CN112442112B - 一种银杏蛋白源ace抑制肽组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种银杏蛋白源ACE抑制肽组合物及其制备方法和应用，属于食品医药技术领域；所述银杏蛋白源ACE抑制肽组合物的主要由氨基酸序列为GFDGR、NDPGR、LDQTYRP、REHETIIL、LRMPGPPSSDDY和LRMPGPPSDDYER的六种小分子肽组成。具体制备过程包括：银杏蛋白的制备、水解银杏蛋白、酶解水解银杏蛋白得ACE抑制肽粗品以及银杏蛋白源ACE抑制肽组合物的分离纯化。本发明利用生物酶技术生产银杏蛋白源ACE抑制肽组合物，以ACE抑制活性为检测指标，建立生物酶技术生产银杏蛋白ACE抑制肽组合物的工艺过程和工艺参数，为工业化生产提供理论基础和技术支撑。

Description

一种银杏蛋白源ACE抑制肽组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及食品医药技术领域，具体涉及一种银杏蛋白源ACE抑制肽组合物及其制备方法和应用。
背景技术
高血压是对人类健康危害极大的一种慢性疾病。是冠心病、中风等心脑血管疾病的主要可控危险因素。研究结果表明，血压降低5mmHg等同于心脑血管疾病危险发生率减少16％，目前用于治疗高血压病的一线药物主要有：利尿剂、受体阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂、钙通道阻滞剂、受体阻断剂、血管紧张素受体拮抗剂等六大类。每年全世界抗高血压药物花费数千亿美元，同时在使用这些药物控制高血压过程中，可出现各种副作用，包括低血压、血钾水平升高、肾功能下降、咳嗽、血管水肿、皮疹以及胎儿畸形等。由于药物疗法存在副作用，安全、天然食物来源降血压功能因子的摄入今后将成为高血压非药物治疗的重要组成部分。
银杏蛋白具有营养功能之外，还具有重要的生理功能，是生物活性肽的良好来源，其中银杏蛋白源ACE抑制肽以安全性高、无副作用等优点，在高血压的防治中具有十分重要的研究价值和实用价值。有关银杏蛋白源ACE抑制肽的研究还处于起步阶段，目前研究报道较少，且仅停留在简单水解条件摸索，更没有商业化开发降血压作用的产品。因此，采用生物酶技术进行银杏蛋白源降血压肽的工业化生产技术的研究，开发出具有我国自主知识产权的银杏蛋白ACE抑制肽产品，具有重要的学术意义和实际应用价值。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种银杏蛋白源ACE抑制肽组合物及其制备方法和应用，用于实现应用天然、安全食物代替药物治疗高血压，避免目前高血压治疗药物使用过程中出现的各种副作用，建立生物酶技术生产银杏蛋白源ACE抑制肽组合物的工艺过程和工艺参数，为工业化生产提供理论基础和技术支撑。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种银杏蛋白源ACE抑制肽组合物，所述ACE抑制肽组合物主要由氨基酸序列为GFDGR、NDPGR、LDQTYRP、REHETIIL、LRMPGPPSSDDY和LRMPGPPSDDYER的六种小分子肽组成。
本发明提供一种所述银杏蛋白源ACE抑制肽组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)脱脂银杏白果粉的制备
将银杏白果粉经石油醚脱脂后得脱脂白果粉；
(2)银杏蛋白的制备
先将步骤(1)所得脱脂白果粉与水混合后加入NaOH调节其pH为10.0，再在40-45℃条件下保温提取，随后将提取液离心取上清后再用HCl调节pH为4～4.5，并离心去上清即得银杏蛋白粉；
(3)银杏蛋白的水解
先将步骤(2)所得银杏蛋白粉配制为蛋白溶液，再在蛋白溶液中加入NaOH溶液调节pH值，随后将蛋白溶液加酶水解；水解结束后离心并收集上清液，得银杏蛋白水解物；
(4)银杏蛋白水解物的超滤分离
将步骤(3)所得银杏蛋白水解物经超滤分离后得超滤透过液；
(5)银杏蛋白源ACE抑制肽粗品的制备
将步骤(4)中得到的超滤透过液进行冷冻干燥，即得银杏蛋白源ACE抑制肽粗品；
(6)银杏蛋白源ACE抑制肽组合物的制备
将步骤(5)所得银杏蛋白源ACE抑制肽粗品先利用二步反相色谱进行分离，再利用高效液相色谱进行纯化即得银杏蛋白源ACE抑制肽组合物。
进一步地，步骤(1)所述白果粉与石油醚的质量体积比为1:12。
进一步地，步骤(2)所述NaOH溶液的浓度为6mol/L，所述HCl溶液的浓度为6mol/L。
进一步地，所述离心的条件为4000r/min离心30min。
进一步地，步骤(3)所述水解过程中所用的酶为AS1.398中性蛋白酶。
进一步地，步骤(3)所述蛋白溶液浓度为7.17％。
进一步地，步骤(3)所述水解的条件为温度为45.61℃，酶与底物的质量比为5％，时间为6h。
进一步地，步骤(4)所述的超滤方式是通过截留分子量为3kDa超滤膜进行超滤。
本发明还提供一种所述银杏蛋白源ACE抑制肽组合物在制备防治高血压药物中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明所述银杏蛋白源ACE抑制肽组合物以安全性高、无副作用等优点，在高血压的防治中具有十分重要的研究价值和实用价值。
本发明对银杏蛋白源ACE抑制肽组合物水解的工艺进行优化，比较分析了四种蛋白酶的银杏蛋白水解物ACE抑制活性。研究结果表明，四种蛋白酶水解物具有不同的ACE抑制活性，其中，AS1.398中性蛋白酶水解物的ACE抑制活性最大。因此，我们可从此研究结果得知，蛋白酶的种类，是获得强ACE抑制肽的关键因素。
本发明在水解条件优化研究过程中，以ACE抑制活性为检测指标，利用三因素三水平的响应面试验设计，优化出ACE抑制肽组合物的最佳制备条件提取温度45.61℃，pH7.38，底物浓度7.17％，ACE抑制率为90.52％。
本发明采用了超滤技术和反相色谱技术，来分离纯化ACE抑制肽组合物，再采用二维质谱技术鉴定肽的氨基酸序列组成。利用超滤技术，可有效分离提取银杏蛋白源ACE抑制肽组合物。3kDa超滤膜所获得的超滤液具有最强的ACE抑制活性，这说明银杏蛋白水解物的ACE抑制活性，主要来源于分子量小于3kDa的短肽。选择source TM 5RPC ST 4.6/150反相色谱柱对ACE抑制肽功能性组分进行精细分离纯化。在一步反相色谱分离效果已经较好，但由于ACE抑制肽组分的性质较接近并且差别不大，可能得到的分离组分纯度不高，因此进行二步反相色谱，利用Advance Bio peptide色谱柱分离纯化后，得到的活性组分纯度较高。
本发明在分离纯化后进行氨基酸序列分析，鉴定出银杏蛋白源ACE抑制肽组合物中六个主要活性肽的氨基酸序列组成，采用4700串联飞行时间质谱仪进行质谱分析分别为GFDGR、NDPGR、LDQTYRP、REHETIIL、LRMPG PPSSDDY和LRMPGPPSDDYER。
附图说明
图1是分离纯化过程中一步反向色谱经3KDa超滤液经过SinoChrom ODS-BP C18色谱柱分离色谱图；
图2是对图1放大的3KDa超滤液经过SinoChrom ODS-BP C18色谱柱分离色谱图；
图3是对图2进行按色谱峰标记得到的不同组分不同洗脱收集管ACE抑制活性；
图4是G5组分经过Advance Bio peptide色谱柱的分离色谱图；
图5是对根据图4吸收峰进行分管收集，测定出来的每个收集管组分的ACE抑制活性；
图6是G5-2组分经过Advance Bio peptide色谱柱的分离色谱图；
图7是G5-2组分的一维质谱分析图；
图8是G5-2-1组分的二维质谱分析图；
图9是G5-2-2组分的二维质谱分析图；
图10是G5-2-3组分的二维质谱分析图；
图11是G5-2-4组分的二维质谱分析图；
图12是G5-2-5组分的二维质谱分析图；
图13是G5-2-6组分的二维质谱分析图；
图14是水解物ACE抑制活性与水解时间的关系。
具体实施方式
下面结合附图进一步说明本发明的实施例，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1银杏蛋白源ACE抑制肽组合物的制备
一、脱脂银杏白果粉的制备
将白果去壳、去掉膜质内种皮后，置于冷冻干燥机中，进行冻干24-48h，烘干后的白果在高速粉碎机中研磨，过筛后获得白果粉。
白果粉与石油醚以1:12(质量与体积)的比例充分混合后置于0-4℃，每隔1-2h搅拌1次，4-6h后更换石油醚，重复3-4次后，直到白果粉呈白色为止，随后将白果粉和石油醚分开，收集湿态的白果粉。最后，在通风系统中，常温条件下，直至石油醚挥发完全，制备脱脂白果粉。
二、银杏蛋白的制备
将脱脂白果粉溶于蒸馏水中，配制成料液比1：18的溶液，加入6mol/L的NaOH溶液，调节其pH为10.0，在40-45℃条件下，保温提取1h，随后在4000r/min离心30min，收集上清液；然后再用6mol/L的HCl调pH为4～4.5，静置2h，在4000r/min离心30min，收集沉淀，在冷冻干燥机中，进行真空干燥，即得银杏蛋白粉。
三、银杏蛋白的水解
精确称取一定量的白果蛋白粉，制成浓度为底物浓度7.17％蛋白溶液，加4mol/LNaOH溶液调节pH值为7.40，然后置于恒温水浴锅中，待反应体系温度达到45.6℃时，加入5％的As1.398中性蛋白酶进行水解，在整个水解过程中不断搅拌，并不断加入1mol/LNaOH以维持恒定的pH值。到水解6小时后，将反应体系在沸水浴中保温15-20min中止反应。将水解物在4000r/min下离心30min，收集上清液。
四、银杏蛋白水解物的超滤分离
将银杏蛋白水解物，经过截留分子量为3kDa超滤膜的超滤分离后，收集得到3kDa超滤透过液；
五、银杏蛋白源ACE抑制肽粗品的制备
将步骤(4)中得到的银杏蛋白水解物超滤液进行冷冻干燥，即得银杏蛋白源ACE抑制肽粗品。
六、银杏蛋白源ACE抑制肽组合物的制备
1、二步反相色谱技术分离ACE抑制肽粗品
(1)第一次反相色谱分离
酶法制备的银杏蛋白源ACE抑制肽粗品组成成分复杂，经过截留分子量为3KDa超滤膜超滤分离后，仅能得到ACE抑制活性强的组分，经高效液相色谱分析，组分纯度较低，不是单一成分组成，因此必须进行下步色谱分离。本发明选择SinoChrom ODS-BP C18反相色谱柱，对超滤分离后得到高活性组分进行进一步分离纯化，在220nm处，进行组分洗脱分离，反相色谱分离的试验结果如图1所示。
由于SinoChrom ODS-BP C18反相色谱柱分辨率高、选择性好，上样组分洗脱分离后仍出现若干个大小不同的吸收峰，峰形尖直且对称，分离效果好。将图1进行进一步放大，可得图2，对图2按色谱峰进行标记，即组分G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7和G8，然后按照上述标记的色谱峰，收集洗脱液，每个收集管组分ACE抑制活性的测定结果如图3所示。
从图3中ACE抑制活性测定结果表明，不同的洗脱液呈现出强弱不同的ACE抑制活性，其中洗脱收集G5组分的ACE抑制活性最强，因此，选择G5组分作为进一步分离纯化组分。重复多次上样收集G5组分，经旋转蒸发浓缩后再继续分离纯化。
(2)第二次反相色谱分离
一步反相色谱分离得到具有强ACE抑制活性的组分G5，利用高效液相色谱系统，采用Advance Bio peptide色谱柱，进行第二次反相色谱分离，在220nm处组分G5的洗脱分离色谱图如图4所示。
从图4的反相色谱分离结果可知，组分G5经反相色谱分离后可得到4个主要的吸收峰，即G5-1组分、G5-2组分、G5-3组分和G5-4组分。依据吸收峰进行分管收集，测定每个收集管组分的ACE抑制活性，试验结果如图5所示。
从图5的分析结果可知，G5-2最大吸收峰组分的ACE抑制活性最强。重复多次上样分别收集纯度较高的组分G5-2。
2、ACE抑制肽组合物的纯化、纯度鉴定及结构序列分析
(1)利用高效液相色谱系统，采用Advance Bio peptide色谱柱，对组分G5-2进行纯度鉴定。纯度鉴定后的色谱分离图如图6所示。
从图6试验结果分析可知，G5-2仅含有一个强吸收峰，其他的杂峰较少，纯度较高。
(2)质谱结构序列分析
A.一级质谱分析
将纯度较高的组分G5-2，利用4700串联飞行时间质谱仪进行质谱分析，一维质谱分析结果如图7所示。
从图7的质谱分析结果表明，组分G5-2主要含有六个主要吸收峰，分子量分别为593.30Da、600.24Da、892.42Da、1010.53Da、1247.54Da以及1532.68Da，分别记为G5-2-1、G5-2-2、G5-2-3、G5-2-4、G5-2-5和G5-2-6。这说明组分G5-2并不是由单一成分的物质构成，主要含有6-10种小肽，这也说明ACE抑制肽组合物的功效组分是小于2000Da的小肽。
B.二级质谱分析
将组分G5-2-1、组分G5-2-2、组分G5-2-3、组分G5-2-4、组分G5-2-5和组分G5-2-6进行MS/MS质谱鉴定分析，MS/MS质谱试验结果见图8、图9、图10、图11、图12和图13。
采用仪器软件4700 Explorer自带的分析工具，De Novo Explorer进行从头测序。测序的试验结果如表1所示。
表1银杏蛋白源ACE抑制肽组合物的氨基酸序列
Figure BDA0002792921670000101
从表1的测序结果可知，由G5-2组分中发挥功效作用的成分是由两个五肽、一个七肽、一个八肽、一个十二肽以及一个十三肽构成，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：6所示。
试验例1水解用酶的筛选
在银杏蛋白浓度为7％，E/S(酶与底物)为5％的条件下，分别在4种蛋白酶的最适温度和最佳反应pH的条件下进行水解银杏蛋白6h，水解反应结束后，在100℃沸水浴中保持15分钟使酶失活，然后4000r/min离心30min，取上清液进行冷冻干燥，干燥后测定4种蛋白酶水解物的ACE抑制活性。试验结果如表2所示。
表2种蛋白酶水解物的ACE酶抑制活性比较
Figure BDA0002792921670000102
Figure BDA0002792921670000103
Figure BDA0002792921670000111
注：Duncan，a＝0.01；字母在同一列数据中，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著。
对表2中水解物的ACE抑制活性进行Duncan新复极差法多重比较可知，AS1.398中性蛋白酶水解物的ACE抑制活性、胰蛋白酶水解物的ACE抑制活性、木瓜蛋白酶水解物的ACE抑制活性和Alcalase水解物的ACE抑制活性差异极显著(P<0.01)。4种蛋白酶水解物的ACE抑制活性的顺序为AS1.398中性蛋白酶>Alcalase>木瓜蛋白酶>胰蛋白酶；其中，AS1.398中性蛋白酶水解物的ACE抑制活性最大，约为87％左右。因此，当以ACE抑制活性作为选定水解用酶制备银杏蛋白源ACE抑制肽的指标时，应选择AS1.398中性蛋白酶作为水解用酶。另外，经细菌发酵制得的AS1.398中性蛋白酶，具有来源稳定，生产成本低等优点，并且该中性蛋白酶的反应条件温和，适于工业化生产的要求，是较理想的工业用酶。因此，本试验选用AS1.398中性蛋白酶作为试验用酶。
试验例2 AS1.398中性蛋白酶水解条件的优化
以AS1.398中性蛋白酶作为试验用酶，采用响应面的中心组合试验设计，筛选最佳的水解条件，其试验结果如表3所示。
表3 AS1.398中性蛋白酶的水解工艺优化中心组合的试验结果
Figure BDA0002792921670000112
Figure BDA0002792921670000121
采用Design-Expert 7.1软件，对表3中的响应值(ACE抑制活性)与各因素，进行回归拟合后，得到回归方程，并对回归方程的结果进行分析，回归分析结果如表4所示。
回归方程为：
Y＝89.61+2.31A+3.93B+0.67C+1.13AB-1.63AC-0.13BC-10.85A2-5.29B2-3.78C2；
表4回归分析结果
Figure BDA0002792921670000122
注：
Figure BDA0002792921670000123
差异显著；
Figure BDA0002792921670000124
差异高度显著；
Figure BDA0002792921670000125
差异极度显著。
由表4的分析结果可知，模型的F＝811.02，P<0.0001，表明实验所采用的二次模型是极显著的，在统计学上是有意义的。失拟项用来表示所用模型与实验拟合的程度，即二者差异的程度。本试验P＝0.4470>0.05，对模型是有利的，无失拟因素存在，因此可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。
因素A提取温度、因素B pH的P<0.0001，说明因素A、B对ACE抑制率的影响是极显著的；因素C底物浓度的P＝0.0011<0.01，说明因素C对ACE抑制率的影响是高度显著的。而A2、B2以及C2的P值均小于0.001，说明A2、B2和C2对ACE抑制率均有极显著影响。
交互项AB、AC的P值均小于0.001，所以交互项AB、AC对ACE抑制率有极度显著性影响。交互项BC的P＝0.4715大于0.015，所以交互项BC对ACE抑制率没有影响。
通过上述分析，可得出的最佳水解工艺条件为：提取温度45.61℃，pH7.38，底物浓度7.17％，ACE抑制率为90.52％。
在上述优化的最佳水解条件，进行验证试验分析，ACE抑制率为91.15％。
试验例3水解时间的优化
在AS1.398中性蛋白酶的最佳水解条件下，即银杏蛋白浓度为7％，E/S(酶与底物)为5％，pH为7.0，进行水解，分别在1、3、6、9、12、24h取样，然后灭酶、离心、取上清液进行冷冻干燥，干燥后测定不同水解时间条件下的水解物的ACE抑制活性，试验结果见图14。
从图14中的多重比较结果可知，水解时间为1h、3h、6h、24h的水解物ACE抑制活性差异显著(P<0.05)，而6h、9h和12h的水解物ACE抑制活性差异不显著(P>0.05)。在水解过程中，水解时间为1h内，水解物获得较高的ACE抑制活性，为76.71％。随着水解时间进一步延长，水解物的ACE抑制活性不断增加。当水解时间为12h，ACE的抑制活性达到最大(90.45％)，然后ACE抑制活性缓慢降低；当水解时间为24h，所获得的水解物的ACE活性降低至73.86％。从上述结果可知，水解时间太长，水解物的ACE抑制活性会降低，因此，选择AS1.398中性蛋白酶的最佳水解时间为6h。
试验例4超滤分离对酶解物ACE抑制活性的影响
经过不同截留分子量的超滤分离后，收集得到3kDa超滤组分、3-10kDa超滤组分和10kDa以上超滤组分，测定其ACE抑制活性，试验结果见表5。
表5超滤对酶解物ACE抑制活性的影响
Figure BDA0002792921670000141
Figure BDA0002792921670000142
注：Duncan，a＝0.01；字母在同一列数据中，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著。
从表5分析结果可知，银杏蛋白酶解物经过超滤分离后，不同截留分子量超滤液的ACE抑制活性差异极显著(P<0.01)。银杏蛋白酶解液经10kDa和3kDa的超滤膜提取分离后，提高其ACE抑制活性。与银杏蛋白酶解液相比，3-10kDa超滤组分和3kDa超滤组分的ACE抑制活性显著提高(P<0.01)。3-10kDa超滤组分的ACE抑制活性是银杏蛋白酶解液ACE抑制活性的1.12倍；3kDa超滤组分的ACE抑制活性是银杏蛋白酶解液ACE抑制活性的1.32倍；10kDa以上超滤浓缩液组分的ACE抑制活性比银杏蛋白酶解液降低了7.95％。由此可见，超滤可有效分离银杏蛋白源ACE抑制肽组合物，可提高酶解物的ACE抑制活性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种银杏蛋白源ACE抑制肽组合物及其制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Phe Asp Gly Arg
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asn Asp Pro Gly Arg
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu Asp Gln Thr Tyr Arg Pro
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Glu His Glu Thr Ile Ile Leu
1 5
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Leu Arg Met Pro Gly Pro Pro Ser Ser Asp Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Leu Arg Met Pro Gly Pro Pro Ser Asp Asp Tyr Glu Arg
1 5 10

Claims (6)

1.一种银杏蛋白源ACE抑制肽组合物，其特征在于，所述ACE抑制肽组合物主要由氨基酸序列为GFDGR、NDPGR、LDQTYRP、REHETIIL、LRMPGPPSSDDY和LRMPGPPSDDYER的六种小分子肽组成。
2.一种根据权利要求1所述银杏蛋白源ACE抑制肽组合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)脱脂银杏白果粉的制备
将银杏白果粉经石油醚脱脂后得脱脂白果粉；
(2)银杏蛋白的制备
先将步骤(1)所得脱脂白果粉与水混合后加入NaOH调节其pH为10.0，再在40-45℃条件下保温提取，随后将提取液离心取上清后再用HCl调节pH为4～4.5，并离心去上清即得银杏蛋白粉；
(3)银杏蛋白的水解
先将步骤(2)所得银杏蛋白粉配制为底物浓度为7.17％的蛋白溶液，再在蛋白溶液中加入NaOH溶液调节pH值为7.40，待反应体系温度达到45.6℃，加入5%的AS1.398中性蛋白酶进行水解；水解6小时后，离心并收集上清液，得银杏蛋白水解物；
(4)银杏蛋白水解物的超滤分离
将步骤(3)所得银杏蛋白水解物经过截留分子量为3kDa超滤膜超滤分离后得超滤透过液；
(5)银杏蛋白源ACE抑制肽粗品的制备
将步骤(4)中得到的超滤透过液进行冷冻干燥，即得银杏蛋白源ACE抑制肽粗品；
(6)银杏蛋白源ACE抑制肽组合物的制备
将步骤(5)所得银杏蛋白源ACE抑制肽粗品先利用SinoChrom ODS-BP C18反相色谱柱进行分离纯化，在220nm处，进行组分洗脱分离，收集测定ACE抑制活性最强的组分，再利用Advance Bio peptide色谱柱在220nm处进行分离纯化，收集测定ACE抑制活性最强的组分，再利用Advance Bio peptide色谱柱进行纯化即得银杏蛋白源ACE抑制肽组合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述白果粉与石油醚的质量体积比为1:12。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述NaOH溶液的浓度为6mol/L，所述HCl溶液的浓度为6mol/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离心的条件为4000r/min离心30min。
6.一种权利要求1所述银杏蛋白源ACE抑制肽组合物在制备防治高血压药物中的应用。
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