CN102241768B - 一种抗甲型h1n1流感病毒血凝素蛋白的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体。本发明还提供了分泌所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明还提供了含有所述单克隆抗体的试剂盒。本发明的单克隆抗体结合甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的构象表位，对甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白HA1片段具有高亲和力，不与其它蛋白发生交叉反应，特异性和灵敏度均非常高。

Description

一种抗甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的抗体

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种抗甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的抗体。

背景技术

流感病毒(Influenza virus)，是一种造成人类及动物患流行性感冒的病毒，在分类学上属于正黏液病毒科，为单股负链RNA病毒。人类流感病毒根据其核蛋白(NP)的抗原性可以分为甲、乙、丙(A，B，C)三类。对于A型流感病毒，根据其表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同，又可以进一步分为不同的亚型。目前，A型病毒有16种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)。会造成急性呼吸道感染，甚至严重的全身性免疫反应。流感病毒借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行，造成严重后果。自1918年爆发西班牙大流感以来，已经发生过至少三次流感大流行。上述流感大流行主要是由H1N1，H2N2，H3N2亚型的A型流感病毒引起。

2009年的甲型H1N1(A/H1N1)流感病毒，在早期被称为“猪流感”或“猪源流感”病毒，暴发于墨西哥和美国，并在数月内席卷全球，因其具有强大的抗原变异性以及能感染人类和多种动物的特点，很快引发了人类又一次流感大恐慌。继香港、德国等国家和地区出现系列感染病例之后，WHO在2009年6月11日决定把H1N1新型流感的警戒级别升至第六级，这也是WHO在过去40年来第一次把传染病警戒级别升至最高级别。甲型H1N1流感病毒危害之重可见一斑。

因此，对于甲型H1N1流感病毒的早期检测就显得尤为重要，目前迫切需要一种快捷、准确的检测手段。尽早检测出甲型H1N1流感病毒，使病人安全隔离，防止甲型H1N1流感病毒在人群中扩散传播。

然而，本领域目前尚未有特异性地针对甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的抗体。

在本发明的第一方面，提供一种特异性抗甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体，其由保藏号为CCTCC NO：C201024的杂交瘤细胞株产生。

在一个优选例中，所述的单克隆抗体特异性识别(如结合)甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的HA1片段。

在另一优选例中，所述单克隆抗体识别甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的构象表位。

在本发明的另一方面，提供所述的单克隆抗体在制备检测甲型H1N1流感病毒的试剂或试剂盒中的用途。

在本发明的另一方面，提供所述的单克隆抗体在制备特异性结合甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(特别是HA1)从而抑制HA1片段功能(即：抑制甲型H1N1流感病毒进入细胞)的组合物中的用途。

在本发明的另一方面，提供所述的单克隆抗体在制备防治甲型H1N1流感病毒感染或甲型H1N1流感病毒感染相关疾病的组合物中的用途。

在本发明的另一方面，提供一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：C201024。

在本发明的另一方面，提供一种试剂盒(或药盒)，所述的试剂盒含有所述的单克隆抗体；或含有所述的杂交瘤细胞株。

在一个优选例中，所述的试剂盒含有：

固相载体，所述的固相载体上包被有第一抗体，该第一抗体是所述的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：

第二抗体，该第二抗体是抗甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的多克隆抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：

酶联免疫检测试剂。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，其包含：

有效量的所述的单克隆抗体；以及

药学上可接受的载体。

在一个优选例中，所述的组合物用于特异性结合甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(特别是HA1)从而抑制HA1片段功能。

在另一优选例中，所述的组合物用于防治甲型H1N1流感病毒感染或甲型H1N1流感病毒感染相关疾病。

在本发明的另一方面，提供体外检测甲型H1N1流感病毒的方法(为非诊断性的方法)，包括以下步骤：

(a)将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白与固相载体上的第一抗体结合，形成带有“血凝素蛋白-第一抗体”二元复合物的固相载体；所述的第一抗体是所述的单克隆抗体；

(b)将第二抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“第二抗体-血凝素蛋白-第一抗体”三元复合物的固相载体；所述的第二抗体是抗甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的多克隆抗体；且所述的第二抗体携带一标记物；

(c)检测三元复合物中的标记物，确定待检测样品中甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的存在与否或存在的量，从而确定甲型H1N1流感病毒的存在与否或存在的量；

或者，包括以下步骤：

(a1)将待测样品包被于固相载体；

(a2)将检测抗体加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白与固相载体上的检测抗体结合，形成带有“血凝素蛋白-检测抗体”二元复合物的固相载体”；所述的检测抗体是所述的单克隆抗体，且所述的检测抗体携带一标记物；

(a3)检测二元复合物中的标记物，确定待检测样品中甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的存在与否或存在的量，从而确定甲型H1N1流感病毒的存在与否或存在的量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了单克隆抗体S-95-7滴度测定的结果。

图2显示了S-95-7抗体对80℃处理(加热变性)与未处理的甲型H1N1流感灭活病毒总蛋白的识别情况鉴定。

图3显示了S-95-7抗体对80℃处理(加热变性)与未处理的昆虫系统表达的甲型H1N1流感HA蛋白识别情况鉴定。

图4显示了S-95-7抗体对80℃处理(加热变性)与未处理的昆虫系统表达的甲型H1N1流感HA蛋白(HA蛋白上的HA1片段)识别情况鉴定。

图5显示了S-95-7抗体对80℃处理(加热变性)与未处理的季节性流感灭活病毒识别情况鉴定。

图6显示了假病毒H1N1的载体示意图。

图7显示了假病毒中和实验检测单抗S-95-7的中和作用。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，首次找到一类特异性抗甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体，其是结合甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的构象表位的单克隆抗体，特别是结合HA1片段。所述的单克隆抗体对甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白HA片段HA1具有高亲和力，不与其它蛋白发生交叉反应，特异性和灵敏度均非常高。

如本文所用，“特异性”是指所述抗体能结合于甲型H1N1流感病毒HA蛋白或其片段；更特别地，指那些能与甲型H1N1流感病毒HA蛋白或片段(HA1)结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。

单克隆抗体

针对本领域中还没有特异性地针对甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体的技术缺陷，本发明人经过大量的、反复的研究试验，最终找到了一种有效的抗甲型H1N1流感病毒HA的单克隆抗体(由杂交瘤细胞株S-95-7产生)，所述单克隆抗体对于甲型H1N1流感病毒HA蛋白具有很高的特异性，不结合于HA以外的其它蛋白。并且，当用于检测时，无需对待测样品进行过多的处理即可方便地获得精确的检测结果。

此外，所述的单克隆抗体可特异性检测甲型流感病毒，并且与季节性流感病毒区分。季节性流感病毒与甲型流感病毒在结构上较为相似，一般的抗体难以区分。尽管季节性流感病毒与甲型流感病毒感染导致的症状在起始阶段较为接近，然而两种病毒感染导致的疾病的严重状况是不一样的，因此将两种病毒感染加以区分，对于疾病的预后以及对症治疗是非常有必要的，也是疾病早期诊断时所必需做到的。

此外，所述的单克隆抗体还是一株中和性抗体，具有结合HA1片段、阻滞HA1与细胞受体结合、进而阻止病毒侵袭细胞的功能。本领域人员已经了解，甲型H1N1流感病毒的HA蛋白是病毒上的膜蛋白，主要分为HA1片段和HA2片段，其中HA1是决定病毒是否可侵袭入细胞的关键因素，其可与细胞受体结合，使得病毒进入到细胞内。而本发明所述的单克隆抗体可以特异性结合HA1片段，阻滞了HA1与细胞受体结合、进而阻止病毒侵袭细胞。因此，本发明所述的单克隆抗体具有防治甲型H1N1流感病毒感染的功能。

本发明实施例的假病毒试验也证明，本发明的单克隆抗体可已知病毒的感染，具有很强的中和作用。

所述的甲型H1N1流感病毒HA蛋白的氨基酸序列与GenBank登录号FJ966082所示的序列基本上相同。其中HA1片段位于该序列中第1-344位。

单克隆抗体的制备

本发明的单克隆抗体利用杂交瘤技术制备获得(见Kohler等，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的单克隆抗体的一种杂交瘤细胞的制备方法是：(1)利用甲型H1N1流感病毒疫苗免疫小鼠；(2)分离经免疫的小鼠的脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞株融合；(3)加入小鼠腹腔饲养细胞与融合细胞共培养，并筛选阳性株；(4)有限稀释法克隆化筛选，从而获得单克隆抗体细胞株，从所述细胞株中筛选可生产所需单克隆抗体的细胞株。

本发明的单克隆抗体还可以利用HA基因产物或片段或功能区(如HA1)，通过免疫技术获得。此外，还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。本领域人员均了解，在得到了所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系或通过测序等手段得知所述的单克隆抗体后，本领域人员可以方便地获得所述的抗体。

在获得了杂交瘤细胞以后，可采用本技术领域人员熟知的单克隆抗体制备技术来大量生产本发明的单克隆抗体。作为本发明的一种实施方式，所述的单克隆抗体可以由下列制备方法所制备，所述方法包括步骤：(1)提供佐剂预处理的小鼠；(2)在小鼠腹腔内接种所述的杂交瘤细胞并分泌单克隆抗体；(3)抽取腹水，分离获得所述的单克隆抗体。作为一种方式，从腹水中分离单克隆抗体的方法是：收集腹水，用经硫酸铵沉淀，接着用Protein G预装层析柱纯化，获得高纯度的抗甲型H1N1流感病毒HA单克隆抗体。

此外，也可按照常规的动物细胞培养方法，体外培养扩增所述的杂交瘤细胞，从而使之分泌所述的单克隆抗体。

在获得了本发明的抗甲型H1N1流感病毒HA单克隆抗体后，本领域人员可通过多种途径来灵敏地检测样品中HA蛋白及其浓度，采用的技术可以是免疫学领域中常用的技术。

检测试剂盒

以所述的单克隆抗体为基础，可制备方便、快速且准确地检测甲型H1N1流感病毒的试剂盒。

因此，本发明提供了一种用于检测样品中是否存在甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒，该试剂盒中含有本发明的抗甲型H1N1流感病毒HA单克隆抗体。

在获得了本发明提供的单克隆抗体后，可以方便地制备出用于特异性检测甲型H1N1流感病毒的检测试剂盒。

作为本发明的一种优选方式，可根据双抗夹心法的原理，制备一种用于检测HA蛋白水平的试剂盒。双抗夹心法常规的做法是将一抗(如本发明的单克隆抗体)固定于载体，然后使一抗与抗原反应，洗涤后再与二抗反应(所述的二抗携带可检测信号，或可与携带可检测信号的物质结合)，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。双抗夹心法特别适用于具有两个或两个以上表位的抗原的检测。

作为另一种可选择的检测方式，采用间接ELISA法，将待测的抗原包被于固相载体上，利用本发明的单克隆抗体检测HA。

为了在检测时更方便，所述试剂盒中除了含有本发明的单克隆抗体以外，还可以包含其它检测试剂或辅助试剂，所述的辅助试剂例如是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要在其中利用了本发明的抗HA单克隆抗体作为与HA特异性结合的试剂。

此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。

检测甲型H1N1流感病毒的方法

在获得了本发明提供的抗HA单克隆抗体和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中HA蛋白或其含量，从而得知待测样品的供体是否感染甲型H1N1病毒，这些方法均被包含在本发明中。较佳地，所述的方法是以非疾病诊断为目的的。

作为一种优选方式，本发明提供一种体外(非诊断或治疗性地)检测甲型H1N1流感病毒的方法，包括以下步骤：

(a)将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的甲型H1N1流感病毒HA与固相载体上的第一抗体结合，形成带有“HA-第一抗体”二元复合物的固相载体；所述的第一抗体是本发明所述的单克隆抗体；

(b)将第二抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“第二抗体-HA-第一抗体”三元复合物的固相载体；所述的第二抗体是抗HA的多克隆抗体且携带一标记物；

(c)检测三元复合物中的标记物，从而确定待检测样品中甲型H1N1流感病毒HA的存在与否以或存在的量，从而确定甲型H1N1流感病毒的存在与否。

作为另一种可选择的检测方式，采用间接ELISA法，包括以下步骤：

(a1)将待测样品包被于固相载体；

(a2)将检测抗体加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的甲型H1N1流感病毒HA与固相载体上的检测抗体结合，形成带有“HA-检测抗体”二元复合物的固相载体”；所述的检测抗体是本发明所述的单克隆抗体，且所述的检测抗体携带一标记物；

(a3)检测二元复合物中的标记物，确定待检测样品中甲型H1N1流感病毒HA的存在与否以或存在的量，从而确定甲型H1N1流感病毒的存在与否。

按照上述方法，只要设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准曲线，通过比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的HA含量。

组合物

基于本发明的新发现，还提供了一种可抑制HA1片段功能或防治甲型H1N1流感病毒感染或甲型H1N1流感病毒感染相关疾病的组合物，其包含：有效量的本发明所述的单克隆抗体；以及药学上可接受的载体。所述组合物可以：(1)抑制HA1片段功能；或(2)防治甲型H1N1流感病毒感染或甲型H1N1流感病毒感染相关疾病。

本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的单克隆抗体相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。

可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如

润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。

使用组合物时，是将安全有效量的本发明的单克隆抗体施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常约0.1微克-10毫克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1-10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围内的。

本发明的主要优点在于：

(1)提供一种新的针对甲型H1N1流感病毒HA的特异性单克隆抗体，是结合HA的构象表位的单克隆抗体。

(2)本发明的单克隆抗体能够区分甲型H1N1流感病毒和季节流感病毒，准确性好。因此该抗体可以用来检测甲型流感病毒，并且与季节性流感病毒区分，从而可防止甲型流感病毒在人群中大规模传播，并且为后续的治疗提供判断依据。

(3)本发明的单克隆抗体具有高亲和力，并且检测范围宽，还具有敏感、特异、制备成本低的特点。当用于检测时，无需对待测样品进行过多的处理即可方便地检测出样品中HA的含量，且与样品中的其它蛋白无交叉反应。所述单克隆抗体在细胞生物学、生物大分子检测和医学临床诊断等领域具有重要应用前景。

(4)本发明的单克隆抗体还是一株中和性抗体，为甲型H1N1流感病毒感染相关疾病的临床防治提供了有效的途径。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.抗甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)单克隆抗体制备

1.甲型H1N1流感病毒疫苗

在本发明中，甲型H1N1流感病毒疫苗(获自华兰生物生物工程股份有限公司，浓度100ug/ml)用于免疫BALB/c小鼠，制备单克隆抗体。

2.动物免疫

取100μg甲型H1N1流感病毒疫苗与等体积的弗氏佐剂混合后，乳化完全，在BALB/c小鼠背部皮下及足部进行注射免疫小鼠。间隔3周免疫1次，连续免疫3次。第1次免疫用完全弗氏佐剂，第2次和第3次用不完全弗氏佐剂。第3次免疫后1周眼眶取血，分离血清，测抗甲型H1N1流感病毒疫苗抗体的效价。选取效价高的小鼠经腹腔注射100μg甲型H1N1流感病毒疫苗再次加强免疫，3天后，取该小鼠脾脏用于融合。

3.细胞融合

(1)细胞准备

骨髓瘤细胞的准备：收集经8-氮鸟嘌呤筛选过的骨髓瘤细胞NS-1、SP2/0，显微镜下观察细胞活性，将活性良好的对数增殖期的细胞洗涤后计数，细胞悬浮在DMEM培养液中备用。

饲养层细胞的准备：融合前一天，将5ml DMEM培养液注入小鼠腹腔，轻轻晃动后抽出腹腔液，离心，计数，调整细胞浓度为1×10⁵/ml，接种到96孔培养板内，50μl/孔。

脾脏细胞的准备：解剖加强免疫后小鼠，取脾脏，用机械法分散脾细胞，经滤网过滤得脾细胞悬液，DMEM培养液洗涤后计数。

(2)细胞融合

取1×10⁷骨髓瘤细胞(NS-1或SP2/0细胞)与5×10⁷脾细胞(按1∶5比例)混合于50ml离心管中，加入无血清培养液，离心，1500rpm，3分钟，弃上清。振松沉淀细胞，逐滴加入50％PEG 1ml，边加边摇晃，1分钟内加完。静置90秒，让PEG继续作用。然后在2.5分钟内逐滴加入37℃预温的无血清培养液10ml，静置5min，终止PEG的作用。融合后细胞悬液离心，1000rpm，3min。弃上清，沉淀细胞轻轻打匀，加入25ml完全培养液，接种于加有饲养层细胞的96孔板内，50μl/well，每孔2×10⁴骨髓瘤细胞。置37℃，5％CO₂培养箱内培养。第二天，加入2×HAT的完全培养液，100μl/well，使孔内终浓度为1×HAT，杀死未融合的骨髓瘤细胞。

4.杂交瘤筛选

(1)ELISA检测法的建立

将甲型H1N1流感病毒疫苗用ELISA包被液稀释成5ug/ml包被到96孔板内，100μl/孔。用稀释液封闭后，加入待测孔内培养上清，同时加入阳性、阴性对照，阳性对照为稀释过的免疫后小鼠血清，阴性对照为未用过的培养液。随后加入HRP酶标记的羊抗小鼠Ig抗体(酶标二抗)，温育后用TMB-H₂O₂显色，反应10分钟后，加入2M H₂SO₄终止反应，以波长450nm测OD值。

(2)筛选单克隆抗体阳性的杂交瘤细胞

融合后10天左右，待杂交瘤细胞集落长至孔底1/5面积的时候，即用ELISA方法筛选融合细胞抗体阳性孔。

(3)杂交瘤细胞克隆化

选择抗体阳性且滴度高的孔用有限稀释法对其中的杂交瘤细胞进行克隆化，一般稀释到0.8个细胞/孔。待细胞培养至20％板底面积时，吸取细胞培养上清用ELISA方法再次筛选抗体阳性孔。若连续3次克隆，每次克隆率小于2/3和阳性率都为100％，这样获得的细胞即为单克隆。

结果：通过上述方法得到一株杂交瘤细胞系S-95-7，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO：C201024。

5.单克隆抗体腹水的制备

BALB/c小鼠，于腹腔注射0.5ml降植烷(pristane)。7-10天后，再次腹腔注射0.5ml 1×10⁶杂交瘤细胞。每天观察小鼠生长情况，7天左右可见腹部隆起，及时采集腹水。

6.杂交瘤细胞的冻存及复苏

冻存：

(1)挑选生长状态良好的细胞，去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入完全培养液使细胞悬浮；

(2)1000rpm离心10分钟，去上清。加入冻存液制成细胞悬液，使成1.0×10⁷细胞/ml；

(3)取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上；

(4)将细胞悬液分装冻存管，每瓶0.5ml-1.0ml；

(5)放-70℃冰箱；

(6)一周后，转入液氮罐内。

复苏：

(1)从液氮罐中取出冻存管，立即放37℃水浴中速溶；

(2)无菌操作打开冻存管，取出细胞悬液，转入含10ml完全培养液的离心管内；

(3)离心，1000rpm，3分钟；

(4)弃上清，加入完全培养液后混匀，转入培养瓶内，37℃二氧化碳培养箱内培养。

7.单克隆抗体Protein G纯化

(1)取2ml抗S-95-7的杂交瘤腹水，50％饱和硫酸铵沉淀初步纯化后，用紫外分光光度计测蛋白浓度；

(2)装Protein G-sepharose 4B柱子，并用约50ml PBS平衡；

(3)初步纯化后的蛋白上柱，并反复循环，1.5小时；

(4)PBS洗脱未结合于柱的蛋白，测蛋白浓度，直至洗脱液内无蛋白为止；

(5)用0.1M PH 2.7甘氨酸(glycine)洗脱结合在柱上的抗体，同时洗脱下来的液体用1M PH 9.0Tris-Hcl中和，使其PH值为中性；

(6)收集洗脱液，测蛋白浓度；

(7)用PBS洗涤柱子，使柱子的PH值为7.0左右；

结果：最后得到S-95-7抗体浓度为0.8mg/ml。

实施例2.单克隆抗体S-95-7滴度测定

1)包被抗原：用常规的包被液将昆虫系统表达的甲型H1N1流感HA蛋白(购自上海中科英沐生物科技有限公司)稀释至10μg/ml，50μl/孔，4℃放置过夜。

2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放3min，反复3次，将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

3)封闭：封闭液5％BSA 100μl/孔，37℃放置2h。

4)洗涤：同2)。

5)加样：一抗S-95-7 1∶10000起用2％BSA进行梯度稀释，50μl/孔。同时用抗RBP蛋白S-17-4抗体作阴性对照，37℃反应2h。

6)洗涤：同2)。

7)二抗：加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(中科英沐生物科技有限公司)，50μl/孔，37℃反应1h。

8)洗涤：同2)。

9)显色：加底物TMB，50μl/孔，室温下避光反应10-15min。

10)终止反应：加终止液2M浓H₂SO₄，50μl/孔。

11)结果检测：用酶联免疫检测仪在波长450nm下进行检测。

结果：抗体S-95-7最大稀释度为1/1280000。最佳工作浓度(OD450＝1)为1/80000。如图1所示。

实施例3.抗体S-95-7识别表位类型鉴定

1)包被抗原：用包被液将甲型H1N1流感疫苗灭活病毒总蛋白(华兰生物工程股份有限公司)分80℃处理与未处理组分别稀释至10μg/ml，50μl/孔，4℃放置过夜。

2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放3min，反复3次，将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

3)封闭：封闭液100μl/孔，37℃放置2h。

4)洗涤：同2)。

5)加样：加入S-95-7抗体，50μl/孔，37℃反应2h。

6)洗涤：同2)。

7)二抗：加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，50μl/孔，37℃反应1h。

8)洗涤：同2)。

9)显色：加底物TMB，50μl/孔，室温下避光反应10-15min。

10)终止反应：加终止液2M浓H₂SO₄，50μl/孔。

11)结果检测：用酶联免疫检测仪在波长450nm下进行检测。

结果：S-95-7抗体对加热变性后的甲型H1N1流感灭活病毒识别显著降低，如图2所示。可见该抗体是一株识别蛋白构象表位的抗体。

实施例4.抗体S-95-7特异识别甲型H1N1流感病毒HA蛋白

1)包被抗原：用包被液将昆虫系统表达的甲型H1N1流感HA蛋白分80℃处理与未处理组分别稀释至10μg/ml，50μl/孔，4℃放置过夜。

2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放3min，反复3次，将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

3)封闭：封闭液100μl/孔，37℃放置2h。

4)洗涤：同2)。

5)加样：加入S-95-7抗体，50μl/孔，37℃反应2h。

6)洗涤：同2)。

7)二抗：加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，50μl/孔，37℃反应1h。

8)洗涤：同2)。

9)显色：加底物TMB，50μl/孔，室温下避光反应10-15min。

10)终止反应：加终止液2M浓H₂SO₄，50μl/孔。

11)结果检测：用酶联免疫检测仪在波长450nm下进行检测。

结果：抗体S-95-7识别甲型H1N1流感HA蛋白，并且识别该蛋白的构象表位。如图3所示。

实施例5.抗体S-95-7特异识别甲型H1N1流感病毒HA蛋白HA1片段

1)包被抗原：用包被液将甲型H1N1流感HA蛋白的HA1片段(购自上海中科英沐生物科技有限公司)分80℃处理与未处理组分别稀释至10μg/ml，50μl/孔，4℃放置过夜。

2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放3min，反复3次，将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

3)封闭：封闭液100μl/孔，37℃放置2h。

4)洗涤：同2)。

5)加样：加入S-95-7抗体，50μl/孔，37℃反应2h。

6)洗涤：同2)。

7)二抗：加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，50μl/孔，37℃反应1h。

8)洗涤：同2)。

9)显色：加底物TMB，50μl/孔，室温下避光反应10-15min。

10)终止反应：加终止液2M浓H₂SO₄，50μl/孔。

11)结果检测：用酶联免疫检测仪在波长450nm下进行检测。

结果：抗体S-95-7识别甲型H1N1流感HA蛋白HA1片段，并且识别该蛋白的构象表位。如图4所示。

实施例6.抗体S-95-7是否识别季节性流感

1)包被抗原：用包被液将季节性流感疫苗灭活病毒(获自华兰生物生物工程股份有限公司)分80℃处理与未处理组分别稀释至10μg/ml，50μl/孔，4℃放置过夜。

2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放3min，反复3次，将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

3)封闭：封闭液100μl/孔，37℃放置2h。

4)洗涤：同2)。

5)加样：加入S-95-7抗体，50μl/孔，37℃反应2h。

6)洗涤：同2)。

7)二抗：加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，50μl/孔，37℃反应1h。

8)洗涤：同2)。

9)显色：加底物TMB，50μl/孔，室温下避光反应10--15min。

10)终止反应：加终止液2M浓H₂SO₄，50μl/孔。

11)结果检测：用酶联免疫检测仪在波长450nm下进行检测。

如图5所示。结果：抗体S-95-7不能识别季节性流感，因此该抗体可以用来区分甲型H1N1流感病毒和季节性流感病毒。并且，该实验证明该抗体具有良好的识别特异性。

实施例7.血凝及血凝抑制实验(HI实验)

一些动物红细胞(如鸡、火鸡豚鼠等)以及人“O”型血红细胞上有流感病毒血凝素(HA)受体，遇流感病毒可产生红细胞凝集现象，简称血凝。若将特异性抗体与流感病毒预先作用后再加入红细胞则不产生凝集，称为血凝抑制现象。用定量血凝素与不同稀释度血清抗体作用后，能完全抑制血凝的最高稀释度，即为血凝抑制抗体效价(HI效价)。

血凝是HA蛋白上HA1片段所发挥的功能，抑制血凝表明该抗体可抑制HA1的作用。

1.鸡红细胞悬液的制备

从静脉或心脏抽取正常健康鸡血，保存于阿氏(Alsevr’s)液中，置4℃保存。用前以PBS洗3次，末次经2000r/min离心10min，将红细胞用PBS配成1％浓度。

2.血凝实验

将甲型H1N1流感病毒在血凝板内用PBS从1∶5开始做系列倍比稀释，每孔0.25mL再加入等量1％鸡红细胞，摇匀，置室温或4℃30-45min后观察结果，以出现血凝的流感病毒最高稀释度为其血凝效价，即为1个血凝单位，血凝抑制实验时采用4个血凝素单位，例如血凝素效价为1∶320，为1个单位，4个单位即为1∶80稀释。

血凝抑制实验前经校对取4个血凝单位用于实验。

3.血凝抑制实验

1).将上述已处理的待检血清(1∶10)再用PBS做系列倍比稀释，每孔加0.25mL。

2).加入等量已配好的4个单位血凝素。

3).每孔加入0.25mL 1％鸡红细胞，摇匀置室温或4℃30-45min。

4).结果观察：观察结果时将血凝板倾斜数十秒钟，待阴性孔内红细胞自由下滑呈泪滴状时读结果。以出现完全抑制的血清最高稀释度的倒数为HI抗体滴度。

结果：血凝实验结果为抗体稀释度为1∶160时仍有血凝抑制作用，表示该抗体具有血凝抑制作用，从而判断该抗体是一株中和性抗体，也即其可特异性结合HA。

实施例8.假病毒(psuedo virus)中和实验

假病毒(pseudo type virus)是指一种病毒能够整合另外一种不同种类病毒的包膜糖蛋白，从而形成的具有外源性病毒的包膜而基因组保持着病毒本身基因组特性的病毒。

假病毒感染后，在细胞内只能进行单一周期复制，安全性好；其在体外环境下模拟天然病毒感染细胞的过程，具有广泛的宿主范围，更高效的转染静止细胞等优点。

目前国内外，已对一些危险的感染性很强的病毒构建了一系列以反转录病毒为载体的假病毒体系，如人免疫缺陷病毒，丙型肝炎病毒，埃博拉病毒，SARS冠状病毒，狂犬病毒等。

目前存在若干种假病毒制备系统。本发明以HIV病毒包装质粒pNL4-3Luc⁺Env^-Vpr^-(中科院巴斯德病毒研究所)为假病毒包装质粒，该质粒不具有感染能力以及进一步复制产生新一轮的病毒的能力，保证生物安全性。

甲型流感(H1N1)病毒是一种新型变异流感病毒，病毒表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)与病毒的致病性、复制及传播关系密切。

HA表面抗原介导了病毒与宿主细胞表面受体的结合，促进了病毒融合过程。NA促进成熟的病毒从宿主细胞中释放从而进一步感染其它宿主细胞。

本实施例通过构建真核表达载体pBudCE4.1-HA-NA，与包装质粒一起转染293T细胞，包装出具有感染性的H1N1假病毒，并通过中和实验证明单抗S-95-7具有中和作用。构建过程如下：将HA基因(其序列为GenBank登录号FJ966082中第1-1701位)插入到pBudCE4.1载体(购自Invitrogen公司)的BglII/NotI酶切位点中；将NA基因(其序列为GenBank登录号FJ969517中第1-1410位)插入到pBudCE4.1载体(购自Invitrogen公司)的SalI/XbaI酶切位点中，获得重组质粒，参见图6。

实验如下：

1.假病毒的包装(质粒共转染293T细胞)

1)转染前一天铺293T细胞(ATCC)于60mm皿中，细胞数为1.2×10⁶个，293T应在复苏后一个月内使用；

2)两种质粒：HA-NA-pBudCE4.1质粒和包装质粒pNL4-3(pNL4-3Luc⁺Env^-Vpr^-)的浓度混合成100ug/ml；用Lipofectamine^TM 2000进行转染，60mm皿共可转染质粒8ug，两种质粒用量各为4ug；

3)转染后6小时后将转染液换成培液；

4)转染后48小时收病毒：取贴壁细胞上清，3000rpm 5min离心，收集上清，分装后冻存在-70℃。

2.假病毒的感染力检测(感染MDCK细胞)

1)感染前一天，MDCK细胞铺24孔板，5×10⁴个/孔，MDCK应在复苏后一个月内使用；

2)感染前用胰蛋白酶(100ug/ml)37℃1小时处理假病毒；

3)感染时，每孔细胞用100ul假病毒+900ul培液(培液中已加血清)；

4)感染后24小时，每孔补加1ml新鲜培液；

5)感染后72小时，裂解MDCK细胞，测荧光素酶值确定病毒的感染力。

3.假病毒中和实验

用感染力稳定的H1N1假病毒检测单抗S-95-7的中和作用效果。

中和实验方法如下：

1)感染前一天MDCK细胞铺24孔板，5×10⁴个/孔，MDCK应在复苏后一个月内使用；

2)感染前用胰蛋白酶(100ug/ml)37℃1小时处理假病毒；

3)将100ul的假病毒+900ul含有不同浓度抗体的培液(抗体用培液倍比稀释，稀释度选自1∶500，1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000)，置培养箱内37℃1小时后，感染MDCK细胞。

对照设置：

VSVG(疱疹性口腔炎病毒假病毒系统，购自中科院巴斯德病毒研究所)：假病毒系统阳性对照；

阳性对照：H1N1假病毒100ul+900ul培液；

阴性对照：H1N1假病毒100ul+900ul培液+无关血清；

空白对照：直接加培液。

每组做两个复孔。

4)24小时后补液时也加入等比例稀释的抗体；

5)感染后72小时，裂解MDCK细胞，测荧光素酶值确定病毒的感染力。

结果如表1和图7。用H1N1假病毒检测S-95-7单抗(不同稀释度)，基本能将假病毒的感染力抑制到本底值，表明S-95-7这株单抗具有较强中和作用。

用不同批次的H1N1假病毒检测S-95-7单抗(不同稀释度)，即使稀释8000倍(即稀释度1∶8000)仍发现其有很强的中和作用(表2)。基本能将假病毒的感染力抑制到本底值，表明S-95-7这株单抗具有较强中和作用。

表1

表2

菌种保藏

本发明的S-95-7菌株已于2010年4月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉)，保藏登记号为CCTCC NO：C201024。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种特异性抗甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体，其由保藏号为CCTCC NO：C201024的杂交瘤细胞株产生。

2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测甲型H1N1流感病毒的试剂或试剂盒中的用途。

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备特异性结合甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白从而抑制HA1片段功能的组合物中的用途。

4.权利要求1所述的单克隆抗体在制备防治甲型H1N1流感病毒感染的组合物中的用途。

5.一种杂交瘤细胞株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCNO：C201024。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1所述的单克隆抗体；或含有权利要求5所述的杂交瘤细胞株。

7.一种组合物，其包含：

有效量的权利要求1所述的单克隆抗体；以及

药学上可接受的载体。

8.体外检测甲型H1N1流感病毒的非诊断性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白与固相载体上的第一抗体结合，形成带有“血凝素蛋白-第一抗体”二元复合物的固相载体；所述的第一抗体是权利要求1所述的单克隆抗体；

(b)将第二抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有“第二抗体-血凝素蛋白-第一抗体”三元复合物的固相载体；所述的第二抗体是抗甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的多克隆抗体；且所述的第二抗体携带一标记物；

(c)检测三元复合物中的标记物，确定待检测样品中甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的存在与否或存在的量，从而确定甲型H1N1流感病毒的存在与否或存在的量；

或者，包括以下步骤：

(a1)将待测样品包被于固相载体；

(a2)将检测抗体加样于(a1)的固相载体，从而使待测样品中的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白与固相载体上的检测抗体结合，形成带有“血凝素蛋白-检测抗体”二元复合物的固相载体；所述的检测抗体是权利要求1所述的单克隆抗体，且所述的检测抗体携带一标记物；

(a3)检测二元复合物中的标记物，确定待检测样品中甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白的存在与否或存在的量，从而确定甲型H1N1流感病毒的存在与否或存在的量。

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