CN107677760A - 羊角的薄层色谱鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羊角的薄层色谱鉴别方法，通过分别鉴别羊角胆固醇成分和亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸成分的薄层色谱，鉴别羊角。本发明操作方便、设备简单、显色容易，同时展开速率快，规范了羊角的鉴别方法。
Description
技术领域
本发明涉及中医药鉴别技术领域，具体是羊角的薄层色谱鉴别方法。
背景技术
羊角为牛科动物山羊Capra hircus L. 的角，宰杀羊时，锯取其角，干燥即得。羊角呈扭曲的长锥形，略呈弓形，一面较平或略向内凹，一面凸起，长15～30cm，基部直径约3～5cm。表面灰黑色、灰白色、棕黑色或淡棕色。先端具纵纹或纵裂纹。自基部向上有7～20个较密集的波状环脊，脊间距约0.5cm。基部切面扁圆形，角塞中部呈空洞状，污白色或黄白色，骨质；角鞘灰黑色或灰白色，角质。质坚硬。气微腥，味淡。羊角的化学成分包括甾族及磷脂类成分与角蛋白、多肽及氨基酸类成分，甾族及磷脂类成分：胆固醇、卵磷脂、脑磷脂、神经鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇等；角蛋白、多肽及氨基酸类成分：天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸等游离氨基酸。羊角具有增强抵抗流感病毒和提高机体免疫功能的作用，解热、降压作用，对中枢神经的抑制作用，对平滑肌的作用。羊角经常被制作成梳子、吊坠等，也可以入药，如羊角是复方羊角片的主要成分。羊角的药用价值越来越被人们所重视，但是至今关于羊角的鉴别方法却少有报道，羊角的质量检测标准也没有得到规范。
发明内容
基于此，本发明提供了一种羊角的薄层色谱鉴别方法，通过分别鉴别羊角胆固醇成分和亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸成分的薄层色谱，鉴别羊角。本发明操作方便、设备简单、显色容易，同时展开速率快，规范了羊角的鉴别方法。
为实现上述技术目的，具体鉴别方法包括以下步骤：
（1）收集样品，确定对照药材，然后对样品进行粉碎处理，并过二号筛，备用；
（2）考察样品的适用性，主要考察水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物四项指标，分别根据《中国药典》2015年版四部通则里0832第二法、2302项下总灰分测定法、2302项下酸不溶性灰分测定法和2201项测定，拟定指标的限度；
（3）含量测定：羊角为动物药，富含氨基酸、蛋白质，参照《中国药典》2015年版四部通则0704氮测定法第二法测定羊角总氮含量，拟定总氮含量的限度；
（4）羊角胆固醇成分薄层色谱鉴别：取样品粉末1g，加乙醇10mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取胆固醇对照品适量，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验,吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（15:2:1:0.6）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
耐用性实验考察：采用点状点样对不同薄层板、不同展开温度：28℃、4℃和不同相对湿度76%、32%进行考察；
（5）羊角甘氨酸、缬氨酸和亮氨酸成分薄层色谱鉴别：取样品粉末1g，加70%乙醇30mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加70%乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取羊角对照药材1g，同法制成对照药材溶液。取甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品适量，分别加70%乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验, 吸取供试品溶液和对照药材溶液各5～10μL，对照品溶液1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（3:1:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，105℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
耐用性实验考察：采用点状点样对不同薄层板、不同展开温度：28℃、4℃和不同相对湿度76%、32%进行考察。
本发明的有益效果是：
本发明采用薄层色谱鉴别方法，通过分别鉴别羊角胆固醇成分和亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸成分的薄层色谱，鉴别羊角。本发明操作方便、设备简单、显色容易，同时展开速率快，规范了羊角的鉴别方法。
本发明先考察样品的水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物、测定羊角总氮含量，拟定了样品中水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物和总氮含量的限值，规范了鉴别标准，提高了鉴别的准确性。本发明还进行了耐用性实验考察，结果均表明本发明方法的耐用性良好，放宽了本发明方法的适用条件；经考察，羊角对照药材色谱中除胆固醇斑点外无其它明显的斑点，因此鉴别羊角胆固醇成分薄层色谱时删除了对照药材作对照，只做胆固醇对照品，节省了对照药材，也简化了操作。
附图说明
图1为羊角药材；
图2为羊角粉末显微特征图；
图3为采用烟台市化学工业研究院生产的硅胶G薄层预制板（批号：110313；规格：20cm×20cm），在圆点状点样：5μL，温度：30℃，相对湿度：69%，展距：16cm条件下的羊角样品薄层色谱图，图中1表示YJ-1，2表示YJ-2，3表示YJ-3，4表示胆固醇对照品，5表示YJ-4，6表示YJ-5，7表示YJ-6，8表示YJ-7，9表示YJ-8，10表示胆固醇对照品，11表示YJ-9，12表示YJ-10，A为蓝紫色荧光斑点；
图4为采用青岛海洋化工有限公司生产的硅胶G薄层预制板（批号：20160715），在圆点状点样：5μL，温度：28℃，相对湿度：76%，展距：8.5cm条件下的羊角样品薄层色谱图，图中1表示YJ-2，2表示YJ-5，3表示YJ-8，4表示羊角对照药材，5表示胆固醇对照品，6表示乙醇，A为蓝紫色荧光斑点；
图5为采用烟台市化学工业研究院生产的硅胶G薄层预制板（批号：20140616），在圆点状点样：5μL，温度：28℃，相对湿度：76%，展距：8.5cm条件下的羊角样品薄层色谱图，图中1表示YJ-2，2表示YJ-5，3表示YJ-8，4表示胆固醇对照品，A 为蓝紫色荧光斑点；
图6为采用MERCK生产普通硅胶G薄层预制板（批号：HX67912426），在圆点状点样：5μL，温度：28℃，相对湿度：76%，展距：8.5cm条件下的羊角样品薄层色谱图，图中1表示YJ-2，2表示YJ-5，3表示YJ-8，4表示胆固醇对照品，A 为蓝紫色荧光斑点；
图7为采用青岛海洋化工有限公司生产的硅胶G薄层预制板（批号：20160715），在圆点状点样：5μL，温度：4℃，相对湿度：76%，展距：8.5cm条件下的羊角样品薄层色谱图，图中1表示YJ-2，2表示YJ-5，3表示YJ-8，4表示胆固醇对照品，A 为蓝紫色荧光斑点；
图8为采用青岛海洋化工有限公司生产的硅胶G薄层预制板（批号：20160715），在圆点状点样：5μL，温度：28℃，相对湿度：32%，展距：8.5cm条件下的羊角样品薄层色谱图，图中1表示YJ-2，2表示YJ-5，3表示YJ-8，4表示胆固醇对照品，A 为蓝紫色荧光斑点；
图9为采用青岛海洋化工厂分厂生产的硅胶G薄层预制板（批号：20140808；规格：10cm×20cm），在圆点状点样：供试品溶液和对照药材溶液各10μL、对照品溶液1μL，温度：28℃，相对湿度：59%，展距：8.5cm条件下的羊角样品薄层色谱图，图中1表示甘氨酸对照品，2表示缬氨酸对照品，3表示亮氨酸对照品，图中4表示YJ-1，5表示YJ-2， 6表示YJ-3，7表示YJ-4，8表示YJ-5， 9表示YJ-6， 10表示YJ-7， 11表示YJ-8， 12表示YJ-9，13表示YJ-10，A、B、C、D均为红色斑点；
图10为采用青岛海洋化工有限公司生产的硅胶G薄层预制板（批号：20160715），在圆点状点样：供试品溶液和对照药材溶液各10μL、对照品溶液1μL，温度：28℃，相对湿度：76%，展距：8.5cm条件下的羊角样品薄层色谱图，图中1表示YJ-2，2表示亮氨酸对照品，3表示YJ-5，4表示缬氨酸对照品，5表示YJ-8，6表示甘氨酸对照品，7表示羊角对照药材，8表示70%乙醇，A、B、C、D 均为红色斑点；
图11为采用烟台市化学工业研究院生产的硅胶G薄层预制板（批号：20140616），在圆点状点样：供试品溶液和对照药材溶液各10μL、对照品溶液1μL，温度：28℃，相对湿度：76%，展距：8.5cm条件下的羊角样品薄层色谱图，图中1表示YJ-2，2表示YJ-5，3表示亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸（自上而下），4表示YJ-8，5表示羊角对照药材，A、B、C、D 均为红色斑点；
图12为采用MERCK生产普通硅胶G薄层预制板（批号：HX67912426），在圆点状点样：供试品溶液和对照药材溶液各10μL、对照品溶液1μL，温度：28℃，相对湿度：76%，展距：8.5cm条件下的羊角样品薄层色谱图，图中1表示YJ-2，2表示YJ-5，3表示亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸（自上而下），4表示YJ-8，5表示羊角对照药材，A、B、C、D 均为红色斑点；
图13为采用青岛海洋化工有限公司生产的硅胶G薄层预制板（批号：20160715），在圆点状点样：供试品溶液和对照药材溶液各10μL、对照品溶液1μL，温度：4℃，相对湿度：76%，展距：8.5cm条件下的羊角样品薄层色谱图，图中1表示YJ-2，2表示YJ-5，3表示亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸（自上而下），4表示YJ-8，5表示羊角对照药材，A、B、C、D 均为红色斑点；
图14为采用青岛海洋化工有限公司生产的硅胶G薄层预制板（批号：20160715），在圆点状点样：供试品溶液和对照药材溶液各10μL、对照品溶液1μL，温度：28℃，相对湿度：32%，展距：8.5cm条件下的羊角样品薄层色谱图，图中1表示YJ-2，2表示YJ-5，3表示亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸（自上而下），4表示YJ-8，5表示羊角对照药材，A、B、C、D 均为红色斑点。
具体实施方式
为了更加详细的介绍本发明，下面结合实施例，对本发明做进一步说明。
实施例，内容如下：
（1）收集样品共10批，详细信息见表1及图1～2。
表1 羊角样品信息一览表
羊角样品YJ-2、YJ-5和YJ-8经广西大学动物科学技术学院李兴芳高级实验师检定，结果确定为牛科动物山羊Capra hircus L.的角，实验中以YJ-2作为羊角的对照药材与其他样品进行对比。完成样品收集后，将所有10批样品，进行粉碎处理，并过二号筛，备用。
（2）考察样品的适用性，主要考察水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物四项指标，分别根据《中国药典》2015年版四部通则里0832第二法、2302项下总灰分测定法、2302项下酸不溶性灰分测定法和2201项测定，测定结果见表2；
表2 沙牛水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物测定结果一览表
根据上表考察结果，考虑药材来源差异情况，拟定样品水分为不超过12.0％，总灰分为不超过26.0％，酸不溶性灰分为不超过0.20％，浸出物含量为不少于2.0%。
（3）含量测定：羊角为动物药，富含氨基酸、蛋白质，参照《中国药典》2015年版四部通则0704氮测定法第二法测定羊角总氮含量。10批羊角总氮含量测定结果详见表3。
表3 羊角总氮含量测定结果一览表
由上表结果可知，羊角10批样品总氮含量最高为128.1mg/g，最低为110.4mg/g，平均值为121.6mg/g，考虑药材来源差异情况，拟定限度为：样品每1g含总氮(N)不得少于90mg。
（2）羊角胆固醇成分薄层色谱鉴别：取样品粉末1g，加乙醇10mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取胆固醇对照品适量，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验, 吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（15:2:1:0.6）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。10批样品按本方法检验，均符合规定，且薄层色谱分离效果好，斑点圆整清晰，比移值适中，重现性好，见图3。
耐用性实验考察：采用点状点样①对不同薄层板进行考察，见图4～6；②对不同展开温度：28℃、4℃进行考察，见图4、7；③对不同相对湿度76%、32%进行考察，见图4、8；结果均表明本法的耐用性良好。
（3）羊角甘氨酸、缬氨酸和亮氨酸成分薄层色谱鉴别：取样品粉末1g，加70%乙醇30mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加70%乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液。另取羊角对照药材1g，同法制成对照药材溶液。取甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品适量，分别加70%乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验, 吸取供试品溶液和对照药材溶液各5～10μL，对照品溶液1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（3:1:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，105℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。10批样品按本法检验，均符合规定，且薄层色谱分离效果好，斑点圆整清晰，比移值适中，重现性好。见图9。
耐用性实验考察：采用点状点样①对不同薄层板进行考察，见图10～12；②对不同展开温度：28℃、4℃进行考察，见图10、13；③对不同相对湿度76%、32%进行考察，见图10、14；结果均表明本法的耐用性良好。
Claims (2)
1.羊角的薄层色谱鉴别方法，其特征在于，所述鉴别方法包括以下内容：
（1）收集样品，确定对照药材，然后对样品进行粉碎处理，并过二号筛，备用；
（2）考察样品的适用性，主要考察水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物四项指标，均根据《中国药典》2015年版四部通则的检测方法进行检测；
（3）含量测定：参照《中国药典》2015年版四部通则0704氮测定法第二法测定羊角总氮含量；
（4）羊角胆固醇成分薄层色谱鉴别：取样品粉末1g，加乙醇10mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取胆固醇对照品适量，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点清晰，置紫外光灯下检视；
（5）羊角甘氨酸、缬氨酸和亮氨酸成分薄层色谱鉴别：取样品粉末1g，加70%乙醇30mL，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加70%乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取羊角对照药材1g，同法制成对照药材溶液；取甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品适量，分别加70%乙醇制成每1mL含1mg对照品的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2015年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各5～10μL，对照品溶液1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，105℃加热至斑点清晰。
2.权利要求1所述的薄层色谱鉴别方法，其特征在于，所述鉴别方法还包括耐用性实验考察：采用点状点样对不同薄层板、不同展开温度：28℃、4℃和不同相对湿度：76%、32%进行考察。
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