CN113072621A - 一种牦牛骨降血压肽及其制备方法与应用 - Google Patents

一种牦牛骨降血压肽及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物活性肽技术领域，具体涉及一种牦牛骨降血压肽及其制备方法与应用。本发明制备得到一种具降血压作用的牦牛骨肽，所述牦牛骨肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。制备所述牦牛骨肽的方法包括：牦牛骨预处理、两步酶解法、酶解产物超滤、多肽粗液凝胶层析、反相高效液相色谱分离纯化。本发明提供的牦牛骨肽食用安全性高，体外具有很强的ACE抑制活性，还具有很强的体内降血压活性，对自发性高血压大鼠没有副作用，且分子对接显示牦牛骨肽与血管紧张素转换酶(ACE)结合紧密。

Description

一种牦牛骨降血压肽及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物活性肽技术领域，具体涉及一种牦牛骨降血压肽及其制备方法与应用。
背景技术
牦牛骨肽蕴含人体必需氨基酸，人体中有8种氨基酸不能自身合成，必须依赖于外源性的补充。牦牛骨肽特有地参与全身代谢的生理功能，在提高免疫力、辅助特殊病人强壮身体、强健骨骼、针对胶原病变均有很好的营养食疗作用。
近年来，许多研究者从不同的原料中分离纯化出多种活性肽。由于活性肽具有较高的特异性和效价，以及较低的毒性，在长期服用的治疗中极具潜力。降血压肽是活性肽中的一种，它能够降低高血压患者的血压，且对正常血压的人无影响。降血压肽通过抑制ACE酶的活性，减少Ⅱ型血管紧张素(AngⅡ)的生成，进而降低血压。现有的研究有CN101798587A《玉米降血压肽的分离纯化方法》采用板框过滤器过滤去掉杂质，再经膜过滤，然后通过高效液相色谱分析确定目标产物分子量，可以分离出纯度相对较高的玉米降血压肽。CN102453741A《一种高活性玉米降血压肽的制备方法及专用装置》通过超滤分级，纳滤膜脱盐，获得高活性的玉米降血压肽，发现能显著降低自发性高血压大鼠的收缩压。CN104031967A《一种沙丁鱼降血压肽及其制备方法与应用》通过酶解获得的沙丁鱼降血压肽，不存在安全性问题，没有化学降血压类药物的副作用，降压效果理想。CN106498015A《一种菲律宾蛤仔降血压肽的制备方法及应用》通过发酵处理的菲律宾蛤仔降血压肽，其提取的肽纯度高，活性强，对ACE抑制效果显著。CN109503699A《一种带鱼鱼肉降血压肽》发现对自发性高血压大鼠(SHR)体重无明显影响，对SHR心率无明显影响。
发明内容
本发明以开发具有降血压作用的牦牛骨肽为研究目标，针对牦牛骨的特点获取具有特定功能的牦牛骨肽，并将制备工艺规范化、具体化。牦牛骨中所含物质丰富且复杂，经蛋白酶酶解后产生的多肽产物含有大量未知序列、未知功能的多肽，而具有特定功能的活性肽的组分很难通过某些共性特征将其区分。现有技术获取的很多牦牛骨蛋白肽并不具备特定功能。
很多方法虽然能够获得分子量较小的蛋白肽，但获得的肽根本不具有降血压的功能，或者功能较差；本发明在研发中，不断优化制备方法，获得了获取牦牛骨降血压肽的方法。
本发明的目的是提供一种具降血压作用的牦牛骨肽及其制备方法与应用。
第一方面，本发明提供包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示多肽的牦牛骨降血压肽。
具体地，本发明提供的具降血压作用的牦牛骨肽中包括氨基酸序列为SASVIPVSAVRA的多肽。
第二方面，本发明提供具降血压作用的牦牛骨肽的制备方法，以牦牛骨为原料，所述原料经两步酶解，高温灭活后获取降血压肽酶解液，离心并超滤所述降血压肽酶解液，得牦牛骨肽粗品。
在本发明提供的制备方法中，所述原料经高速搅拌机搅拌后，于40～50℃中自溶2.5～3.5h，自溶底物喷雾干燥过200目筛。
在本发明提供的制备方法中，两步酶解时第一步酶解反应的温度为50～65℃，pH值为6.9～7.5，向蛋白重量8～10wt％的牦牛骨蛋白液中加入0.2～0.5wt％中性蛋白酶，反应时间为1.75～2.25h；第二步酶解反应的温度为55～65℃，pH值为8.0～9.0，复合蛋白酶添加量为0.2～0.5wt％，反应时间为1.0～2.0h；所述复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶。两步酶解完成后，高温灭活的温度为95～105℃，时间为15～20min。
在本发明提供的制备方法中，所述降血压肽酶解液，在8000～10000rpm转速下离心10～20min后，使用2000Da以下的超滤膜过滤，得牦牛骨肽粗品。
本发明提供的制备方法中，还包括使用SephadexG-25凝胶柱进行牦牛骨肽粗品肽段的分离，吸光度为220nm，收集第2个洗脱峰；反相高效液相色谱分离纯化时，检测波长为220nm，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中9～12min中的肽洗脱液。
具体地，一种制备牦牛骨降血压肽的方法包括：
(1)预处理，牦牛骨破碎过200目筛、匀浆、调pH至7.0；
(2)两步酶解法，加入占蛋白重量0.3wt％的中性蛋白酶，55℃下酶解2h，向第一步酶解反应产物中加入0.3wt％复合蛋白酶55℃下酶解2h，100℃灭酶15min；
(3)超滤，将灭活后的肽酶解液离心(8000r,4℃,15min)，超滤膜为截留分子量为2000Da以下的超滤膜，得到多肽粗液，浓缩、冻干；
(4)凝胶层析，冻干后的粉末配成溶液选用Sephadex G-25凝胶柱进行分离，分离条件为：玻璃柱(1.5cm×100cm)，上样浓度为200mg/mL，上样量400μL，流速为60mL/h，灵敏度为1.0，吸光度为220nm；
(5)反相高效液相色谱分离，将凝胶层析分离得到IC50功能性最强的组分溶于水中，配成蛋白浓度1mg/mL的溶液用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离纯化，分离条件：进样体积，100μL；流速，1mL/min；洗脱液，A液:0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液；B液:0.1％TFA乙睛溶液；线性洗脱梯度，0～10min,0～5％B；10～20min,5％～19％B；20～29min,19％～90％B；29～40min,90％～0％B；柱温：35℃；检测波长，220nm；收集IC50功能性最强的组分；
(6)质谱测序，分离纯化结束后用ESI-MS-MS和MALDI-TOF-MS对活性最高的组分进行结构和序列的鉴定。
本发明从牦牛骨中分离纯化得到的降血压肽，是效果显著的降血压物质。不仅能够降低牦牛骨的浪费率，同时增加了牦牛骨的附加值，增加牦牛骨的经济价值。
第三方面，本发明要求保护，上述具降血压作用的牦牛骨肽在制备缓解高血压的药品、食品或保健品中的应用。
第四方面，本发明要求保护，一种血管紧张素转化酶活性抑制剂，含有上述具降血压作用的牦牛骨肽。
本发明的有益效果至少在于：
(1)本发明所述制备方法所用原料为骨料废弃物牦牛骨，在高原地区产量高。
(2)本发明所述制备方法采用双酶法对牦牛骨进行酶解，酶解效果好，能有效地将牦牛骨蛋白酶解成具降血压功能的多肽。
(3)本发明所述牦牛骨降血压肽食用安全性高，在体外具有很强的ACE抑制活性外，还具有很强的体内降血压活性，对自发性高血压大鼠没有副作用。
(4)在分子对接中显示，本发明提供的牦牛骨降血压肽与血管紧张素转换酶(ACE)结合紧密。
(5)本发明所述牦牛骨降血压肽可应用于食品工业、制药工业、饲料工业等。
附图说明
图1为本发明实施例1中降血压肽段初次柱层析纯化的色谱图。
图2为本发明实施例1中降血压肽段反相液相纯化的色谱图。
图3为本发明实施例1中降血压肽段纯品的一级和二级质谱图。
图4为本发明实验例2中降血压肽段对自发性高血压大鼠的降压效应图。
图5为本发明实验例3降血压肽段于ACE结合的最佳对接结构图。
图6为本发明实验例3降血压肽段与ACE氨基酸残基相互作用的2D图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1牦牛骨降血压肽的制备
(1)预处理，200g牦牛骨破碎过筛、匀浆、调pH至7.0；
(2)两步酶解法，加入占蛋白重量0.3wt％的中性蛋白酶，55℃下酶解2h，向第一步酶解反应产物中加入0.3wt％复合蛋白酶55℃下酶解2h，100℃灭酶15min；
(3)超滤，将灭活后的肽酶解液离心(8000r,4℃，15min)，超滤膜为截留分子量为2000Da以下的超滤膜，得到多肽粗液，浓缩、冻干；
(4)凝胶层析，冻干后的粉末配成溶液选用Sephadex G-25凝胶柱进行分离，分离条件为：玻璃柱(1.5cm×100cm)，上样浓度为200mg/mL，上样量400μL，流速为60mL/h，灵敏度为1.0，吸光度为220nm，收集第2个洗脱峰；柱层析纯化的质谱图见图1；
(5)反相高效液相色谱分离，将凝胶层析分离得到IC50功能性最强的组分溶于水中，配成蛋白浓度1mg/mL的溶液用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离纯化，分离条件：进样体积，100μL；流速，1mL/min；洗脱液，A液:0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液；B液:0.1％TFA乙睛溶液；线性洗脱梯度，0～10min,0～5％B；10～20min,5％～19％B；20～29min,19％～90％B；29～40min,90％～0％B；柱温：35℃；检测波长，220nm，收获9～12min收集得到的肽液；反相液相纯化的色谱图如图2；
(6)质谱测序，分离纯化结束后用ESI-MS-MS和MALDI-TOF-MS对活性IC50最高的组分进行结构和序列的鉴定；一级及二级的质谱图见图3，经过一级质谱和二级质谱的鉴定后，分析得到降血压肽纯品的序列为Ser-Ala-Ser-Val-Ile-Pro-Val-Ser-Ala-Val-Arg-Ala，为未被发现的新型降血压肽段。
实施例2牦牛骨降血压肽的制备
(1)预处理，600g牦牛骨破碎过筛、匀浆、调pH至7.0；
(2)两步酶解法，加入占蛋白重量0.4wt％的中性蛋白酶，60℃下酶解2.2h，向第一步酶解反应产物中加入0.4wt％复合蛋白酶60℃下酶解2h，100℃灭酶15min；
(3)超滤，将灭活后的肽酶解液离心(9000r,4℃,15min)，超滤膜为截留分子量为2000Da以下的超滤膜，得到多肽粗液，浓缩、冻干；
(4)凝胶层析，冻干后的粉末配成溶液选用Sephadex G-25凝胶柱进行分离，分离条件为：玻璃柱(1.5cm×100cm)，上样浓度为200mg/mL，上样量400μL，流速为60mL/h，灵敏度为1.0，吸光度为220nm，收集第2个洗脱峰；
(5)反相高效液相色谱分离，将凝胶层析分离得到的功能性最强的组分溶于水中，配成蛋白浓度1mg/mL的溶液用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离纯化，分离条件：进样体积，100μL；流速，1mL/min；洗脱液，A液:0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液；B液:0.1％TFA乙睛溶液；线性洗脱梯度，0～10min,0～5％B；10～20min,5％～19％B；20～29min,19％～90％B；29～40min,90％～0％B；柱温：35℃；检测波长，220nm，收获9～12min收集得到的肽液；色谱图与图2类似。
(6)质谱测序，分离纯化结束后用ESI-MS-MS和MALDI-TOF-MS对活性IC50最高的组分进行结构和序列的鉴定；经过一级质谱和二级质谱的鉴定后，分析得到降血压肽纯品的序列为Ser-Ala-Ser-Val-Ile-Pro-Val-Ser-Ala-Val-Arg-Ala。
实施例3牦牛骨降血压肽的制备
(1)预处理，1000g牦牛骨破碎过筛、匀浆、调pH至7.0；
(2)两步酶解法，加入占蛋白重量0.5wt％的中性蛋白酶，65℃下酶解2.2h，向第一步酶解反应产物中加入0.5wt％复合蛋白酶60℃下酶解2h，100℃灭酶15min；
(3)超滤，将灭活后的肽酶解液离心(10000r,4℃,20min)，超滤膜为截留分子量为2000Da以下的超滤膜，过滤离心后的上清液得到多肽粗液，浓缩、冻干；
(4)凝胶层析，冻干后的粉末配成溶液选用Sephadex G-25凝胶柱进行分离，分离条件为：玻璃柱(1.5cm×100cm)，上样浓度为200mg/mL，上样量400μL，流速为60mL/h，灵敏度为1.0，吸光度为220nm，收集第2个洗脱峰；
(5)反相高效液相色谱分离，将凝胶层析分离得到的功能性最强的组分溶于水中，配成蛋白浓度1mg/mL的溶液用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离纯化，分离条件：进样体积，100μL；流速，1mL/min；洗脱液，A液:0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液；B液:0.1％TFA乙睛溶液；线性洗脱梯度，0～10min,0～5％B；10～20min,5％～19％B；20～29min,19％～90％B；29～40min,90％～0％B；柱温：35℃；检测波长，220nm，收获9～12min收集得到的肽液；色谱图与图2类似。
(6)质谱测序，分离纯化结束后用ESI-MS-MS和MALDI-TOF-MS对活性最高的组分进行结构和序列的鉴定；经过一级质谱和二级质谱的鉴定后，分析得到降血压肽纯品的序列为Ser-Ala-Ser-Val-Ile-Pro-Val-Ser-Ala-Val-Arg-Ala。
实验例1血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性检测方法
1、牦牛骨肽SASVIPVSAVRA
试验样品：实施例1、实施例2、实施例3制备的牦牛骨降血压肽ACE抑制能力按照如下方法进行：
在离心管中加入80μL 5mmol/L HHL(马尿酰-组氨酰-亮氨酸)(溶于HEPES缓冲液，pH8.3)和30μL不同浓度的样品溶液，样品来源于实施例1、2、3所得到的氨基酸序列为SASVIPVSAVRA的牦牛骨肽(溶于双蒸水)，混合后置于37℃水浴5min，再加入40μL 0.025U/mL ACE(溶于HEPES缓冲液，pH8.3)，37℃孵育1h，然后加入150μL 1M盐酸终止反应，作为处理组。
空白组在加入ACE的同时加入盐酸，对照组使用30μL双蒸水代替样品溶液，卡托普利(10ng/mL)作为阳性对照。反应完成后用RP-HPLC检测处理组中马尿酸(HA)的含量，通过与马尿酸标准品峰面积比较计算得出检测样品中马尿酸含量。
色谱条件：色谱柱(CAPCELL PAK C18 AQ S-5,4.6×150mm)，柱温30℃，流动相A：水+0.2％三氟乙酸，流动相C：乙腈，流动相比例A：C＝80％：20％，流速1.0mL/min，检测波长：228nm，进样体积100μL，分析时间10min。抑制率I％＝([HA]b-[HA]s)/([HA]b-[HA]c)×100％，其中[HA]b表示对照组的马尿酸峰面积，[HA]s表示样品的马尿酸峰面积，[HA]c表示的空白组的马尿酸峰面积。
结果分析：
实施例1所得序列为SASVIPVSAVRA的牦牛骨肽对ACE抑制有较高的活性其IC50达到54.22μM；实施例2所得序列为SASVIPVSAVRA的牦牛骨肽对ACE抑制有较高的活性其IC50达到53.83μM；实施例3所得序列为SASVIPVSAVRA的牦牛骨肽对ACE抑制有较高的活性其IC50达到53.38μM；证实本发明所得具降血压作用的牦牛骨肽有广泛的应用前景。
2、多肽粗液冻干粉的ACE抑制效果
在离心管中加入80μL 5mmol/L HHL(马尿酰-组氨酰-亮氨酸)(溶于HEPES缓冲液，pH8.3)和30μL不同浓度的样品溶液，样品溶液来源于实施例1、2、3步骤(3)超滤后得到的多肽粗液的冻干粉(溶于双蒸水)，混合后置于37℃水浴5min，再加入40μL 0.025U/mL ACE(溶于HEPES缓冲液，pH8.3)，37℃孵育1h，然后加入150μL 1M盐酸终止反应，作为处理组。
空白组在加入ACE的同时加入盐酸，对照组使用30μL双蒸水代替样品溶液，卡托普利(10ng/mL)作为阳性对照。反应完成后用RP-HPLC检测样品中马尿酸(HA)的含量，通过与马尿酸标准品峰面积比较计算得出检测样品中马尿酸含量。
色谱条件：色谱柱(CAPCELL PAK C18 AQ S-5,4.6×150mm)，柱温30℃，流动相A：水+0.2％三氟乙酸，流动相C：乙腈，流动相比例A：C＝80％：20％，流速1.0mL/min，检测波长：228nm，进样体积100μL，分析时间10min。抑制率I％＝([HA]b-[HA]s)/([HA]b-[HA]c)×100％，其中[HA]b表示对照组的马尿酸峰面积，[HA]s表示样品的马尿酸峰面积，[HA]c表示的空白组的马尿酸峰面积。
结果分析：
实施例1的步骤(3)所得粗肽溶液对ACE抑制有较高的活性其IC50达到1.47mg/mL，实施例2的步骤(3)所得粗肽溶液对ACE抑制有较高的活性其IC50达到1.36mg/mL，实施例3的步骤(3)所得粗肽溶液对ACE抑制有较高的活性其IC50达到1.32mg/mL。(因粗肽溶液无法得知分子量大小，所以只能用单位mg/mL表示)。
实验例2降血压肽动物降血压实验
采用尾袖法测定自发性高血压大鼠收缩压(SBP)的变化，探讨实施例1制得的多肽SASVIPVSAVRA的体内降压作用。20只雌性SHR，体重230±15g，收缩压(SBP)超过190mmhg。每只SHR定期接受25±4℃和40±6％湿度的饲料和自来水。为使大鼠适应环境，每天测量一次收缩压，每次重复测定5次，连续1周。SHR在适应一周后随机分为3组，每组6只进行实验。
分别将合成SASVIPVSAVRA和卡托普利溶于蒸馏水中作为样品组(10mg/kg BW)和阳性对照组(10mg/kg BW)。阴性对照组为无菌水。每天给药1次，在给药后0、2、4和6小时内，使用Softron BP无创血压监测仪(Softron BP-2000，日本东京)在37℃下测量ACE抑制剂对SBP的影响。测定之前，将大鼠在38℃条件下保温，稳定后进行测定，每次重复测定5次，取平均值即为SHR的收缩压。
结果如图4所示，相比给药前，牦牛降血压肽SASVIPVSAVRA在给药后的6小时内能够显著降低自发性高血压大鼠的收缩压，与空白对照组相比血压降低明显，这说明该降血压肽具有优秀的降血压功效。
实验例3功能性肽SASVIPVSAVRA与ACE的分子对接模拟
功能性肽SASVIPVSAVRA由Discovery Studio 3.5(DS，2.1版)进行了分子对接。以功能肽结合ACE复合物(PDB:1O86A)晶体结构进行建模。在分子对接前去除水分子和配体，并在ACE模型中加入Zn2+和Cl-来优化ACE的结构。分子对接的活性位点坐标为X:43.249，Y:33.469，Z:42.325，对接半径为15°。对接模拟图见图5及图6。
通过对接模拟，图5显示了肽SASVIPVSAVRA在ACE活性位点的最佳对接姿势。相互结合能为153.031kj/mol，图6展示了肽SASVIPVSAVRA与ACE氨基酸残基的结合主要依赖于范德华力、氢键和金属受体。肽存在于ACE活性位点的窄通道中，与ACE形成13个氢键。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 安徽国肽生物科技有限公司
<120> 一种牦牛骨降血压肽及其制备方法与应用
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Ala Ser Val Ile Pro Val Ser Ala Val Arg Ala
1 5 10

Claims (10)

1.具降血压作用的牦牛骨肽，其特征在于，包括氨基酸序列为SASVIPVSAVRA的多肽。
2.具降血压作用牦牛骨肽的制备方法，其特征在于，以牦牛骨为原料，所述原料经中性蛋白酶和复合蛋白酶两步酶解后，高温灭活获取降血压肽酶解液，离心并超滤所述降血压肽酶解液，得牦牛骨肽粗品。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述原料经高速搅拌机搅拌后，于40～50℃中自溶2.5～3.5h，自溶底物喷雾干燥过200目筛。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，两步酶解中，第一步酶解反应为：向蛋白重量8～10wt％的牦牛骨蛋白液中加入0.2～0.5wt％中性蛋白酶，在温度50～65℃和pH值为6.9～7.5条件下进行酶解反应1.75～2.25h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，两步酶解中，第二步酶解反应为：向第一步酶解反应产物中加入0.2～0.5wt％复合蛋白酶，在温度55～65℃和pH值为8.0～9.0条件下进行酶解反应1.0～2.0h，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶。
6.根据权利要求2-5任一项所述的制备方法，其特征在于，两步酶解完成后，高温灭活的温度为95～105℃，时间为15～20min。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，降血压肽酶解液在8000～10000rpm转速下离心10～20min后，使用2000Da以下的超滤膜过滤，得牦牛骨肽粗品。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括，使用Sephadex G-25凝胶柱进行牦牛骨粗品中肽段的纯化分离，吸光度为220nm，收集第2个洗脱峰；反相高效液相色谱分离纯化时，检测波长为220nm，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中9～12min中的肽洗脱液。
9.权利要求1所述牦牛骨肽或权利要求2～8任一所述的制备方法制得的牦牛骨肽在制备缓解高血压的药品、食品或保健品中的应用。
10.一种血管紧张素转化酶活性抑制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的牦牛骨肽或权利要求2～8任一所述的制备方法制得的牦牛骨肽。
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