CN115554386B - 天麻多肽在制备抑制或杀灭毛癣菌的外用产品中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药、消杀等多重领域，具体涉及天麻多肽在制备抑制或杀灭毛癣菌的外用产品中的用途。实验结果显示，本发明的天麻多肽具有很强的抑制或杀灭毛癣菌(特别是须癣毛癣菌和红色毛癣菌)活性，可以广泛用于抗毛癣菌的皮肤外用药物制剂、日化用品、医疗器械等抑制或杀灭毛癣菌的应用。本发明首次发现天麻多肽具有高效抑制和杀灭毛癣菌的活性，可以将其制成液体剂、水凝胶、冻干粉、气雾剂、喷雾剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂等多种形式，以用于预防或治疗由毛癣菌引起的手癣、脚癣、头癣、灰指甲、体癣、股癣等皮肤癣病，因此具有良好的应用价值、社会意义和市场前景。

Description

天麻多肽在制备抑制或杀灭毛癣菌的外用产品中的用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及天麻多肽在制备抑制或杀灭毛癣菌的外用产品中的用途。

背景技术

天麻是兰科植物天麻Gastrodiaelata Bl.的干燥块根，其性辛、温，具有息风定惊、镇静催眠、镇痛、抗血小板聚集、抗氧化、延缓衰老、降压、抗惊厥、抗癫痫、改善学习记忆，增强非特异性免疫及细胞免疫等功效。近年来天麻在抗肿瘤、调节免疫等方面的作用倍受关注。天麻的化学成分主要有天麻素、天麻醚苷以及天麻多糖等，但是对天麻多肽的研究和报道较少。本发明人长期致力于相关领域的研究，并首次发现了天麻多肽具有良好的抗菌和抗病毒能力，对常见致病菌和病毒以及新冠病毒具有很强的杀伤力(参见CN105087732A，CN113855782A)。此外，本发明人还发现天麻多肽安全性高、毒性低，天麻多肽的稳定性好，既耐酸碱又耐高温，高温处理及真空干燥后仍保留完整的药理活性，使用简单方便，皮肤渗透性好，无刺激性，不易残留，因此很适合将其作为抗菌和抗病毒防护产品对其进行商业开发。

真菌性皮肤病，又称皮肤癣菌病，是由浅部真菌侵入人体皮肤、毛发、甲板引起的感染，简称癣。根据世界卫生组织WHO的数据统计，世界上有四分之一的人口受到皮肤癣菌的影响，而在我国南方的一项调查中发现，人群中脚癣发病率高达60％以上，其中红色毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌和絮状表皮癣菌是导致人体脚癣、灰指甲、体癣、股癣等的主要致病菌。上述病原菌主要是通过接触患者等感染，少数为接触土壤感染，公用卫生用品间接接触感染主要是带菌的拖鞋和毛巾、被褥等。

对于癣菌的治疗，大多数采用外用药即可。根据不同皮肤损害采用不同性质、不同剂型的药物。需要特别强调的是应保证用药的次数每天的次数和整个疗程的次数以及用药的连续性，如卡氏涂剂、冰醋酸、克霉唑、复方酮康唑霜和脚气灵软膏等。尽量避免使用刺激作用和剥脱作用强的配剂、软膏，如复方土槿皮酊、全量的复方苯甲酸软膏等，以免触发癣菌疹或造成真菌感染等并发症，范围较广泛者，可短期口服抗真菌药物配合治疗。西药抗真菌药品，如制霉菌素、两性霉素B、球红霉素、氟康唑、伊曲康唑等副作用大，价格昂贵，疗效亦不够理想。各种外用的抗真菌制剂对皮肤癣病亦很难根治。而目前抗真菌西药尤其是唑类药物耐药菌株的出现日益增多。

本发明是发明人此前研究工作的延续，本发明首次提出了天麻多肽可以对多种类型的毛癣菌具有抑制和杀灭作用，以用于预防或治疗由毛癣菌引起的手癣、脚癣、头癣、灰指甲、体癣、股癣等皮肤癣菌病，具有良好的应用价值、社会意义和市场前景。

发明内容

为了解决目前高效、低毒、低刺激性且不易产生耐药的抑制或杀灭毛癣菌外用产品严重短缺的问题，本发明提供了一种天麻多肽在制备抑制或杀灭毛癣菌的外用产品中的用途。

具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：

本发明提供了天麻多肽在制备抑制或杀灭毛癣菌的外用产品中的用途，所述天麻多肽具有抑制和杀灭毛癣菌的活性。

作为可选的方式，在上述用途中，所述毛癣菌选自絮状表皮癣菌、红色毛癣菌或须癣毛癣菌。

优选地，所述毛癣菌选自红色毛癣菌或须癣毛癣菌。

作为可选的方式，在上述用途中，所述天麻多肽用于预防或治疗由毛癣菌引起的皮肤癣菌病。

作为可选的方式，在上述用途中，所述皮肤癣菌病选自以下一种或多种：手癣、脚癣、头癣、灰指甲、体癣或股癣。

作为可选的方式，在上述用途中，所述天麻多肽的制备方法包括以下步骤：

1)天麻经洗涤、剔出杂质后，过筛粉碎40-100目，按1g：6mL-12mL的料液比，置于浓度为0.4％-1％的氯化钠溶液中，80℃水浴提取2-8h；

2)减压过滤后，将得到的天麻蛋白滤液浓缩为0.5-1.2g/mL的原药浓度；

3)向天麻蛋白浓缩液中按体积比加入0.2-0.8％的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶1-3％，胰蛋白酶0.6-1.5％，风味蛋白酶0.5-1％，酶解温度为50-60℃，酶解时间为30min-1.5h，然后将酶解液过10KDa膜进行超滤，8000rpm离心20min，即得天麻多肽，为酸性多肽，分子量范围在5.8-7.8KDa，等电点为7.83-8.15。

作为可选的方式，在上述用途中，所述外用产品为药物制剂、日化用品或医疗器械。

作为可选的方式，在上述用途中，所述药物制剂为溶液剂、水凝胶、巴布剂、冻干粉、气雾剂、喷雾剂、膜剂、外用搽剂或软膏剂。

作为可选的方式，在上述用途中，所述日化用品为消毒剂、清洗剂、洗涤剂、护肤品或个人护理用品。

作为可选的方式，在上述用途中，所述医疗器械为消毒湿巾、消毒棉棒或消毒纱布。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

本发明首次发现天麻多肽具有高效抑制和杀灭毛癣菌的活性，可以将其制成溶液剂、水凝胶、冻干粉、气雾剂、喷雾剂、膜剂、外用搽剂、软膏剂等多种形式。

天麻多肽安全性高、毒性低，天麻多肽的稳定性好，既耐酸碱又耐高温，高温处理及真空干燥后仍保留完整的药理活性，使用简单方便，皮肤渗透性好，无刺激性，不易残留，是非常好的绿色环保抗毛癣菌防护产品，具有较高的商业开发价值。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

制备实施例

天麻多肽的制备方法本发明人此前的申请CN105087732A，具体制备实施例如下所示：

实施例1：

1)天麻经洗涤、剔出杂质后，粉碎至80目，按料液比1:6(g/mL)，置于浓度为0.6％的氯化钠溶液中，80℃水浴提取4h；

2)减压过滤后,将所得天麻蛋白提取液浓缩为1(g/mL)的原药浓度；

3)向浓缩液中按体积比加入0.4％的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶1.5％,胰蛋白酶0.8％，风味蛋白酶0.6％，酶解温度为55℃，酶解时间为40min，然后将酶解液过10KDa膜进行超滤，8000rpm离心20min，所得膜下滤液即为天麻多肽提取物，于4℃条件下保存备用。

4)采用SDS-PAGE电泳法测天麻多肽分子量，以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker作为标准，该标准蛋白是由3种多肽和2种低分子蛋白构成，分子量范围为3.3-20.1KDa，经试验得出天麻多肽分子量大概为5.8-7.8KDa。

实施例2：

1)天麻经洗涤、剔出杂质后，粉碎至100目，按料液比1:8(g/mL)，置于浓度为0.4％的氯化钠溶液中，80℃水浴提取2h；

2)减压过滤后,将所得天麻蛋白提取液浓缩为0.8g/mL的原药浓度；

3)向浓缩液中按体积比加入0.2％的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶2％，胰蛋白酶0.6％，风味蛋白酶0.5％，酶解温度为50℃，酶解时间为30min，然后将酶解液过10KDa膜进行超滤，8000rpm离心20min，所得滤液即为天麻多肽提取物，于4℃条件下保存备用；

4)采用SDS-PAGE电泳法测天麻多肽分子量，以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker作为标准，该标准蛋白是由3种多肽和2种低分子蛋白构成，分子量范围为3.3-20.1KDa，经试验得出天麻多肽分子量大概为5.8-7.8KDa。

实施例3：

1)天麻经洗涤、剔出杂质后，粉碎至40目，按料液比1:12(g/mL)，置于浓度为1％的氯化钠溶液中，80℃水浴提取6h；

2)减压过滤后，将所得天麻蛋白提取液浓缩为0.5g/mL的原药浓度；

3)向浓缩液中按体积比加入0.8％的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶3％，胰蛋白酶1.5％，风味蛋白酶1％，酶解温度为60℃，酶解时间为1.5h，然后将酶解液过10KDa膜进行超滤，8000rpm离心20min，所得滤液即为天麻多肽提取物，于4℃条件下保存备用；

4)采用SDS-PAGE电泳法测天麻多肽分子量，以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker作为标准，该标准蛋白是由3种多肽和2种低分子蛋白构成，分子量范围为3.3-20.1KDa，经试验得出天麻多肽分子量大概为5.8-7.8KDa。

实施例4：

1)天麻经洗涤、剔出杂质后，粉碎至60目，按料液比1:10(g/mL)，置于浓度为0.8％的氯化钠溶液中，80℃水浴提取8h；

2)减压过滤后，将所得天麻蛋白提取液浓缩为1.2g/mL的原药浓度；

3)向浓缩液中按体积比加入0.5％的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶1％，胰蛋白酶1.2％，风味蛋白酶0.8％，酶解温度为55℃，酶解时间为1h，然后将酶解液过10KDa膜进行超滤，8000rpm离心20min，所得滤液即为天麻多肽提取物，于4℃条件下保存备用；

4)采用SDS-PAGE电泳法测天麻多肽分子量,以索莱宝公司的超低分子量蛋白质marker作为标准，该标准蛋白是由3种多肽和2种低分子蛋白构成，分子量范围为3.3-20.1KDa，经试验得出天麻多肽分子量大概为5.8-7.8KDa。

实施例5：

天麻抗菌肽原液的配方如下所示(参见CN113855782A)：

实施例1至实施例4制备的天麻多肽提取物(w/v，g/mL)50％

丙三醇(w/v，g/mL) 0.10％

纯化水(v) 100％

效果实施例

实施例6：天麻多肽提取物的皮肤刺激性(参见CN105087732A)

1.实验方法：

采用多次完整皮肤刺激试验法，选用4只皮肤完好、重约3kg新西兰白兔,试验前24h，脱去其背部脊柱两侧各约3cm×3cm的毛，次日分别将本发明制备的实施例1、实施例2、实施例3、实施例4的天麻多肽提取物0.5mL擦于一侧去毛皮肤表面，敷贴2.0cm×2.0cm的2层无菌纱布并用无刺激胶布固定,另一侧以0.5mL提取溶剂作为空白对照。4h后去除敷贴物，用水清洗除去残留物。每天涂抹一次,连续涂抹14d。分别于去除受试物后24h观察皮肤局部反应,进行刺激反应评分。

2.皮肤刺激试验结果：

采用多次完整皮肤刺激试验法对4只新西兰种白兔进行试验,以检测不同原药浓度天麻多肽提取物对实验动物皮肤的刺激作用和强度。分别于24h后观察受试兔子脊柱两侧皮肤局部反应，观察结果为试验兔两侧皮肤均无红肿和红斑，评分均为0，皮肤刺激强度分级为无刺激性级别。

实施例7：天麻抗菌肽原液抑制或杀灭毛癣菌的活性

本实验委托权威检测机构广东省微生物分析检测中心完成，如有需要，可以提供原始检测报告(检验报告编号2022SP05710R01a)，在本实施例中仅节选了部分检测结果。

一、检测项目：悬液定量杀菌试验

二、检测依据和方法：WS/T 650-2019(5.2.1)，试验作用时间2min。

三、试验材料：

样品：天麻抗菌肽原液，生产日期：2022年01月01日，规格：50mL/瓶，生产批号：20220101，由通化仁生源生物科技股份有限公司提供。

试验菌株：须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)GIM 3.598

红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)GIM 3.629

四、试验结果

试验测试结果如下表1所示。

表1：本发明天麻抗菌肽原液抑制或杀灭毛癣菌的活性

五、试验结论

送检样品天麻抗菌肽原液，作用2min，其对须癣毛癣菌、红色毛癣菌的杀菌率均＞99％，符合WS/T 650-2019(5.2.1.7)的结果判定(说明书规定时间的杀菌率≥99％，判为较强抗菌作用)，该样品对所测菌株具有较强抗菌作用。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.天麻多肽在制备抑制或杀灭毛癣菌的外用产品中的用途，其特征在于：所述天麻多肽具有抑制和杀灭毛癣菌的活性，所述毛癣菌选自红色毛癣菌或须癣毛癣菌，所述天麻多肽的制备方法包括以下步骤：

1）天麻经洗涤、剔出杂质后，过筛粉碎40-100目，按1 g：6 mL-12 mL的料液比，置于浓度为0.4%-1%的氯化钠溶液中，80℃水浴提取2 h-8 h；

2）减压过滤后，将得到的天麻蛋白滤液浓缩为0.5 g/mL-1.2 g/mL的原药浓度；

3）向天麻蛋白浓缩液中按体积比加入0.2%-0.8%的复合酶水解液，复合酶水解液中含木瓜蛋白酶1%-3%，胰蛋白酶0.6%-1.5%，风味蛋白酶0.5%-1%，酶解温度为50℃-60℃，酶解时间为30 min-1.5 h，然后将酶解液过10 KDa膜进行超滤，8000 rpm离心20 min，即得天麻多肽，为酸性多肽，分子量范围在5.8KDa-7.8KDa，等电点为7.83-8.15。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述天麻多肽用于预防或治疗由毛癣菌引起的皮肤癣菌病。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其特征在于：所述外用产品为药物制剂、日化用品或医疗器械。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述外用产品为消毒剂。