NO300138B1 - Anti-thrombinpolypeptider - Google Patents

Description

Foreliggende beskrivelse angår polypeptider samt fremstilling derav. Polypeptidene er blitt isolert fra iglen Hirudinaria manillensis. Polypeptidene har anti-trombinegenska-per.

De mest populære antikoaguleringspeptider er sannsynligvis de som tilhører familien hirudiner. Hirudin, opprinnelig isolert fra den medisinske igle Hirudo medicinalis, er en velkjent og vel karakterisert polypeptidinhibitor for trombin<1,2>. Mere spesielt binder det trombin ved ioniske interaksjoner og forhindrer således spaltning av fibrinogen til fibrin og den etterfølgende fibrinagregeringsdannelse.

I animalske studier har hirudin vist effektivitet i å forhindre venøs trombose, vaskulær shunt okklusjon og trombin-indusert disseminert intravaskulær koagulering. I tillegg oppviser hirudin lav toksisitet, liten eller ingen antigenisitet og har en meget kort oppklaringstid fra sirkulasjonen<3>.

Polypeptider med antikoagulerende egenskaper er blitt isolert fra en annen igleart, Hirudinaria manillensis (EP-A-0347376 og WO 90/05143) . Denne igle er utviklingsmessig mer avansert enn Hirudo medicinalis og kan derfor syntetisere antikoagulerende peptider hvis aminosyresekvenser kan være forskjellige fra de til hirudin og andre kjente hiru-dinvarianter.

Søker har analysert et preparat erholdt fra Hirudinaria manillensis igler. Det er blitt funnet tre ny polypeptider med anti-trombinaktivitet. Følgelig fremskaffer foreliggende oppfinnelse et polypeptid omfattende aminosyresekvensen. samt farmasøytisk akseptable salter derav, hvori Yaa er Asp eller Tyr og Zaa er -0H, -NH2 eller Gly-OH.

Aminosyreresiduene er angitt i henhold til trebokstavkoden (Eur. J. Biochem. 138, 9-37, 1984). Et residuum Yaa representerer et Asp eller Tyr residuum og Zaa er -0H, -NH2 eller Gly-OH. Saltene kan være syreaddisjonsalter. De kan være salter med en organisk syre, såsom en hydrohalogensyre såsom saltsyre, svovelsyre, fosforsyre eller pyrofosfor-syre. Saltene kan være salter med en organisk syre såsom benzensulfonsyre, p-toluensulfonsyre, metansulfonsyre, eddiksyre, melkesyre, palmitinsyre, stearinsyre, eplesyre, vinsyre askorbinsyre eller sitronsyre. Polypeptidene inneholder også frie karboksylgrupper og kan følgelig være tilstede som natrium, kalsium, kalium, magnesium eller ammoniumsalter eller salter med en fysiologisk tolererbar organisk nitrogeninnholdende base. Polypeptidene kan også være i form av innersalter.

Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse består i hovedsak av aminosyresekvensene (i) til (iii). De naturlige polypeptider isolert fra hirudinaria manillensis igler har aminosyresekvensen (i) eller (ii) hvor Yaa er Asp og Zaa er -0H eller den partisielle aminosyresekvens (iii) . Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan bli isolert og renset for bruk som anti-trombinmiddel.

Polypeptidene kan bli fremstilt etterfølgende av hele eller deler av en ledersekvens. Ledersekvensen kan være en nativ eller fremmed ledersekvens med hensyn til cellen hvor polypeptidet blir erholdt. Ledersekvensen er istand til å dirigere utskillelse av polypeptidet fra cellen. To av de naturlige polypeptider ifølge oppfinnelsen blir uttrykt med en ledersekvens som etterfølgende spaltes av. Alt eller deler av denne ledersekvens kan følgelig være tilstede hvor sekvensen er: Met Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val Cys Ile Cys Val Ser Gin Ala.

Et naturlig polypeptid i henhold til oppfinnelsen eller salter derav kan bli fremstilt ved å isolere nevnte polypeptid eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav fra vevet eller sekretene fra en igle av arten Hirudinaria manillensis. Mere spesielt kan et polypeptid ifølge oppfinnelsen bli erholdt ved å fremskaffe et preparat i henhold til WO 90/05143 og underkaste preparatet høytrykksvæskekro-matografi.

Et polypeptid i henhold til oppfinnelsen, eller et salt derav kan også bli fremstilt ved:

(a) å fremskaffe en vertsorganisme transformert med en ekspresjonsvektor omfattende en DNA sekvens som koder for nevnte polypeptid under slike betingelser at nevnte polypeptid blir uttrykt deri, og b) isolere nevnte polypeptid således erholdt eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav. Denne metode er typisk basert på å erholde en nukliotid-sekvens som koder for polypeptidet, det ønskes å uttrykke polypeptidet i rekombinante organismer. Dyrkningen av de genetisk modifiserte organismer fører til produksjonen av det ønskede produkt som oppviser full biologisk aktivitet. Foreliggende oppfinnelse fremskaffer følgelig videre - en ekspresjonsvektor omfattende en DNA sekvens som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen;

en vertsorganisme transformert med en kompatibel ekspresjonsvektor i henhold til oppfinnelsen; og en DNA-sekvens som koder for et polypeptid i henhold til oppfinnelsen.

En vertsorganisme hvor et polypeptid i henhold til oppfinnelsen er istand til å bli uttrykt fremstilles ved å transformere en vertsorganisme med en kompatibel ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen. Ekspresjonsvektoren kan bli fremstilt ved: (a) å kjemisk syntetisere en DNA-sekvens som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen, og (b) å sette nevnte DNA inn i en ekspresjonsvektor.

Alternativt kan en ekspresjonsvektor bli fremstilt ved : (a) å fremstille og isolere et cDNA som koder for polypeptidet ifølge oppfinnelsen fra mRNA til en igle av arten Hirudinaria manillensis; og

(b) sette inn det isolerte cDNA i en ekspresjonsvektor.

Et polypeptid ifølge oppfinnelsen blir følgelig fremstilt ved å fremskaffe en transformert vertsorganisme under slike betingelser at polypeptidet blir uttrykt deri. Når en eukaryot vertsorganisme anvendes kan polypeptidet bli erholdt glykosylert. Polypeptidet kan isoleres som sådan eller i form av et farmasøytisk akseptabelt salt. På denne måte kan et polypeptid eller salt i henhold til oppfinnelsen bli erholdt i ren form.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan bli modifisert ved hjelp av aminosyreutvidelse ved hver enkelt eller i begge ender. Et polypeptid bestående av en slik utvidet sekvens må selvfølgelig fremdeles oppvise anti-trombinaktivitet. F.eks. kan en kort sekvens på opptil 3 0 aminosyreresiduer bli anbrakt ved hver ende.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan underkastes en eller flere posttranslasjonell modifisering såsom sulfatering, COOH-amidering, acylering eller kjemisk endring av polypeptidkjeden. F.eks. kan et polypeptid med et glycinresiduum ved sin karboksyterminal underkastes enzymatisk amidering med peptidylglysin a-amiderende monooksygenase (PAM enzym).

For å fremstille et anti-trombinpolypeptid ved rekombinant DNA-teknologi blir et gen som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen fremstilt. Den kodende DNA-sekvens innbefatter typisk ikke introner. DNA-sekvensen isoleres og renses. Genet settes inn i en ekspresjonsvektor som er istand til å drive fremstilling av det rekombinante produkt. DNA-sekvensen kan være en cDNA-sekvens. DNA-sekvensen kan være en syntetisk DNA-sekvens. Det syntetiske gen fremstilles typisk ved å kjemisk syntetisere oligonukleotider som totalt sett tilsvarer det ønskede gen. Oligonukleotidene blir så satt sammen for å erholde genet.

Et gen kan følgelig bli konstruert av 6 kjemisk syntetis-erte oligonukleotider hvor hvert oligonukleotid representerer ca. 1/3 av en kjede av et dobbeltkjedet DNA-gen. Oligonukleotidene blir ligert og sammenført for å erholde det ønskede gen. Om ønsket kan gensekvensen bli modifisert ved seterettet mutagenese for å innføre en eller flere kodon-endringer. Typisk konstrueres genet med restriksjonsseter ved hver ende for å lette dets etterfølgende manipulering.

En DNA-sekvens kan bli fremstilt som ytterligere koder for et lederpeptid som nevnt ovenfor. Lederpeptidet er istand til å dirigere utskillelse av polypeptidet fra celler hvor polypeptidet skal uttrykkes. Sekvensen som koder for leder-peptidet er typisk fusert til den 5'ende av DNA-sekvensen som koder for polypeptidet.

Lederpeptidet kan være OmpA lederpeptidet når ekspresjon i en bakteriell vertsorganisme såsom E. coli er ønsket. Lederpeptidet kan være lederpeptidet av vesikulær stomatitis virus G protein (VSV G protein) når ekspresjon skal foretas i insektceller. Passende DNA-sekvenser som koder for OmpA og VSV G protein ledersekvensene er:

OmpA leder:

VSV G protein leder:

En DNA-sekvens kan bli fremstilt som koder for et fusjonsprotein som er spaltbart for å frigjøre et polypeptid ifølge oppfinnelsen. En DNA-sekvens kan bli brukt for en bærerpolypeptidsekvens fusert via en spaltbar binding til N-terminalen av polypeptid ifølge oppfinnelsen. Den spalt-bare binding kan være en som kan spaltes av cyanogenbromid.

For ekspresjon av polypeptidet blir en ekspresjonsvektor konstruert som omfatter en DNA-sekvens som koder for polypeptidet og som er istand til å uttrykke polypeptidet når det foreligger i en egnet vertsorganisme. Passende trans-kripsjonene og translasjonelle kontrollelementer er anbrakt innbefattende en promoter for DNA-sekvensen, et transkripsjonelt termineringssete og translasjonelle start-og stoppkodoner. DNA-sekvensen er anbrakt i korrekt ramme for å tillate ekspresjon av polypeptidet og inntreffe i en vertsorganisme som er kompatibel med vektoren.

Ekspresjonsvektoren omfatter typisk et replikasjonsstart-sted og, om ønsket, et utvelgbart markøren såsom et antibi-otisk resistensgen. En promoter er operativt forbundet med DNA-sekvensen som koder for polyepeptidet. Ekspresjonsvektoren kan være et plasmid. I dette tilfellet er fortrinnsvis en promoter valgt fra Ptrp og operativt forbundet med DNA-sekvensen. Alternativt kan ekspresjonsvektoren være et virus. Viruset kan være et rekombinant baculovirus hvor polyhedrinpromotoren er operativt forbundet med DNA-sekvensen som koder for polypeptidet. En ekspresjonsvektor som er istand til å uttrykke polypeptidet, kan bli fremstilt på enhver passende måte. Et DNA-fragment som koder for polypeptidet kan settes inn i et passende restriksjonssete av en ekspresjonssete f.eks. en plasmidvektor. Et rekombinant baculovirus kan fremstilles ved: (i) å klone et gen som koder for polypeptidet i en baculovirus overføringsvektor, ved et restriksjonssete nedstrøms for polyhedrinpromoteren, og (ii) å ko-transfektere insektceller som er mottagbare for baculovirusinfeksjon med den rekombinante overføringsvektor fra trinn 1 og intakt villtype baculovirus DNA.

Homolog rekombinasjon inntreffer og resulterer i et rekombinant baculovirus som inneholder polypeptidgenet nedstrøms for polyhedrinpromoteren. Baculovirus overføringsvektoren kan være en som har et enestående kloningssete nedstrøms for polyhedrin ATG start-kodonet. Produktet som så blir uttrykt av det resulterende rekombinante baculovirus vil være et fusjonsprotein hvor en N-terminal del av polyhe-drinproteinet er fusert til N-terminalen av polypeptidet. Som angitt ovenfor, kan en spaltbar binding bli fremskaffet ved fusjonsskjøten. Insektcellene anvendt i trinn 2 er typisk Spodoptera fru<g>iperda celler. Villtype-baculoviruset er typisk Autographa califronica nukleær polyhedrosis virus (AcNPV).

En ekspresjonsvektor som koder for polypeptidet blir fremskaffet i en passende vertsorganisme. Celler blir transformert med polypeptidgenet. En transformert vertsorganisme blir fremskaffet under slike betingelser at polypeptidet blir uttrykt deri. Transformerte celler blir f.eks. dyrket for å tillate ekspresjon å inntreffe. Ethvert kompatibelt vertsvektorsystem kan bli brukt.

Den transformerte vertsorganisme kan være en prokariot eller eukaryot vertsorganisme. En bakteriell eller gjær-celle kan bli brukt f.eks. E. coli eller S. cerevisiae. Gram-positive bakterier kan bli anvendt. En foretrukket bakteriell vertsorganisme er en stamme av E. coli type B. Insektceller kan alternativt bli brukt, i hvilket tilfelle et baculovirus ekspresjonssystem er passende. Insektcellene er typisk Spodu<p>tera fru<g>iperda celler. Som et ytterligere alternativ kan celler av en pattedyrcellelinje bli transformert. Et transgent dyr f.eks. et ikke-humant pattedyr, kan bli anvendt hvor polypeptidet blir fremstilt. Polypeptidet som blir uttrykt kan bli isolert og renset. Et polypeptid med enhver av aminosyresekvensene (i), (ii) eller (iii) ovenfor etterfølgende et Met-residuum som stammer fra et translasjonsstartkodon, kan bli erholdt. Alternativt, som nevnt ovenfor, kan et fusjonsprotein bli erholdt omfattende aminosyresekvensen av et polypeptid ifølge oppfinnelsen, det vil sekvens (i),(ii) eller (iii) ovenfor fusert til en bærersekvens. Hvor en passende binding er fremskaffet i fusjonsproteinet mellom aminosyresekvensen (i), (ii) eller (iii) og bærersekvensen kan være et polypeptid med aminosyresekvensen (i), (ii) eller (iii) kan proteinet bli frigjort ved spaltning med et passende middel.

Et polypeptid ifølge oppfinnelsen eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav kan også bli fremstilt ved: (a) å kjemisk syntetisere nevnte polypeptid; og (b) isolere nevnte polypeptid således erholdt eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Polypeptidene kan følgelig bli bygget opp ved kjemisk syntese fra enkle aminosyrer og/eller på forhånd dannede peptider av to eller flere aminosyrer i rekkefølge av sekvensen av det ønskede polypeptid. Fastfase eller oppløs-ningsmetoder kan bli benyttet. Det resulterende polypeptid kan bli omdannet til et farmasøytisk akseptabelt salt om ønsket.

I fastfasesyntese blir aminosyresekvensen av det ønskede polypeptid bygget opp sekvensielt fra den C-terminale aminosyre som er bundet til et uoppløselig resin. Når det ønskede polypeptid er blitt dannet, blir det spaltet fra resinet; når oppløsnings-fasesyntese blir brukt kan det ønskede polypeptid igjen bli bygget opp fra den C-terminale aminosyre. Karboksylgruppen av denne syre forblir blokkert hele tiden med en passende blokkeringsgruppe som blir fjernet ved slutten av syntesen. Uansett hvilken teknikk av fastfase eller oppløsningsfase som blir benyttet, har hver aminosyre tilført reaksjonssystemet typisk en beskyttet aminogruppe og en aktivert karboksylgruppe. Funksjonelle sidekjedegrupper er også beskyttet. Etter hvert trinn i syntesen, blir en aminobeskyttende gruppe fjernet. Funksjonelle sidekjedegrupper blir generelt fjernet ved slutten av syntesen.

Et polypeptid kan bli omdannet til et farmasøytisk akseptabelt salt. Det kan omdannes til et syreaddisjonssalt med en organisk eller uorganisk syre. Passende syrer innbefatter eddiksyre, ravsyre og saltsyre. Alternativt kan peptidet bli omdannet til et karboksylsyresalt, såsom ammonium-saltet eller et alkalimetallsalt såsom natrium- eller ka-

liumsalt.

Et polypeptid eller farmasøytisk akseptabelt salt derav kan bli brukt i en farmasøytisk blanding sammen med et farma-søytisk akseptabelt bæremiddel eller eksipient for dette. En slik formulering er typisk for intravenøs tilførsel (i hvilket tilfelle bæremidlet generelt er sterilt fysiologisk saltvann, eller vann av passende renhet). Et polypeptid i henhold til oppfinnelsen er et anti-trombin og er passende for behandling av tromboemboliske tilstander såsom koa-guleringen av blod, typisk i en human pasient. Et polypeptid kan følgelig bli brukt for terapi og profylakse av tromboser og tromboembolismer, innbefattende profylakse av postoperative tromboser, hvor akutt sjokkterapi (f.eks. for septisk eller polytraumatisk sjokk) for terapi av oppløs-ning av koaguleringselementer i hemodialyse, hemoseparasjo-ner og i utenom-legemlig blodsirkulasjon. I en utførelses-form av oppfinnelsen kan polypeptidet eller saltet derav bli tilført med plasminogenaktivator, såsom plasminogen-vevsaktivator.

Doseringen avhenger spesielt av den spesielle tilførelses-form, og for formålet med terapien eller profylaksen. Størrelsen av de enkelte doser og tilføringsmetoden kan best bli bestemt ved hjelp av individuell vurdering av det spesielle sykdomstilfelle hvor metoder for å bestemme relevante blodfaktorer, som er nødvendig for dette formål, er kjent for fagmannen. Normalt i tilfelle av en injeksjon av den terapeutisk effektive mengde av forbindelser ifølge oppfinnelsen er denne i et doseområde fra omtrent 0,005 til 0,01 mg per kilo kroppsvekt. Et område fra omkring 0,01 til 0,05 mg per kilo kroppsvekt er foretrukket. Tilførselen utføres ved intravenøs intramuskulær eller subkutan injeksjon. Følgelig inneholder farmasøytiske blandinger for parenteraltilførsel i enkel doseform per dose, avhengig av tilføringsmetoden, fra omkring 0,04 til omkring 7,5 mg av forbindelsen i henhold til oppfinnelsen. I tillegg til den aktive bestanddel inneholder disse farmasøytiske blandinger vanligvis også en buffer, f.eks. en fosfatbuffer som har til hensikt å holde pH-verdien mellom omkring 3,5 og 7, samt også natriumkloridmannitol eller sorbitol for å juste-re isotonisiteten. De kan være frysetørket eller i oppløst form idet det er mulig for oppløsninger fordelaktig å inneholde et antibakterielt aktivt preservativ f.eks. 0,2 til 9,3% 4-hydroksybenzosyremetylester eller -etylester.

En blanding for topisk tilførsel kan være i form av en vandig oppsløsning, lotion eller gel, en oljeoppløsning eller suspensjon eller fettinnholdende eller spesielt emulgert salve. En blanding i form av en vandig oppløsning erholdes f.eks. ved å oppløse de aktive bestanddeler i henhold til oppfinnelsen eller et terapeutisk akseptabelt salt derav i en vandig bufferoppløsning på fra f.eks. pH 4 til pH 6,5, og, om ønsket, å tilsette en ytterligere aktiv bestanddel f.eks. et anti-inflammatorisk middel og/eller et polymerisk bindemiddel, f.eks. polyvinylpyrrolidon og/eller et preservativ. Konsentrasjonen av aktiv bestanddel er fra omkring 0,1 til omkring 1,5 mg, foretrukket fra 0,25 til 1,0 mg i 10 ml av en oppløsning eller 10 g av en gel.

En oljeform for tilførsel for topisk anvendelse blir erholdt f.eks. ved å suspendere den aktive bestanddel i henhold til oppfinnelsen, eller et terapeutisk akseptabelt salt derav i en olje, eventuelt med tilsetting av svelle-midler såsom aluminiumstearat og/eller overflateaktive midler (tensider) med en HLB-verdi ("hydrofil-lipofil-balanse") på under 10, og som fettsyremonoestere av polyhy-driske alkoholer, f.eks. glyserin monostearat, sorbinat-monolaurat, sorbitanmonostearat eller sorbitanmonooleat. En fettinnholdende salve erholdes ved f.eks. å suspendere den aktive bestanddel i henhold til oppfinnelsen eller et salt derav i en spredbar fettbase eventuelt med tilsetting av et tensid med en HLB-verdi på under 10. En emulgert salve erholdes ved å trituere en vandig oppløsning av den aktive bestanddel i henhold til oppfinnelsen eller et salt derav i en myk spredbar fettbase med tilsetting av et tensid med en HLB-verdi på under 10. Alle disse former for topisk tilfør-sel kan også inneholde preservativer. Konsentrasjonen av aktiv bestanddel er fra omkring 0,1 til 1,5 mg, fortrinnsvis fra 0,25 til 1,0 mg i omkring 10 g base.

I tillegg til blandingene beskrevet ovenfor, og analoge farmasøytiske blandinger til disse som er tenkt for direkte medisinsk bruk i legemet hos et menneske eller pattedyr, omfatter foreliggende oppfinnelse også farmasøytiske blandinger og preparater for medisinsk bruk utenfor legemet til mennesker eller pattedyr. Slike blandinger og preparater blir brukt spesielt som antikoaguleringsadditiver til blod som blir underkastet sirkulering eller behandling utenfor legemet (f.eks. utenomlegemlig sirkulering eller dialyse i kunstige nyrer), preservering eller modifisering (f.eks. hemoseperasjon). Slike preparater såsom stamoppløsninger eller alternative preparater i enkel doseform er lignende i sammensetning som injeksjonspreparatene ovenfor, men mengden eller konsentrasjonen av aktiv bestanddel er justert i forhold til volumet av blodet som skal behandles, eller mere nøyaktig til dets trombininnhold. I denne sammenheng må det bli tatt i betraktning at den aktive bestanddel i henhold til oppfinnelsen (i fri form) fullstendig deak-tiverer omkring 5 ganger vektmengden av trombin, er fysiologisk harmløs selv i relativt store mengder og blir fjernet fra det sirkulerende blod raskt selv i høye konsentrasjoner slik at det ikke er noen risiko for overdose, selv f.eks. under blodoverføringer. Avhengig av det spesielle formål er den egnede dose fra omkring 0,01 til omkring 1,0 mg av den aktive bestanddel per liter blod, selvom den øvre grense fremdeles kan overskrides uten risiko.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. I de med-følgende tegninger er:

Figur 1 et kromatogram viser resultatene av HPLC-analysen fra eksempel 1. Pl til P3 betegner de tre forskjellige topper som er erholdt fra preparatet i henhold til eksempel .1, FT er for gjennomstrømningsvolumet og 4-AB er for aminobenzamidin. Figur 2 viser elueringsbrofilene erholdt i eksempel 2(b) for trypsinfordøyet PE-P1 (A) og PE-P2 (B). Figur 3 viser nukleotidsekvensen av de 6 oligonukleotider som koder for det meste av proteinet som tilsvarer topp 2 (P2) hvor aminosyreresiduet i posisjon 61 er Asp og den siste aminosyre av polypeptidkjeden er Asn64. Sekvensen vist i uthevet skrift indikerer Vall-setet som er brukt for ytterligere konstruksjoner. Den nedre del av figuren viser sammensetningsmønsteret av de 6 oligoelementer. HindiII- og Pstl-seter ble innbefattet for å tillate etterfølgende manipuleringer. Figur 4 viser konstruksjons-skjemaet for det mellomliggende plasmid M13-P2, som er kilden for et Ball DNA-fragment for alle ytterligere P2 konstruksjoner. Figur 5 viser skjematisk konstruksjonen av et nytt M13-P2, betegnet 0MP-P2, som bærer det fullstendige P2-gen bundet til Ompa-lederpeptidet. Lederpeptidsekvensen er vist i uthevet skrift, mens den Ball butte ende og den Hindlll klebrige ende er understreket. Figur 6 viser skjematisk konstruksjonen av pFC-P2 som er plasmider brukt for fremstillingen av P2-proteinet i E. coli. Figur 7 viser den generelle struktur av plasmidet pOMPA-P2 brukt for fremstillingen av P2 i E. coli. Søker anvendte tradisjonelle genmanipuleringsteknikker for å fremstille dette nye plasmid hvor P2-genet er under transkripsjonen kontroll av hybridpromotoren. Pipp/iac. Også i dette tilfellet driver Ompa leder-peptidet sekresjon av P2 til periplasma av E. coli. Figur 8 viser nukleotidsekvensen og sammensetningen av de syntetiske oligoelementer brukt for utskillelse av P2 fra insektceller. Sekvensen som er vist i uthevet skrift, indikerer VSV G protein lederpeptidet. Figur 9 er en skjematisk angivelse av konstruksjonen av et nytt rekombinant M13, betegnet VSV-P2, hvor det fullstendige P2-gen er bundet til VSV G protein lederpeptid. Figur 10 viser skjematisk konstruksjonen av pAc-P2 som er blitt brukt som overføringsvektor til baculovirus-genomet. pAcYMl er utgangsplasmidet som er meget brukt som akseptor for heterologe sekvenser som skal overføres til viruset. Figur 11 viser nukleotidsekvensen og sammensetningen av de syntetiske oligoelementer som koder for starten av P2-kjeden. ATG-kodonet som koder for det ytterligere metionin-residuum, er vist i uthevet skrift. Figur 12 viser skjematisk konstruksjonen av pAcFTl, som er blitt brukt ved intracellulær ekspresjon. Figur 13 er en skjematisk tegning av et nytt overførings-plasmid, betegnet pAcFTl-P2 som bærer den fullstendige P2-sekvens bundet til de første 18 aminosyrer av polyhedrin. Dette plasmid er blitt brukt for å overføre den heterologe sekvens til baculovirus genomet. Figur 14 er en skjematisk tegning av RACE-fremgangsmåten for amplifikering av 3'ender. I figuren representerer "<***>TTTT..." dT17 adaptor-primeren. Ved hvert trinn er diagrammet forenklet for å illustrere kun hvorledes det nye produkt dannet under det foregående trinn blir brukt. Figur 15 er en skjematisk tegning av RACE-fremgangsmåten for amplifikering av 5'ender. I figuren representerer henholdsvis »***TTTT..." og "<***»> dT17 adaptor-primerene. Ved hvert trinn er skjemaet forenklet for å illustrere kun hvordan det nye produkt dannet i løpet av foregående trinn blir brukt.

Materialer oa metoder

Antitrombin- aktivitet:

Antitrombin-aktiviteten av P2-proteinet og aktiviteten av antitrombin-preparatet ifølge PCT/WO90/05143 ble bestemt på grunnlag av den raske og støkiometriske reaksjonen mellom de to proteiner og trombin.

Denne aktiviteten ble målt kvantitativt ved hjelp av titrering av en standard oppløsning av trombin (Lundblad, R.L. et al., Methods in Enzymology, 45, 156-161, 1976). Trombin-aktiviteten ble kalibrert med et Internasjonalt Standard Preparat av Trombin (c 70/157) som ble skaffet fra the National Institute for Biological Standards and Control (London, GB) og uttrykt ved National Institute of Health enheter (N.I.H. enheter).

Den trombin-nøytraliserende aktivitet av prøvene ble uttrykt som antitrombin-enheter (ATU), hvor en ATU er mengden av forsøksforbindelse som nøytraliserer en NIH-enhet av trombin.

Undersøkelsen ble utført som følger:

0,2 ml av en standard oppløsning av 0,05% humant fibrinogen (Kabi Vitrum, Sverige) i Tris-HCl-buffer pH 7,4 ble inkubert ved 37°C i nærvær av 0,01 til 0,1 ml av oppløsningene av polypeptidene som skulle undersøkes.

Deretter ble porsjoner på 0,005 ml (0,5 NIH-enheter) av en 100 NIH/ml trombin standard oppløsning tilsatt progressivt hvert minutt og blandet forsiktig.

Slutten av titreringen ble ansett for å være nådd når et fibrin-aggregat ble dannet innet ett minutt.

Faktisk oppsto aggregat-dannelse kun når en tilstrekkelig mengde av trombin var tilsatt til reaksjonsblandingen, hvor det tilsatte trombin var i stand til å nøytralisere den totale mengde av proteinet som var tilstede i blandingen.

Antitrombin-aktiviteten av de to undersøkte forbindelser har blitt uttrykt i ATU/mg protein.

Kromoaent substrat- assay:

Prinsippet for metoden er basert på den inhibitoriske aktivitet av de undersøkte forbindelser på reaksjonen mellom trombin og dets spesifikke kromogene substrat S-2238 (Wiman et al., BBA, 579, 142-154, 1979).

Forsøket ble utført som følger:

630 fil av en 0,5 mM oppløsning av S-2238 i 0,05 M Tris-buffer pH 8,3 inneholdende 0,1 N NaCl og 100 KIU/ml apro-tinin ble pre-inkubert i 10 minutter ved 25°C. Etter denne preinkuberingsperioden ble 70 /il av en 2 IU/ml trombin-oppløsning i 0,025 M natrium-fosfat-buffer pH 6,6 inneholdende 0,3 M NaCl og 0,5% bovin albumin tilsatt. For kontrollene ble 70 /il buffer benyttet.

Umiddelbart etter tilsetningen av trombin ble absorbans-variasjonene nedtegnet spektrofotometrisk ved bølgelengden 405 nm. Nedtegninger ble foretatt kinetisk hvert minutt over en totaltid på 6 minutter.

Deretter ble 20 fil av oppløsningene av de undersøkte proteinene tilsatt, og absorbans-variasjonene ble nedtegnet igjen som beskrevet tidligere.

Endelige konsentrasjoner av forsøksforbindelsene var 1,25, 2,5, 7,5, 10 og 15 ng/ml i 0,025 M natriumfosfat-buffer pH 6,6 inneholdende 0,3 M NaCl.

Absorbans-variasjonene per minutt (A Abs/min) ble bestemt henholdsvis før og etter tilsetningen av prøven og den gjennomsnittlige A Abs/min ble regnet ut. Inhiberingen av reaksjonen mellom trombin og det kromogene substrat S-2238 ble regnet ut som forholdet (uttrykt som prosentdel) mellom de gjennomsnittlige A Abs/min før og etter tilsetningen av proteinet.

Det er blitt laget en standardkurve på basis av den pro-sentvise inhibering mot konsentrasjonen av prøven.

Sluttresultatene ble uttrykt som sluttkonsentrasjoner av forsøksforbindelsene som induserer 50% inhibering av reaksjonen mellom trombin og det kromogene substrat.

Eksempel 1

Et anti-trombin preparat ble fremstilt fra Hirudinaria manillensis igler i henhold til WO 90/05143, ved å følge fremgangsmåten illustrert under a) og b) nedenfor.

a) Acetonekstraksi on

Etanoltørkede iglehoder (2920 g) ble finhakket i små deler

og behandlet med en blanding 40:60 aceton/vann (7,5 1). Etter homogenisering med omrøring ved romtemperatur ble blandingen sentrifugert i 15 min ved 2700 rpm og supernatanten ble dekantert; pelleten ble igjen re-suspendert i 40:60 aceton/vann-blanding omrørt i 30 minutter og blandingen ble sentrifugert i 15 minutter ved 2700 rpm. Supernatanten ble slått sammen med den opprinnelige og surgjort til pH 4,5 med iseddiksyre (volum 8,5 1). Blandingen ble sentrifugert ved 2700 rpm i 15 min, derpå ble supernatanten dekantert, og pH av oppløsningen justert til pH 6,0 ved tilsetting av 3 0% ammoniakk. Etter rotasjoninndampning ved 35°C ble pH av den konsentrerte oppløsning senket til 1,8, utfelte forurensninger ble fjernet ved sentrifugering, og det rå anti-trombinmaterialet ble utfelt fra blandingen ved å bruke et 9 gangers overskudd av aceton. Blandingen ble så sentrifugert ned, pelleten resuspendert i aceton og igjen sentrifugert. Det utfelte materialet ble så frysetørket.

b) Ionebytteropprensnin<g>er

Det rå anti-trombinmaterialet ble rekonstituert i vann,

dialysert mot 10 mm ammoniumacetat-buffere ved pH 4,0, og satt på en karboksymetyl Sepharosekolonne (CM Sepharose, Pharmacia, 2,6 x 3 0 cm) på forhånd ekvilibrert i samme buffer. Etter en 10 mm vask med startbuffer ble anti-trombinaktivitet-fraksjoner eluert med 20 ammoniumacetat pH 4,5 samlet opp og slått sammen (1,3 liter). For ytterligere opprenskningstrinn ble sammenslåtte fraksjoner konsentrert til 0,5 liter i et Minitan apparatur (Millipore); den

konsentrerte oppløsning ble nøytralisert med NaOH og derpå påsatt en Q Sepharosekolonne ekvilibrert i 20 mM Tris-HCl pH 7,0. Det bundete materialet ble eluert med en lineær gradient på 0 - 1 M NaCl i startbufferen. Fraksjonene inneholdende anti-trombinaktivitet ble slått sammen, konsentrert og avsaltet på en superdex S-200 kolonne eluert med 20 mM Tris-HCl pH 7,5 ved en strømningshastighet på 4 ml/minutt. Aktivt sammenslått materiale fra gelfiltrering ble konsentrert med Minitan og ytterligere renset med svak anionebytterkromatografi (DEAE FPLC). Det aktive materiale ble satt på en protein Pak DEAE-5PW kolonne (Waters) og eluert med en gradient på 0 - 1 M NaCl i 20 mM Tris-HCl pH 6,5, ved en strømningshastighet på 1,0 ml/min. Aktive fraksjoner ble slått sammen, karakterisert for proteininnhold og aktivitet (spesifikk aktivitet: 800 ATU/mg), og frysetørket i en SpeedVac konsentrator (Savant).

Det således erholdte, delvis opprensete materiale (spesifikk aktivitet 800 ATU/mg) ble underkastet to ytterligere kromatograferingstrinn, for å oppnå homogene polypeptider som beskrevet nedenfor c) og b) .

c) Trombin- Sepharose

Kommersielt bovintrombin (Sigma) ble ytterligere renset i

henholdt til fremgangsmåten beskrevet av Lundblad (<*>) og ble så festet til aktivert Sepharose CL 6B (Pharmacia) ved å følge forhandlers instruksjon. Kolonnen (1,7 ml) ble ekvilibrert med 50 mM Tris-HCl pH 8,3 og frysetrøket materiale fra DEAE-FPLC (rekonstituert i buffer) ble satt på. Kolonnen ble underkastet 3 vaskinger i startbuffer, derpå i samme buffer inneholdende 3,8 M NaCl og igjen med startbuffer (hver vask var 3 ganger kolonnevolumet). Strømningsha-stigheten var 0,3 ml/min. Det bundete materialet ble eluert med 10 ml 0,1 M 4-aminobenzamidin i 25 mM HCl. De aktive fraksjoner ble slått sammen og buffereluert i 50 mM Tris HCL pH 8.3 på en PD-10 kolonne (Pharmacia).

Ubundet materiale eluert fra kolonnen ved å vaske i startbuffer og fremdeles inneholde anti-trombinaktivitet, ble på nytt satt på kolonnen inntil all aktivitet var bundet og kromatografert. (<*>) Lundblad, R.L., 1971 Biocehmistry, 10: 2501-2506 .

d) RP- HPLC

Materialet erholdt etter affinitetskromatografi ble endelig

renset ved reversfase høyeffektivitetskromatografi (RP-HPLC) på en C4 Vydac-kolonne (4,6 x 250 mm. 5/z) , ved å bruke 20 mM natriumfosfat pH 7,5 som et første elueringsmiddel og 50% acetonitril i vann som modifisert elueringsmiddel. Anti-trombinpolypeptider ble eluert med en lineær gradient fra 5% til 55% elueringsmiddel B i 45 minutter ved romtemperatur med en strømningshastighet på 1,0 mm per minutt. Det resulterende kromatogram er vist i figur 1.

Protein-topper (påvist ved 220 nm) ble samlet opp manuelt, konsentrert under vakuum og på nytt kromatografert under samme betingelser.

Rene anti-trombinpolypeptider ble etter C4 HPLC karakterisert for proteininnhold, aminosyresammensetning, N-terminal sekvens, C-terminal ende og deres aktivitet bestemt ved in vitro assays (ATU/NIH test og "trombin tids test"). Hver av de tre proteintopper er blitt funnet å ha anti-trombinaktivitet .

De fullstendige aminosyresekvenser av polypeptidene betegnet Pl og P2 i figur 1 ble bestemt ved N-terminal sekvense-ring av peptidene erholdt fra tryptiske og V8 proteasefor-døyinger. Sekvensene er angitt under (i) og (ii) ovenfor. Den partisielle aminosyresekvens av det andre polypeptid (P3) er angitt under (iii).

Eksempel 2

Tryptisk fordøying og peptidkartle<gg>in<g> av pyridvletylert ( PE) Pl og P2.

a) Reduksion/ alkylering - Aktive fraksjoner renset ved affinitetskromatografi på trombin-Sepharose (Eksempel lc)

ble slått sammen og buffereluert i lOmM Tris-HCl pH 8,3 på en PD-10 kolonne. Det aktive sammenslåtte materiale (omkring 50 /ig) ble konsentrert i Speed-Vac sentrifuge (Savant) og behandlet med 100 /il av 1% b-merkaptoetanol i 6M guanidin-HCl/50 mM Tris-HCl pH 8,5, under nitrogen, i mørke i 2 timer ved romtemperatur. Derpå ble 4 /il av 4-vinyl-pyridin (netto) tilsatt og blandingen inkubert igjen i to timer som ovenfor<4>.

Pyrilidyletylerte polypeptider ble først gjenvunnet fra reaksjonsblandingen ved RP-HPLC på en C4 Vydac (4.6 x 250 mm, 5 /im) kolonne eluert med en 90 minutters lineær gradient fra 5 til 65% acetonitril i 0,1% TFA, ved en strøm-ningshastighet på 1,0 ml per minutt. Under slike betingelser blir blandingen av anti-trombinpolypeptider dårlig oppløst slik at de må kromatograferes på nytt på samme kolonne ved å bruke elueringssystemet natriumfosfat/acetonitril med betingelsene allerede beskrevet i eksempel ld. b) Trypsinfordøving og peptidkartlegging av PE- P1 og PE-P2 - Opprenset PE-P1 (henholdsvis 10 og 2 0 /ig) ble fordøyet med TPCK-behandlet trypsin (Sigma) i 200 /il av 1% ammo-niumbikarbonat pH 8,0 i nærvær av o,2 M natriumfosfat. Trypsin ble tilsatt i et enzym til et substratforhold på 1:20 (w/w) og inkubering ble utført i 4 timer ved 37°C. Fordøying ble stoppet ved frysetørking i Savant.

Peptider erholdt ved tryptisk fordøying ble adskilt på en /iBondapak C18 kolonne (3.9 x 300 mm, 10/i Waters) eller på en C4-Vydac (4,6 x 250 mm, 5/im), kolonne eluert ved å bruke en 60 minutters lineær gradient fra 5-65% acetonitril i 0,1% TFA, ved en strømningshastighet på 1,0 ml/minutt

(figur 2). Eluerte topper ble manuelt samlet opp, konsentrert i Savant og derpå underkastet aminosyreanalyse og N-terminal sekvensanalyse på en pulsert væskefase modell 477A sekvensator (Applied Biosystems).

Resultatene av C4-HPLC peptidkartleggingen av trypsinfordø-yet PE-P1 (A) og PE-P2 (B) er vist nedenfor.

Den fullstendige aminosyresekvens av Pl og P2 er følgelig:

Pl

Eksempel 3

Kjemisk syntese av P2- genet

En kodende nukleotidsekvens ble utformet på basis av de foretrukne kodoner av Escherichia coli<5>. Videre ble et Ball-restriksjonssete utformet meget nær den 5'ende av det syntetiske gen for å tillate innsetting av en slik sekvens i forskjellige ekspresjonsvektorer. Faktisk ble det samme syntetiske gen brukt for ekspresjon av rekombinant P2-protein i bakterielle og insektceller. I tilfelle med insektceller ble metoder utviklet som ga protein P2 som et utskilt eller cytoplasmisk produkt.

Alle plasmid DNA-manipulasjoner ble utført som beskrevet av Maniatis et al<6>.

Seks syntetiske komplementære oligonukleotider ble fremstilt ved å bruke en automatisk DNA syntetisator (Applied Biosystems) og deres sekvens er vist i figur 3. Etter en symatisk fosforylering ble alle 6 oligoelementer satt sammen ved å bruke DNA-ligase og den resulterende dobbelt-kjedede sekvens ble satt inn i M13 fag-vektoren mpl8, for å erholde det rekombinante plasmid M13-p2 som er vist i figur 4. For å tillate innsetting av P2-genet i M13-vektoren, ble Hindlll og Pstl seter også tilført i de syntetiske oligoelementer. Den korrekte nukleotidsekvens er blitt bekreftet

ved Sanger-metoden utført på enkeltkjedet fag-DNA<7>.

Det rekombinante plasmid M13-P2 ble brukt som kilde for P2-genet for alle ekspresjonsvektorene brukt i eksemplene.

Eksempel 4

Ekspresjon og utskillelse av P2 fra E. coli- celler

For å erholde utskillelse til periplasma av det rekombinante produkt, er det nødvendig å syntetisere P2-molekylet i form av et pre-protein. Mere spesielt må en aminosyresekvens betegnet "lederpeptid" som er ansvarlig for en effektiv utskillelse, være tilstede ved NH2 enden av p2<8,9>. Denne ekstra sekvens blir så spaltet fra in vivo under utskillelse av en spesifikk E. coli lederpeptidase for å gi den korrekte ferdigutviklete sekvens<10>.

Mange eksempler på sekresjonssystemer er blitt beskrevet i litteraturen 11-12. Blant dem, har søker valgt ut systemet basert på sekresjonssignalet av yttermembranproteinet til E. coli (Omp A) tidligere publisert<13>. Søker dannet følge-lig to ytterligere komplementære oligonukleotider som koder for OmpA lederpeptidet etterliggende Opma Shine-Dalgarno-sekvensen som er kjent for å være ansvarlig for en effektiv translasjon av messenger RNA<14.>

Deres sekvens, vist i figur 5, innbefatter også starten av P2-genet som koder for de første 10 aminosyrer. Tilstedeværelsen av Ball-setet tillot spleising av den syntetiske del til resten av den P2-kodende sekvens, mens tilstedeværelsen av et oppstrøms Hindlll-sete tillot spleising til M3-vektoren. Således ble det syntetiske HindIII-BalI-fragment ligert til Ball-BamHI-del fra M13-P2 og satt inn i M13mpl8, for å erholde et nytt plasmid betegnet OMP-P2. Den skjematiske representasjon av denne nye plasmidkonstruksjon er også vist i figur 5.

Fra 0MP-P2 kan P2 genet bli utskåret som et HindiII-BamHI-fragment som koder for OmpA Shine-Dalgarno- og lederpeptidet fulgt av den kodende sekvens. Dette restriksjonsfrag-mentet er nå klart til å bli satt inn i en passende ekspresjonsvektor. Flere ekspresjonssystemer kunne, teoretisk, anvendes for å erholde høye produksjonsnivå av heterologe proteiner i bakterier. Systemet basert på promoteren Pcrp er blitt brukt med hell i søkers laboratorium tidligere. Igjen, selv i tilfelle med den utvalgt promoter, kan eks-presjonsnivåene av et gitt polypeptid ikke bli forutsagt.

Plasmid pFC33, vist i figur 6, er allerede blitt beskrevet i litteraturen<14>. Det bærer resistens mot antibiotikumet ampicillin og har den bakterielle promoter Ptrp som driver ekspresjon av proapolipoprotein Al. Etter fordøying av pFC33 med HindiII og BamHI, ble det store HindiII-BamHI-fragment, som bærer antibiotikum resistensgenet og promoteren, isolert og spleiset til HindiII-BamHI-fragmentet fra 0MP-P2 som koder for P2-genet. Detaljene for denne konstruksjon er vist i figur 6. Søker isolerte et nytt plasmid betegnet pFC-P2, som er sluttplasmidet for produksjonen av P2 i E. coli.

Et mål for foreliggende oppfinnelse er bruken av E. coli stammer av typen B for ekspresjon og sekresjon til periplasma av P2 og de andre anti-trombinpolypeptider ifølge oppfinnelsen. Faktisk har søker funnet at innsetting av plasmid pFC-P2 i type B-stammer av bakterien E. coli fremskaffer høye produksjonsnivå av P2. Interessant virker forskjellige stammetyper av E. coli ikke like effektivt og det synes følgelig som om verts-stammetypen er avgjørende for at produksjonen av bufrudin skal lykkes.

Flere typer B stammer av E. coli er tilgjengelig og kan bli brukt for fremstillingen av P2. Foretrukkene stammer er ATCC 12407, ATCC 11303, NCTC 10537. Nedenfor er et eksempel på transformering av stamme NCTC 10537 med plasmid pFC-P2 og påfølgende dyrkning av transformanten.

Kompetente celler av stamme NCTC 10537 ble fremstilt ved å bruke kalsiumklorid-fremgangsmåten til Mandel og Higa<15>. Omtrent 200/xl av et preparat av disse celler ved 1 x 10<9 >celler per ml ble transformert med 2 [ il plasmid DNA (om-trentlig konsentrasjon 5 /ig/ml) .

Transformanter ble utvalgt på plater av L-agar inneholdende 100 /xg/ml ampicillin. To små kollonier ble streket med tannpirkere av tre (hver som tre streker omkring 1 cm lange) på L-agar inneholdende samme antibiotikum. Etter tolv timers inkubering i 37°C, ble deler av strekene under-søkt for P2-proteinproduksjon ved inokulering og 10 ml LB medium, (inneholdende ampicillin, og konsentrasjon på 159 /xg/ml) og inkubert over natten ved 3 7°C. Den følgende dag ble kulturene fortynnet 1:100 i M9 medium, inneholdende samme konsentrasjon av ampicillin, og inkubert i 6 timer ved 37°C. 20 ml av en slik kultur ble sentrifugert ved 12000 x g, 4°C i 10 minutter. Den bakterielle pellet ble resuspendert i 2 ml 33 mM HCl Tris pH 8; et likt volum av en andre oppløs-ning 33 mM EDTA, 40% sukrose ble så tilsatt og den totale blanding ble inkubert under forsiktige ristebetingelser ved 37°C i 10 minutter. Etter sentrifugering ble de permea-biliserte celler resuspendert i 2 ml kaldt vann og oppbe-vart i 10 min på is. Den resulterende supernatant ble isolert ved sentrifugering og representerer den periplasmi-ske fraksjon av bakteriecellene. Ved å bruke et kromogent assay som er basert på inhiberingen av trombinegenskapene til å spalte et syntetisk substrat S-2238<16>, har søker målt tilstedeværelsen av anti-trombinaktivitet i den periplasmi-ske fraksjon av P2 produserende celler, men ikke periplas-miske kontrollfraksjoner.

Med en lignende fremgangsmåte har søker også konstruert et nytt ekspresjon/sekresjonsplasmid for P2 hvor promoteren Plpp/lac<17> er tilstede istedenfor promoteren Ptrp. Dette forskjellige plasmid betegnet pOMP-P2, er vist i figur 7. Etter innsetting av dette plasmid i E. coli-stammer av type B, ble høye nivå av aktivt P2 erholdt. Som utgangsplasmid for konstruksjonen av pOMP-P2 brukte søker plasmidet PIN-III-ompA3 beskrevet av Ghrayb et al<17>. Betingelse for dyrking og induksjon av ekspresjon med isopropyl-S-D-tiogala-ctopyranosid (IPTG) var som tidligere beskrevet.

Eksempel 5

Eks<p>resjon ocr sekresjon av protein P2 fra insektceller. For å erholde sekresjon av protein P2 fra rekombinante insektceller måtte søker spleise den P2-kodende sekvens til et lederpeptid som blir effektivt gjenkjent av disse celler. Søker har brukt lederpeptidet til det vesikulære stomatitis-virus (VSV) G-protein<18>. På lignende måte som beskrevet ovenfor har en syntetisk DNA-sekvens som koder for VSV G-protein-lederpeptidet fulgt av starten på P2-genet blitt fremstilt og nukleotidsekvensen er gitt i figur 8. Også i dette tilfelle fremskaffet søker passende restriksjonsseter (Hindlll, BamHI og Ball) for å tillate spleising av resten av P2-genet til ekspresjonsvektoren.

Det syntetiske HindiII-Ball-fragment ble spleiset til et renset Bal-BamHI-fragment fra M13-P2 som bærer P2-genet og satt inn i M13mpl8 på forhånd spaltet med HindiII og BamHI. Denne konstruksjon, som ga et nytt plasmid betegnet VSV-P2, er skjematisk vist i figur 9. Fra VSV-P2 har søker skåret ut et BamHi-BamHI DNA-fragment som bærer P2-genet fusert til VSV leder-peptidet og som så ble satt inn i vektoren pAcYMl<19>, som vist i figur 10. Det resulterende plasmid ble betegnet pAc-P2.

For å erholde ekspresjon i insektceller må den VSV-P2-kodende sekvens bli overført til baculoviurs-genomet under transkripsjonen kontroll av polyhedrinpromoteren. For dette formål ko-transfekterte søker insektceller med et vill-type baculovirus-DNA og med overføringsvektoren pAc-P2 . Som insektceller ble Spodoptera fru<g>i<p>erda celler valgt som vertsceller. Eksprimentelle detaljer er som følger: S. frugiperda celler ble transfektert med en blanding av infeksjonsdyktig AcNPV DNA og plasmid-DNA som representerer de enkelte rekombinante overføringsvektorer ved en modi-fikasjon av fremgangsmåten beskrevet av Summers et al<20>. Et mikrogram av viralt DNA blandet med 25-100 fig av plasmid-DNA og utfelt med (endelige konsentrasjoner) 0,125 M kalsiumklorid i nærvær av 20 mM HEPES buffer, pH 7,5, 1 mM dinatriumhydrogenortofosfat, 5 mM kaliumklorid, 140 mM natriumklorid og 10 mM glukose (totaltvolum lml) ble dannet .

DNA-suspensjonen ble inokulert på et monolag av 10<6> S. frugiperda celler i en 35-mm vevskultur-skål, tillatt å absorbere til cellene i en time ved romtemperatur, derpå erstattet med 1 ml medium. Etter inkubering ved 2 8°C i tre dager ble supernatantvæskene innhøstet og brukt for å danne plakker i S. frugiperda celle-monolag. Plakker inneholdende rekombinante virus ble identifisert ved sin mangel på polyhedra når de undersøkes ved lysmikroskopi. Virus fra slike plakker ble gjenvunnet og etter ytterligere plakk-opprensking ble de brukt for å danne polyhedrin-negative virus stam løsninger.

Den ovennevnte fremgangsmåte tillot søker å isolere et rekombinant baculovirus hvis genom bar P2 under kontroll av polyhedrinpromoteren og av VSV G protein lederpeptidet. Søker brukte dette virus til å infisere S. frugiperda celler i henhold til vel etablerte fremgangsmåter<20>, ved en infeksjons-multiplisitet på 10. Infiserte celler ble så dyrket i spinner-kultur eller i monolag i nærvær av 10% føtalt kalveserum i henhold til publiserte metoder. I begge tilstander viste S-2238 kromogent assay tilstedeværelse av anti-trombinaktivitet i kultursupernatantene av de infiserte celler.

Eksempel 6

Ekspresjon av protein P2 i cytoplasma av insektceller. Protein P2 kunne også bli fremstilt og akkumulert i cytoplasma av S. fru<g>iperda celler. Denne metode gir generelt et bedre utbytte av heterologe proteiner, siden den benyt-ter ekspresjonssignalene av polyhedrin som er et ikke utskilt viralt protein.

Søkers fremgangsmåte for å erholde store mengder av rekombinant protein P2 er basert på ekspresjonen av et fu-sjonspolypeptid hvor de første 18 aminosyrer av polyhedrin blir spleiset i ramme til de 64 aminosyrer av P2. Tilstedeværelsen av NH2 ende-sekvensen av polyhedrin tillater høye ekspresjonsnivå<21.>1 tillegg plasserte søker mellom polyhe-drindelen og P2 sekvensen et metionin-residuum som tillater frigjøring av P2-enheten ved behandling av hybridproteinet med CNBr.

På lignende måte som de ovennevnte fremgangsmåter fremstil-te søker et syntetisk DNA-fragment som kunne tillate splei-singen i Ball-BamHI-fragment fra M13-P2 til en passende overføringsvektor. Den nye syntetiske del vist i figur 11, innbefatter også BamHI- og Ballseter for etterfølgende manipulasjoner.

En forskjellig overføringsvektor, pAcFTl, som bærer nukleotidsekvensen som koder for de første 18 aminosyrer av polyhedrin er blitt erholdt (figur 12). Kort angitt har EcoRV-BamHI-fragmentet av pAcYml<19> blitt erstattet med et syntetisk oligonukleotid som inneholder polyhedrin gensekvensen fra nukleotid -92 til nukleotid +55. Et passende BamHI-sete er tilstede etter denne sekvens, og det er blitt brukt for innsetting av den fullstendige P2-kodende sekvens i henhold til et skjema illustrert i figur 13. Via denne konstruksjon erholdte søker et nytt plasmid betegnet pAc-FT1-P2 som er blitt brukt for å overføre hybridgenet til baculovirus-genomet.

Det rekombinante baculovirus ble erholdt som beskrevet i eksempel 5. Infeksjon av S. frugiperda celler ble utført i henhold til 2 0 standard fremgangsmåter. Dyrking av infiserte insektceller fører til cytoplasmisk akkumulering av fusjonsproteinet. Dette hybrinprotein var kilden for rekombinant P2. Flere metoder er tilgjengelige fra litteraturen som kan bli brukt for å spalte hybridet med CNBr 22,23 . Anvendelsen av metoden av Olson et al<23>, har tillatt søker å erholde den riktige polypeptidsekvens til P2. Dette molekyl oppviste antitrombinaktivitet.

Eksempel 7

For å erholde Tyr61-varianten av P2-proteinet er oligonukleotidene nr. 5 og 6 beskrevet ovenfor i eksempel 3 og vist i figur 3 blitt substituert med de følgende Oligo 5-Tyr

oligo 6-Tyr

I oligo 5-Tyr koder tripletten TAC som er understreket, for et tyrosin residuum og erstatter GAC-tripletten som koder

for asparaginsyre som opprinnelig var tilstede. Oligo 6-Tyr er blitt opprettet tilsvarende for å erholde en fullstendig komplementaritet mellom to kjeder. De følgende trinn som fører til ekspresjon og/eller sekresjon av varianten i insektceller eller i E. coli, er de samme som beskrevet ovenfor i eksempel 4 til 6.

Eksempel 8

For å erholde et glysinutvidet derivat av P2-proteinet, har oligonukleotidene 5 og 6 beskrevet ovenfor i eksempel 3, blitt substituert med de følgende:

oligo 5-Gly

oligo 6-Gly

I oligo 5-Gly har tripletten GGT som er understreket og som koder for glysin, blitt satt inn før stoppkodone. Oligo 6-Gly er blitt opprettet tilsvarende for å erholde fullstendig komplementaritet mellom de to kjeder. De følgende trinn som fører til ekspresjon og/eller sekresjon av det Gly-utvidede derivat i insektceller eller i E. coli, er de samme som beskrevet ovenfor under eksempel 4 til 6.

Eksempel 9

cDNA kloning av Pl og P2

(a) Totalt RNA fra Hirudinaria manillensis' hoder ble fremstilt i henhold til Cathala et al<24>. (b) Revers transkripsjonreaksjonen ble utført som følger: ble slått sammen på is, blandet og blandingen ble oppvarmet i 2 minutter ved 65°C fulgt av avslutning på is. 10 enheter ' RNAsin (Promega) og 20 enheter av AMV revers transkriptase (Boehringer Mannheim) ble tilsatt, fulgt av inkubering ved 42°C i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble så fenolkloroform- ekstrahert og isopropanol-utfelt. (c) Polymerase kjedereaksjon-(PCR)-reaksjoner ble utført. Det generelle skjema for hver PCR-reaksjon er skissert nedenfor:

PCR blanding:

Reaksjonsblandingen ble denaturert ved 95°C i 5 minutter før tilsetningen av 2,5 enheter Taq-polymerase (Cetus/Per-kin-Elmer) og derpå overlagt med 80 /il av mineralolje. Reaksjonen ble gjentatt i syklus i en Cetus/Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler.

Den gjenværende Taq-polymerase ble inaktivert med fenol-kloroform og etanol utfelling; prøver kunne bli lagret ved -2 0°C. For å erholde de fullstendige sekvenser av Pl og P2 cDNAer, ble tre runder av PCR amplifikering uført. Sekvensene av hver primer som ble brukt, er vist nedenfor. Posisjoner ved hvilke en degenerasjon ble innført i oligo-nukleotidsekvensen er angitt ved de alternative nukleotider vist under primersekvensen (N betegner at alle 4 nukleotider ble brukt). Restriksjonseter tillagt for å lette kloning av amplifikeringsproduktene er understreket.

dT17 adoptor primer:

Adaptor primer:

Primer 3-8 Primer 52-56

Primer 32-37

Primer 51 I Primer 5' II

Første amplifikeringsrunde

500 pmol av fullstendig degenererte primere, som strekker seg fra residuum 3 til 8, og fra residuum 56 til 52 av P2 aminosyresekvensen, blir brukt som motsåtende primere i PCR reaksj onen.

Amplifikering av cDNA 3'ender (RACE fremgangsmåte) Frohman et al<25.>

En gen-spesifikk primer som strekker seg fra residuum 32 til 37 ble utformet på basis av nukleotidsekvensen av P2 bestemt i første amplifikeringsrunde. Denne ble brukt sammen med dT adaptor-primeren for å amplifikere cDNA (figur 14).

Amplifikering av cDNA 5' ende (RACE fremgangsmåte) Frohman et al<25>.

10 fig av totalt RNA fra iglehoder ble reverstranskribert som beskrevet ovenfor for substitusjonen av 1 fig av en gen-spesif ikk primer (5'I) for dT17 adaptor-primer (se figur 15). Reaksjonsblandingen ble så isopropanolutfelt, og den første kjede cDNA-produkter ble polyadenylert ved sine 5' ender ved å bruke Terminal deoxynukleotidyltrensferase

(TdT) som følger:

Prøver ble inkubert i 10 minutter ved 37°C og oppvarmet 16 min til 65°C. Reaksjonsblandingen ble så fortynnet til 500 /il i destillert vann. 10 fil av de polyadenylerte produkter ble amplifikert ved å bruke 10 pmol av dT17 adaptor-primeren, 25 pmol av adaptor-primeren og 25 pmol av en andre genspesifikk primer opp-strøms for den første spesifikke ble brukt for transskrip-sjon (5' II, se figur 15).

d) Analyse av PCR-produkter

De amplifikerte produkter ble spaltet ved restriksjonsseter

som var tilstede i hver primer. Det fordøyde produkt ble gelopprenset og subklonet i pUC13-vektor, på forhånd for-døyet med samme restriksjonsenzym. Plasmider som bærer inn-skuddet av interesse, ble identifisert ved restriksjons-analyse. Plasmid-DNA ble sekvensert med sekvenase (USB) ved å bruke forhandlers anbefalinger. cDNA sekvensene av Pl og P2 således erholdt og de utledede aminosyresekvenser er som følger. Ledersekvenser er understreket.

Pl CDNA

P2 CDNA

Claims (1)

1. Polypeptid, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvensen: samt farmasøytisk akseptable salter derav og hvori Yaa er Asp eller Tyr og Zaa er -0H, -NH2 eller Gly-OH.

2. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at enhver av aminosyresekvensene vist i krav 1 ligger etter et Met residuum.

3. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at enhver av aminosyresekvensene vist i krav 1, ligger etter en fullstendig eller deler av en ledersekvens såsom ledersekvensen: Met Phe Ser Leu Lys Leu Phe Val Val Phe Leu Ala Val Cys Ile Cys Val Ser Gin Ala.

4. Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det er et fusjonsprotein hvor enhver av aminosyresekvensene vist i krav 1 er fusert til en bærersekvens.

5. Fremgangsmåte ved fremstilling av et polypeptid som angitt i ethvert av de foregående krav eller et farmasøy-tisk akseptabelt salt derav, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: (a) å fremskaffe en vertsorganisme transformert med en ekspresjonsvektor, omfattende en DNA-sekvens som koder for et av de angitte polypeptider under slike betingelser at polypeptidet blir uttrykt deri, og (b) isolere polypeptidet således erholdt, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at vertsorganismen er et bakterium, gjær, en pattedyrcellelinje, insektcellelinje eller dyr, fortrinnsvis en stamme av E. coli type B eller en Spodoptera frugiperda cellelinje.

7. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel eller fortynningsmid-del, og som aktiv bestanddel et polypeptid som angitt i ethvert av kravene 1-4, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

8. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter en DNA-sekvens som koder for et polypeptid som angitt i ethvert av kravene 1-4, hvilken vektor kan være et plasmid, en virus såsom en rekombinant baculovirus hvor polyhedrinpromotoren er operativt forbundet til nevnte DNA-sekvens, samt hvor DNA-sekvensen eventuelt ytterligere koder for et lederpeptid som er i stand til å dirigere sekresjon av polypeptidet fra celler hvor polypeptidet blir uttrykt, eller hvor DNA-sekvensen koder for et fusjonsprotein som er saltbart for å frigjøre polypeptidet.

9. Vertsorganisme, karakterisert ved at den er transformert med en kompatibel ekspresjonsvektor ifølge krav 10, hvilken vertsorganisme fortrinnsvis er et bakterium, gjær, en pattedyrcellelinje, insektscellelinje eller dyr, fortrinnsvis en stamme av E. coli type B eller en Spodoptera frugiperda cellelinje.

10. DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for et polypeptid som angitt i ethvert av kravene 1-4, hvilken DNA-sekvens kan være en syntetisk DNA-sekvens, et cDNA, og som eventuelt ytterligere koder for et lederpeptid som er i stand til å dirigere sekresjon av polypeptidet fra celler hvor polypeptidet blir uttrykt.

11. DNA-sekvens ifølge krav 10, karakterisert ved at den koder for et fusjonsprotein som er spaltbart for å frigjør polypetidet.

12. DNA-sekvens ifølge krav 10, karakterisert ved at den består i hovedsak av:

13. DNA-sekvens ifølge krav 12, karakterisert ved at den angitte sekvens ligger umiddelbart etter sekvensen: Referanser 1) Markwardt, F. 1970, Methods in Enzymology, 19., p. 924 2) Markwardt, F. 1985, Biomed. Biochim. Acta. ±±, p. 1007 3) Markwardt, F. Hauptmann, J., Nowak, G., Klessen, C., and Walsmann, P. 1982. Thromb. Haemostasis 42, p. 226. 4) Dupont D., Keim P., Chui A., Bello R. and Wilson K., Derivatizer-Analyser User Bulletin No. 1, Applied Biosystems Inc., 1987 5) Grosjeans H. and Fiers W. 1982. Gene, lfi., p. 1996) Maniatis T., Fritsch E.F. and Sambrook J. 1982. Cold Spring Harbor, NY 7) Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R. 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74., P* 5463. 8) Blobel G. and Dobberstain B. 1975. J. Cell Biology, 67. p. 83 9) Pages J.M. 1983, Biochimie, 6_5_, p. 531 10) Wolfe P.B. 1983. J. Biol. Chem. 218., p. 12073 11) Talmadge K., Stahl S. and Gilbert W. 1980. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77, p. 3369 12) Oka T., Sakamoto S., Miyoshi K., Fuwa T., Yoda K., Yamasaki M., Tamura G. and Miyake K. 1985. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82., p. 721213) Henning V., Royer H.D., Teather R.M., Hindennach I. and Hollenberg CP. 1979. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76. p. 436014) Isacchi A., Sarmientos P., Lorenzetti R. and Soria M.1989, Gene 8_1, p. 129

15) Mandel M. and Higa A.J. 1970. J. Mol. Biology, 53_, p.

154

16) Krstenansky, J.K., and Mao, s.J.T. 1987. FEBS Lett. 211. p. 10

17) Ghrayeb J., Kimura H., Takahara M., Hsiung H., Masui Y. and Inouye M. 1984. EMBO Journal 3_, p. 2437 18) Bailey, M.J., McLeod, D.A., Kang, C, and Bishop, D.H.L.

1989. Virology 169, p. 323

19) Matsuura, Y., Possee, R.D., Overton, H.A. and Bishop. D.H.L. 1987. J. Gen. Virol. 68, p. 1233

20) Summers, M.D., and Smith, G.E. 1987, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555

21) Luckow, V.A. and Summers, M.D. 1988, Virology, 167, p.56

22) Gross E. 1967. Methods in Enzymology, H, p. 238

23) Olson H., Lind P., Pohl G., Henrichson C, Mutt V., Jornvall H., Josephson S., Uhlen M. and Lake M. 1987, Peptides, 9_, p. 301

24) Cathala, G., Savouret, J.-F., Mendez, B., West, B.L., Karin, M., Martial, J.A. and Baxter, J.D. (1983) DNA, 2,4: 329-335

25) Frohman, M.A., Dush, M.K. and Martin, G.R. (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85: 8998-9002