CN105601735A - 一种静注巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种静注巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法，其巨细胞病毒中和抗体效价大于等于1:500。该制备方法包括：(1)筛选出巨细胞病毒中和抗体效价大于等于1:20的特免血浆；(2)将筛选出的高效特免血浆混合；(3)将上述混合血浆采用低温乙醇压滤法分离并结合离子交换层析法分离纯化免疫球蛋白组分Ⅱ，经过滤、层析、超滤、配制、低pH孵放灭活病毒、纳米膜过滤去除病毒，分装得到纯度98.5％-100％的免疫球蛋白，抗体效价不低于1：500。该制备和生产方法得到的巨细胞人免疫球蛋白抗体效价、纯度和回收率高，可以针对性的对巨细胞病毒进行治疗，是治疗巨细胞病毒在人群中引起的隐性和显性感染的有效药物，安全可靠，具有较大的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域的治疗用血液制品，特别是涉及一种巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法。
背景技术
人巨细胞病毒(Humancylomegalovirus,HCMV)，也称人疱疹病毒5型(HHV5)，属β疱疹病毒亚科。HCMV是人类先天性病毒感染的最常见病原之一，该病毒在我国成人感染率高达95％以上。普通人通常为隐性感染，但对于免疫力低下人群，如骨髓和实体器官移植受者、HIV感染者和肿瘤患者，HCMV感染会导致严重后果。孕妇原发或复发HCMV感染引起新生儿宫内感染或围产期感染侵袭胎儿，可致感染患儿中枢神经系统受累、多器官损害、智力低下或耳聋等；在正常健康人中可引起单核细胞增多症；在免疫缺陷者如器官移植受者、获得性免疫缺陷综合症者及癌症患者中可引起严重的感染,甚至死亡。国外临床上广泛使用抗病毒药物联合巨细胞病毒特异性人免疫球蛋白(CMV-IVIG)防治实体器官移植患者术后HCMV感染及相关疾病。但目前国内尚无CMV-IVIG上市，因此，开发高效价的HCMV特异性中和抗体的人免疫球蛋白制品具有重要意义。
但是由于巨细胞人免疫球蛋白对于原料选择以及制备条件的要求比较苛刻，所以目前的巨细胞人免疫球蛋白普遍存在效率低、性质不稳定等问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种有效治疗巨细胞病毒重症感染的人免疫球蛋白及其制备方法，使其应用于工业化生产，且产品高效、安全、可靠。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种静注巨细胞人免疫球蛋白，巨细胞人免疫球蛋白中和抗体效价大于等于1∶500。
所述免疫球蛋白与正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀线为IgG。免疫球蛋白纯度与总蛋白的质量百分比在98.5％-100％之间。
在制备时，其原料血浆为巨细胞病毒抗体效价不低于1∶20的血浆。
所述免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到99％-99.5％，PKA(中文含义为激肽释放酶原激活剂)≤30IU/mL，ACA(中文含义为抗补体活性)≤45％。
本发明所述静注巨细胞人免疫球蛋白可以有效治疗巨细胞病毒重症感染，具有高效、安全和可靠等优点，适合大规模的工业化生产。
为方便使用以及长久的保持其有效，本发明所述静注巨细胞人免疫球蛋白的剂型为液体制剂或冻干制剂。
本发明提供一种静注巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)用中和试验法筛选出巨细胞病毒不低于1:20中和抗体效价滴度的原料血浆；
(2)以筛选后的所述血浆原料制备混合血浆供试品，所述混合血浆中巨细胞病毒中和抗体效价滴度不低于1:160；
(3)将所述混合血浆供试品采用低温乙醇压滤法分离结合阴离子交换层析法纯化生产人免疫球蛋白，生产操作压力为0.05-0.3MPa，包括从血浆中分离组分II+III沉淀、从组分II+III中分离组分II、层析、超滤、病毒灭活、配置、分装得到产品。
进一步，步骤(1)所述中和试验法具体步骤包括：
(A)样品稀释：
血浆样本用细胞维持液预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，之后继续5倍稀释，即最终1:20倍稀释样品液；
打开足够量的96孔细胞板，标明病毒回滴用板和样品试验板，并在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒性型号和代次；
将预先灭活的1:20倍稀释样品液分别加入到96孔细胞板的相应位置，每孔加样品50μL，病毒回滴孔与阴性对照孔分别加50μL细胞维持液,每样品作竖向两孔平行；所述细胞维持液为体积比为5％的胎牛血清的MEM液；
(B)攻击病毒：
攻击病毒液制备：根据试验的标本数用细胞维持液制备足量的攻击病毒液，将病毒稀释到100CCID50/0.05mL；除病毒回滴孔与阴性对照孔外，其余各孔中均加入50μL含100CCID50的攻击病毒液；
回滴100CCID50攻击病毒液：用细胞维持液将攻击病毒液作10-1、10-2、10-3稀释，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，每个稀释度加10孔，50μL/孔；
阴性对照：向阴性对照各孔中再加入50μL细胞维持液；将所有96孔细胞板放入37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中和培养2小时；
(C)细胞悬液的配制与添加：
细胞悬液的配制：取足够量的MRC-5细胞，消化后计数，稀释至试验所需的细胞液量，试验用细胞悬液浓度应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用；
细胞悬加：将步骤(B)中和培养后的每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(D)培养及观察统计：
将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养11天，病毒接种后的第9天显微镜下观察细胞生长情况，第11天最终判定结果，并记录统计。
进一步，步骤(3)生产人免疫球蛋白的具体步骤包括：
(A)从血浆中分离组分II+III：将冷冻血浆在温度在2-4℃之间融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到7.0-7.2，加入体积分数为54％的乙醇溶液，使血浆中乙醇的最终浓度为8％-10％，使反应液的最终温度为-2至-4℃，离心分离组分I，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到5.9-6.0，加入体积分数为95％的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到20％，使反应液的最终温度控制在-2.0℃至-5.0℃，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀；
(B)将上步加压过滤后的组分II+III沉淀用加入4-8倍质量预冷的注射用水溶解，使反应温度控制在0至4.0℃。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.05-5.25，加入体积分数为95％的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-3.5℃至-6.5℃，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液；向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.1-7.5，按每升溶液添加2.8g氯化钠的比例补加氯化钠以提高反应液离子强度；加入体积分数为95％的乙醇溶液，使反应液中乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-9.0℃至-12.0℃，继续搅拌0.5小时，静止1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为手足口病人免疫球蛋白的粗制品；
(C)加入6-8倍质量的组分II沉淀量的注射用水溶解后，澄清过滤、超滤脱盐，控制蛋白液电导率不高于0.35ms/cm，按每升蛋白液加入80-120g甘氨酸的比例加入甘氨酸作为保护剂，用0.1-0.5mol/L碳酸氢钠溶液调整蛋白液pH至7±0.2，在60.0±0.5℃条件下巴氏灭活10小时；
(D)巴氏灭活结束后，降温制品至25℃以下，用0.1mol/L盐酸溶液调整制品pH为6.8-7.2，降温蛋白液至2℃以下，搅拌加入-15℃以下的体积分数为95％的乙醇溶液，使制品中乙醇浓度为18％-22％，控制最终温度在-1至6℃，搅拌反应1小时以上，按0.5-2g/L蛋白液加入助滤剂硅藻土，继续反应1小时后压滤分离沉淀，滤过液温度控制在6℃以下，压力控制在0-0.3Mpa，沉淀废弃，之后，用0.1mol/L氢氧化钠溶液或0.1mol/L盐酸溶液调整滤出液pH为6.9-7.3，搅拌加入-15℃以下的体积分数为95％乙醇的乙醇溶液，使制品中乙醇终浓度为20％-24％，控制最终温度在-6至-12℃，搅拌反应1小时以上，压滤分离沉淀，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0-0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取沉淀称重；
(E)将步骤(D)加压后的沉淀用0-4℃注射用水溶解6-8小时，溶解温度控制在0℃-3.0℃；将充分溶解的组分II过滤澄清，加入3％盐酸调节溶液的pH值至6.40-6.80之间，用5％氯化钠溶液调节溶液的电导为1.30-1.50ms/m；采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱；用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.40-6.80的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.40-6.80后上样，上样压力不超过1.5kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.40-6.80的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3％盐酸调节溶液pH至3.60-3.90，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中；
(F)启动超滤器，开始初浓缩，控制温度在3℃-9.0℃之间，蛋白浓度达到6％-8％(g/mL)时，加入3.0℃-9.0℃注射用水,使液蛋白浓度在2％-6％并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定。透析过程中注意补加3％HCl适量以保持蛋白液pH在3.50-4.00；透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用3.0℃-9.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中；
(G)向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，用3％的HCl调整浓缩后蛋白液的pH值为3.80-4.40，使最终制品中免疫球蛋白含量为50-56g/L，麦芽糖含量为9％-11％(g/mL)，抗体效价不低于1∶500，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法使制品保持在21℃-25℃下21天进行病毒灭活；
(H)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释药液的最终蛋白浓度为53.5g/L，再用纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注巨细胞人免疫球蛋白。
进一步，在加压过滤时，加入1％-2％(g/mL)的硅藻土做助滤剂,有利于提高过滤效果。
本发明所述制备方法与现有技术相比有以下优点：
(1)从健康人群中筛选出具有较高滴度的特异性原料血浆，其标准符合《中华人民共和国药典》2015版中“生物制品生产用血浆”规定，经低温乙醇压滤工艺结合柱层析纯化制备出高效价的巨细胞人免疫球蛋白，是用于预防和治疗巨细胞病毒所引起疾病的有效药物，特异性高，对于提高患者的存活率具有重要的意义。
(2)本产品将填补国内缺乏该药物的市场空白。
(3)目前市面上无筛选巨细胞病毒抗体的试剂盒，采用细胞中和试验法对原料及产品进行特免血浆的筛选和抗体效价的检测，该方法具有操作性强，灵敏度高、特异性好的优点，弥补了筛选和检测上的技术空缺。
(4)与现有技术相比，本发明在离心去除冷沉淀的基础上，进一步通过调节血浆pH至7.0～7.2，乙醇浓度至8％～10％，离心去除组分I沉淀，得到的组分I沉淀可以用来制作纤维蛋白原，提升的血浆的附加值，同时使后续制备的巨细胞人免疫球蛋白纯度更高，蛋白纯度达到100％，远远高于现有技术制备的蛋白纯度。
(5)本发明对压滤后的组分III上清液通过摸索反应离子强度、pH和乙醇浓度，最终确定向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.55，按2.8g/L补加氯化钠以提高反应液离子强度。加入95％的乙醇，使反应液乙醇的最终浓度为25％，压滤分离组分II沉淀，该步反应最终确定反应液的离子强度、pH和乙醇浓度使得压滤得到的组分II沉淀量最大、免疫球蛋白纯度最高(最终纯度为100％)、效价最高(不低于1:500)，较现有技术(例如申请号为CN201310573517.5的发明申请)只压滤一次相比，得到的组最终制品纯度(纯度为98％)和效价(1:400)更高。
(6)本发明对压滤的组分II沉淀再次进行溶解，并对其采用巴氏灭活后进行压滤精纯，较现有的申请的专利(申请号：CN201310573517.5)中只对组分II+III压滤一次相比，对脂包膜病毒和非脂包膜病毒灭活更彻底、蛋白纯度达到100％，较之前申报专利的制备出的98％的纯度更高。同时通过精纯能够能有效去除多聚体及酸性杂蛋白，经纯化后最终产品不含多聚体、单体和二聚体的含量在99％-100％，较现有的申请的专利(申请号：CN201310573517.5)单体二聚体的含量在96％相比更高，同时不含多聚体、白蛋白等杂质。
(7)收集的特异性原料血浆，采用压滤机为主要分离设备，代替离心机进行静注人免疫球蛋白的生产，使分离的温度等条件容易控制，分离速度快，而且没有高速运转设备，生产安全性高；同时，采用离子交换层析法进行产品的进一步纯化，制备出的免疫球蛋白制剂纯度达到98.5％以上，抗体效价不低于1∶500，单体和二聚体之和达到98.5％-99.5％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。较现有申报巨细胞人免疫球蛋白的申报专利(申请号：CN201310573517.5)效价1:400相比，效价更高(不低于1:500)、质量更稳定、回收率更高。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
1.供血浆者的血浆筛选采集：
选择血浆，采用中和试验法检测原料血浆中的巨细胞抗体的中和效价应满足以下条件：中和效价不低于1:20；蛋白质含量(双缩脲法检测)大于等于56g/L；丙氨酸氨基转移酶(赖氏法监测)不高于35单位；ELISA法测定梅毒、乙型肝炎表面抗原、HIV-1/HIV-2抗体、HCV抗体均为阴性。低温-20℃以下冰冻储存，保存期不超过2年。
2.中和实验法测定原料血浆中抗体效价：
(A)将血浆样品供试品用细胞维持液的MEM细胞培养液预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后继续5倍稀释，即最终1:20倍稀释；所述细胞维持液为体积百分比为5％的胎牛血清，细胞维持液和MEM细胞培养液均购自Gibco。
(B)取足够量的96孔细胞培养板，在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒性型号和代次，然后加入相应的预稀释灭活的各样品液50μL/孔，病毒回滴和阴性对照孔中加入50μL细胞维持液，每样品平行2孔。
(C)取巨细胞病毒HCMV用足量的细胞维持液稀释至试验所需浓度(即100×CCID50/0.05mL)，50μL/孔等量加入细胞培养板中，并同时设置阴性对照孔和病毒回滴孔。
细胞(阴性)对照孔：直接加入细胞维持液100μL/孔；
病毒回滴孔：先在板孔中加入细胞维持液50μL/孔，然后将应用病毒液进行10倍比稀释后，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，50μL/孔。
(D)中和反应：将各板孔中液体小心混匀后置于37℃，体积分数为5％的CO2培养箱中进行中和反应2小时。
(E)细胞悬液的配制以及细胞悬加：
细胞悬液的配制：取足够量的MRC-5细胞(中文名称为人胚肺成纤维细胞，购自ATCC)，培养液为含10％(V/V)胎牛血清的MEM，消化后计数，用细胞维持液调节试验用细胞悬液浓度应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用。
细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(F)培养：将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养11天，病毒接种后的第9天显微镜下观察细胞生长情况，第11天最终判定结果，并记录统计。
(G)样品中和抗体效价的判定：各样品若两孔均未发生病变则其中和效价＜1:20；若一孔发生病变另一孔未发生病变则中和效价为1:20；若两孔均发生病变则其中和效价＞1:20。血浆样品以中和效价大于或等于1:20判为合格的高效价巨细胞免疫球蛋白特免血浆。
含较高滴度的特异性血浆在投产前进行混合检测，抗体滴度不低于1:160，连续三批混合血浆检测结果分别见下表1-3。
表1第一批混合血浆检测结果
| 检测项目 | A(普通血浆) | B(高低度特异性血浆) |
| 蛋白含量 | 56.5g/L | 57.5g/L |
| HCMV中和抗体效价 | 1:20 | 1:175 |
表2第二批混合血浆检测结果
表3第三批混合血浆检测结果
| 检测项目 | A(普通血浆) | B(高低度特异性血浆) |
| 蛋白含量 | 56g/L | 56.5g/L |
| HCMV中和抗体效价 | 1:26 | 1:165 |
3.巨细胞人免疫球蛋白的制备：
(A)将1700名具有抗手足口病抗体的供血浆者的血浆融化混合，混合后体积为1000L，用中和试验法检测混血浆的中和效价为1:175；
(B)从血浆中分离组分II+III沉淀：将冷冻血浆1000L在温度在4℃融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到7.06，加入浓度为54％(体积分数)的乙醇溶液175Kg，使血浆中乙醇的最终浓度为8％，使反应液的最终温度为-2.8℃，离心分离组分I，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到5.95，加入浓度为95％(体积分数)的乙醇溶液160Kg，使血浆中乙醇的浓度从8％达到20％，使反应液的最终温度控制在-4.6℃，加入1.5％(g/mL)的硅藻土做助滤剂15Kg，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀84.75kg。
(C)分离组分II沉淀：将上步加压过滤后的组分II+III沉淀用加入5倍量预冷的注射用水424Kg溶解，使反应温度控制在1.0℃。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.13，加入47.2Kg浓度为95％(体积分数)的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-5.2℃，按5.0Kg/吨血浆加入硅藻土搅拌30分钟，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液。向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.45，按每升溶液补加2.8g的比例补加氯化钠以提高反应液离子强度。加入95％(体积分数)的乙醇溶液，使反应液乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-10.7℃，继续搅拌0.5小时，静止1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取26.5Kg组分II沉淀，组分II沉淀即为巨细胞人免疫球蛋白的粗制品。
(D)巴氏灭活：加入8倍组分II沉淀量的注射用水溶解后，经澄清过滤、超滤脱盐，控制蛋白液的电导率不高于0.35ms/cm，按每升蛋白液加入100g甘氨酸的比例加入甘氨酸，甘氨酸作为保护剂，用0.1mol/L碳酸氢钠溶液调整蛋白液pH至7.2，在60.0±0.5℃条件下灭活10小时。
(E)压滤精制：巴氏活结束后，降温制品至25℃以下，用0.1mol/L盐酸溶液调整制品pH为7.1，降温蛋白液至2℃以下，搅拌加入-15℃以下的95％(体积分数)乙醇溶液，使制品中乙醇浓度为20％，控制最终温度在4℃，搅拌反应1小时以上，按0.8g/L蛋白液分别加入助滤剂硅藻土，继续反应1小时后压滤分离沉淀，滤过液温度控制在6℃以下，压力控制在0-0.3Mpa，沉淀废弃。用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整滤出液pH为7.1，搅拌加入-15℃以下的95％(体积分数)乙醇溶液，使制品中乙醇终浓度为22％，控制最终温度在-6至-12℃，搅拌反应1小时以上，压滤分离沉淀，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0-0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取沉淀。
(F)层析法纯化：将上步加压过滤后的组分II用2℃注射用水溶解6小时，溶解温度控制在2.5℃。将充分溶解的组分II用90sp的滤芯过滤澄清，加入3％盐酸调节溶液的pH值至6.61，用5％氯化钠溶液调节溶液的电导为1.4ms/m。采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱。用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.62的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.62后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.62的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3％盐酸调节溶液pH至3.90，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中。
(G)超滤浓缩：启动超滤器，开始初浓缩，温度控制在6.5℃，蛋白浓度达到7％(g/mL)时，加入6℃注射用水,使蛋白浓度达到4％(g/mL)并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定。透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用5.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中。
(H)配制：向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，用3％的HCl调整浓缩后蛋白液的pH值为3.91，使最终制品中免疫球蛋白含量为55.6g/L，麦芽糖含量为10％(g/mL)，抗体效价为1∶700，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法使制品保持在23℃下21天进行病毒灭活。
(I)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释药液的最终蛋白浓度为53g/L，再用DV-50纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注巨细胞人免疫球蛋白(pH4)。
通过上述方法得到的巨细胞人免疫球蛋白抗体效价、纯度和回收率高，可以针对性的对巨细胞病毒进行治疗，是治疗巨细胞病毒在人群中引起的隐性和显性感染的有效药物，安全可靠，具有较大的社会效益和经济效益。
实施例2
1.供血浆者的血浆筛选采集：
选择血浆，采用中和试验法检测原料血浆中的巨细胞抗体的中和效价应满足以下条件：中和效价不低于1:20；蛋白质含量(双缩脲法检测)大于等于56g/L；丙氨酸氨基转移酶(赖氏法监测)不高于35单位；ELISA法测定梅毒、乙型肝炎表面抗原、HIV-1/HIV-2抗体、HCV抗体均为阴性。低温-20℃以下冰冻储存，保存期不超过2年。
2.中和实验法测定原料血浆中抗体效价：
(A)将血浆样品供试品用细胞维持液(体积百分比为5％的胎牛血清，购自Gibco)的MEM细胞培养液(购自Gibco)预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后继续5倍稀释，即最终1:20倍稀释。
(B)取足够量的96孔细胞培养板，在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒性型号和代次，然后加入相应的预稀释灭活的各样品液50μL/孔，病毒回滴和阴性对照孔中加入50μL细胞维持液，每样品平行2孔。
(C)取巨细胞病毒HCMV用足量的细胞维持液稀释至试验所需浓度(即100×CCID50/0.05mL)，50μL/孔等量加入细胞培养板中，并同时设置阴性对照孔和病毒回滴孔。
细胞(阴性)对照孔：直接加入细胞维持液100μL/孔；
病毒回滴孔：先在板孔中加入细胞维持液50μL/孔，然后将应用病毒液进行10倍比稀释后，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，50μL/孔。
(D)中和反应：将各板孔中液体小心混匀后置于37℃，体积分数为5％的CO2培养箱中进行中和反应2小时。
(E)细胞悬液的配制以及细胞悬加：
细胞悬液的配制：取足够量的MRC-5细胞(中文名称为人胚肺成纤维细胞，购自ATCC)，培养液为含10％(V/V)胎牛血清的MEM，消化后计数，用细胞维持液调节试验用细胞悬液浓度应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用。
细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(F)培养：将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养11天，病毒接种后的第9天显微镜下观察细胞生长情况，第11天最终判定结果，并记录统计。
(G)样品中和抗体效价的判定：各样品若两孔均未发生病变则其中和效价＜1:20；若一孔发生病变另一孔未发生病变则中和效价为1:20；若两孔均发生病变则其中和效价＞1:20。血浆样品以中和效价大于或等于1:20判为合格的高效价巨细胞免疫球蛋白特免血浆。
3.巨细胞人免疫球蛋白的制备：
(A)将1760名具有抗手足口病抗体的供血浆者的血浆融化混合，混合后体积为1100L，用中和试验法检测混血浆的中和效价为1:170；
(B)从血浆中分离组分II+III沉淀：将冷冻血浆1100L在温度在3℃融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到7.01，加入浓度为54％(体积分数)的乙醇溶液168Kg，使血浆中乙醇的最终浓度为8％，使反应液的最终温度为-2.7℃，离心分离组分I，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到5.91，加入浓度为95％(体积分数)的乙醇溶液152Kg，使血浆中乙醇的浓度从8％达到20％，使反应液的最终温度控制在-5℃，加入1.5％(g/mL)的硅藻土做助滤剂14.5Kg，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀83.25Kg。
(C)分离组分II沉淀：将上步加压过滤后的组分II+III沉淀用加入4倍量预冷的注射用水500Kg溶解，使反应温度控制在0℃。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.05，加入53.2Kg浓度为95％(体积分数)的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-3.5℃，按每吨血浆5.0kg加入硅藻土搅拌30分钟，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液。向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.1，按2.8g/L补加氯化钠以提高反应液离子强度。加入95％(体积分数)的乙醇溶液，使反应液乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-9℃，继续搅拌0.5小时，静止1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取23.5Kg组分II沉淀，组分II沉淀即为巨细胞病毒人免疫球蛋白的粗制品。
(D)巴氏灭活：加入7倍组分II沉淀量的注射用水溶解后，经澄清过滤、超滤脱盐，控制蛋白液的电导率不高于0.35ms/cm，按每升蛋白液加入100g甘氨酸的比例加入甘氨酸，甘氨酸作为保护剂，用0.2mol/L碳酸氢钠溶液调整蛋白液pH至7.1，在60.0±0.5℃条件下灭活10小时。
(E)压滤精制：巴氏活结束后，降温制品至25℃以下，用0.1mol/L盐酸溶液调整制品pH为6.8，降温蛋白液至2℃以下，搅拌加入-15℃以下的95％(体积分数)乙醇溶液，使制品中乙醇浓度为20％，控制最终温度在-1℃，搅拌反应1小时以上，每升蛋白液分别加入0.8g助滤剂硅藻土，继续反应1小时后压滤分离沉淀，滤过液温度控制在6℃以下，压力控制在0-0.3Mpa，沉淀废弃。用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整滤出液pH为6.9，搅拌加入-15℃以下的95％(体积分数)乙醇溶液，使制品中乙醇终浓度为22％，控制最终温度在-6至-12℃，搅拌反应1小时以上，压滤分离沉淀，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0-0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取沉淀。
(F)层析法纯化：将上步加压过滤后的组分II用0℃注射用水溶解7小时，溶解温度控制在0℃。将充分溶解的组分II用90sp的滤芯过滤澄清，加入3％盐酸调节溶液的pH值至6.4，用5％氯化钠溶液调节溶液的电导为1.35ms/m。采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱。用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.4的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.4后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.4的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3％盐酸调节溶液pH至3.75，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中。
(G)超滤浓缩：启动超滤器，开始初浓缩，温度控制在3℃，蛋白浓度达到6％(g/mL)时，加入3℃注射用水,使蛋白浓度达到2％(g/mL)并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定。透析过程中注意补加3％HCl适量以保持蛋白液pH在3.50。透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用3.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中。
(H)配制：向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，用3％的HCl调整浓缩后蛋白液的pH值为3.8，使最终制品中免疫球蛋白含量为55.2g/L，麦芽糖含量为9％(g/mL)，抗体效价为1∶600，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法使制品保持在21℃下21天进行病毒灭活。
(I)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释药液的最终蛋白浓度为53.5g/L，再用DV-50纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注巨细胞人免疫球蛋白(pH4)。
通过上述方法得到的巨细胞人免疫球蛋白抗体效价、纯度和回收率高，可以针对性的对巨细胞病毒进行治疗，是治疗巨细胞病毒在人群中引起的隐性和显性感染的有效药物，安全可靠，具有较大的社会效益和经济效益。
实施例3
1.供血浆者的血浆筛选采集：
选择血浆，采用中和试验法检测原料血浆中的巨细胞抗体的中和效价应满足以下条件：中和效价不低于1:20；蛋白质含量(双缩脲法检测)大于等于56g/L；丙氨酸氨基转移酶(赖氏法监测)不高于35单位；ELISA法测定梅毒、乙型肝炎表面抗原、HIV-1/HIV-2抗体、HCV抗体均为阴性。低温-20℃以下冰冻储存，保存期不超过2年。
2.中和实验法测定原料血浆中抗体效价：
(A)将血浆样品供试品用细胞维持液(体积百分比5％胎牛血清，购自Gibco)的MEM细胞培养液(购自Gibco)预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，后继续5倍稀释，即最终1:20倍稀释。
(B)取足够量的96孔细胞培养板，在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒性型号和代次，然后加入相应的预稀释灭活的各样品液50μL/孔，病毒回滴和阴性对照孔中加入50μL细胞维持液，每样品平行2孔。
(C)取巨细胞病毒HCMV用足量的细胞维持液稀释至试验所需浓度(即100×CCID50/0.05mL)，50μL/孔等量加入细胞培养板中，并同时设置阴性对照孔和病毒回滴孔。
细胞(阴性)对照孔：直接加入细胞维持液100μL/孔；
病毒回滴孔：先在板孔中加入细胞维持液50μL/孔，然后将应用病毒液进行10倍比稀释后，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，50μL/孔。
(D)中和反应：将各板孔中液体小心混匀后置于37℃，体积分数为5％的CO2培养箱中进行中和反应2小时。
(E)细胞悬液的配制以及细胞悬加：
细胞悬液的配制：取足够量的MRC-5细胞(中文名称为人胚肺成纤维细胞，ATCC购买)，培养液为含10％(V/V)胎牛血清的MEM，消化后计数，用细胞维持液调节试验用细胞悬液浓度应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用。
细胞悬加：中和培养后每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(F)培养：将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养11天，病毒接种后的第9天显微镜下观察细胞生长情况，第11天最终判定结果，并记录统计。
(G)样品中和抗体效价的判定：各样品若两孔均未发生病变则其中和效价＜1:20；若一孔发生病变另一孔未发生病变则中和效价为1:20；若两孔均发生病变则其中和效价＞1:20。血浆样品以中和效价大于或等于1:20判为合格的高效价巨细胞免疫球蛋白特免血浆。
3.巨细胞人免疫球蛋白的制备：
(A)将1660名具有抗手足口病抗体的供血浆者的血浆融化混合，混合后体积为1000L，用中和试验法检测混血浆的中和效价为1:165；
(B)从血浆中分离组分II+III沉淀：将冷冻血浆1000L在温度在2℃融化，离心去冷沉淀，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到7.2，加入浓度为54％(体积分数)的乙醇溶液160Kg，使血浆中乙醇的最终浓度为8％，使反应液的最终温度为-4℃，离心分离组分I，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节组分I上清液的pH到5.95，加入浓度为95％(体积分数)的乙醇溶液141Kg，使血浆中乙醇的浓度从8％达到20％，使反应液的最终温度控制在-2℃，加入1.5％(g/mL)的硅藻土做助滤剂14.0Kg，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀81.55Kg。
(C)分离组分II沉淀：将上步加压过滤后的组分II+III沉淀用加入8倍量预冷的注射用水490Kg溶解，使反应温度控制在4℃。用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节制品的pH值为5.25，加入50.5Kg浓度为95％(体积分数)的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-6.5℃，按5.0Kg/吨血浆加入硅藻土搅拌30分钟，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液。向组分III上清液中加入1M碳酸氢钠溶液调节pH值为7.5，每升溶液补加2.8g氯化钠以提高反应液离子强度。加入95％(体积分数)的乙醇溶液，使反应液乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-12℃，继续搅拌0.5小时，静止1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取22.1Kg组分II沉淀，组分II沉淀即为巨细胞人免疫球蛋白的粗制品。
(D)巴氏灭活：加入6倍组分II沉淀量的注射用水溶解后，经澄清过滤、超滤脱盐，控制蛋白液的电导率不高于0.35ms/cm，按100g/L蛋白液的比例加入甘氨酸作为保护剂，用0.5mol/L碳酸氢钠溶液调整蛋白液pH至7.15，在60.0±0.5℃条件下灭活10小时。
(E)压滤精制：巴氏活结束后，降温制品至25℃以下，用0.1mol/L盐酸溶液调整制品pH为7.2，降温蛋白液至2℃以下，搅拌加入-15℃以下的95％(体积分数)乙醇溶液，使制品中乙醇浓度为18％，控制最终温度在6℃，搅拌反应1小时以上，每升蛋白液加入0.8g助滤剂硅藻土，继续反应1小时后压滤分离沉淀，滤过液温度控制在6℃以下，压力控制在0-0.3Mpa，沉淀废弃。用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整滤出液pH为7.15，搅拌加入-15℃以下的95％(体积分数)乙醇溶液，使制品中乙醇终浓度为22％，控制最终温度在-6至-12℃，搅拌反应1小时以上，压滤分离沉淀，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0-0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取沉淀。
(F)层析法纯化：将步骤(D)加压过滤后的组分II用4℃注射用水溶解6小时，溶解温度控制在3℃。将充分溶解的组分II用90sp的滤芯过滤澄清，加入3％盐酸调节溶液的pH值至6.82，用5％氯化钠溶液调节溶液的电导为1.5ms/m。采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱。用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.82的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.82后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.82的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，用3％盐酸调节溶液pH至3.6，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中。
(G)超滤浓缩：启动超滤器，开始初浓缩，温度控制在9℃，蛋白浓度达到8％(g/mL)时，加入9℃注射用水,使蛋白浓度达到6％(g/mL)并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定。透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用5.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中。
(H)配制：向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，用3％的HCl调整浓缩后蛋白液的pH值为4.4，使最终制品中免疫球蛋白含量为55.6g/L，麦芽糖含量为11％(g/mL)，抗体效价为1∶600，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法使制品保持在25℃下21天进行病毒灭活。
(I)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释药液的最终蛋白浓度为53.5g/L，再用DV-50纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注巨细胞人免疫球蛋白(pH4)。
通过上述方法得到的巨细胞人免疫球蛋白抗体效价、纯度和回收率高，可以针对性的对巨细胞病毒进行治疗，是治疗巨细胞病毒在人群中引起的隐性和显性感染的有效药物，安全可靠，具有较大的社会效益和经济效益。
实施例1-3中，低pH孵育法指用3％盐酸溶液滴定蛋白浓度为1％，滴定pH值至3.79-4.10。
质量检验
按上述工艺制备的巨细胞(HCMV)人免疫球蛋白，其质量检验如下表4。
通过表4可以看出本发明制备的静注巨细胞人免疫球蛋白(pH4)的各项指标均符合规定，并具有特性高、纯度好等优点。
表4.巨细胞人免疫球蛋白检验报告书
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种静注巨细胞人免疫球蛋白，其特征在于，巨细胞人免疫球蛋白中和抗体效价大于等于1∶500。
2.根据权利要求1所述一种静注巨细胞人免疫球蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白与正常免疫球蛋白人血清相比，主要沉淀线为IgG。
3.根据权利要求1所述一种静注巨细胞人免疫球蛋白，其特征在于，免疫球蛋白纯度与总蛋白的质量百分比在98.5％-100％之间。
4.根据权利要求1所述一种静注巨细胞人免疫球蛋白，其特征在于，原料血浆为巨细胞病毒抗体效价不低于1∶20的血浆。
5.根据权利要求1所述一种静注巨细胞人免疫球蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白的单体和二聚体之和达到99％-99.5％，PKA≤30IU/mL，ACA≤45％。
6.根据权利要求1至5任一项所述一种静注巨细胞人免疫球蛋白，其特征在于，所述静注巨细胞人免疫球蛋白的剂型为液体制剂或冻干制剂。
7.一种静注巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用中和试验法筛选出巨细胞病毒不低于1:20中和抗体效价滴度的原料血浆；
(2)以筛选后的所述血浆原料制备混合血浆供试品，所述混合血浆中巨细胞病毒中和抗体效价滴度不低于1:160；
(3)将所述混合血浆供试品采用低温乙醇压滤法分离结合阴离子交换层析法纯化生产人免疫球蛋白，生产操作压力为0.05-0.3MPa，包括从血浆中分离组分II+III沉淀、从组分II+III中分离组分II、层析、超滤、病毒灭活、配制、分装得到产品。
8.根据权利要求7所述的静注巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于,步骤(1)所述中和试验法具体步骤包括：
(A)样品稀释：
血浆样本用细胞维持液预先进行1：4预稀释后，56℃灭活30分钟，之后继续5倍稀释，即最终1:20倍稀释样品液；
打开足够量的96孔细胞板，标明病毒回滴用板和样品试验板，并在各样品试验板盖上标示该板试验样本号、病毒型号和代次；
将预先灭活的1:20倍稀释样品液分别加入到96孔细胞板的相应位置，每孔加样品50μL，每样品作竖向两孔平行；病毒回滴孔与阴性对照孔分别加50μL细胞维持液；所述细胞维持液为体积比为5％的胎牛血清的MEM液；
(B)攻击病毒：
攻击病毒液制备：根据试验的标本数用细胞维持液制备足量的攻击病毒液，将病毒稀释到100CCID50/0.05mL；除病毒回滴孔与阴性对照孔外，其余各孔中均加入50μL含100CCID50的攻击病毒液；
回滴100CCID50攻击病毒液：用细胞维持液将攻击病毒液作10-1、10-2、10-3稀释，将攻击病毒液100与其10-1、10-2、10-3稀释度的病毒液加入到相应的病毒回滴用96孔细胞板孔中，每个稀释度加10孔，50μL/孔；
阴性对照：向阴性对照各孔中再加入50μL细胞维持液；将所有96孔细胞板放入37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中和培养2小时；
(C)细胞悬液的配制与添加：
细胞悬液的配制：取足够量的MRC-5细胞，消化后计数，稀释至试验所需的细胞液量，试验用细胞悬液浓度应为1×105个/mL，配好的细胞液立即使用；
细胞悬加：将步骤(B)中和培养后的每孔加细胞悬液100μL，约1×104个/孔；
(D)培养及观察统计：
将完成以上操作的96孔细胞板放置37℃、含有CO2体积百分数为5％的培养箱中培养11天，病毒接种后的第9天显微镜下观察细胞生长情况，第11天最终判定结果，并记录统计。
9.根据权利要求7所述的静注巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于,步骤(3)生产人免疫球蛋白的具体步骤包括：
(A)从血浆中分离组分II+III：将冷冻血浆在温度在2-4℃之间融化，离心去冷沉淀，调节血浆pH值到7.0-7.2，加入乙醇使血浆中乙醇的最终浓度为8％-10％，使反应液的最终温度为-2至-4℃，离心分离组分I，调节组分I上清液的pH到5.9-6.0，加入乙醇溶液使血浆中乙醇的浓度达到20％，使反应液的最终温度控制在-2.0℃至-5.0℃，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II+III沉淀；
(B)将上步加压过滤后的组分II+III沉淀用加入4-8倍质量预冷的注射用水溶解，使反应温度控制在0-4.0℃,调节制品的pH值为5.05-5.25，加入体积分数为95％的乙醇溶液，使血浆中乙醇的浓度达到18％，反应液温度最终控制在-3.5℃至-6.5℃，用压滤机进行加压过滤分离组分III上清液；将组分III上清液调节pH值为7.1-7.5，按每升溶液添加2.8g氯化钠的比例补加氯化钠以提高反应液离子强度；加入乙醇溶液使反应液中乙醇的最终浓度为25％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-9.0℃至-12.0℃，继续搅拌0.5小时，静止1小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为手足口病人免疫球蛋白的粗制品；
(C)加入6-8倍质量组分II沉淀量的注射用水溶解后，澄清过滤、超滤脱盐，控制蛋白液电导率不高于0.35ms/cm，按每升蛋白液加入80-120g甘氨酸的比例加入甘氨酸作为保护剂，调整蛋白液pH至7±0.2，在60.0±0.5℃条件下巴氏灭活10小时；
(D)巴氏灭活结束后，降温制品至25℃以下，调整制品pH为6.8-7.2，降温蛋白液至2℃以下，搅拌条件下加入-15℃以下的乙醇溶液使制品中乙醇浓度为18％-22％，控制最终温度在-1至6℃，搅拌反应1小时以上，按0.5-2g/L蛋白液加入助滤剂硅藻土，继续反应1小时后压滤分离沉淀，滤过液温度控制在6℃以下，压力控制在0-0.3Mpa，沉淀废弃，之后调整滤出液pH为6.9-7.3，搅拌加入-15℃以下的体积分数为95％乙醇的乙醇溶液，使制品中乙醇终浓度为20％-24％，控制最终温度在-6至-12℃，搅拌反应1小时以上，压滤分离沉淀，滤过液温度控制在-3℃以下，压力控制在0-0.3Mpa，压滤完毕，将沉淀物吹干或挤干，刮取沉淀称重；
(E)将步骤(D)加压后的沉淀用0-4℃注射用水溶解6-8小时，溶解温度控制在0℃-3.0℃；将充分溶解的组分II过滤澄清，调节溶液的pH值至6.40-6.80之间，调节溶液的电导为1.30-1.50ms/m；采用阴离子交换层析介质二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱；用AKTA-process层析系统控制进液流速，将层析柱用pH值为6.40-6.80的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.40-6.80后上样，上样压力不超过1.5Kg/cm，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用pH值为6.40-6.80的磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并滤过液和后顶液称重，调节溶液pH至3.60-3.90，将调整好的蛋白液通过转接管道抽至清洁的反应罐中；
(F)启动超滤器，开始初浓缩，控制温度在3℃-9.0℃之间，蛋白浓度达到6％-8％(g/mL)时，加入3.0℃-9.0℃注射用水,使液蛋白浓度在2％-6％并进行恒体积超滤透析脱盐,超滤透析过程中蛋白液体积保持恒定；透析过程中保持蛋白液pH在3.50-4.00；透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达8％以上，用3.0℃-9.0℃注射用水顶洗超滤系统，将顶洗液合并入超滤罐中；
(G)向超滤浓缩后的蛋白液加入麦芽糖，补加注射用水，调整浓缩后蛋白液的pH值为3.80-4.40，使最终制品中免疫球蛋白含量为50-56g/L，麦芽糖含量为9％-11％(g/mL)，抗体效价不低于1∶500，用0.22um的滤膜除菌过滤，进行低pH孵育法使制品保持在21℃-25℃下21天进行病毒灭活；
(H)在灭菌灭活结束后，通过原液送样检测蛋白含量，向药液中加入注射用水稀释药液，再用纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注巨细胞人免疫球蛋白。
10.根据权利要求9所述静注巨细胞人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，在加压过滤时，加入1％-2％(g/mL)的硅藻土做助滤剂。
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