CN101838330A - 一种杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法和应用。本发明根据已公布的杀菌/通透性增强蛋白基因和人酸性成纤维细胞生长因子基因序列，通过基因重叠延伸拼接法，得到了中间带有疏水性多肽接头的杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合基因，将其克隆至表达载体pPICZαA中，构建了杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体，再转化至毕赤酵母菌X-33中，获得工程菌株，该菌株可高效表达杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白。本发明融合蛋白既能用于制备杀菌剂，还可促进细胞增殖，在治疗伤口感染或促进伤口愈合的药物研究中具有临床应用价值。

Description

一种杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程抗菌蛋白的制备领域，具体涉及一种杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

随着现代文明与高科技不断发展，许多传染病、营养不良性疾病得到有效控制，乃至基本消失，但创伤却有增无减。全球每年创伤人数达数千万、致死者约200余万人，在我国每年创伤数百万人、致死人数至少有20余万。伤口在愈合过程中，损伤创面坏死的细胞常成为细菌的最好培养基，很容易受到细菌等感染，G菌感染引发的内毒素释放及肠源性内毒素易位，引起菌血症或脓毒血症；内毒素侵入体内后，首先与血浆中的内毒素结合蛋白(LBP)结合，再与单核细胞、巨噬细胞等髓源性细胞表面的脂多糖受体CD14(mCD14)或血浆中的可溶性受体CD14(sCD14)结合，激活单核-巨噬细胞系统，引起体内炎症介质的大量合成、释放、启动全身炎症反应，最终诱发肝肾衰竭，心血管或血液系统衰竭等多脏器功能障碍综合症(MODS)。从创伤病例分析，伤后修复7～14天感染、中毒、继发多脏器功能障碍综合症(MODS)是死亡主要原因之一。许多学者对MODS的感染机制研究表明：感染时内毒素(LPS)在MODS发生中起着“扳机”作用。LPS是G外膜的主要组成部分，同时也是G致病的重要因素。如何在促进伤口愈合的同时避免细菌感染、预防多脏器功能障碍综合症(MODS)的发生是一个极为重要的课题。

杀菌/通透性增强蛋白(bacteriacidal/permeability-increasing protein，BPI)为一种小分子蛋白，与LBP具有较高同源性，与LPS的亲和力远大于LBP，BPI-LPS复合物既可防止巨噬细胞的激活，中和内毒素的毒力，阻断内毒素的多种作用。另外BPI与G细菌外膜也可特异性结合，使细菌停止生长而最终导致细菌溶解死亡。

BPI最早是Wesis等(1978年)从人中性粒细胞中分离获得的抗菌蛋白，相对分子质量55×10³，主要存在于人和哺乳动物的多形核粒细胞(PMN)的嗜天青颗粒中，为PMN的主要抗菌成分，占其细胞总蛋白的0.5％～1.0％，在粒细胞分化的早幼粒阶段合成并储存于胞浆颗粒中，也微量存在于细胞表面及泪腺中。Takahashi和Levy等在人及小鼠的皮肤和黏膜上皮细胞发现BPI的存在，同时证明BPI在发囊和黏膜上皮抗感染的过程中起着重要作用。

天然BPI是一种由456个氨基酸残基组成，呈特殊的“回飞棒”形。晶体结构显示一个对称的、一分为二的蛋白质构象。由各200个氨基酸左右的N-末端区和C-末端区及富含脯氨酸的21个氨基酸残基(230～250)中间连接单位三部分组成，经蛋白酶水解后可裂解为25KD的N端片断和30KD的C端片断，其中N端功能片段(1～199)是含很高比例的碱基和亲水残基的碱性蛋白，具有完整BPI杀菌、结合/中和LPS的全部活性。体内外实验表明BPI及其功能性N端片段对LPS具有拮抗作用，阻断或降低感染时由LPS引起的病理损伤。同时BPI是正常存在于人和哺乳动物多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)嗜天青颗粒中和微量表达于PMN表面的自身成分，机体可对其形成天然的免疫耐受。BPI及其功能性N端片段由于其独特地抗菌机制及结合/中和内毒素功能，使其在创伤的临床治疗中具有良好的应用价值。

目前美国Xoma公司开发的CHO细胞表达重组BPI氨基端蛋白处于世界领先水平，该分子单独或与其它抗生素联合使用已被证明可以抵御致死剂量的G接种或内毒素接种，现已应用于创伤性失血、严重腹内感染、部分肝切除、脑膜炎(球)菌血症和眼科疾病等一些临床研究。国内已利用现代分子生物学、生物信息学及计算机分子模拟技术合成BPI小分子肽，并实验验证具有较强的生物活性；但药代动力学研究表明，rBPI₂₃/rBPI₂₁在体内的半衰期太短(＜1h)，将rBPI₂₃/rBPI₂₁与其他功能基因片段嵌合表达融合蛋白来提高其的半衰期并带有特殊的生物学活性是目前解决此问题的主要方向。

创伤愈合包括炎症、增殖、重新塑型三个阶段，需要多种细胞和多种生长因子参与调控。人酸性成纤维细胞生长因子(human acidic Fibroblast GrowthFactor，haFGF)是成纤维细胞生长因子家族成员之一，广泛分布于脑、垂体、神经组织、视网膜、肾上腺、心脏和骨等器官或组织内，能够诱导多种细胞分化、增殖，具有营养和保护神经元、诱导缺血区血管形成、促进神经再生和伤口愈合、调节肿瘤的发生和脂肪形成等功能，目前体外、体内实验表明，haFGF对治疗创伤、机体缺血损伤、溃疡、神经退化变性疾病及眼科疾病等具有很好的应用前景。

Jaye(1986年)首次克隆了人类aFGF基因(hafgf)，并测定其核苷酸序列。haFGF基因位于第5对染色体(5q31.3-33.2)，为单拷贝基因，其功能区呈不连续状态，由三个外显子组成。haFGF为含有154个氨基酸的β筒状蛋白，三级结构是12条反向β链组成的三叶草型，Bernett MJ(2004年)研究发现，haFGF结构中存在数个核心包装缺陷，使haFGF热稳定性较低，结构域较活跃；translation/libration/screw(TLS)分析显示，亚单位折叠单位β链6～12连接成一个刚体，与邻近的羧基末端、氨基末端差异较大，是肝素结合区；将β链6～12断开，β链1～5没有相关的TLS运动，灵活性较高，是受体结合区；除此，Lazano和Wesche J等实验证明haFGF还具有引导其跨膜进入细胞核作为信号分子直接诱导核分裂的N端单向核定位序列(NLS1)和C端的双向核定位序列(NLS2)。

李校坤率先将通过基因技术获得的人重组酸性成纤维细胞生长因子应用于美容行业，并以细胞活能品牌推到了美容界，被称为表皮变白因子，引起很大的反响，获得了较好的社会效益和经济效益。2002年8月，rhaFGF开始进入I期临床试验，对36例深II度的烧伤患者分别在创面滴注不同剂量的rhaFGF，结果除4例发生局部疼痛外，各剂量组均未见明显不良反应，在不同时间点均未能在血清中测到rhaFGF，该药用于治疗深II度的烧、烫伤创面是安全的。目前暨南大学医药生物技术研究开发中心与上海万兴生物制药有限公司联合开发的外用冻干重组人酸性成纤维细胞生长因子已获国家药品监督管理局颁发的新药证书，作为基因工程国家一类新药全面进入临床使用。

BPI₂₃和haFGF是小分子多肽，易被机体环境失活或被伤口部位存在的蛋白酶降解，活性半衰期只有数小时或更短，达不到所期望的生物活性效果。为了充分发挥BPI₂₃和haFGF的生物功能，协同互补，将这两种蛋白多肽基因融合在一起，就有可能构建成具有双重功能的融合蛋白，同时增加了化学、生物、基因产物，延长半衰期，可研究开发一种既能杀菌又能促进伤愈合的新型药物。

发明内容

本发明的目的在于根据现有抗菌蛋白中存在的半衰期短、容易降解的问题，提供一种杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白，该蛋白活性半衰期较长，不易被蛋白酶降解。

本发明另一目的在于提供上述杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供上述杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白包含杀菌/通透性增强蛋白的功能性N端肽序列(BPI₂₃，即N端前199个氨基酸，分子量为23KDa的蛋白片段)、疏水性多肽接头和人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)的肽序列。其中，所述多肽接头是(Gly₄Ser)₃。

本发明杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法如下：根据已公布的杀菌/通透性增强蛋白基因和人酸性成纤维细胞生长因子基因序列，获得杀菌/通透性增强蛋白BPI₂₃和人酸性成纤维细胞生长因子haFGF，通过基因重叠延伸拼接法，得到了中间带有疏水性多肽接头的杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合基因，将其克隆至表达载体pPICZαA中，构建了杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体，再转化至毕赤酵母菌X-33中，获得工程菌株，通过表达条件的优化，该菌株高效表达杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白。

作为一种优选方案，本发明杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法如下：

(1)从人外周血白细胞中提取到完整的总RNA，RT-PCR扩增得到了BPI₂₃基因的cDNA序列，从人胎脑组织中提取到完整的总RNA，RT-PCR扩增得到了haFGF基因的cDNA序列，以杀菌/通透性增强蛋白和人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的cDNA序列为模板，根据Genebank公布序列设计两对引物P1～P4，扩增出与Genebank公布序列一致的杀菌/通透性增强蛋白的功能性N端片段和人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白基因序列，引物序列如SEQ ID NO：2～5所示；

(2)设计两对引物P5～P8，引物序列如SEQ ID NO：6～9所示，其中，P5和P6用于扩增杀菌/通透性增强蛋白的功能性N端片段基因序列，P7和P8用于扩增人酸性成纤维细胞生长因子基因序列，通过基因重叠延伸拼接法，将扩增得到的两段基因通过多肽接头DNA序列进行体外基因重组，合成融合基因，序列如SEQ ID NO：10所示；

(3)将融合基因用定点克隆至经相同双酶切的真核表达载体pPICZαA，成功构建了pPICZαA/BPI₂₃-haFGF分泌型酵母表达载体；

(4)将Sac I线性化的pPICZαA-BPI₂₃-haFGF电转化至毕赤酵母宿主菌X-33中，获得稳定表达的工程菌株X-33/pPICZαA-BPI₂₃-haFGF；通过表达条件的优化，该菌株高效表达杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白。

本发明杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白可以用于制备抗菌药或抑菌药。

本发明杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白还可用于促进成纤维细胞的增殖，因此可用于制备促进伤口愈合的药物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

对本发明融合蛋白初步的生物功能评价后发现：在体外，琼脂孔扩散法和MTT掺入法实验证实，融合蛋白对细菌有抑制作用，对成纤维细胞有促分裂作用；通过动物创伤模型实验证实，本发明融合蛋白既能抑制细菌感染，又能改善伤口的生理状态，加速创伤愈合；上述实验证明本发明融合蛋白既能用于制备抗菌药或抑菌药，还可以用于制备促进伤口愈合的药物，从两个方面调节创伤愈合的生理状态，这在治疗伤口感染的药物研究中具有一定的创新，对创伤感染所引发的全身炎症反应综合征的治疗有重要意义，具有潜在的临床应用价值。

附图说明

图1是重组质粒pUCm-T/BPI₂₃双酶切鉴定及PCR验证，其中，M是分子量标准GeneRuler 1kb DNA Ladder；1是以重组质粒pUCm-T/BPI₂₃为模板扩增约700bp产物；2是BamH I、Xho I双酶切重组质粒pUCm-T/BPI₂₃的产物；

图2是重组质粒pUCm-T/haFGF双酶切鉴定及PCR验证，其中，M是分子量标准GeneRuler 1kb DNA Ladder；1是以重组质粒pUCm-T/haFGF为模板扩增约480bp产物；2是EcoR I、Xho I双酶切重组质粒pUCm-T/haFGF的产物；

图3是BPI₂₃-haFGF融合基因的合成，其中，M是分子量标准GeneRuler 1kbDNA Ladder；1是PCR扩增产物Linker-haFGF；2是PCR扩增产物BPI₂₃-Linker；3是PCR扩增产物BPI₂₃-haFGF融合基因；

图4是pPICZαA-BPI₂₃-haFGF的双酶切鉴定，其中，M是分子量标准GeneRuler 1kb DNA Ladder；1是kpnI、Not I双酶切pPICZαA-BPI₂₃-haFGF；2是kpn I单酶切pPICZαA-BPI₂₃-haFGF；3是kpn I单酶切pPICZαA；

图5是融合蛋白的Western blot鉴定，其中，M是蛋白marker；1是X-33/pPICZαA-BPI₂₃-haFGF；*代表BPI₂₃-haFGF带；

图6是纯化洗脱液SDS-PAGE，其中，M是蛋白marker，1是纯化前，2是用100mmol/L的咪唑洗脱后的纯化蛋白；3是用300mmol/L的咪唑洗脱后的纯化蛋白；4是用500mmol/L的咪唑洗脱后的纯化蛋白；

图7是融合蛋白对革兰氏阴性菌的作用，其中，1是生理盐水，2是X-33/pPICZαA-BPI₂₃-haFGF，3是X-33/pPICZαA，4是氨苄青霉素；

图8是融合蛋白对革兰氏阳性菌的作用，其中，1是生理盐水，2是X-33/pPICZαA-BPI₂₃-haFGF，3是X-33/pPICZαA，4是氨苄青霉素；

图9是MTT检测融合蛋白促NIH3T3细胞增殖活性；

图10是受伤后14d小鼠皮肤病理切片，其中，A是阴性对照组，B是融合蛋白组，C是标准haFGF组(×100)。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

1.杀菌/通透性增加蛋白BPI₂₃和人酸性成纤维细胞生长因子haFGF的克隆

从人外周血白细胞和胎脑组织中分别提取完整的总RNA，逆转录合成cDNA，用作BPI₂₃和haFGF两个基因扩增模板。根据Genebank公布的BPI(Genebank登录号：NM_001725)和haFGF(Genebank登录号：S67291)cDNA序列，利用Primer Premier 5.0和DNA club生物学软件设计4条特异性引物P1～P4，引物序列如SEQ ID NO：2～5所示；以cDNA为模板，P1、P2为引物扩增包括信号肽的BPI₂₃ cDNA序列，上游P1含BamH I酶切位点，，下游P2含Xho I酶切位点；P3、P4为引物扩增haFGF cDNA序列，上游P3含EcoR I酶切位点，下游P4含Xho I酶切位点。并将其分别克隆入pUCm-T载体，测序分析。运用相关生物信息学软件对克隆的序列进行预测分析。

RT-PCR扩增得到约700bp的BPI₂₃和480bp的haFGF cDNA片段。分析两个序列，结果表明：BPI₂₃和haFGF编码序列cDNA与Genebank公布序列一致(如图1、2)。

2.BPI₂₃-haFGF融合基因的构建及其序列分析

应用Primer Premier 5.0和DNA club软件，设计两对特异性引物P5～P8，引物序列如SEQ ID NO：6～9所示；根据已经扩增出的BPI₂₃和haFGF构建融合基因BPI₂₃-haFGF，P5、P6用于扩增BPI₂₃，P7、P8用于扩增haFGF；在P5及P8的5’端分别引入EcoR V、XhoI酶切位点，P6和P7中间有重叠部分为疏水性肽段(Gly₄Ser)₃的Linker。运用Gene SOEing技术将两段基因通过疏水性多肽接头(Gly₄Ser)₃DNA序列进行体外基因重组合成融合基因，克隆入pUCm-T载体，构建pUCm-T/BPI₂₃-haFGF重组质粒，测序，并运用相关生物信息学软件对克隆的序列进行预测分析。

采用Gene SOEing技术将两段基因通过一疏水性多肽接头(Gly₄Ser)₃DNA序列进行体外基因重组，扩增得到约1.2Kb的融合基因片断，如SEQ ID NO：10所示。序列分析表明BPI₂₃、haFGF及linker拼接组合的顺序，方向及序列完全正确。BPI₂₃-haFGF为1.2kb，始密码子为ATG，终止密码子为TAA，编码399个氨基酸，编码的蛋白质具有信号肽序列以及BPI₂₃和haFGF蛋白保守结构域。预测不带信号肽的BPI₂₃-haFGF序列，编码368个氨基酸，分子量40.36ku，pI为9.45(图3)。

3.BPI₂₃-haFGF融合基因酵母表达载体的构建

根据已构建的含信号肽BPI₂₃-haFGF测序结果以及pPICZαA多克隆位点序列，借助于Primer Premier 5.0和DNA club生物软件设计2条特异引物P9、P10，引物序列如SEQ ID NO：11～12所示；扩增包括不含信号肽BPI N端编码199个氨基酸的BPI₂₃基因、非极性疏水柔性肽段(Gly₄Ser)₃的Linker和haFGF基因，同时两端分别引入Kpn I酶切位点和Not I酶切位点。用Kpn I和Not I双酶切BPI₂₃-haFGF融合基因克隆入载体pPICZαA中，构建pPICZαA/BPI₂₃-haFGF分泌型重组表达质粒。

测序分析，序列包括编码无信号肽BPI N端前199个氨基酸基因、编码(Gly₄Ser)₃的Linker基因和不含终止子的haFGF基因，大小为1107bp。BLAST结果表明：融合基因前段与Genebank上的BPI mRNA序列(登录号：4502446)同源性为99％，融合基因后段与Genebank上的haFGF mRNA序列(登录号：15055546)完全一致，获得编码正确的重组表达载体pPICZαA-BPI₂₃-haFGF。生物信息学软件分析预测编码融合蛋白序列，包括融合基因编码的368个氨基酸和表达载体pPICZαA上编码的18个氨基酸BPI₂₃-haFGF-c-Myc-6×His，共396个氨基酸，分子量43.5KD，pI为9.24，具有BPI₂₃和haFGF两个保守结构域，在哺乳动物、酵母、大肠杆菌中的半衰期分别为：30h、＞20h、＞10h，不稳定指数为45.65，脂溶性指数为76.31，GRAVY指数(两亲性指数)为0.466，6个半胱氨酸其中4个形成2个二硫键骨架。可以看出，此肽为阳离子多肽，稳定性很好，有利于基因工程表达(图4)。

4.BPI₂₃-haFGF融合蛋白的表达鉴定

依据The EasySelect Pichia Expression Kit制备酵母菌X-33感受态和5～10μgSac I线性化的pPICZαA-BPI₂₃-haFGF，按Bio-Rad电转仪的说明书，在电压1100V、脉冲宽度0.2ms、脉冲间隔0.2sec、脉冲次数3times条件下电击转化，挑取具有Zeocin抗性的转化子扩大培养。采用煮冻煮法抽提酵母总DNA作为模版，以表达载体pPICZαA上α-factor primer及3’AOX1 primer为引物PCR鉴定BPI₂₃-haFGF基因在酵母染色体上的重组情况。筛选鉴定后的转化子接种于2mLBMGY(pH 6.0)培养基中，30℃，250r/min培养至OD(600)为6.0左右，离心收集菌体，用6mL BMMY(pH 6.0，甲醇浓度0.5wt％)培养基重悬菌体，28℃，230r/min继续培养，并每天补加体积分数为0.5％的甲醇，诱导表达4d。离心，收集表达上清，用氯仿、甲醇浓宿后，根据《现代分子生物学实验技术》方法进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定。

15体积％分离胶SDS-PAGE分析和6×His标签一抗Western Blot鉴定，在约43.5KD有特异性条带，与目的融合蛋白预测大小相符，表达量为10～20μg/ml(图5)。

实施例2诱导表达条件的优化

按照上述方法，接种表达量较高的菌株培养，在终浓度为0.5mM的PMSF诱导培养基中诱导表达，从诱导开始每隔24h取样一次，直至第7天，SDS-PAGE比较不同时间的表达量；再以最佳的诱导时间，在不同温度(24℃、26℃、28℃、30℃)、不同PH值(4.0、5.0、6.0、7.0)、不同甲醇浓度(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％)下进行诱导表达，SDS-PAGE比较各种情况的表达量，确定其最佳的诱导表达条件。

结果发现：28℃、pH5.0、甲醇终浓度为1.0wt％、PMSF终浓度为0.5mM、诱导4d为最佳表达条件，表达量可达约25μg/ml。

实施例3融合蛋白的扩大表达、纯化及浓缩

以最佳的诱导表达条件(28℃、pH5.0、甲醇终浓度为1.0％、PMSF终浓度为0.5mmol/L，诱导表达时间96h)进行扩大表达，收集上清，用0.22μm微孔滤膜过滤后，按照Bio-Rad蛋白纯化系统和Amersham Bioscenes的HisTrap^TM HP Kit说明书进行纯化，用含不同浓度的咪唑PBS溶液洗脱目的蛋白，收集洗脱液后SDS-PAGE，将含有目的蛋白的洗脱夜用截留分子量为3KD的透析袋透析除盐后冻干浓缩，-70℃保存备用。

收集的纯化洗脱液SDS-PAGE分析表明，100mmol/L咪唑的洗脱液中含有大量的融合蛋白，300mmol/L咪唑的洗脱液中含有少量融合蛋白，500mmol/L咪唑的PBS洗脱液中几乎不含融合蛋白，经扫描分析，纯化后融合蛋白BPI₂₃-haFGF纯度高达90％，回收率约为50％(图6)。

实施例4融合蛋白的生物功能评价

1.琼脂孔扩散法检测融合蛋白的抑菌活性

在50℃左右液体顶琼脂中按1∶100加入过夜培养的菌液，迅速混匀后倒入铺有底琼脂的平板内，待凝固后打孔。将纯化冻干的融合蛋白溶解为2.5g/L的溶液，分别加到含有大肠杆菌DH5α和金黄色葡萄球菌的顶琼脂孔内(40μl/孔)，以2.5g/L的Ampicillin作为阳性对照，以转化有空载体的酵母菌X-33诱导表达的浓缩上清和生理盐水作阴性对照，设2个复板。置于37℃培养箱培养4～8h，测量抑菌圈大小，拍照记录结果(图7、8)。

2.MTT检测融合蛋白促NIH3T3细胞增殖活性

消化对数生长期的NIH3T3细胞，细胞计数后加到96孔板中，7×10³cell/孔，200μl；贴壁24h，弃上清，分别加入BPI₂₃-haFGF融合蛋白(样品组)和标准品HaFGF(阳性对照)，使终浓度分别为0.0(阴性对照)、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9g/L，4个复孔，37℃，5％CO₂培养24h，MTT法测定细胞A_490nm值(以A_630nm值为参照)，将所得结果进行t-检验，分析样品组与对照组之间的差异(图9)。

3.BPI₂₃-haFGF融合蛋白对小鼠创伤模型的作用

用戊巴比妥钠麻醉NIH3T3小白鼠，将Na₂S溶液脱毛的小鼠背部暴露于90℃水浴中15s，造成约占体表面积10％的烫伤；随机分成样品组(0.4g/LBPI₂₃-haFGF融合蛋白)、阳性对照组(0.4g/L标准品HaFGF)和阴性对照组(0.9wt％生理盐水)，12只/组，每日涂药1次，观察创面变化；烫伤后7、14和21d脱颈处死小鼠，每次每组4只，切取创伤部位及周围皮肤作组织病理切片，观察不同组切片成纤维细胞和毛细血管数量(图10)。

实施例5生物功能评价结果

1.体外实验：琼脂孔扩散法表明，融合蛋白具有一定的抑制和杀伤革兰氏阴性菌的能力；MTT掺入法检测结果融合蛋白对NIH3T3细胞有促增殖活性，当融合蛋白浓度为0.40mg/ml时，促NIH3T3细胞增殖作用最明显，当浓度高于或低于0.40mg/ml时促增殖效果降低。

2.体内实验：造小鼠皮肤浅二度烫伤模型，隔日涂药，以haFGF标准品为阳性对照，以0.9wt％生理盐水为阴性对照，分别在烫伤后7d、14d、21d取小鼠受损皮肤作病理切片。结果显示，烫伤后第14d样品组创面已基本愈合，溃疡处毛细血管和成纤维细胞远比阴性对照组密集，与haFGF标准品作用相当；样品组比阴性对照组提前2～3d愈合。

一种杀菌通透性增强蛋白人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法和应用 序列表

<110>广东药学院

 

<120>一种杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方

     法和应用

 

<130>

 

<160>12

 

<170>PatentIn version 3.2

 

<210>1

<211>368

<212>PRT

<213>人工序列

 

<400>1

Val Asn Pro Gly Val Val Val Arg Ile Ser Gln Lys Gly Leu Asp Tyr

1               5                   10                  15

Ala Ser Gln Gln Gly Thr Ala Ala Leu Gln Lys Glu Leu Lys Arg Ile

            20                  25                  30

Lys Ile Pro Asp Tyr Ser Asp Ser Phe Lys Ile Lys His Leu Gly Lys

        35                  40                  45

Gly His Tyr Ser Phe Tyr Ser Met Asp Ile Arg Glu Phe Gln Leu Pro

    50                  55                  60

Ser Ser Gln Ile Ser Met Val Pro Asn Val Gly Leu Lys Phe Ser Ile

65                  70                  75                  80

Ser Asn Ala Asn Ile Lys Ile Ser Gly Lys Trp Lys Ala Gln Lys Arg

                85                  90                  95

Phe Leu Lys Met Ser Gly Asn Phe Asp Leu Ser Ile Glu Gly Met Ser

            100                 105                 110

Ile Ser Ala Asp Leu Lys Leu Gly Ser Asn Pro Thr Ser Gly Lys Pro

        115                 120                 125

Thr Thr Thr Cys Ser Ser Cys Ser Ser His Ile Asn Ser Val His Val

    130                 135                 140

His Ile Ser Lys Ser Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His Lys

145                 150                 155                 160

Lys Ile Glu Ser Ala Leu Arg Asn Lys Met Asn Ser Gln Val Cys Glu

                165                 170                 175

Lys Val Thr Asn Ser Val Ser Ser Lys Leu Gln Pro Tyr Phe Gln Thr

            180                 185                 190

Leu Pro Val Met Thr Lys Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe Thr Ala

    210                 215                 220

Leu Thr Glu Lys Phe Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys

225                 230                 235                 240

Leu Leu Tyr Cys Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp

                245                 250                 255

Gly Thr Val Asp Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu

            260                 265                 270

Gln Leu Ser Ala Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu

        275                 280                 285

Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser

    290                 295                 300

Gln Thr Pro Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn

305                 310                 315                 320

His Tyr Asn Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe

                325                 330                 335

Val Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His

            340                 345                 350

Tyr Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp

        355                 360                 365

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

cgggatccat gagagagaac atggc                                          25

 

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>3

ccgctcgagt attttggtca ttactgg                                        27

 

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>4

cggaattcat ggctgaaggg gaaat                                          25

 

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>5

ccgctcgagt taatcagaag agactg                                         26

 

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>6

gatatcatga gagagaacat ggccaggggc ccttgc                              36

 

<210>7

<211>61

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>7

gctgccgcca ccgccgcttc cgccaccgcc gcttccaccg ccacctattt tggtcattac    60

t                                                                    61

<210>8

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>8

ggtggcggtg gaagcggcgg tggcggaagc ggcggtggcg gcagcgctga aggggaaat      59

 

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>9

ctcgagttaa tcagaagaga ctggcagggg gagaaa                               36

 

<210>10

<211>1200

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>10

atgagagaga acatggccag gggcccttgc aacgcgccga gatgggcgtc cctgatggtg     60

ctggtcgcca taggcaccgc cgtgacagcg gccgtcaacc ctggcgtcgt ggtcaggatc    120

tcccagaagg gcctggacta cgccagccag caggggacgg ccgctctgca gaaggagctg    180

aagaggatca agattcctga ctactcagac agctttaaga tcaagcatct tgggaagggg    240

cattatagct tctacagcat ggacatccgt gaattccagc ttcccagttc ccagataagc    300

atggtgccca atgtgggcct taagttctcc atcagcaacg ccaatatcaa gatcagcggg    360

aaatggaagg cacaaaagag attcttaaaa atgagcggca attttgacct gagcatagaa    420

ggcatgtcca tttcggctga tctgaagctg ggcagtaacc ccacgtcagg caagcccacc    480

accacctgct ccagctgcag cagccacatc aacagtgtcc acgtgcacat ctcaaagagc    540

aaagtggggt ggctgatcca actcttccac aaaaaaattg agtctgcgct tcgaaacaag    600

atgaacagcc aggtctgcga gaaagtgacc aattctgtat cctccaagct gcaaccttat    660

ttccagactc tgccagtaat gaccaaaata ggtggcggtg gaagcggcgg tggcggaagc    720

ggcggtggcg gcagcgctga aggggaaatc accaccttca cagccctgac cgagaagttt    780

aatctgcctc cagggaatta caagaagccc aaactcctct actgtagcaa cgggggccac    840

ttcctgagga tccttccgga tggcacagtg gatgggacaa gggacaggag cgaccagcac    900

attcagctgc agctcagtgc ggaaagcgtg ggggaggtgt atataaagag taccgagact    960

ggccagtact tggccatgga caccgacggg cttttatacg gctcacagac accaaatgag   1020

gaatgtttgt tcctggaaag gctggaggag aaccattaca acacctatat atccaagaag   1080

catgcagaga agaattggtt tgttggcctc aagaagaatg ggagctgcaa acgcggtcct   1140

cggactcact atggccagaa agcaatcttg tttctccccc tgccagtctc ttctgattaa   1200

 

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>11

ggtaccatgg tcaaccctgg cgtcgtg                                         27

 

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>12

gcggccgcat cagaagagac tggcag                                          26

Claims (8)

1.一种杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白中包含杀菌/通透性增强蛋白的功能性N端肽序列、疏水性多肽接头和人酸性成纤维细胞生长因子的肽序列。

3.根据权利要求2所述的杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于所述多肽接头是(Gly₄Ser)₃。

4.权利要求1～3所述杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：根据已公布的杀菌/通透性增强蛋白基因和人酸性成纤维细胞生长因子基因序列，获得杀菌/通透性增强蛋白BPI23和人酸性成纤维细胞生长因子haFGF，通过基因重叠延伸拼接法，得到了中间带有疏水性多肽接头的杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合基因，将其克隆至表达载体pPICZαA中，构建了杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体，再转化至毕赤酵母菌X-33中，获得工程菌株，通过表达条件的优化，该菌株高效表达杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白。

5.根据权利要求4所述杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)合成杀菌/通透性增强蛋白BPI₂₃和人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白haFGF的cDNA序列，根据Genebank公布的BPI cDNA和haFGF cDNA的序列，设计两对引物P1～P4，扩增出杀菌/通透性增强蛋白的功能性N端片段和人酸性成纤维细胞生长因子基因序列，引物序列如SEQ ID NO：2～5所示；

(2)设计两对引物P5～P8，引物序列如SEQ ID NO：6～9所示，其中，P5和P6用于扩增杀菌/通透性增强蛋白的功能性N端片段基因序列，P7和P8用于扩增人酸性成纤维细胞生长因子基因序列，通过基因重叠延伸拼接法，将扩增得到的两段基因通过多肽接头DNA序列进行体外基因重组，合成融合基因，序列如SEQ ID NO：10所示；

(3)将融合基因克隆入载体pPICZαA中，构建杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体；

(4)将表达载体转化至毕赤酵母菌X-33中，获得工程菌株，通过表达条件的优化，该菌株高效表达杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白。

6.权利要求1～3所述杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备抗菌药或抑菌药中的应用。

7.权利要求1～3所述杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白在促进成纤维细胞增殖中的应用。

8.权利要求1～3所述杀菌/通透性增强蛋白-人酸性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备促进伤口愈合的药物中的应用。

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