇毒指纹图谱的洗脱梯度。
实施例7柱温的选择
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒(批号：20171207-4)
(1)供试品和对照品溶液的制备：同实施例1步骤(1)
(2)指纹图谱检测：柱温调整为20℃、25℃、30℃；其余同实施例1步骤(2)
结果分析
实验结果见图7，三种柱温下，色谱行为基本一致，考虑试验的简便性，故选25℃为本方法的柱温条件；同时可见，本法对柱温条件的微小变化耐用性良好。
实施例2～7结论：
色谱柱筛选结果：C8色谱柱
检测波长筛选结果：280nm
流动相筛选结果：A-0.1％TFA水溶液，B-0.1％TFA乙腈溶液，10～70％B，45min
柱温筛选结果：25℃
供试品溶液制备：蛇毒约20mg+水溶液2ml→3000rpm，低温(8℃)离心15min→取上清，滤过，即得。
实施例8“长白山白眉蝮蛇蛇毒指纹图谱的检测方法”的方法学考察
1.专属性
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒(批号：20171207-4)、黑眉蝮蛇蛇毒、尖吻蝮蛇蛇毒、江浙蝮蛇蛇毒、蝰蛇蛇毒、矛头蝮蛇蛇毒、眼镜蛇蛇毒、银环蛇蛇毒(黑眉蝮蛇蛇毒批号：20161227，来源为辉南县翔龙养蛇有限公司；其它蛇种蛇毒批号20170322，来源为江西农大特种动物蛇类养殖示范基地)。
实验方法
同实施例1方法，分别检测不同蛇种色谱行为的差异，计算相似度。
表1白眉蝮蛇与其它蛇种相似度结果表
结果及分析
结果见表1及图8。由图8可见，本法具有专属性；从表1相似度结果可见，与白眉蝮蛇相似度较高的为黑眉蝮蛇和江浙蝮蛇，相似度分别为为0.753、0.491，均小于0.90。
2.精密度实验
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒(批号：20171207-4)
实验方法：
参见实施例1方法，精密吸取同一份供试品溶液，连续进样6次，依法测定，记录特征图谱，同时用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”计算相似度。
结果及分析
结果见图9，以4号峰为内参比峰，各主要色谱峰相对保留时间RSD＜0.5％，同时用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”计算，测得的色谱指纹图谱与其所得的共有模式图的相似度分别为1.000、1.000、1.000、0.999、1.000、0.999，均大于0.99，表明仪器稳定，精密度良好。
3.重复性实验
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒(批号：20171207-4)
实验方法：
参见实施例1方法，取同一批号蛇毒，平行9份，分别制成供试液，依法测定，记录特征图谱，同时用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”计算相似度。
实验结果及分析
表2特征峰相对保留时间(反相法)
表3相似度结果(反相法)
匹配结果
结果见表2、表3、图10，以4号峰为内参比峰，各主要色谱峰相对保留时间RSD＜0.2％，同时用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”计算，测得的色谱指纹图谱与其所得的共有模式图的相似度均大于0.99，表明方法重复性良好。
4.稳定性实验
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒(批号：20171207-4)
实验方法：
参见实施例1方法，精密吸取同一份供试品溶液，分别在制备后0、2、4、8、12、24h，依法测定，记录特征图谱，同时用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”计算相似度。
实验结果及分析
结果见图11～12，以4号峰为内参比峰，各主要色谱峰相对保留时间RSD＜0.2％，同时用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”计算，测得的色谱指纹图谱与其所得的共有模式图的相似度均大于0.99，表明样品在制备后8℃及室温放置24h稳定性良好。
5.耐用性实验
5.1不同品牌色谱柱的耐用性
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒(批号：20171207-4)
实验方法：
分别考察相同规格不同品牌色谱柱方法的耐用性。
参见实施例1方法，色谱柱调整为YMC C8、安捷伦C8、Kromasil C8。
结果及分析
表4不同色谱柱相对保留时间结果表
结果见表4、图13，各品牌色谱柱色谱图整体表观基本一致，但保留时间存在品牌间差异，在峰数、峰形等色谱行为上Agilent-C8柱略优于其他两个品牌；各特征峰相对保留时间的RSD＞5％(S峰前)，RSD＜5％(S峰后)；工作中建议用安捷伦C8色谱柱。
5.2色谱条件的耐用性
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒(批号：20171207-4)
实验方法：
参见实施例1方法，考察方法中梯度时间点(±2min)、有机相起止比例(±1％)微小变动时，指纹谱图检测方法的耐用性。
实验结论
结果见图14，色谱条件微小变动对指纹图谱整体轮廓无影响，耐用性均良好。
6.范围
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒(批号：20171207-4)
实验方法
参见实施例1方法，其中供试品溶液浓度调整为1、2、5、10、20、30mg/ml。
结果及分析
表5相似度结果
结果见图15、表5，蛇毒样品浓度1～30mg/ml范围内，蛇毒指纹图谱相似度均＞0.90，相似度良好；且样品浓度在2～20mg/ml范围时，相似度结果更加理想。
实施例9特征图谱及技术参数
1.白眉蝮蛇蛇毒特征图谱共有模式的建立(反相法)
样品
供试品：长白山白眉蝮蛇蛇毒，17批，批号见“供试品”表格
实验方法
参见实施例1方法，取不同产地不同季节白眉蝮蛇蛇毒17批次，依法测定，记录HPLC图，采用国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统”进行数据分析处理，生成共有模式，并记录各供试品与共有模式的相似度结果。
结果及分析
结果见图16～17，1～17号蛇毒样品与共有模式的相似度分别为0.978、0.998、0.999、0.997、0.998、0.999、0.998、0.999、0.998、0.999、0.998、0.998、0.998、0.993、0.999、0.996、0.996，均大于0.9，说明蛇毒特征图谱相似度高，表明蛇毒对照品以特征图谱评价合理。
2.特征峰的标定
实验方法
特征峰的标定是在共有峰标定的基础上进行的，将蛇毒的指纹峰锁定在8～38min共有特征区进行统计，从17批样品图谱中选定其中9个主要共有峰作为蛇毒对照品的特征峰。以专属性强、保留时间居中，峰面积较大且稳定的4号峰为内参比峰，计算各特征峰的相对保留时间。
表6特征峰的相对保留时间表
结果及分析
白眉蝮蛇蛇毒特征图谱分析结果表明(见表6、图16～17)，17批蛇毒特征图谱中各特征峰相对保留时间RSD＜1％，符合相关规定。规定值为：0.4337(峰1)、0.4466(峰2)、0.4648(峰3)、1.1912(峰5)、1.5852(峰6)、1.5997(峰7)、1.7864(峰8)、1.8244(峰9)，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。
结论
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似度评价，选取9个特征峰构成了白眉蝮蛇蛇毒的特征图谱，结果表明其特征图谱相似度高，以共有模式作为白眉蝮蛇蛇毒的检测鉴别标准方法，且能提供更全面的产品质量息。实验证明本发明方法具有操作性强，重现性好，可作为白眉蝮蛇蛇毒产品质量的检测方法。

Claims (20)

1.长白山白眉蝮蛇蛇毒的指纹图谱检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)供试品和对照品溶液的制备：分别取长白山白眉蝮蛇蛇毒供试品和长白山白眉蝮蛇蛇毒对照品，用溶剂溶解并稀释，离心，取上清液，过滤，即得供试品和对照品溶液；
(2)指纹图谱检测：取步骤(1)所得供试品和对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算相似度，
其中色谱条件包括：
色谱柱用辛烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A-0.1％TFA水溶液、B-0.1％TFA乙腈溶液，或A-0.1％TFA水溶液、B-乙腈；
所述步骤(2)中检测波长为214或280nm；
所述步骤(2)中洗脱梯度为10～70％B 45min；
进行梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)进一步包括：所述溶剂为水或0.1％TFA溶液；溶解并稀释制成每1ml中含1～30mg的供试品或对照品的溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)进一步包括：离心条件为3000～10000rpm；8～16℃；离心15～20min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)进一步包括：离心条件为3000rpm；8℃；离心15min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)色谱条件进一步包括：所述辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱包括YMC-C8柱、安捷伦C8柱、或Kromasil-C8柱，规格为4.6×250mm，5um；孔径300A。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)色谱条件进一步包括：柱温为20～30℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)色谱条件进一步包括：上样量为20μl，样品盘温度为8-25℃，流速为1ml/min。
8.根据权利要求1～7任一所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：
(1)供试品和对照品溶液的制备：分别取长白山白眉蝮蛇蛇毒供试品及长白山白眉蝮蛇蛇毒对照品，用水溶解并稀释制成每1ml中含10mg的溶液，3000rpm、8℃离心15分钟，取上清液，过滤，即得供试品和对照品溶液；
(2)指纹图谱检测：分别取20μl供试品和对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算供试品图谱与对照品图谱相似度；
其中所述色谱条件包括：
色谱柱：安捷伦C8柱；
进样体积：20μl；
检测波长：280nm；
流速：1ml/min；
样品盘温度：8℃；
柱温：25℃；
流动相：A-0.1％TFA的水溶液，B-0.1％TFA的乙腈溶液；
按以下梯度进行梯度洗脱：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)对照品的指纹图谱包括9个特征峰，相对保留时间的规定值为：0.4337为峰1、0.4466为峰2、0.4648为峰3、1.1912为峰5、1.5852为峰6、1.5997为峰7、1.7864为峰8、1.8244为峰9，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)进一步包括：采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行计算，供试品图谱与对照品图谱相似度不得低于0.90。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)进一步包括供试品图谱与对照品图谱相似度不得低于0.95。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述流动相为A-0.1％TFA水溶液、B-0.1％TFA乙腈溶液。
14.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)进一步包括：所述溶剂为水；溶解并稀释制成每1ml中含2～20mg的供试品或对照品的溶液。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)进一步包括：所述溶剂为水；溶解并稀释制成每1ml中含10mg的供试品或对照品的溶液。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)色谱条件进一步包括：检测波长为280nm。
17.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)色谱条件进一步包括：所述辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱为安捷伦C8柱，规格为4.6×250mm，5um；孔径300A。
18.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)色谱条件进一步包括：柱温为25℃。
19.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)色谱条件进一步包括：上样量为20μl，样品盘温度为8-16℃，流速为1ml/min。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)色谱条件进一步包括：上样量为20μl，样品盘温度为8℃，流速为1ml/min。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101063117A (zh) * 2007-05-15 2007-10-31 锦州奥鸿药业有限责任公司 白眉蛇毒血凝酶及其提取方法与应用
CN101539555A (zh) * 2008-03-18 2009-09-23 上海医药工业研究院 蛇毒指纹图谱的建立方法及其指纹图谱
CN104498464A (zh) * 2014-12-24 2015-04-08 锦州奥鸿药业有限责任公司 一种从白眉蝮蛇蛇毒中提取白眉蛇毒血凝酶的方法
CN111896651A (zh) * 2020-07-30 2020-11-06 山东大学 一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101063117A (zh) * 2007-05-15 2007-10-31 锦州奥鸿药业有限责任公司 白眉蛇毒血凝酶及其提取方法与应用
CN101539555A (zh) * 2008-03-18 2009-09-23 上海医药工业研究院 蛇毒指纹图谱的建立方法及其指纹图谱
CN104498464A (zh) * 2014-12-24 2015-04-08 锦州奥鸿药业有限责任公司 一种从白眉蝮蛇蛇毒中提取白眉蛇毒血凝酶的方法
CN111896651A (zh) * 2020-07-30 2020-11-06 山东大学 一种白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
反相高效液相色谱法鉴别不同来源降纤酶;矫筱蔓;王全一;战祥友;;中国药师(第11期);第1740-1741页 *
蝮蛇蛇毒蛋白指纹图谱研究及应用;苏恒;魏晓东;赵文杰;冯军;顾敏;;中国医药工业杂志(第04期);第288-291页 *
长白山白眉蝮蛇蛇毒中类凝血酶的分离纯化方法研究;钟读波;吴远双;余旭亚;孟庆雄;;中国药房(第36期);第2825-2828页 *
长白白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的纯化及质量检测;杨帆, 许航, 郭慧云, 曹海石, 刘兰英;中国生物制品学杂志(第02期);第100-102页 *

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