CN101591389A - 水痘-带状疱疹人免疫球蛋白及其制备方法以及其在制药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水痘－带状疱疹人免疫球蛋白，其中，水痘－带状疱疹病毒中和抗体效价大于等于50IU/mL，其免疫球蛋白纯度大于等于总蛋白的90％，蛋白质含量小于等于180g/L。其制造方法为：在符合国家采血标准的供血浆者中，取其中水痘－带状疱疹病毒中和抗体IgG效价大于等于2IU/mL，蛋白质含量大于等于55g/L者的血浆为水痘－带状疱疹人免疫球蛋白的制备原料血浆，并将所得血浆混合；再将所得的原料血浆按低温乙醇或层析法蛋白分离工艺，分离提取免疫球蛋白组分，经加压过滤、层析、离心、超滤、病毒灭活、调配、除菌、分装等工序制成。其可用于制备预防水痘和治疗带状疱疹后遗神经痛药物的制备。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种生物免疫制品，特别是涉及一种水痘和治疗带状疱疹的特异免疫球蛋白及其制备方法，以及其在制药物中的应用。
背景技术
水痘-带状疱疹病毒(英文缩写：VZV)属于人类单纯疱疹病毒3型，其原发感染为水痘。水痘是儿童常见的一种急性、高传染性，可经呼吸道和接触传播的感染性疾病，一般预后良好，但某些人群(长期应用放、化疗病人，外科手术病人，器官移植病人等)及成人感染VZV后症状甚为严重，一旦在易感人群中出现水痘病人，就很难预防水痘在该群体中爆发。VZV潜伏后再激活则引起带状疱疹。近年来，带状疱疹(英文缩写：HZ)的发病率明显增高，且引起的后遗神经痛(英文缩写：PHN)用抗病毒药物治疗无明显疗效。水痘-带状疱疹及相关性后遗症逐渐成为重要的公共卫生问题而日益受到国家重视。
目前我国水痘的预防主要是应用水痘疫苗进行主动免疫，但个体水痘的预防接种不能改变水痘的爆发及流行病学特征。目前治疗带状疱疹常用的抗病毒药物一般为化学合成药、中草药以及干扰素等生物制剂，但其特异性差，疗效也不能充分肯定。
特异性免疫球蛋白是由病毒等病原体感染机体或主动接种疫苗后，在机体内产生的具有特异性、高活性及中和作用的球蛋白。使用特异性免疫球蛋白可针对性的预防病毒等病原体的感染及其感染后所发生疾病的治疗，这种方法称为被动免疫。被动免疫是控制感染性疾病暴发及治疗的有效途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对目前人免疫球蛋白对水痘-带状疱疹病毒无特异性的缺点，提供一种疗效好的高效价水痘-带状疱疹病毒人免疫球蛋白，并提供一种简单方便成本低的制备方法，以及其在制备用于预防水痘的发生和治疗带状疱疹后遗神经痛药治疗的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
水痘-带状疱疹人免疫球蛋白，其中，水痘-带状疱疹病毒中和抗体效价大于等于50IU/mL，其免疫球蛋白纯度大于等于总蛋白的90％，蛋白质含量小于等于180g/L。
本发明所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白，其中，仅与抗人血清产生沉淀线。
本发明所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白，其中，与正常人血清比较，主要沉淀线为IgG。
本发明所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白，其中IgG单体与二聚体含量之和大于等于90％。
本发明所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白，其中剂型为液体针剂型或冻干剂型，规格为125IU/2.5mL/瓶、250IU/5.0mL/瓶。
本发明所述水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的制造方法，其中，按以下步骤制备：
a.检测符合国家采血标准的供血浆者的血浆或血清，取其中水痘-带状疱疹病毒中和抗体IgG，选择中和抗体效价大于等于2IU/mL者的血浆为水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的制备原料血浆，并将所得血浆混合；
b.将a步骤所得的混合原料血浆按低温乙醇或层析法蛋白分离工艺，分离提取免疫球蛋白组分，经超滤、层析、病毒灭活、配制、除菌、分装等工序制成。
本发明所述水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的制造方法，其中，步骤a的方法为：
选择符合国家采血标准的供血浆者，接种国家批准的水痘疫苗，接种15天-20日时，以固相酶联免疫法(ELISA)定量检测供血浆者血浆或血清的水痘-带状疱疹病毒中和抗体IgG，中和抗体效价大于等于2IU/mL的血浆为水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的合格原料血浆，所述符合国家采血标准包括以下项目：以双缩脲法检测蛋白质含量大于等于55g/L，丙氨酸氨基转移酶(赖氏法)不高于25单位，乙型肝炎表面抗原阴性，梅毒阴性，HIV-1/HIV-2抗体阴性，HCV抗体阴性者。
本发明所述水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的制造方法，其中，每批次的混合原料血浆由不少于100名供血浆者的原料血浆混合而成，测定混合原料血浆中的水痘-带状疱疹病毒中和抗体效价，留中和抗体效价大于等于4IU/mL的混合原料血浆用以制备水痘-带状疱疹人免疫球蛋白，如所得血浆的水痘-带状疱疹病毒中和抗体效价小于4IU/mL，则该批次血浆不能使用，只能另作它用。
本发明所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白在制造预防易感人群患水痘的药中的应用，其使用量为10～15IU/kg体重，且最大给药剂量为625IU，最小给药剂量125IU。
本发明所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白在制造治疗带状疱疹及其后遗神经痛药物中的应用，其使用剂量为1000～5000IU每天。
本发明的优点为：提供了一种水痘-带状疱疹病毒中和抗体效价大于等于50IU/mL，其免疫球蛋白纯度大于等于总蛋白的90％，蛋白质含量小于等于180g/L的人免疫球蛋白，因为其中的水痘-带状疱疹病毒中和抗体效价大于等于50IU/mL，故此其可以用以防治水痘病和治疗带状疱疹后遗神经痛，并取得良好的效果。为了得到水痘-带状疱疹病毒中和抗体效价大于等于50IU/mL的人免疫球蛋白，发明人在采集血浆的时候，有目的的筛选水痘-带状疱疹病毒中和抗体效价大于2IU/mL的献血者的血浆，该方法在不提高制造成本的情况下，提升了最终产品中水痘-带状疱疹病毒抗体的浓度，提高了药效且简单方便。
具体实施方式
实施例1
1、供血浆者的免疫：
2008年8月1日至2008年9月7日选择身体健康的符合国家采血标准的供血浆者254名，同一名供血者在0、25天分别接种水痘减毒活疫苗(疫苗生产厂家为中国生物技术集团公司上海生物制品研究所，批号为20080803，0.5ml/支)各1支。所述符合国家采血标准包括以下项目：以双缩脲法检测蛋白质含量大于等于55g/L，丙氨酸氨基转移酶(赖氏法)不高于25单位，乙型肝炎表面抗原阴性，梅毒阴性，HIV-1/HIV-2抗体阴性，HCV抗体阴性者。
2、供血浆者的血浆筛选采集：
2008年9月21起选择固相酶联免疫法分别定量检测已接种水痘疫苗供血浆者254人血浆中水痘-带状疱疹病毒抗体IgG，水痘-带状疱疹病毒酶联免疫试剂盒为中国药品生物制品检定所生产，批号为20090424，共检出中和抗体效价大于2IU/mL的供血浆者分别为158人，将该158人的血浆低温冰冻储存。
3、水痘、带状疱疹人免疫球蛋白的制备：
(1)将水痘-带状疱疹人免疫球蛋白合格原料血浆158份融化混合，得混合原料血浆90000毫升，用固相酶联免疫法，水痘-带状疱疹病毒酶联免疫试剂盒为中国药品生物制品检定所生产，批号为20090424，定量检测混合后混合原料血浆水痘-带状疱疹病毒中和抗体效价为6.7IU/mL；
(2)将(1)步骤所得的无菌混合原料血浆，在2℃下离心去除冷沉淀7.6Kg；
(3)将(2)步骤中去除冷沉淀后得到血浆83L，用8.3L生理盐水稀释，用256mlPH4.0醋酸缓冲溶液调节反应液pH值至6.5，加95％乙醇19.2L至反应液中，最终乙醇浓度为20％，反应液终体积为110L，使用冷媒控制反应液温度至-4.5℃并保持，板框压滤分离得沉淀14kg；
(4)将步骤(3)的沉淀用0℃ 0.01mol/L NaCl溶液126L搅拌溶解，终体积为140L；
(5)在步骤(4)中得到的上清液中加50％乙醇47.6L至反应液中，最终乙醇浓度为度为17％，用PH4.0醋酸缓冲溶液365ml调节反应液pH值至5.1，反应液终体积为188L，使用冷媒控制反应液温度至-4.5℃并保持，板框压滤分离去除沉淀，收集上清液为178L；
(6)将步骤(5)中得到的上清液进行超滤透析四遍后上DEAE-Sepharose-Fast Flow弱阴离子交换层析，反应液温度为10℃，收集流出液为150L；
(7)将步骤(6)所得的流出液进行再超滤，用2mol/L的冰醋酸780ml调节流出液pH值为4.0，温度至10℃，透析8遍后浓缩至10L，测蛋白含量为8.7％、pH为3.90；
(8)将步骤(7)所得的浓缩液用2mol/L的冰醋酸12ml调pH至3.85，加入30％麦芽糖5L使最终浓度在10％，蛋白含量刚好为5.8％；
(9)将上述步骤(8)所得原液经24～25℃孵放21天之后用纳米膜过滤的病毒灭活处理；21天后将所得的液体再返回经超滤、脱醇、脱盐、浓缩，得到原液3520ml，用固相酶联免疫法，定量检测水痘-带状疱疹人免疫球蛋白中和抗体效价为120IU/ml，水痘-带状疱疹病毒酶联免疫试剂盒为中国药品生物制品检定所生产，批号为20090424；
(10)加入1mol/L的碳酸氢钠溶液600ml调节步骤(9)所得原液pH值至6.8，并加入30％葡萄糖溶液740ml至原液中，使葡萄糖终浓度为4％，补加生理盐水800ml，用固相酶联免疫法，定量检测水痘-带状疱疹人免疫球蛋白中和抗体效价为75IU/ml，，水痘-带状疱疹病毒酶联免疫试剂盒为中国药品生物制品检定所生产，批号为20090424，再经0.45um滤膜过滤得半成品5560ml。
(11)除菌分装为2.5ml/瓶成品，共计1780瓶，取样25瓶交质量检定部检定。
4、成品检定：
(1)活性
以酶联免疫法检测，使用中国药品生物制品检定所的酶联免疫免疫试剂盒，批号为20090424，水痘-带状疱疹病毒中和抗体效价为76.2IU/ml，以中和蚀斑法检测效价为74.8IU/ml。
(2)鉴别
免疫双扩散法：与抗人的血清反应，抗人血清的生产厂家为中国药品生物制品检定所，批号20060216，产生沉淀线，与抗马、抗牛、抗猪、抗羊的血清未产生沉淀线。
免疫电泳法：DYY-2C型电泳仪，琼脂糖凝胶，100V恒压电泳2小时，与正常人血清反应，主要沉淀线为IgG。
(3)蛋白质含量
定氮法检测126.7g/L。
(4)纯度
检测方法：全自动电泳扫描法
免疫球蛋白纯度为98.5％。
(5)分子大小分布
检测方法：高压液相色谱检测
IgG单体与二聚体含量之和97.4％。
(6)外观
为无色澄清液体，无浑浊。
(7)热稳定性
57℃水浴中保温4小时后，无凝胶化及絮状物。
(8)pH值
用生理氯化钠溶液将供试品蛋白质含量稀释成10g/L，pH值为6.9。
(9)无菌检查
无杂菌生长；合格。
(10)异常毒性
观察7天，用10只小白鼠和4只豚鼠(sps级，从安徽医科大学购得)，取0.5ml腹腔注射健存，体重平均增加4g；合格。
(11)热原检查：使用成年兔子(普通级，从安徽医科大学购得)3只，按0.45ml/Kg静脉注射实施例1所得的免疫球蛋白，升温总和为0.87℃；个别升温分别为0.28℃、0.39℃、0.20℃；合格。
(12)HCV抗体检查
为阴性；合格。
(13)HIV 1，2抗体检查，酶联试剂盒，北京华大吉比爱生物公司，批号为20071001，为阴性；合格。
实施例2
预防水痘
在水痘高发区某小学，随机选择三年级4个班共262人。实验组126人，平均年龄9.8岁，其中男65人，女61人；均应用实例1制备的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白肌肉注射125IU/人，仅注射1次，观察4个月，无一例发生水痘，发病率为0％。空白对照组136人，平均年龄10.1岁，其中男69人，女67人；观察4个月，31例发生水痘，发病率为22.8％。
实施例3
带状疱疹的治疗
实验组：选择带状疱疹病人55例，男35例，女20例，平均年龄51.7岁，应用实例1制备的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白肌肉注射3500IU每人/天，连续7天，全部病例均疼痛消失，疱疹面积减少50％以上，有效率100％。
对照组：选择带状疱疹病人35例，男20例，女15例，平均年龄52.5岁，均应用静注人免疫球蛋白10g/天及一般对症治疗，连续观察7天，疼痛消失，疱疹面积减少50％以上16例，有效率45.7％。
上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内，如未接种水痘疫苗的供血浆者血清或血浆中水痘-带状疱疹病毒抗体IgG效价也可以大于2IU/mL，该人群的血浆也可以作为原料血浆。
Claims (10)
1、水痘-带状疱疹人免疫球蛋白，其特征在于，水痘-带状疱疹病毒中和抗体效价大于等于50IU/mL，其免疫球蛋白纯度大于等于总蛋白的90％，蛋白质含量小于等于180g/L。
2、根据权利要求1所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白，其特征在于，仅与抗人血清产生沉淀线。
3、根据权利要求1所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白，其特征在于，与正常人血清比较，主要沉淀线为IgG。
4、根据权利要求1所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白，其特征在于IgG单体与二聚体含量之和大于等于90％。
5、根据权利要求1所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白，其特征在于剂型为液体针剂型或冻干剂型，规格为125IU/2.5mL/瓶、250IU/5.0mL/瓶。
6、根据权利要求1至5任意一项所述水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的制造方法，其特征在于，按以下步骤制备：
a.在符合国家采血标准的供血中，取其中水痘-带状疱疹病毒中和抗体IgG效价大于等于2IU/mL者的血浆为水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的制备原料血浆，并将所得血浆混合；
b.将a步骤所得的混合原料血浆按低温乙醇或层析法蛋白分离工艺，分离提取免疫球蛋白组分，经超滤、层析、病毒灭活、配制、除菌、分装等工序制成。
7、根据权利要求6所述水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的制造方法，其特征在于，步骤a的方法为：
选择符合国家采血标准的供血浆者，接种国家批准的水痘疫苗，接种后15天-90天时，以固相酶联免疫法定量检测供血浆者血浆或血清的水痘-带状疱疹病毒中和抗体效价，大于等于2IU/mL者的血浆为水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的原料血浆。
8、根据权利要求6或7所述水痘-带状疱疹人免疫球蛋白的制造方法，其特征在于，将大于等于100名供血浆者的原料血浆混合成每批次的混合原料血浆，测定混合原料血浆中的水痘-带状疱疹病毒中和抗体效价，留中和抗体效价大于等于4IU/mL的混合原料血浆用以制备水痘-带状疱疹人免疫球蛋白。
9、根据权利要求1所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白在制造预防易感人群患水痘的药中的应用。
10、根据权利要求1所述的水痘-带状疱疹人免疫球蛋白在制造治疗带状疱疹及其后遗神经痛药物中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN105601735A (zh) * | 2016-01-28 | 2016-05-25 | 哈尔滨派斯菲科生物制药股份有限公司 | 一种静注巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法 |
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2009
- 2009-06-30 CN CNA2009100880405A patent/CN101591389A/zh active Pending
Cited By (2)
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| CN105601735B (zh) * | 2016-01-28 | 2019-04-19 | 哈尔滨派斯菲科生物制药股份有限公司 | 一种静注巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法 |
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