CN111398482A - 鸡内金的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鸡内金的检测方法，包括以下步骤：提供待测样品；采用液质联用技术(ESI+)检测所述待测样品，获取一级质谱；根据一级质谱中是否中含有质荷比为563.8的分子离子峰，确定待测样品中是否含有鸡内金。该鸡内金的检测方法具有较强的专属性，能够快速准确地鉴别出待测样品中鸡内金的真伪。

Description

鸡内金的检测方法
技术领域
本发明涉及中药检测技术领域，特别涉及鸡内金的检测方法。
背景技术
鸡内金为雉科动物家鸡Callus gallusdomesticusBrisson的干燥沙囊内壁。杀鸡后，取出鸡肫，立即剥下内壁，洗净，干燥。性味甘，平。归脾、胃、小肠、膀胱经。有健胃消食，涩精止遗，通淋化石的功效。常用于食积不消，呕吐泻痢，小儿疳积，遗尿，遗精，石淋涩痛，胆胀胁痛。
鸡内金的药材及其饮片的质量标准收载于2015年版《中国药典》一部，其质量标准只有性状、水分、总灰分以及浸出物，并未规定鉴别项目。鸭、鹅、鸽的砂囊与鸡内金比较相似，常常作为伪品加入到鸡内金药材中，尤其干燥后易碎，难以区分，但鸡内金在临床上使用多以汤剂为主，当鸡内金饮片煮成汤剂或制成配方颗粒后，失去了原有的性状，无法与鸭内金、鹅内金以及鸽内金的汤剂进行区别。
目前，很少有文献报道鸡内金与鸭内金、鹅内金、鸽内金的专属鉴别，主要都是从性状上进行区分，如邹烘来等《鸡内金与鸭内金、鹅内金的鉴别》以及刘小专的《怎样鉴别鸡内金与鸭内金》等均是从药材的性状进行鉴别。陈振德等使用蛋白多肽高效毛细管电泳法鉴别鸡内金与鸭内金，即通过鸡内金与鸭内金的HPCE图谱差异来进行鉴定；吕武清等则通过淀粉酶、蛋白酶的活力，氨基酸和微量元素含量差异，来鉴定鸡、鸭、鹅内金。但上述检测方法不具有专属性，且准确性较低，很难准确区分鸡内金与鸭内径、鹅内金或鸽内金，继而无法实现快速准确地鉴别出待测样品中鸡内金的真伪的目的，特别是对于标准汤剂样品，难度更大。
发明内容
基于此，有必要提供一种鸡内金的检测方法，该鸡内金的检测方法具有较强的专属性，能够快速准确地鉴别出待测样品中鸡内金的真伪。
一种鸡内金的检测方法，包括以下步骤：
提供待测样品；
采用液质联用技术(ESI+)检测所述待测样品，获取一级质谱图；
根据所述一级质谱中是否中含有质荷比为563.8的分子离子峰，确定所述待测样品中是否含有鸡内金。
在其中一实施例中，当所述一级质谱中含有质荷比为563.8的分子离子峰时，所述确定所述待测样品中是否含有鸡内金的步骤还包括：
根据所述一级质谱，获取质荷比为563.8的分子离子峰的二级质谱的步骤；
及根据所述二级质谱，确定所述待测样品中是否含有鸡内金；
当所述二级质谱包含有质荷比为341.1和786.4的碎片峰，则确定所述待测样品中含有鸡内金。
在其中一实施例中，所述质荷比为563.8的分子离子峰的保留时间为(12.31±1)min。
在其中一实施例中，所述液质联用技术中，所采用的流动相包括A相和B相，其中，A相为乙腈，B相为0.08wt％～0.12wt％的甲酸水溶液。
在其中一实施例中，所述流动相的流速为0.2mL/min～0.5mL/min，且所述流动相的洗脱梯度为：
在0～3min，A相的体积百分含量从3％逐步升至8％，B相的体积百分含量从97％逐步降至92％；
在3min～20min，A相的体积百分含量从8％逐步升至14％，B相的体积百分含量从92％逐步降至86％；
在20min～22min，A相的体积百分含量从14％逐步升至32％，B相的体积百分含量从86％逐步降至68％；
在22min～22.1min，A相的体积百分含量从32％逐步升至100％，B相的体积百分含量从68％逐步降至0；
在22.1min～26min，A相的体积百分含量为100％，B相的体积百分含量为0；
在26min～26.1min，A相的体积百分含量为100％逐步降至3％，B相的体积百分含量为0逐步升至97％。
在其中一实施例中，所述液质联用技术中，色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEHC18，柱温为25℃～40℃，进样量为1.8μL～2.2μL。
在其中一实施例中，所述待测提供样品的步骤包括以下步骤：
将待测药材与碳酸氢铵溶液混合，固液分离，得滤液；
将胰蛋白酶和碳酸氢铵溶液混合，制得胰蛋白酶溶液；
将所述滤液和所述胰蛋白酶溶液混合，酶解，制得所述待测样品。
在其中一实施例中，所述待测药材为待测标准汤剂，所述将待测药材与碳酸氢铵溶液混合的步骤包括以下步骤：
将0.1g待测标准汤剂与50mL质量百分含量为0.8％～1.2％碳酸氢铵溶液混合，超声处理20min～40min。
在其中一实施例中，将所述将胰蛋白酶和碳酸氢铵溶液混合的步骤中，每1mL所述胰蛋白酶溶液含0.9～1.1mg胰蛋白酶；和/或
将所述滤液和所述胰蛋白酶溶液混合的步骤中，每0.1g所述待测药材与8μL～12μL所述胰蛋白酶溶液混合。
在其中一实施例中，上述鸡内金的检测方法还包括提供对照样品及采用液质联用技术检测所述对照样品以作为所述待测样品的标准对照的步骤，其中，所述提供对照样品的步骤包括以下步骤：
将0.1g鸡内金对照药材与10mL的0.8wt％～1.2wt％碳酸氢铵溶液混合，加热回流20min～40min，固液分离，收集滤液；
将胰蛋白酶和0.8wt％～1.2wt％碳酸氢铵溶液混合，制得胰蛋白酶溶液；
将所述滤液和所述胰蛋白酶溶液混合，37℃±0.2℃的条件下进行酶解，制得所述对照样品。
本发明技术人员通过研究发现，仅鸡内金存在质荷比为563.8的分子离子峰，鸭内金、鹅内金和鸽内金均无该分子离子峰，可以通过该特征峰有效地辨别样品是否含有鸡内金，进而可以有效地辨别药材的真伪。上述方法为专属性检测方法，为鸡内金的质量评价研究提供科学的实验依据，特别适用于鸡内金标准汤剂的检测，可以在质量上实现鸡内金标准汤剂的专属性鉴别，能够弥补标准汤剂由于不具饮片外观性状而造成鉴别不准确的缺陷，降低混伪品给中药市场带来的不良影响，确保公众用到优质、正品鸡内金制剂产品。同时也建立了一种简单、可靠的鸡内金标准汤剂的检测方法。
附图说明
图1为鸡内金、鹅内金、鸭内金和鸽内金标准汤剂的在高分辨质谱仪中获取的质谱图；
图2为图1中鸡内金汤剂中m/z为563.8的二级离子质谱图；
图3为15批次的鸡内金标准汤剂的质谱图；
图4为鸡内金对照药材溶液在三重四级杆质谱仪中获得的质谱图；
图5为对照药材溶液D-1、待测样品溶液G-1～G-4专属性图谱(563.79＞786.44)；
图6为对照药材溶液D-1、待测样品溶液G-1～G-4专属性图谱(563.79＞341.14)；
图7为对照药材溶液D-2、待测样品溶液G-5～G-8专属性图谱(563.79＞786.44)；
图8为对照药材溶液D-2、待测样品溶液G-5～G-8专属性图谱(563.79＞341.14)；
图9为对照药材溶液D-3、待测样品溶液G-9～G-12专属性图谱(563.79＞786.44)；
图10为对照药材溶液D-3、待测样品溶液G-9～G-12专属性图谱(563.79＞341.14)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施方式的鸡内金检测方法，包括以下步骤：
S101：提供待测样品；
可以理解的，可以根据待测药材的性状、剂型等对药材进行一定的预处理，制得可供液质联用技术(ESI+)检测的样品，具体处理方法无特别限定，仅需能够供液质联用仪器检测即可，具体可以根据药材性状及其仪器设备要求进行选择，应理解为均在本发明的保护范围内。
进一步地，优选采用以下方法获取待测样品：
S1011：将待测药材与碳酸氢铵溶液混合，固液分离，得滤液；
进一步地，将待测药材制成粉末状，以提高药材中相关组分的溶出率。更进一步地，优选采用冻干的方法对待测药材进行处理，制得冻干粉末。进一步地，待测药材为中药饮片。
进一步地，待测药材为待测标准汤剂。
更进一步地，每0.1g待测标准汤剂与10mL～50mL的0.8wt％～1.2wt％的碳酸氢铵溶液混合。
更进一步地，步骤S1011包括以下步骤：将0.1g待测标准汤剂与50mL的0.8wt％～1.2wt％碳酸氢铵溶液混合，超声处理(优选超声功率为250W，频率为50KHz)20min～40min。更进一步地，优选采用质量百分含量为1％的碳酸氢铵溶液。
S1012：将胰蛋白酶和碳酸氢铵溶液混合，制得胰蛋白酶溶液；
进一步地，优选步骤S1012中碳酸氢氨溶液的质量百分含量0.8％～1.2％；更进一步地，优选步骤S1012中碳酸氢氨溶液的质量百分含量与步骤S1011中的碳酸氢氨溶液相同。
进一步地，优选步骤S1012中，每1mL胰蛋白酶溶液含0.9～1.1mg胰蛋白酶。
S1013：将滤液和胰蛋白酶溶液混合，酶解，制得待测样品。
进一步地，优选步骤S1013中，每0.1g待测药材与8μL～12μL胰蛋白酶溶液混合。进一步地，步骤S1013中酶解温度为37℃±0.2℃；酶解时间可以根据具体情况进行调整，在此不进行特别限定，优选酶解时间为8～16h。
S102：提供对照样品；
可理解的，步骤S102可以根据情况予以省略，不应理解为对本发明的限制。优选还包括步骤S102，以提高测试的准确性。通过先对对照样品进行检测，确定含有所需分子离子峰的保留时间，再测试待测样品，检测与对照样品相同保留时间处是否存在相应的分子离子峰。
对照样品的制备方法优选采用与待测样品类似的方法，以排除溶剂等因素的影响，进一步地，对照样品的制备包括以下步骤：
S1021：将鸡内金对照药材与0.8wt％～1.2wt％碳酸氢铵溶液混合，加热回流20min-40min，固液分离，收集滤液；
优选每0.1g鸡内金对照药材与10mL质量百分含量为0.8％～1.2％碳酸氢铵溶液混合；更进一步地，优选采用质量百分含量为1％的碳酸氢铵溶液。
S1022：将胰蛋白酶和0.8wt％～1.2wt％碳酸氢铵溶液混合，制得胰蛋白酶溶液；
步骤S1022同步骤S1012，在此不再进行赘述。
S1023：将滤液和胰蛋白酶溶液混合，酶解，制得对照样品。
步骤S1023同步骤S1013，在此不再进行赘述。
S103：采用液质联用技术(ESI+)检测待测样品，获取一级质谱图；根据一级质谱中是否中含有质荷比为563.8的分子离子峰，确定待测样品中是否含有鸡内金。
可理解的，当提供有对照样品时，在检测待测样品前，还包括检测对照样品的步骤，即可以先对对照样品进行检测，确定对照样品中含有质荷比为563.8的分子离子峰的保留时间，然后再测试待测样品，获取一级质谱图，观察一级质谱图中在和对照样品相同的保留时间内是否含有质荷比为563.8的分子离子峰，当一级质谱中含有质荷比(m/z)为563.8的分子离子峰，则判定待测样品中含有鸡内金。
需要说明的是，本发明的质荷比为563.8的分子离子峰带有两个电荷，即z为2。
本发明技术人员通过研究发现，仅鸡内金存在质荷比为563.8的分子离子峰，鸭内金、鹅内金和鸽内金均无该分子离子峰，可以通过该特征峰有效地辨别样品是否为鸡内金，成功地构建得到鸡内金质谱鉴别的专属性检测方法，为鸡内金的质量评价研究提供科学的实验依据，特别适用于鸡内金标准汤剂的检测，可以在质量上实现鸡内金标准汤剂的专属性鉴别，能够弥补标准汤剂由于不具饮片外观性状而造成鉴别不准确的缺陷，降低混伪品给中药市场带来的不良影响，确保公众用到优质、正品鸡内金制剂产品。同时也建立了一种简单、可靠的鸡内金标准汤剂的检测方法。
进一步地，质荷比为563.8的分子离子峰的保留时间为(12.31±1)min。需要说明的是，测量仪器不同，保留时间存在一定的差异，不应理解为对本发明的限制，保留时间为(12.31±1)min是指在该时间区间内的某一时间点存在质荷比为563.8的分子离子峰。在进行检测时，可以采用对照样品，并使对照样品和待测样品的保留时间一致即可。
S104：当一级质谱中含有质荷比为563.8的分子离子峰时，根据一级质谱，获取质荷比为563.8的分子离子峰的二级质谱，根据二级质谱，确定待测样品中是否含有鸡内金；当二级质谱包含有质荷比为341.1和786.4的碎片峰，则确定待测样品中含有鸡内金。
通过在一级质谱的质荷比为563.8的分子离子峰基础上再做二级质谱，确定相应的碎片峰，能够有效地提高测试的准确性。
本发明中的液质联用技术应理解为本领域的常规解释，即液相色谱-质谱联用技术，具体仪器型号及其规格无特别限定，可以根据需要采用现有的仪器设备，例如：高分辨质谱仪、三重四极杆液质联用仪等。
进一步地，液质联用技术中，色谱条件为：流动相包括A相和B相，其中，A相为乙腈，B相为0.08％～0.12％(优选0.1％)的甲酸水溶液；进一步地，流动相流速为0.2mL/min～0.5mL/min，优选为0.3mL/min；流动相的洗脱梯度为：在0～3min，A相的体积百分含量从3％逐步升至8％，B相的体积百分含量从97％逐步降至92％；在3min～20min,A相的体积百分含量从8％逐步升至14％，B相的体积百分含量从92％逐步降至86％；在20min～22min,A相的体积百分含量从14％逐步升至32％，B相的体积百分含量从86％逐步降至68％；在22min～22.1min,A相的体积百分含量从32％逐步升至100％，B相的体积百分含量从68％逐步降至0；在22.1min～26min,A相的体积百分含量为100％，B相的体积百分含量为0；在26min～26.1min,A相的体积百分含量为100％逐步降至3％，B相的体积百分含量为0逐步升至97％。
更进一步地，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，柱温为25℃～40℃，进样量为1.8μL～2.2μL(优选2μl)。
上述鸡内金检测方法具有较强的专属性，能够快速准确地鉴别出待测样品中鸡内金的真伪。且不受药材性状的影响，即使为不具饮片外观性状也能得到很好地鉴别，相比于药材性状鉴定法，准确度更高，且检测速度更快；相比于HPCE鉴定法、微量元素鉴定法等，具有更广的应用空间，且检测效率更高，适宜广泛应用于鸡内金药材真伪辨别，特别是不具饮片外观性状的标准汤剂的鉴别。
下面列举具体实施例来对本发明进行说明。
实施例1：检测方法的建立
1.仪器与试药
1.1仪器
电子天平Mettler Toledo XP205DR(d＝0.01mg)、Mettler Toledo MS204S(d＝0.1mg)、高频数控超声波清洗器(KQ-300TD，昆山市超声仪器有限公司)Simplicity UV纯水机(Millipore)；Waters UPLC-Xevo TQ-S三重四极杆液质联用仪(沃特世公司)；Thermo-QE高分辨质谱仪；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；药品稳定性验箱(重庆市永生实验仪器厂)。
1.2试药
鸡内金对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121153-201002)；胰蛋白酶(中国药品生物制品检定所，批号：615-200206)；乙腈(默克公司，色谱级，批号：SY21908005)；碳酸氢铵(CNW，色谱级，批号：79060010)；甲酸(CNW，色谱级，批号：82940090)水为超纯水。
物料批号和产地信息见下表1：
表1
品名 饮片批号 标准汤剂批号 产地
鸡内金 GP1804017 GT11804017 山东省临沂市平邑县
鸡内金 GP1804018 GT11804018 山东省临沂市
鸡内金 GP1805097 GT11805097 山东菏泽鄄城舜王城
鸡内金 GP1805098 GT11805098 山东菏泽鄄城舜王城
鸡内金 GP1805099 GT11805099 山东临沂平邑县
鸡内金 GP1805100 GT11805100 浙江省金华市磐安县
鸡内金 GP1805119 GT11805119 浙江省金华市磐安县
鸡内金 GP1805120 GT11805120 山东聊城莘县朝城
鸡内金 GP1805121 GT11805121 山东聊城莘县朝城
鸡内金 GP1805122 GT11805122 山东聊城莘县朝城
鸡内金 GP1805123 GT11805123 辽宁省鞍山市
鸡内金 GP1805124 GT11805124 辽宁省鞍山市
鸡内金 GP1810259 GT11810259 辽宁省鞍山市
鸡内金 GP1810260 GT11810260 辽宁省鞍山市
鸡内金 GP1810261 GT11810261 辽宁省鞍山市
鸭内金 GP1911501 GT11911501 广东省佛山市里水镇新天地市场
鸭内金 GP1911502 GT11911502 广东省佛山市和顺金溪市场
鸭内金 GP1912501 GT11912501 广东省佛山市和顺金溪市场
鹅内金 GP1911503 GT11911503 广东省佛山市里水镇新天地市场
鹅内金 GP1911504 GT11911504 广东省佛山市和顺金溪市场
鹅内金 GP1912502 GT11912502 广东省佛山市和顺金溪市场
鸽内金 GP1911505 GT11911505 广东省佛山市里水镇新天地市场
鸽内金 GP1911506 GT11911506 广东省佛山市和顺金溪市场
鸽内金 GP1912503 GT11912503 广东省佛山市和顺金溪市场
2.方法与结果
2.1色谱质谱条件
Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(150mm×2.1mm，1.7μm)；流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液梯度洗脱(梯度洗脱如表2)；柱温为30℃，流速为0.3ml/min。电喷雾正离子模式(ESI+)，进行多反应监测(MRM)，选择质荷比(m/z)563.8(双电荷)→341.1和563.8(双电荷)→786.4作为检测离子对。进样2μl，按上述检测离子对测定的MRM色谱峰的信噪比均应大于3:1。
表2
时间(min) 乙腈(％) 0.1％甲酸(％)
0～3 3→8 97→92
3～20 8→14 92→86
20～22 14→32 86→68
22→22.1 32→100 68→0
22.1→26 100 0
26→26.1 100→3 0→97
2.2对照药材溶液的制备：
称取鸡内金对照药材粉末(中国食品药品检定研究院，批号：121153-201002)0.5g，加1％碳酸氢铵溶液50mL，加热回流30分钟，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液100μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液(取胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液溶解，制成每1mL中含1mg的溶液，临用前现配制)10μL，摇匀，37℃恒温酶解12h，即得，记为D-1。
2.3待测样品溶液的制备：
取本品适量，分别为鸡内金标准汤剂(GT11804017)、鹅内金标准汤剂(GT11911503)、鸭内金标准汤剂(GT11911501)及鸽内金标准汤剂(GT11911505)，分别按以下方法进行处理：
将各待测样品研细，取约0.1g，加1％碳酸氢铵溶液50mL，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，用0.22μm微孔滤膜滤过，精密移取100μL置微量进样瓶中，分别加胰蛋白酶溶液10μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，即得，分别为G-1(鸡内金标准汤剂)、G-2(鹅内金标准汤剂)、G-3(鸭内金标准汤剂)和G-4(鸽内金标准汤剂)。
2.4测定法
分别精密吸取对照药材溶液与待测品溶液各2μl，注入液相色谱仪，测定。以质荷比(m/z)563.8(双电荷)→341.1和563.8(双电荷)→786.4离子对提取的待测品离子流色谱中，应同时呈现与对照药材色谱保留时间一致的色谱峰。
2.5特征分子离子峰及离子对的选择
电喷雾正离子模式(HESI+)，鞘气流速：10L/min；辅助气流速：5L/min；喷雾电压：3.30kV；毛细管温度：320℃；辅助气温度：320℃；进行Full-MS-ddms2模式扫描，比较鸡内金标准汤剂、鸭内金标准汤剂、鹅内金标准汤剂及鸽内金标准汤剂样品所得质谱图谱。
如图1所示，可以确定了鸡内标准金汤剂G-1在12.31min处有一特征分子离子峰，m/z为563.8，而其它三种内金(G-2～G-4)在相同的保留时间下未检出此分子离子峰，且如图3所示，15批次的鸡内金标准汤剂(分别为GT11804017、GT11804018、GT11805097、GT11805098、GT11805099、GT11805100、GT11805119、GT11805120、GT11805121、GT11805122、GT11805123、GT11805124、GT11810259、GT11810260、GT11810261)，均能检测出12.31分钟处m/z为563.8的分子离子峰。
如图2所示，通过分析二级离子图谱，选择了质荷比(m/z)563.8(双电荷)→341.1和563.8(双电荷)→786.4作为本鉴别方法的两对离子对，并使用鸡内金对照药材在三重四级杆质谱仪中采用多反应监测(MRM)对特征离子对进行了验证，具体如图4所示。其中，三重四级杆质谱条件：采用电喷雾正离子模式，毛细管温度：150℃，离子源温度：350℃，离子源气流流速：650L/Hr，锥孔电压：40V；碰撞能量：20V。
3.方法学验证
3.1专属性
制备对照药材溶液D-1(中国食品药品检定研究院，批号：121153-201002)的制备：同实施例1中2.2对照药材溶液的制备；
待测样品溶液鸡内金标准汤剂G-1、鹅内金标准汤剂G-2、鸭内金标准汤剂G-3和鸽内金标准汤剂G-4的制备：同实施例1中2.3待测样品溶液的制备；
取对照药材溶液D-1、待测样品溶液G-1、G-2、G-3和G-4分别精密吸取2μL，按“2.1色谱质谱条件”项下方法测定，记录质谱图。以质荷比(m/z)563.8(双电荷)→341.1和563.8(双电荷)→786.4离子对提取的待测品离子流色谱中，测试结果如图5和图6所示，其中，图5为563.8(双电荷)→786.4离子对，图,6为563.8(双电荷)→341.1离子对。
从图5和图6可以看出，正品鸡内金标准汤剂G-1同时呈现与对照药材溶液D-1色谱保留时间一致的色谱峰，而鹅内金标准汤剂G-2、鸭内金标准汤剂G-3及鸽内金标准汤剂G-4均未呈现与对照药材色谱保留时间一致的色谱峰。故通过此检测方法，可有效鉴别正品鸡内金标准汤剂和伪品鹅内金标准汤剂、鸭内金标准汤剂及鸽内金标准汤剂。
实施例2：检测方法的应用
将实施例1中所建立的检测方法同时应用于各批鸡内金饮片的质量控制中，具体如下：
1仪器与试药
1.1仪器
电子天平Mettler Toledo XP205DR(d＝0.01mg)、Mettler Toledo MS204S(d＝0.1mg)、高频数控超声波清洗器(KQ-300TD，昆山市超声仪器有限公司)Simplicity UV纯水机(Millipore)；Waters UPLC-Xevo TQ-S三重四极杆液质联用仪(沃特世公司)；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；药品稳定性验箱(重庆市永生实验仪器厂)。
1.2试药
鸡内金对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121153-201002)；胰蛋白酶(中国食品药品检定研究院，批号：615-200206)；乙腈(默克公司，色谱级，批号：SY21908005)；碳酸氢铵(CNW，色谱级，批号：79060010)；甲酸(CNW，色谱级，批号：82940090)水为超纯水，饮片批号和产地信息见“实施例1”的“物料批号和产地信息见下表”。
2方法与结果
2.1色谱质谱条件
Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(150mm×2.1mm，1.7μm)；流动相为乙腈-0.1％甲酸水溶液梯度洗脱；柱温为30℃，流速为0.3ml/min。电喷雾正离子模式(ESI+)，进行多反应监测(MRM)，选择质荷比(m/z)563.8(双电荷)→341.1和563.8(双电荷)→786.4作为检测离子对。进样2μl，按上述检测离子对测定的MRM色谱峰的信噪比均应大于3:1。
表2
时间(min) 乙腈(％) 0.1％甲酸(％)
0～3 3→8 97→92
3～20 8→14 92→86
20～22 14→32 86→68
22→22.1 32→100 68→0
22.1→26 100 0
26→26.1 100→3 0→97
2.2对照药材溶液的制备：
称取鸡内金对照药材粉末(中国食品药品检定研究院，批号：121153-201002)0.5g，加1％碳酸氢铵溶液50mL，加热回流30分钟，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液100μL，置微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液(取胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液溶解，制成每1mL中含1mg的溶液，临用前现配制)10μL，摇匀，37℃恒温酶解12h，即得。
2.3待测样品溶液的制备：
取鸡内金、鹅内金、鸭内金及鸽内金饮片粉末约0.1g，加1％碳酸氢铵溶液50mL，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，用0.22μm微孔滤膜滤过，精密移取100μL置微量进样瓶中，分别加胰蛋白酶溶液10μL(取序列分析用胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1mL中含1mg的溶液，临用时配制)，摇匀，37℃恒温酶解12小时，即得各内金饮片的待测样品溶液。
2.4测定法
分别精密吸取对照药材溶液和各内金饮片待测品溶液各2μL，按“2.1色谱质谱条件”项下方法测定，记录质谱图。以质荷比(m/z)563.8(双电荷)→341.1和563.8(双电荷)→786.4离子对提取的待测品离子流色谱中，应同时呈现与对照药材色谱保留时间一致的色谱峰。
2.5结果与分析
试验结果显示，以质荷比(m/z)563.8(双电荷)→341.1和563.8(双电荷)→786.4离子对提取的待测品离子流色谱中，测试结果如图7-图10，具体地将图5-图10整理如下：
表3
品名 批号 563.79＞786.44图谱 563.79＞341.1图谱
鸡内金对照药材 121153-201002 图5中D-1 图6中D-1
鸡内金待测饮片 GP1804017 图5中G-1 图6中G-1
鹅内金待测饮片 GP1911503 图5中G-2 图6中G-2
鸭内金待测饮片 GP1911501 图5中G-3 图6中G-3
鸽内金待测饮片 GP1911505 图5中G-4 图6中G-4
鸡内金对照药材 121153-201002 图7中D-2 图8中D-2
鸡内金待测饮片 GP1805097 图7中G-5 图8中G-5
鹅内金待测饮片 GP1911504 图7中G-6 图8中G-6
鸭内金待测饮片 GP1911502 图7中G-7 图8中G-7
鸽内金待测饮片 GP1911506 图7中G-8 图8中G-8
鸡内金对照药材 121153-201002 图9中D-3 图10中D-3
鸡内金待测饮片 GP1805098 图9中G-9 图10中G-9
鹅内金待测饮片 GP1912502 图9中G-10 图10中G-10
鸭内金待测饮片 GP1912501 图9中G-11 图10中G-11
鸽内金待测饮片 GP1912503 图9中G-12 图10中G-12
从图7-图10可以看出，鸡内金饮片同时呈现与对照药材色谱保留时间一致的色谱峰，而鸭内金、鹅内金及鸽内金饮片未检测出于鸡内金对照药材色谱保留时间一致的色谱峰。以此通过此检测方法，也可有效鉴别正品鸡内金饮片和伪品鸭内金、鹅内金及鸽内金饮片。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种鸡内金的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供待测样品；
采用液质联用技术(ESI+)检测所述待测样品，获取一级质谱；
根据所述一级质谱中是否中含有质荷比为563.8的分子离子峰，确定所述待测样品中是否含有鸡内金。
2.根据权利要求1所述的鸡内金的检测方法，其特征在于，当所述一级质谱中含有质荷比为563.8的分子离子峰时，所述确定所述待测样品中是否含有鸡内金的步骤还包括如下步骤：
根据所述一级质谱，获取质荷比为563.8的分子离子峰的二级质谱；
及根据所述二级质谱，确定所述待测样品中是否含有鸡内金；
当所述二级质谱包含有质荷比为341.1和786.4的碎片峰，则确定所述待测样品中含有鸡内金。
3.根据权利要求1所述的鸡内金的检测方法，其特征在于，所述质荷比为563.8的分子离子峰的保留时间为(12.31±1)min。
4.根据权利要求1～3任一项所述的鸡内金的检测方法，其特征在于，所述液质联用技术中，所采用的流动相包括A相和B相，其中，A相为乙腈，B相为0.08wt％～0.12wt％的甲酸水溶液。
5.根据权利要求4所述的鸡内金的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.2mL/min～0.5mL/min，且所述流动相的洗脱梯度为：
在0～3min，A相的体积百分含量从3％逐步升至8％，B相的体积百分含量从97％逐步降至92％；
在3min～20min，A相的体积百分含量从8％逐步升至14％，B相的体积百分含量从92％逐步降至86％；
在20min～22min，A相的体积百分含量从14％逐步升至32％，B相的体积百分含量从86％逐步降至68％；
在22min～22.1min，A相的体积百分含量从32％逐步升至100％，B相的体积百分含量从68％逐步降至0；
在22.1min～26min，A相的体积百分含量为100％，B相的体积百分含量为0；
在26min～26.1min，A相的体积百分含量为100％逐步降至3％，B相的体积百分含量为0逐步升至97％。
6.根据权利要求4所述的鸡内金的检测方法，其特征在于，所述液质联用技术中，色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，柱温为25℃～40℃，进样量为1.8μL～2.2μL。
7.根据权利要求1～3任一项所述的鸡内金的检测方法，其特征在于，所述提供待测样品的步骤包括以下步骤：
将待测药材与碳酸氢铵溶液混合，固液分离，得滤液；
将胰蛋白酶和碳酸氢铵溶液混合，制得胰蛋白酶溶液；
将所述滤液和所述胰蛋白酶溶液混合，酶解，制得所述待测样品。
8.根据权利要求7所述的鸡内金的检测方法，其特征在于，所述待测药材为待测标准汤剂，所述将待测药材与碳酸氢铵溶液混合的步骤包括以下步骤：
将0.1g待测标准汤剂与50mL质量百分含量为0.8％～1.2％碳酸氢铵溶液混合，超声处理20min～40min。
9.根据权利要求7所述的鸡内金的检测方法，其特征在于，将所述胰蛋白酶和碳酸氢铵溶液混合的步骤中，每1mL所述胰蛋白酶溶液含0.9mg～1.1mg胰蛋白酶；和/或
将所述滤液和所述胰蛋白酶溶液混合的步骤中，每0.1g所述待测药材与8μL～12μL所述胰蛋白酶溶液混合。
10.根据权利要求7所述的鸡内金的检测方法，其特征在于，还包括提供对照样品及采用液质联用技术检测所述对照样品以作为所述待测样品的标准对照的步骤，其中，所述提供对照样品的步骤包括以下步骤：
将0.1g鸡内金对照药材与10mL的0.8wt％～1.2wt％碳酸氢铵溶液混合，加热回流20min-40min，固液分离，收集滤液；
将胰蛋白酶和0.8wt％～1.2wt％碳酸氢铵溶液混合，制得胰蛋白酶溶液；
将所述滤液和所述胰蛋白酶溶液混合，37℃±0.2℃的条件下进行酶解，制得所述对照样品。
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