CN101333258B

CN101333258B - 一种具有抗菌及促伤口愈合功能的融合多肽

Info

Publication number: CN101333258B
Application number: CN2008100125355A
Authority: CN
Inventors: 王秋雨; 金莉莉; 李强; 冯恺
Original assignee: Liaoning University
Current assignee: Liaoning University
Priority date: 2008-07-29
Filing date: 2008-07-29
Publication date: 2010-09-15
Anticipated expiration: 2028-07-29
Also published as: CN101333258A

Abstract

本发明涉及一种具有抗菌及促伤口愈合功能的融合多肽。采用的技术方案是：一种具有抗菌及促伤口愈合功能的融合多肽：包括序列表SEQ ID NO.1所述氨基酸序列的人表皮生长因子、序列表SEQ ID NO.2所述氨基酸序列的凝血酶蛋白切割位点和序列表SEQ ID NO.3所述氨基酸序列的东北林蛙抗菌肽；凝血酶酶切位点将人表皮生长因子和东北林蛙抗菌肽融合在一起，构建的融合多肽具有序列表SEQ ID NO.4所述氨基酸序列。本发明融合多肽稳定性好，酶解后具有广谱抗菌、促细胞分裂功能，以凝胶剂、喷剂等剂型给药可以应用到人及哺乳动物的烧伤、烫伤、创伤等外伤治疗。具有防止伤口感染、加快伤口愈合的作用。

Description

一种具有抗菌及促伤口愈合功能的融合多肽

技术领域：

本发明属于生物医学领域，尤其涉及具有抗菌及促伤口愈合功能的融合多肽。

背景技术：

两栖类动物皮肤湿润、裸露，无疑给外界微生物的侵入提供了便利条件，为了自身生存和适应栖息地的多样化生态环境的需要，它们依靠皮肤腺体分泌出一系列抗菌肽，防御外界病原菌的侵袭。抗菌肽具有高效广谱的抗细菌、真菌、病毒、寄生虫、肿瘤、内毒素以及免疫趋化、促进创面修复等多种生物学功能，成为两栖类动物先天免疫的第一道防线。两栖动物种类繁多、作用各异的抗菌肽构成了抗菌肽的天然资源库。因此，两栖类动物抗菌肽开发利用有望成为继传统抗生素之后的又一类重要的新型抗菌药物，为解决病原菌对传统抗生素日益增强的耐药性这一棘手难题提供新途径。

但是现有抗菌肽直接应用存在的问题是：

(1)抗菌肽分子量过小导致表达过程中降解。

(2)由于抗菌肽是一类小分子肽，分离纯化难度较大。

(3)在基因工程表达过程中，抗菌肽对宿主细胞具有杀伤作用。

(4)天然提取抗菌肽的产量低、成本高。

发明内容：

为了解决上述问题，本发明提供了一种含有从东北林蛙皮肤中提取的东北林蛙抗菌肽、并且可有效保护宿主细胞不被杀伤，易于分离纯化的具有抗菌及促伤口愈合功能的融合多肽。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：包括序列表SEQ IDNO.1所述的人表皮生长因子氨基酸序列、序列表SEQ ID NO.2所述的凝血酶酶切位点氨基酸序列和序列表SEQ ID NO.3所述的东北林蛙抗菌肽氨基酸序列；凝血酶酶切位点将人表皮生长因子和东北林蛙抗菌肽融合在一起，构建的融合多肽具有序列表SEQ ID NO.4所述氨基酸序列。

本发明所涉及的东北林蛙抗菌肽为东北林蛙皮肤中新发现的抗菌肽家族成员，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所述，我们命名为dybowskin-2CDYa。其具有正电荷数量高，亲水性强，具有广谱的抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌的活性。不具有溶血性，因此使用安全性高。

从东北林蛙皮肤中新发现的东北林蛙抗菌肽dybowskin-2CDYa的制备方法是：将活体东北林蛙用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，8V直流电刺激，可见大量的泡沫状物质从东北林蛙皮肤分泌出来，收集分泌物，立即加入乙酸使其终浓度为4％，酸化处理，冷冻干燥，经SephadexG-50层析，收取II峰，浓缩冻干，冻干物经SephadexA-25层析，收取IV峰，浓缩，冻干，再经反相高效液相色谱(HPLC)C18柱分离纯化，取PT-HPLC的峰VII，即为从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽dybowskin-2CDYa。利用PT-HPLC方法鉴定其纯度。分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment.55 spectrometry，以B一Ms)，测得分子量为2184.2；等电聚焦电泳测定等电点，测得等电点为12.60；用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列。

人表皮生长因子(Human Epidermal Growth Factor，hEGF)是重要的生长因子之一，也是最早发现并试用于临床的生长因子之一，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。临床表明，hEGF能促进皮肤创面组织修复过程中DNA、RNA和羟脯氨酸的合成，诱导分化成熟的表皮细胞逆转化为表皮干细胞，加速创面肉芽组织的生成和上皮细胞的增殖，促使外胚层细胞和毛细血管生长，促进烧伤、创伤及外科伤口的愈合，加速移植表皮和移值角膜的生长，从而缩短创面的愈合时间，提高创面修复质量。因此，hEGF对创烧伤救治、皮肤和角膜移植、外伤性皮肤溃疡等治疗已有广泛使用。

人表皮生长因子可用于：(1)烧伤、烫伤、灼伤创面(包括浅II度、深II度创面)，残余小创面，供皮区创面等的治疗；(2)各类慢性溃疡创面(包括糖尿病性、血管性、放射性溃疡)等；(3)各类新鲜及难愈性皮肤创面的治疗；(4)如普通创面、足坏疽、角膜炎、鼓膜穿孔、褥疮、口腔溃疡、黄雀斑、激光手术防护等。

本发明中，利用聚合酶链式反应(PCR)技术，构建含有人表皮生长因子、凝血酶酶切位点和东北林蛙抗菌肽dybowskin-2CDYa的融合蛋白基因，克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K或pPICZα系列中，并转化毕赤酵母(Pichia pastoris)。筛选高拷贝转化子，通过高密度发酵表达及分离纯化获得重组融合多肽。该融合多肽稳定性好，酶解后具有广谱抗菌、促细胞分裂功能。以凝胶剂、喷剂等剂型给药可以应用到人及哺乳动物的烧伤、烫伤、创伤等外伤治疗。具有防止伤口感染、加快伤口愈合的作用。

利用凝血酶酶切位点(Leu-Val-Pro-Arg-Ala-Ser)将具有皮肤修复功能的人表皮生长因子和具有抗菌功能的东北林蛙抗菌肽基因融合在一起，构建新型融合多肽，将编码上述融合蛋白的核苷酸序列转化入酵母分泌型表达载体中并在毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行表达。哺乳动物体内的各种凝血酶能特异性识别该融合多肽中的凝血酶酶切位点并切割融合多肽，使融合多肽在人体伤口应用时能自动裂解成同时具有皮肤修复功能的人表皮生长因子和抗菌功能的东北林蛙抗菌肽。

本发明的有益效果是：本发明将两种蛋白采用融合的方式表达解决了以下问题：

(1)增大了抗菌肽dybowskin-2CDYa的分子量，防止由于抗菌肽分子量过小引起的表达过程中的降解。

(2)可降低分离纯化的难度。由于抗菌肽是一类小分子肽，分离纯化及其困难。利用融合表达，增大抗菌肽分子量，大大降低融合多肽的分离纯化难度。

(3)融合表达降低抗菌肽的抑菌活性。防止分泌表达过程中，抗菌肽对宿主细胞的杀伤作用。

(4)在体表应用时融合多肽被凝血酶从凝血酶切割位点切断从而获得具抗菌功能的抗菌肽和具有修复功能的表皮生长因子。

本发明采用酵母细胞融合表达具有以下优点：

(1)天然提取抗菌肽具有产量低、成本高的问题。本发明为抗菌肽的来源提供新的途径。

(2)抗菌肽对宿主细胞具有杀伤作用。本发明利用融合表达使抗菌肽的抗菌活性大大降低，可有效保护宿主细胞不被杀伤。

(3)降低分离纯化难度。酵母表达系统自分泌的蛋白极少，因此可通过常规的层析、透析等方法进行分离纯化。

(4)不需另外使用蛋白酶进行酶切。通过人或哺乳动物血液中含有的凝血酶即可将融合蛋白酶切，使抗菌肽及人表皮生长因子的活性恢复。

具体实施方式举例：

实施例1具有抗菌及促伤口愈合功能的融合多肽

(一)hEGF-抗菌肽融合多肽真核表达

根据hEGF的DNA序列设计引物P1(序列见序列表中SEQID NO.5)、P2(序列见序列表中SEQ ID NO.6)、P3(序列见序列表中SEQ ID NO.7)、P4(序列见序列表中SEQ ID NO.8)用于组建人表皮生长因子基因(hEGF)；特异引物E1(序列见序列表中SEQ ID NO.9)和E2(序列见序列表中SEQ ID NO.10)，用于扩增hEGF并在其5’、3’端分别加挂EcoRI酶切位点及凝血酶酶切位点。

P1：AATAGTGACTCTGAATGTCCCCTGTCCCACGATGGGTACTGCCTCCATGATGGTG；

P2：CATACTTGTCCAATGCTTCAATATACATGCACACACCATCATGGAGGCAGTACC；

P3：TGAAGCATTGGACAAGTATGCATGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGG；

P4：CCACCACTTCAGGTCTCGGTACTGACATCGCTCCCCGATGTAGCCAACAACACAG；

E1：CCGGAATTCAATAGTGACTCTGAATGTC；

E2：AGAACCTCTTGGAACCAAGCGCAGTTCCCACCACTTCAGGTCTC。

从东北林蛙皮肤中新发现的东北林蛙抗菌肽dybowskin-2CDYa的制备方法是：将活体东北林蛙用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，8V直流电刺激，可见大量的泡沫状物质从东北林蛙皮肤分泌出来，收集分泌物，立即加入乙酸使其终浓度为4％，酸化处理，冷冻干燥，经SephadexG-50层析，收取II峰，浓缩冻干，冻干物经SephadexA-25层析，收取IV峰，浓缩，冻干，再经反相高效液相色谱(HPLC)C18柱分离纯化，取PT-HPLC的峰VII，即为从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽dybowskin-2CDYa。利用PT-HPLC方法鉴定其纯度。分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment.55spectrometry，以B一Ms)，测得分子量为2184.2；等电聚焦电泳测定等电点，测得等电点为12.60；用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列。

设计特异引物Z73-1(序列见序列表中SEQ ID NO.11)和Z73-2(序列见序列表中SEQ ID NO.12)，用于扩增东北林蛙抗菌肽基因序列并在其5’、3’端分别加挂凝血酶酶切位点及Not I酶切位点。

Z73-1：TTGGTTCCAAGAGGTTCTTCTGCAGTAGGAAGACATAG

Z73-2：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAATGTTTTCTGTGTTTTC

将扩增得到的hEGF和东北林蛙抗菌肽基因序列共同作为模板，利用两端引物E1和Z73-2进行扩增，得到从5’端到3’端依次为人表皮生长因子、凝血酶酶切位点、东北林蛙抗菌肽融合基因。融合基因与酵母分泌型表达载体pPIC9K(或pPICZ α)分别经EcoRI、Not I双酶切后进行连接，经测序证实碱基序列及读码框无误后转化毕赤酵母GS115。以宿主基因组DNA为模板，利用α-factor、3’AOX载体通用引物进行扩增，得到430bp片段，证实目的融合多肽基因以插入宿主基因组内；以宿主总RNA经反转录得到cDNA为模板，以E1、Z73-2特异引物进行扩增，得到260bp片段，证实外源融合多肽基因能够转录；利用G418筛选多拷贝的阳性克隆子，并进行甲醇诱导表达。经Tricine-SDS-PAGE分析证实：上清液中含有目的蛋白，其显示为约9KD蛋白产物。

(二)融合多肽的纯化

将发酵的上清液进行超滤浓缩，超滤板截留量为3.5kD，超滤产物进行Sephadex G-50层析。收集目的蛋白峰，冷冻干燥即为融合多肽。

实施例2：融合多肽凝血酶酶切产物的抗菌实验

利用琼脂扩散法检测体外抑菌活性。受试菌株为蜡状芽孢杆菌标准株(CGMCC1.126)；出血性大肠杆菌0157、鲍曼溶血不动杆菌、产气肠杆菌、耳葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门杆菌、绿脓杆菌分离株。取未经酶切的融合多肽及生理盐水作为对照。结果显示：酶切后的多肽对上述所有受试菌株均有强大的杀伤作用，抑菌圈直径均大于20mm(Φ＜8mm视为无抑菌活性)。不同菌株的抑菌圈直径大小差异不显著。未经酶切的融合多肽及及生理盐水不具抗菌活性。

实施例3：融合多肽凝血酶切产物的促细胞分裂活性实验

以原代培养的大鼠肺成纤维细胞、人胚肾HEK293细胞系为受试细胞。利用MTT法进行融合多肽酶切产物的促细胞生长活性分析，并以人表皮生长因子(hEGF)标准品为阳性对照，以Hanks缓冲液为阴性对照。试验结果显示：融合多肽凝血酶切产物及hEGF均能明显促细胞分裂，二者之间无显著差异，但与阴性对照差异极其显著。

实施例4：融合多肽酶切产物的溶血活性实验

用血色素的泄露来评估溶血性，从而考察融合多肽的使用安全性。用生理盐水配成2％健康人血红细胞悬液，并加入一定浓度的融合多肽酶切产物。37℃孵育1h后离心取上清，测540nm吸光值，并计算溶血率。以生理盐水作为阴性对照。结果显示：在融合多肽酶切产物的浓度在1mg/ml时，溶血率不足1％，与生理盐水无显著差别。

实施例5：融合多肽卡波姆凝胶剂的制备

取实施例1中，纯化后融合多肽1mg及蒸馏水90ml、丙二醇10ml置于烧杯内，加入卡波姆940干粉1g，搅匀后用0.01mol/L NaOH调节pH至7.5即成透明凝胶状。经真空脱气后即为融合多肽浓度为10ug/ml的凝胶剂。

实施例6：融合多肽卡波姆凝胶剂对大鼠烧伤模型促愈合及抗菌实验

取健康Wister大鼠，建立深II度烧伤模型。创面滴加绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌混合液。药物组创面涂抹融合多肽卡波姆凝胶剂，对照组创面涂抹无融合多肽成分的卡波姆凝胶。观察试验结果：涂抹融合多肽卡波姆凝胶剂的大鼠，第二天创面变干燥，开始结痂，13天痂壳脱落，无感染现象。对照组大鼠第二天伤口潮湿泛白，表面覆盖脓性体液，出现感染现象。6天后结痂，21天结痂脱落。

实施例7：融合多肽卡波姆凝胶剂的稳定性

将实施例5制备的融合多肽卡波姆凝胶剂分别置于37℃、80℃环境1个月、5h，涂抹大鼠烧伤模型伤口表面。其抗菌促愈合效果明显，与新鲜制备的融合多肽卡波姆凝胶剂效果无差别。

序列表

<110>辽宁大学

<120>一种具有抗菌及促伤口愈合的融合多肽

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>51

<212>PRT

<213>人

<400>1

Asn Ser Asp Ser Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gyl

1 5 10 15

Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys

20 25 30

Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys

35 40 45

Trp Trp Glu Leu Arg

50

<210>2

<211>6

<212>PRT

<213>人

<400>2

Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5

<210>3

<211>18

<212>PRT

<213>东北林蛙

<400>3

Ser Ala Val Gly Arg His Ser Arg Arg Phe Gly Leu Arg Lys His Arg

1 5 10 15

Lys Hi s

<210>4

<211>75

<212>PRT

<400>4

Asn Ser Asp Ser Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gyl

1 5 10 15

Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys

20 25 30

Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys

35 40 45

Trp Trp Glu Leu Arg Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Ala Val Gly Arg

50 55 60

His Ser Arg Arg Phe Gly Leu Arg Lys His Arg Lys His

65 70 75

<210>5

<211>55

<212>DNA

<400>5

aatagtgact ctgaatgtcc cctgtcccac gatgggtact gcctccatga tggtg 55

<210>6

<211>54

<212>DNA

<400>6

catacttgtc caatgcttca atatacatgc acacaccatc atggaggcag tacc 54

<210>7

<211>49

<212>DNA

<400>7

tgaagcattg gacaagtatg catgcaactg tgttgttggc tacatcggg 49

<210>8

<211>55

<212>DNA

<400>8

ccaccacttc aggtctcggt actgacatcg ctccccgatg tagccaacaa cacag 55

<210>9

<211>28

<212>DNA

<400>9

ccggaattca atagtgactc tgaatgtc 28

<210>10

<211>44

<212>DNA

<400>10

agaacctctt ggaaccaagc gcagttccca ccacttcagg tctc 44

<210>11

<211>38

<212>DNA

<400>11

ttggttccaa gaggttcttc tgcagtagga agacatag 38

<210>12

<211>36

<212>DNA

<400>12

atagtttagc ggccgcttaa tgttttctgt gttttc 36

Claims

1.一种具有抗菌及促伤口愈合功能的融合多肽，其特征在于：由序列表SEQ ID NO.1所述的人表皮生长因子氨基酸序列、序列表SEQ IDNO.2所述的凝血酶酶切位点氨基酸序列和序列表SEQ ID NO.3所述的东北林蛙抗菌肽氨基酸序列构成；凝血酶酶切位点将人表皮生长因子和东北林蛙抗菌肽融合在一起，构建的融合多肽的氨基酸序列如序列表SEQID NO.4所示。

2.权利要求1所述的具有抗菌及促伤口愈合功能的融合多肽在制备治疗创伤、烫伤及烧伤药物中的应用。

3.一种重组载体，含有权利要求1所述的融合多肽。

4.按照权利要求3所述的重组载体，为毕赤酵母表达载体。