CN101698682B - 一种基于抗菌肽的双功能融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于抗菌肽的双功能融合蛋白及其制备方法和用途，所述的基于抗菌肽的双功能融合蛋白，是基于天蚕素B蛋白序列和人表皮生长因子的融合蛋白，并将其连接蛋白特别设计为凝血酶能够识别的位点，并且在融合蛋白上构建纯化的His标签。本发明对于上述融合蛋白采用原核表达系统来实现其生物制备，并获得了纯化的融合蛋白。利用纯化的融合蛋白进行了抑菌试验和活体动物实现验证，表明该融合蛋白能够应用于制备治疗表皮创伤的药物，用于表皮的创伤、擦伤、烧伤、烫伤等疾病，并可防止伤口的感染。

Description

一种基于抗菌肽的双功能融合蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及具有生物活性的多肽的人工设计和合成，特别涉及一种基于抗菌肽的双功能融合蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

1、抗菌肽研究进展

随着“传统抗生素”的广泛使用，导致大量的抗药菌株的产生，并且在病原菌感染时，如果用抗生素进行治疗，会刺激机体内毒素的释放，对机体造成伤害。因此，寻找新一代抗菌剂成为新药开发的热点，而抗菌肽(antimicrobial peptides)的发现克服了传统抗生素的以上缺陷。

抗菌肽是一类具有抗菌活性短肽的总称，最早是由Boman等从惜古比天蚕蛹中诱导分离得到的，目前为止已经明确的抗菌肽已不下几百种，其来源、抗菌谱、结构均不尽相同。其中，昆虫抗菌肽具有一些共同的特点，如分子量小，为碱性肽类物质，具有热稳定性，具有两亲性的分子结构。昆虫抗菌肽按照其分子结构，可以分为四类：第一类为不含半胱氨酸残基的、具有两个双亲α螺旋结构的抗菌肽；第二类为富含半胱氨酸残基的抗菌肽；第三类为富含脯氨酸残基的抗菌肽；第四类为富含甘氨酸残基的抗菌肽。其中，第一类以天蚕素(Cecropin)为代表，它含有31-39个氨基酸，分子量约为4kD，分子内具有两个双亲α螺旋结构，N端区带高度正电荷，C端区带高度负电荷，抗菌谱包括革兰氏阳性菌和阴性菌。

与青霉素等传统抗生素对细菌作用机制不同，抗菌肽分子通过其两亲α-螺旋上正电荷与细菌细胞膜磷脂分子上负电荷之间的静电吸引而结和聚集在质膜上，抗菌肽的疏水端C端α-螺旋插入到疏水的细菌细胞膜中央，双亲的α-螺旋留在质膜表面，打乱了质膜上蛋白和脂质原有的排列秩序，使得膜外正电荷增多，超过阈值时导致膜去极化，双亲的α-螺旋形成离子通道，使阳离子外流，作用结果是使细菌细胞质膜通透性增大而导致细菌的死亡。

因为抗菌肽本身的天然产量很低，合成或从机体中提取的步骤复杂、产率低、成本高，所以利用基因工程方法生产抗菌肽具有重要意义，但是，抗菌肽分子对表达系统的宿主细胞具有毒性，因此，选择适和的表达形式和系统已成为实现抗菌肽能否广泛应用的关键性问题。原核表达系统与真核表达系统相比，具有产量高成本低的优点。因此，在原核表达系统中以融合蛋白的形式表达抗菌肽成为研究的热点。

2、表皮生长因子研究进展

表皮生长因子(EGF)是是一种非常重要的多肽类生长因子，它是存在于表皮细胞和间充质细胞的一种有效的促分裂剂。20世纪60年代初由美国的Vanderbilt大学医学院生化系的Stanley Cohen等从小鼠颌下腺中分离纯化得到的。自EGF发现以来，先后发现了转化生长因子α(TGF-α)、结和肝素的EGF样生长因子(heparin-binging EGF-likegrowth factor，HB-EGF)、双向调节素(arnphireguli，AR)等。它们在一级结构上具有一定的保守性，其中保守的三对二硫键使EGF家族具有相似的空间构象，能够与EGF受体结和。其中人表皮生长因子(human epider mal growth factor，hEGF)是由53个氨基酸组成的单链多肽，链中含有6个半胱氨酸分子，形成3个稳定的分子内二硫键(6-20，14-31，33-42)，分子量为6040Da，等电点为4.6，消光系数(280nm)30.9，沉淀常数1.25S。

EGF能够专一性的与细胞表面受体结和，使受体自身磷酸化，EGF与受体结和后将细胞外信息传递至细胞内，从而改变细胞内的钙浓度，促进糖酵解、蛋白质合成、RNA和DNA的合成，从而刺激细胞增殖，调节细胞分化。EGF在疾病的治疗上有广泛的用途，它能够刺激外胚层、中胚层和内胚层细胞的增殖和分化，促进组织成熟和再生，因而能够促进外科手术伤口及其他创面的愈和，如皮肤的擦伤、创伤和烧伤等；EGF还能够促进胃肠粘膜的增殖与分化，研究发现给予外源性EGF能够减轻阿司匹林及其他药物引起的急性胃粘膜损伤；给慢性实验性胃溃疡大鼠皮下注射EGF，可使溃疡愈和速度加快；此外，EGF在化妆品领域也有广泛的应用，起到延缓皮肤细胞衰老，使皮肤滋润光滑的作用。

目前人表皮生长因子生产方法主要有三种，包括化学合成、生物来源提取以及基因工程技术生产，但是化学合成的产物产量和纯度不能满足工业化生产需求，生物提取又存在原料中有效成份含量低，提取工艺复杂等缺陷，使得人表皮生长因子的广泛应用受到了限制。因此利用基因工程方法生产人表皮生长因子成为研究的热点。目前国内仍无原核表达的人表皮生长因子上市应用于临床治疗。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于抗菌肽的双功能融合蛋白，以及其制备方法和用途，该融合蛋白是基于天蚕素B和人表皮生长因子融合，通过原核系统表达制备、纯化，具有抗菌和促表皮细胞生长的双功能。

本发明通用以下技术方案来实现：

一种基于抗菌肽的双功能融合蛋白，通过连接蛋白将天蚕素B的C端与人表皮生长因子的N端连接。

所述的天蚕素B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，人表皮生长因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的人表皮生长因子其C端之后还插入了6个组氨酸残基。

所述的连接蛋白为能够被凝血酶识别的多肽。

所述的能够被凝血酶识别的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的包含凝血酶识别多肽的基于抗菌肽的双功能融合蛋白，从N端到C端依次为：抗菌肽蛋白序列-凝血酶切割位点-人表皮生长因子蛋白序列-6个His残基；其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种表达基于抗菌肽的双功能融合蛋白的人工重组核苷酸序列，包含SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

上述基于抗菌肽的双功能融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)构建包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重组原核表达载体；

2)将构建好的重组原核表达载体转染宿主细胞，筛选出阳性克隆的重组细胞，并对其进行增殖培养；当菌液浓度A₆₀₀为0.3～0.6时，用终浓度为0.1～1mmol/L的IPTG诱导3～5h，离心收集重组细胞。

3)双功能融合蛋白的纯化：

将重组细胞裂解后离心分离得到沉淀，将其溶解于上样缓冲液中，4℃溶解过夜；所述的上样缓冲液为：8mol/L尿素、10mmol/L Tris和0.1mol/L NaCl，pH7.0；

过夜后离心弃沉淀，保留上清得到双功能融合蛋白的包涵体溶解上清；

对包涵体溶解上清进行镍离子亲和层析柱分离，以咪唑梯度溶液洗脱层析柱得到包含双功能融合蛋白的洗脱峰；

调整收集的洗脱峰的双功能融合蛋白浓度至0.1～0.2g/L，加入β-巯基乙醇至终浓度为10～20mmol/L，然后分别依次用复性缓冲液I、复性缓冲液II和复性缓冲液III进行梯度透析复性，最终离心收集得到包含复性的双功能融合蛋白的上清；

所述的复性缓冲液I为：2mol/L尿素、10mmol/L Tris和5mmol/L β-巯基乙醇，pH7.0；复性缓冲液II为：10mmol/L Tris和5mmol/L β-巯基乙醇，pH7.0；复性缓冲液III为：PBS缓冲液，pH7.0。

所述的重组原核表达载体为pET22b-Cecropin B-EGF，所述的宿主细胞为Rosetta-gami^TM2(DE3)。

上述SEQ ID NO.4所示的包含凝血酶识别多肽的基于抗菌肽的双功能融合蛋白，应用于制备治疗表皮创伤的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明构建的双功能融合蛋白，将天蚕素B(CecropinB)和人表皮生长因子(hEGF)通过连接蛋白融合而成，克服了抗菌肽在表达时对宿主细胞的毒害作用，使得能够通过基因工程方法获得；而且天蚕素B和人表皮生长因子蛋白的分子量都不大，蛋白不易纯化，将两者进行融合表达，分子量较大，解决了纯化困难的问题；而且以融合蛋白的形式用药也能够延长蛋白在体内的半衰期，减少用药次数；

而且融合蛋白的设计还基于以下考虑：以前研究表明在天蚕素B的N末端加上多余的氨基酸会使抗菌肽的活性完全丧失，而在C末端加入氨基酸，抗菌肽仍可保持活性；因此，本发明将表皮生长因子融合在天蚕素B的C末端进行表达，不仅克服了抗菌肽对原核细菌的毒害作用，也保证了凝血酶切割后抗菌肽的活性。

2、鉴于表皮生长因子作用的部位伤口包含了多种凝血酶因子，因此本发明将连接蛋白设定为凝血酶能够识别的序列，当融合蛋白用于伤口的治疗时，不需要酶切或化学方法裂解即可得到双功能的蛋白，人或哺乳动物自身分泌的凝血酶可以自动识别、切断CecropinB-hEGF融合蛋白，CecropinB分子和人EGF分子恢复原有的活性，使CecropinB和人EGF联和发挥自身作用：CecropinB可以杀死伤口处的耐药菌，人EGF可以促进伤口快速愈和。

3、本发明在人表皮生长因子的C端融合了6个His标签，克服了融合蛋白难以纯化的问题，使纯化方法简单易行。

这样通过生物工程的方法制备融合蛋白，解决了抗菌肽本身的天然产量低，合成或从机体中提取的步骤复杂、产率低、成本高的问题。

4、本发明对于双功能融合蛋白设计构建了其原核表达载体pET22b-Cecropin B-EGF，转染了宿主细胞Rosetta-gami^TM2，并通过Ni离子亲和层析法或分子筛回收整个融合蛋白；从而实现了天蚕素B和表皮生长因子在原核表达系统中的高效表达。

5、本发明利用纯化的融合蛋白进行的抑菌实验结果显示，凝血酶切割后的抗菌肽能够抑制周边细菌的生长，无菌水和未切割融合蛋白周围没有抑菌圈的形成。

6、本发明利用纯化的融合蛋白进行的修复动物创伤及抑菌实验结果显示，融合蛋白治疗组在7天左右伤口开始缩小，在12～14天左右痊愈，期间并且没有发现细菌感染，对照组则需要17～20天左右痊愈。

上述生物活性检测表明本发明提供的双功能融合蛋白具有抗菌肽的抑菌、杀菌效果，和人表皮生长因子的刺激细胞增殖作用，能够应用于制备治疗表皮创伤的药物。

附图说明

图1是重组表达质粒pET22b-Cecropin B-EGF的酶切鉴定结果图；

图2是诱导表达的pET22b-Cecropin B-EGF/Rosetta-gami2的SDS-PAGE分析结果图；

图3是Cecropin B-EGF的Western Blot鉴定结果图；

图4是Cecropin B-EGF的表达、纯化的SDS-PAGE分析结果图；

图5是不同浓度标准品rhEGF与Cecropin B-EGF对促Balb/c 3T3细胞增殖的曲线图，其中，横坐标为稀释倍数，纵坐标为吸光度；

图6是融合蛋白凝血酶切割产物抑菌活性鉴定。

具体实施方式

本发明提供的基于抗菌肽的双功能融合蛋白，是基于天蚕素B蛋白序列和人表皮生长因子的融合蛋白，并将其连接蛋白特别设计为凝血酶能够识别的位点，并且在融合蛋白上构建纯化的His标签。

本发明对于上述融合蛋白采用原核表达系统来实现其生物制备，并获得了纯化的融合蛋白。

利用纯化的融合蛋白进行了抑菌试验和活体动物实现验证，表明该融合蛋白能够应用于制备治疗表皮创伤的药物，用于表皮的创伤、擦伤、烧伤、烫伤等疾病，并可防止伤口的感染。

下面结和附图对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。

a、天蚕素B与人表皮生长因子融合蛋白基因的构建

将天蚕素B基因和人表皮生长因子基因通过连接基因(DNA linker)连接，在人表皮生长因子基因之后插入6×His标记基因，并且在融合蛋白基因5’端和3’端克隆入酶切位点；

其中，连接基因编码的氨基酸序列能够被凝血酶识别，具体采用如下序列作为DNA linker：

ctggttccgc gcggctcc  18；

其编码的氨基酸序列为：Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser；

根据GenBank中公布的天蚕素(ID：159200)和人表皮生长因子(ID：1950)序列，分别全基因合成天蚕素B和人表皮生长因子融合蛋白基因，合成的基因全长297bp，具体的序列如SEQ ID NO.5所示；

在该段基因中，天蚕素B基因融合在表皮生长因子的前端，中间连以凝血酶切割位点序列，表皮生长因子的的C端连有6×His标记基因，5’端和3’端为Nde I酶切位点和Sal I酶切位点；融合基因CecropinB-EGF构建完成。

b、表达载体的构建

合成上述序列后，通过Nde I酶切位点和Sal I酶切位点将该序列克隆至表达载体pET22b(+)中，构建表达载体pET22b-CecropinB-EGF；对重组的表达载体进行酶切电泳鉴定，结果如图1所示：其中，泳道1为DL2000；泳道2、3为pET22b-Cecropin B-EGF双酶切结果；泳道4为对照载体pET22b-X双酶切的结果；泳道2、3与泳道4相比，可以清楚的看到300bp左右的目标片段，说明表达载体构建成功。

c、重组菌体的构建和融合蛋白的表达

CaCl₂法制备Rosetta-gami2(DE3)感受态细胞，将表达载体pET22b-CecropinB-EGF加入至Rosetta-gami2(DE3)感受态细胞中，42℃热激转化，然后在含有氨苄西林、四环素、氯霉素和链霉素的LB平板上进行筛选，阳性克隆命名为pET22b-Cecropin B-EGF/Rosetta-gami2(DE3)。

挑取阳性克隆于含有氨苄西林、四环素、氯霉素和链霉素的LB液体培养基中，摇床37℃培养过夜，取培养过夜的菌液1％～5％转接至新鲜的含氨苄西林(50～200μg/ml)的LB液体培养基摇培至菌体浓度达到A₆₀₀为0.3～0.6时，用终浓度为0.1～1mmol/L的IPTG诱导3～5h，离心收集菌体。

如图2所示的诱导和未经诱导的重组菌SDS-PAGE电泳检测结果，泳道1为蛋白质marker；泳道2为未经诱导的重组菌；泳道3、4、5为经IPTG诱导的重组菌；对比泳道2与泳道3、4、5，融合蛋白在10kD处有特异的蛋白表达条带，说明融合蛋白在宿主细胞中得到了有效的表达。

在上述电泳检测的基础上，对融合蛋白进行Western Blot鉴定，一抗为小鼠抗EGF单克隆抗体，二抗为羊抗小鼠IgG-AP，检测结果如图3所示：其中，泳道1为蛋白质marker；泳道2为未经诱导的重组菌pET22b-CecropinB-EGF/Rosetta-gami2(DE3)；泳道3，4为经IPTG诱导的重组菌pET22b-Cecropin B-EGF/Rosetta-gami2(DE3)；对比泳道2与泳道3、4，可以看到泳道3，4有明显的特异性条带，进一步说明融合蛋白经IPTG诱导后在宿主细胞中得到有效表达。

d、融合蛋白的纯化

将诱导表达的pET22b-Cecropin B-EGF/Rosetta-gami2(DE3)菌体用裂解缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.5)悬浮，溶菌酶裂解，4℃离心得到裂菌上清和沉淀，15％SDS-PAGE检测融合蛋白在裂菌上清和沉淀中的表达情况，结果显示目的蛋白存在于裂菌沉淀中；

将裂菌沉淀溶解于上样缓冲液(8mol/L尿素，10mmol/L Tris，0.1mol/LNaCl，pH7.0)中，搅拌1～3h，4℃溶解过夜；然后离心弃沉淀，保留上清得到融合蛋白的包涵体溶解上清；

上样缓冲液平衡镍离子亲和层析柱之后，将包涵体溶解上清上样，上样缓冲液冲洗至基线后，分别用含10mmol/L咪唑、200mmol/L咪唑及500mmol/L咪唑的上样缓冲液梯度洗脱镍离子亲和层析柱，200mmol/L咪唑洗下融合蛋白。

调整收集的融合蛋白浓度至0.1～0.2g/L，加入β-巯基乙醇至终浓度为10～20mmol/L，然后分别用复性缓冲液I(2mol/L尿素、10mmol/L Tris、5mmol/L β-巯基乙醇，pH7.0)，复性缓冲液II(10mmol/L Tris，5mmol/L β-巯基乙醇，pH7.0)以及复性缓冲液III(PBS，pH7.0)进行依次透析复性，最终离心收集得到复性上清。

对于上述纯化的不同阶段的融合蛋白的表达和纯化进行SDS-PAGE检测，结果如图4所示：其中，泳道M为蛋白质marker；泳道1为未经诱导的重组菌pET22b-Cecropin B-EGF/Rosetta-gami2(DE3)；泳道2为经IPTG诱导的重组菌pET22b-Cecropin B-EGF/Rosetta-gami2(DE3)；泳道3为溶菌酶裂解pET22b-Cecropin B-EGF/Rosetta-gami2(DE3)上清；泳道4为溶菌酶裂解pET22b-Cecropin B-EGF/Rosetta-gami2(DE3)沉淀；泳道5为融合蛋白的包涵体溶解上清；泳道6为经过层析柱分离后的纯化融合蛋白CecropinB-EGF；泳道7为融合蛋白Cecropin B-EGF透析复性产物；对比泳道1～7可以看出，融合蛋白存在于重组菌裂解后的沉淀中，以包涵体形式存在，通过识别6×His标签的亲和层析纯化之后，再经过透析复性之后几乎不存在其他蛋白杂质；最终得到纯化的融合蛋白。

f、融合蛋白对于促细胞增殖活性的检测

MTT法体外测定复性的融合蛋白Cecropin B-EGF对Balb/c 3T3细胞株的促生长作用：

预稀释4000倍复性的融合蛋白Cecropin B-EGF及10倍rhEGF标准品(效价为400IU/ml)；在含有10％的新生牛血清的RPMI 1640完全培养液中培养Balb/c 3T3细胞株24-36h，调整浓度为10⁴细胞/ml，转接于96孔板中，37℃，5％CO₂培养24h；分别加入梯度浓度稀释的融合蛋白Cecropin B-EGF和rhEGF标准品，37℃，5％CO₂培养64-72h，然后每孔加入MTT溶液20μl，继续培养5h，弃去上清，向每孔中加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，混匀后置于酶标仪上，于波长570nm处测定吸光度；

以稀释倍数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制样品融合蛋白CecropinB-EGF和rhEGF标准品的活性曲线，结果如图5所示，在低浓度情况下，稀释倍数为4×10⁵～4×10⁷时融和蛋白与标准品rhEGF对促细胞增殖效果相近；随着浓度增大，稀释倍数为4×10¹～4×10⁵时融和蛋白的促细胞增殖效果降低，但是最后随着浓度的增大，融和蛋白的促细胞增殖效果又迅速提升，甚至超过标准品；

经下述计算：

供试品的生物学活性 $(\mathrm{IU}/\mathrm{ml})=\mathrm{Pr}\×\frac{\mathrm{Ds}\×\mathrm{Es}}{\mathrm{Dr}\×\mathrm{Er}}=1.94\×{10}^5\mathrm{IU}/\mathrm{ml}$

融合蛋白的比活性为1.94×10⁵IU/ml，表明融合蛋白Cecropin B-EGF具有表皮生长细胞因子的生物活性。

g、融合蛋白的抑菌实验

用20～50μl活化的E.coli K₁₂D₃₁菌液或藤黄微球菌菌液和20ml 50℃左右含0.7％～0.9％琼脂的LB培养基充分混和铺平板，用打孔器打孔，孔中分别加入经16℃凝血酶切割20h的融合蛋白(3号孔)，未切割的融合蛋白(4号孔)，无菌水(2号孔)，氨苄青霉素(1号孔)，其中未切割的融合蛋白和无菌水作为阴性对照，氨苄青霉素作为阳性对照，37℃过夜培养；

结果如图6所示，作为阳性对照的氨苄青霉素(1号孔)出现抑菌斑，抑制了细菌的生长，凝血酶切割后的抗菌肽(3号孔)也出现了抑菌斑，能够抑制周边细菌的生长；无菌水(2号孔)和未切割融合蛋白(4号孔)周围没有抑菌圈的形成；说明融合蛋白经凝血酶切割后的抗菌肽片段具有抑菌、杀菌的生物活性。

h、融合蛋白修复动物创伤及抑菌的活体实验

小鼠或兔子于实验前一天脱毛，实验当天麻醉后烫成II度烫伤或在背部做皮肤全层切口，去除皮肤块及筋膜，用无菌纱布压迫止血，在无菌纱布上滴加溶解的融合蛋白进行包扎，同时以加生理盐水为对照；

包扎后的动物单笼喂养，自由进食，饮水，饲养14～20天；每天以同样的方法进行换药，观察创口愈和情况；

结果显示，融合蛋白治疗组在7天左右伤口开始缩小，在12～14天左右痊愈，而对照组则需要17～20天左右痊愈，并且没有发现细菌感染。

核苷酸序列表

<110>陕西省微生物研究所

<120>一种基于抗菌肽的双功能融合蛋白及其制备方法和用途

<160>5

<210>1

<211>35

<212>PRT

<213>人工合成的天蚕素B

<400>1

Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg Asp Gly Ile Val

1               5                   10                  15                  20

Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Leu Gly Glu Ala Leu Ala Leu

            25                  30                  35

<210>2

<211>53

<212>PRT

<213>人工合成的人表皮生长因子

<400>2

Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys

1               5                   10                  15                  20

Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr AlaCys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu

            25                  30                 35                      40

Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg

        45                  50

<210>3

<211>6

<212>PRT

<213>人工合成

<400>3

Leu Val Pro Arg Gly Ser

1                 5

<210>4

<211>111

<212>PRT

<213>人工合成

<400>4

Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg Asp Gly Ile Val

1                 5                  10                  15                  20

Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Leu Gly Glu Ala Leu Ala Leu Asn Gly Leu Val Pro

                 25                  30                  35                  40

Arg Gly Ser Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp

                 45                  50                  55                  60

Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr

                 65                  70                  75                  80

Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Val Asp Lys Leu

                 85                  90                  95                 100

Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His

                105                  110

<210>5

<211>297

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

atgaaatgga aagtcttcaa gaaaattgaa aaaatgggtc gtaatatccg agatggtatt     60

gtcaaggctg gccctgcgat cgcggtttta ggcgaagcca aagcgctgaa cggcctggtt    120

ccgcgcggct ccaatagcga ctctgaatgt cctctgtccc acgatggcta ctgcctccat    180

gatggtgtgt gcatgtatat tgaagcattg gacaagtatg catgcaactg tgttgttggc    240

tacatcggcg agcgctgcca gtaccgtgac ctgaagtggt gggaactgcg caacggc       297

Claims (2)

1.一种基于抗菌肽的双功能融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重组原核表达载体；

2)将构建好的重组原核表达载体转染宿主细胞Rosetta-gami^TM2(DE3)，筛选出阳性克隆的重组细胞，并对其进行增殖培养；当菌体浓度达到A₆₀₀为0.3～0.6时，用终浓度为0.1～1mmol/L的IPTG诱导3～5h，离心收集重组细胞；

3)双功能融合蛋白的纯化：

将重组细胞裂解后离心分离得到沉淀，将其溶解于上样缓冲液中，4℃溶解过夜；所述的上样缓冲液为：8mol/L尿素、10mmol/L Tris和0.1mol/L NaCl，pH7.0；

过夜后离心弃沉淀，保留上清得到双功能融合蛋白的包涵体溶解上清；

对包涵体溶解上清进行镍离子亲和层析柱分离纯化，以咪唑梯度溶液洗脱层析柱得到包含双功能融合蛋白的洗脱峰；

调整收集的洗脱峰的双功能融合蛋白浓度至0.1～0.2g/L，加入β-巯基乙醇至终浓度为10～20mmol/L，然后用复性缓冲液I、复性缓冲液II和复性缓冲液III依次进行透析复性，最终离心收集得到包含复性的双功能融合蛋白的上清；

所述的复性缓冲液I为：2mol/L尿素、10mmol/L Tris和5mmol/L β-巯基乙醇，pH7.0；复性缓冲液II为：10mmol/L Tris和5mmol/L β-巯基乙醇，pH7.0；复性缓冲液III为：PBS缓冲液，pH7.0。

2.如权利要求1所述的基于抗菌肽的双功能融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的重组原核表达载体为pET22b-CecropinB-EGF，是将SEQ IDNO.5所示核苷酸序列克隆到表达载体pET22b(+)中而得到的。

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