CN101481692B - 无血清制备重组人类凝血因子ⅸ - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组人类凝血因子IX的制备与应用。该重组hFIX蛋白与人类血液来源的hFIX有相同的分子组成和生物活性。用于血友病B小鼠模型可以获得缓解。该重组hFIX蛋白可以用作临床检测hFIX等试验的标准品，也可以治疗血友病B等需要补充hFIX的疾病。

Description

无血清制备重组人类凝血因子IX
发明领域
本发明属基因治疗技术领域，具体涉及一种用于作为检测标准样品或血友病B治疗药物的重组hFIX(人凝血因子IX)的制备与应用。
技术背景
血友病是一组遗传性出血性疾病，是由于血液中某些凝血因子的缺乏而导致的严重凝血功能障碍。其中包括血友病A(因子VIII、AHG缺乏)，血友病B(因子IX、PTC缺乏)及血友病C(因子XI、PTA缺乏)。
血友病B(hemophilia B)是人凝血因子IX(human clotting factor IX，hFIX)缺乏所引起的一种严重凝血功能障碍性疾病。编码hFIX的基因(hFIX)位于人X染色体长臂远端，被定位于Xq27.1区域，全长34kb，由8个外显子和7个内含子组成，cDNA全长2802bp，编码区1383bp。(NM_000133)该病临床表现为自发性出血，严重者可导致关节变形或残疾。血友病B严重威胁着人类健康，为X染色体隐性遗传疾病，在男性中的发病率为三万分之一。血友病不仅给患者带来身体和精神上的痛苦，也使之承受着沉重的经济负担。
血友病A多见(1-2/万)，约为血友病B的七倍左右。由于患者血浆中缺乏某种凝血因子，患者的血管破裂后，血液较正常人不易凝结，因而会流去更多的血。体表的伤口所引起的出血通常并不严重，而内出血则严重得多。内出血一般发生在关节、组织和肌肉内部。当内脏出血或颅内出血发生时，常常危及生命。关节出血在血友病患者中是很常见的。血液淤积到患者的关节腔后，会使关节活动受限，使其功能暂时丧失，关节反复出血则可导致滑膜炎和关节炎，造成关节畸形，因此很多血友病患者有不同程度的残疾。
因凝血因子的活性水平也不同，据此可将血友病患者分为重型、中型和轻型。重度血友病患者的血浆中所缺乏的凝血因子的活性程度达不到正常人的3％，一个月内可数次出血，出血常常在没有明显原因的情况下发生，称为自发出血。关节出血很普遍。中度血友病患者的因子活性程度为正常人的3％至6％，他们的出血常常由小创伤导致，例如运动损伤。关节出血一般在外伤后发生。
轻度血友病患者的因子活性程度为正常人的6％至25％，一般只在外科手术、拔牙或严重外伤后出血不止。关节出血较少。血友病的治疗分为局部止血治疗与替代疗法。前者一般包括局部压迫、放置冰袋、局部用血浆、止血粉、凝血酶或明胶海绵贴敷等。替代疗法包括：输血浆：为轻型血友病的首选有效疗法，新鲜血浆和新鲜冰冻血浆含有所有的凝血因子。目前替代疗法依然是血友病最有效以及在紧急情况下可行的方法。
血友病作为一种出血性疾病严格意义上讲是止血障碍。临床治疗就是在紧急情况下为病人止血以挽救生命。但是，血友病标准的治疗应该是预防性治疗，病人可以依据具体情况一周使用2-3次血液替代品，从而可以完全恢复正常生活以及防止出现严重慢性并发症。
尽管目前的状态是血液制品依然占据主流，但是重组制剂以其安全性日益获得医疗体系和病人的认同。拜科奇于2000年获得美国FDA和欧盟EMEA批准，目前已在超过54个国家被批准使用。拜耳医药保健的血友病治疗药物“拜科奇”(基因重组人凝血因子VIII)已获得国家食品药品监督管理局(SFDA)批准在中国上市。这是目前在国内上市的第一个基因重组人凝血因子VIII。事实上，在发达国家，血友病的预防和治疗用药是一个颇具规模的市场，除了拜耳先灵之外，全球还有美国百特和美国惠氏也生产基因重组人凝血因子VIII，其中，百特的销售额与拜耳的旗鼓相当。
血液制品的安全性隐患是重组VIII因子与重组FIX因子治疗血友病的发展趋势的基本原因，其次供求关系也是一个重要的因素。这两个因素在可以预期的将来没有缓解的可能，可能越来越严重。缺血已经是一个日常的医疗课题，而HIV，HBV，HCV在我国日益严重的事态也是的血液制品的安全性难于改善。这构成了对重组因子的刚性需求的源泉。另一方面，随人民收入水平提高，国家富强，无论是国家还是家庭都有充分治疗这些可以治疗的病人的能力与需求。所以，可以预见病人的就诊率与充分治疗率都将上升，从而使治疗水平达到水解平均水平，并且逐步达到发达国家水平。国内市场在可以预期的将来是一个稳定成长的市场。
发明内容
本发明属生物技术和基因工程技术领域，具体涉及重组人类凝血因子IX的制备与应用。首先构建CMV(巨细胞病毒)启动子驱动的表达人类凝血因子IX(hFIX)的质粒，用该质粒转染CHO-K1细胞(中国仓鼠卵巢细胞K1株)，筛选稳定高表达hFIX的细胞株，扩增培养高表达细胞系，并且收集细胞培养上清，使用免疫层析纯化hFIX，蛋白经电泳和质谱分析确定纯度达到99％，保存于10％蔗糖生理盐水溶液中并冻干，使用前用无菌水溶解。该重组hFIX蛋白与人类血液来源的hFIX有相同的分子组成和生物活性。用于血友病B小鼠模型可以获得缓解。该重组hFIX蛋白可以用作临床检测hFIX等试验的标准品，也可以治疗血友病B等需要补充hFIX的疾病。
具体而言，本发明涉及一种全程无动物蛋白体系的制备重组hFIX蛋白质的方法，其包括如下步骤：首先，进行无血清驯化CHO-K1细胞；其次构建CMV启动子驱动的表达人类凝血因子IX的质粒，用该质粒转染CHO-K1细胞，筛选稳定高表达hFIX的细胞株，扩增培养高表达细胞系，并且收集细胞培养上清，使用免疫层析纯化hFIX，蛋白经电泳和质谱分析确定纯度达到99％，保存于10％蔗糖生理盐水溶液中并冻干，使用前用无菌水溶解。
本发明还涉及一种采用上述方法制备得到的重组hFIX蛋白。
本发明进一步涉及一种上文所述的重组hFIX蛋白，其中所述的重组hFIX蛋白与人类血液来源的hFIX有相同的分子组成和生物活性。
本发明还涉及上文所述的重组hFIX蛋白在制备治疗和检验血友病药物中的应用。
本发明的主要内容在于提供一种无血清发酵制备重组人类凝血因子IX。
1.无血清驯化CHO-K1细胞
从ATCC购买CHO-K1细胞，直接用无血清培养基常规复苏培养，传代消化时使用重组胰蛋白酶消化，然后继续作有限稀释无血清培养，筛选状态良好的适应无血清生长条件的细胞作为无血清驯化CHO-K1细胞种子细胞，常规无血清冻存。
2.采用hFIX基因转染无血清CHO-K1细胞以及种子库构建
常规使用无血清条件用lipofect2000介导pRBS-CMVhFIX转染CHO-K1、G418筛选、有限稀释后挑去24个单个克隆、扩增并取培养基上清用免疫酶标方法检测不同克隆hFIX分泌水平。将高表达克隆进一步扩增建立一级种子库。一级种子库扩增到109形成生产种子库并-196℃保存。
3.hFIX表达与纯化
采用无血清贴壁培养，收集上清常规SD除毒，离心除细胞，直接上注到交联又抗hFIX单克隆抗体H4B5(参见复旦学报(自然科学版)，2000年03期，邱信芳等)的argarose树脂柱，常规洗脱，通过超滤置换为10％蔗糖生理盐水保存液，hFIX定量分析，过滤除菌，分装冻干保存。
4.重组hFIX用于检测凝血因子FIX检测和治疗血友病B.
与现有技术相比，本发明提供了一种新的无血清发酵制备重组人类凝血因子IX的方法，该方法全程无动物蛋白体系，从而降低了可能存在的污染性，提高了制备产率，产品治疗稳定，效果应用良好。
下面将结合具体实施例，进一步详述本发明的技术方案：
本发明所用的试剂、细胞、实验动物均为商业化购得，所采用的实验方法、效果评价方法也均为本领域常用的常规方法，其应当为本领域技术人员所公知，因此在此不再赘述。
附图说明
图1为重组hFIX制备工艺图。其中左侧方框内为主要工艺程序，右侧文字为对应工艺过程的主要结果，箭头代表工艺的顺序关系。
图2为表达质粒pRBS-CMVhFIX图谱。
图3为种子细胞筛选结果。其中图3A为hFIX标准稀释曲线；图3B为24个克隆的hFIX表达检测，表现为细胞株表达物与标准稀释hFIX免疫酶标扫描数据。
图4为重组hFIX蛋白纯度检测，显示HPLC检测重组hFIX纯度的实验结果。
图5为重组hFIX用于治疗血友病B疗效观察结果。
具体实施方式
1.无血清驯化CHO-K1
CHO-K1细胞(中国仓鼠卵巢细胞K1株)购自美国典型培养物保存中心(CCL-61TM，CHO-K1)。冻存细胞42℃水浴解冻，细胞用无血清清洗，直接用5ml无血清培养基(无血清培养基购于Gibco，CHO-S-SFM)在37℃，5％CO2条件下培养，隔天换相同培养基，在有明显克隆群落时用重组胰蛋白酶(Promga)消化，稀释细胞到103/ml，分别接种到96孔细胞培养板，待克隆形成后，在显微镜下筛选生长快，细胞体积大以及无中毒颗粒的细胞作为CHO-K1无血清适宜细胞，并扩增保存。
2.CHO-K1转hFIX基因修饰
表达hFIX的质粒(pRBS-CMVhFIX)由本实验室构建，其构建方法是本领域普通技术人员熟知的常规载体构建方法，其特点是hFIX表达框架中在相当于第一于第二外显子对应的序列中间插入一个内含子序列，从而提高hFIX在细胞中的表达水平(具体方法参见“中国科学”，C辑，1998，28卷，5期，张克中等)。表达框架由CMV启动字驱动，以适应在细胞中高效表达，在CMV启动子前面附加RBE序列，可以配合rep蛋白介导在人类细胞定点整合。质粒常规用Qiagen的无内毒素抽提试剂盒完成。
pRBECMV-hFIX转染CHO-K1细胞采用Invitrogen的lipofect2000试剂按相关说明常规完成。转染后24小时加G418至最终浓度500ng/ml培养，直到培养板上出现单个>40细胞的独立克隆。用接种针刮去单克隆转移到含有G418的24孔板继续培养。能继续生长的克隆被认定为稳定地整合克隆。用于进一步鉴定与筛选hFIX表达细胞克隆。
3.稳定高表达hFIX细胞克隆分离鉴定与种子库建立
由G418筛选的稳定细胞株从24孔板用重组胰蛋白酶消化，转移到6孔板继续培养，在细胞长到占底部70％左右开始48小时取培养基用酶联免疫反应测定细胞分泌hFIX的水平(中国科学，C辑，1998，28卷，5期，张克中等)，而细胞继续扩增仪构建地一级种子库。表达达到hFIX>500ng/ml的细胞株被认为是稳定高表达细胞株，对应的细胞株进一步扩增到107细胞，构成一级种子冷冻保存。
最高表达水平的5株细胞各取一只保存细胞复苏，分别扩增到1010细胞。收集所有细胞培养基用于检测hFIX表达于探索纯化条件，细胞风别冻存。构成二级种子库。二级种子库的细胞直接提供生产使用。
4.生产性表达
二级种子库中的最高表达细胞株常规扩增，以1:2传代的方法扩增细胞，一般在细胞长到70％后48小时传代，同时收集培养基用于纯化，暂时不纯化的培养基-70℃保存。同时检测hFIX表达水平变化。当培养基hFIX水平低于450时丢弃相应的细胞。
5.从维持转基因细胞的培养基中纯化hFIX
收集合格生产性(400ng/ml)表达细胞培养基，4℃15000rpm离心30分钟，收集上清液，通过0.45um孔径的滤膜后加样到10cm/10ml的预制argarose-抗FIX抗体H4B5柱，磷酸盐pH梯度洗脱，实时监控蛋白洗脱情况。常规SD除病毒处理消除可能的病毒污染。
用超滤管(Mircom，3000D)浓缩重组hFIX并用10％蔗糖生理盐水置换磷酸盐洗脱液。用班氏试剂检测总蛋白质含量，用酶联免疫反应检测hFIX含量。调解重组蛋白浓度到5000ng/ml。
浓缩重组蛋白通过025um孔径的除菌滤膜，清除可能的细菌污染。分装，冷冻干燥。低温(-20℃)保存。
6.重组hFIX治疗血友病B的试验
用重组hFIX100ng/g尾静脉注射以及用等体积10％蔗糖生理盐水空白对照处理FIX KO血友病B模型小鼠。计数鼠尾部分剪除出血时间愈出血量以评价疗效。确定重组hFIX生物活性。并观察急性免疫反应。确定推荐治疗剂量。实验结果参见图5所示。
该实验结果表明，按照本发明方法制备得到的重组hFIX能有效的治疗和检验血友病。

Claims (1)

1.一种制备重组hFIX蛋白质的方法，其包括如下步骤：首先，进行无血清驯化CHO-K1细胞；其次构建CMV启动子驱动的表达人类凝血因子IX的质粒，用该质粒转染CHO-K1细胞，筛选稳定高表达hFIX的细胞株，扩增培养高表达细胞系，并且收集细胞培养上清，使用免疫层析纯化hFIX，蛋白经电泳和质谱分析确定纯度达到99％，保存于10％蔗糖生理盐水溶液中并冻干，使用前用无菌水溶解。
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