CN110577588B - 一种凹耳蛙免疫调节肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种免疫调节肽，其包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明还公开了上述免疫调节肽在制备促进皮肤伤口愈合药物或护肤品中的应用。本发明提供了一种新的免疫调节肽及其应用，并公开了其促进伤口愈合的作用机制，可作为伤口愈合肽模板。
Description
技术领域
本发明涉及医学分子生物学技术领域，尤其涉及一种凹耳蛙免疫调节肽及其应用。
背景技术
伤口愈合是皮肤感染或受到物理创伤后引起的病理过程的总称，需要各种不同类型细胞恢复组织完整性的一个高度有序的生物过程。创面愈合过程涉及几种不同的细胞类型，任何特定细胞类型的细胞活性在修复的不同阶段也可能变化。愈合过程的复杂性和协调性是治疗方法的主要障碍，因此任何治疗剂都必须有效地排序到合适的阶段。伤口愈合作为人体正常的生物过程，是通过四个精确和高度程序化的阶段实现的：止血，炎症，增殖和重塑。伤口愈合是一个动态过程，每个阶段过程中的中断，异常或延长可导致伤口愈合延迟或不愈合的慢性伤口。手术后伤口愈合不良或伤口破裂是外科手术后的常见症状，造成多种不良的预后，包括伤口感染、形成瘢痕等。许多术后感染形成难以愈合性伤口，给患者带来极大的痛苦和心理负担。
在过去的十几年里，各种新型的生物制剂疗法取得了一定的成效，目前可促进伤口愈合的有效药物主要是生长因子类，包括表皮生长因子(EGF)，成纤维生长因-2 (FGF-2)，血管内皮生长因子 (VEGF)，血小板来源的生长因子(PDGF)，角质形成细胞因子-1(KGF-1)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和有一些其他的因子。虽然基于这些生长因子的治疗在临床上取得了一定的应用，但是这些生长因子的分子量大、生产成本很高，从而限制了他们在临床上的广泛应用。
两栖动物的皮肤是有效的天然屏障，在防御、呼吸和水分调节方面起重要作用。由于两栖动物生存环境复杂，其皮肤经常受到各种生物和非生物的损伤，比如捕食、寄生感染、微生物感染和一些物理损伤。然而令人惊奇的是，两栖动物的皮肤即使在没有任何伤后护理情况下仍然具有很好的愈合能力。这说明两栖动物已经进化出优秀的愈合系统，而伤口愈合肽是其重要的组成部分。虽然已有一些两栖动物来源的伤口愈合肽报道，如CN201510000510.3、CN201810366376.2所公开的抗菌肽，但愈合肽的作用机制，比如对伤口处中性粒细胞的趋化作用、对中性粒细胞是否具有直接趋化作用、对巨噬细胞是否具有直接趋化作用、对效应细胞之间互作的调节作用等机制的研究还不够深入。
凹耳蛙多分布于中国安徽省黄山，白天隐匿于阴暗潮湿的洞隙内，夜晚常匍匐在山溪两岸的灌木、矮草枝或草丛的叶片上捕食。由于其鼓膜凹陷，呈一个略向前斜的外听道，科学家多将焦点集中到它的超声通讯以及利用超声通讯的行为学研究上，至今未有生物活性多肽的报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种凹耳蛙免疫调节肽及其应用，本发明提供了一种新的免疫调节肽及其应用，可利用该免疫调节肽作为新型伤口愈合多肽模板。
本发明的第一个目的是公开一种免疫调节肽（以下命名为Ot-WHP），其包括SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列。上述Ot-WHP）由24个氨基酸组成，分子量为2666.19道尔顿。
进一步地，免疫调节肽来源于凹耳蛙（拉丁文名为Odorranatormota）。
进一步地，免疫调节肽来源于凹耳蛙的皮肤。
本发明的第二个目的是公开免疫调节肽在制备促进皮肤伤口愈合药物或护肤品中的应用。
进一步地，药物用于促进人类的皮肤伤口愈合。
进一步地，在巨噬细胞存在下，所述药物引起中性粒和巨噬细胞的迁移。
进一步地，药物诱导小鼠巨噬细胞和皮肤伤口处产生趋化因子和细胞因子。
进一步地，药物激活骨髓来源的巨噬细胞的MAPKs、NF-кB和TGF-β/Smad信号通路。
进一步地，在巨噬细胞存在下，所述药物促进角质细胞和成纤维细胞的增殖。
进一步地，在巨噬细胞存在下，所述药物促进成纤维细胞向成纤维母细胞的转化并促进成纤维细胞的胶原产生。
进一步地，在巨噬细胞存在下，所述药物中免疫调节肽的浓度为20-100μg/mL。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明提供了一种新的免疫调节肽Ot-WHP，其分子量小，生产成本低，将其应用于制备促进皮肤伤口愈合药物中，相比于生长因子而言，应用前景广阔，且其作用机制明确，将来可作为新型的伤口愈合多肽模板。
本发明提供的Ot-WHP可以显著促进小鼠伤口愈合，而且Ot-WHP分子量小，结构简单，易于化学合成和蛋白表达。Ot-WHP作用机制明确，这些优点使其有望成为新一代临床促进伤口愈合的优良候选多肽。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1图示了实施例1中从凹耳蛙皮肤分泌液中分离制备Ot-WHP过程中在 280nm波长下所测得的活性峰；
图2为实施例3中不同实验组小鼠的皮肤伤口愈合情况照片图；
图3为实施例3中不同实验组小鼠的皮肤伤口愈合率测试结果；
图4为实施例4中不同实验组小鼠的中性粒细胞和巨噬细胞的免疫组化和数量统计结果；
图5为实施例5中不同浓度的Ot-WHP对中性粒和巨噬细胞的迁移影响结果；
图6为实施例6中不同浓度的Ot-WHP对小鼠BMDMs细胞和皮肤伤口处的趋化因子和细胞因子产生情况的影响情况测试结果；
图7为实施例7中不同浓度的Ot-WHP对小鼠BMDMs细胞的不同信号通路的激活作用测试结果；
图8为实施例8中不同浓度的Ot-WHP对角质细胞和成纤维细胞的增值影响测试结果；
图9为实施例9中不同浓度的Ot-WHP促进与巨噬细胞协同作用的成纤维细胞向成纤维母细胞的转化以及胶原沉积情况测试结果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：从凹耳蛙皮肤分泌液中分离制备Ot-WHP
凹耳蛙采集自中国黄山，并用少许乙醚刺激凹耳蛙，会看到蛙体背部有大量分泌液产生，收集分泌液，5000 ×g离心10分钟，收集上清，并冻干。冻干粉溶解于10 mL的PBS中（0.1M，pH6.0），并在5000 ×g离心10分钟，收集上清，上样到Sephadex G-50 (Superfine，Amersham Biosciences，2.6 cm × 100 cm)的葡聚糖凝胶层析柱中，进行过滤层析，过滤层析的缓冲为PBS（0.1M，pH6.0），按照每3mL每10分钟收集一管，约收集200管。收集完毕后，检测各管的在280 nm处的光吸收，根据各管的光吸收值，绘制出图1A。
根据图1A，凹耳蛙皮肤分泌液经Sephadex G-50葡聚糖凝胶过滤层析后，可以被粗分为四个吸收峰，合并各峰，并按照实施例3中检测各峰是否具有促进小鼠皮肤伤口愈合活性，其中发现一个峰具有促进小鼠皮肤伤口愈合的功能（图1A中箭头所示）。然后将图1A中的活性峰上样到C18(5 µm particle size，110 Å pore size，250 mm × 4.6 mm，Gemini，CA，USA)反向高效液相色谱过滤层析，平衡相为加有0.1%三氟乙酸的水，用0-60%的乙腈梯度进行洗脱，洗脱时间为80分钟，检测280 nm处的光吸收，光吸收特征如图1B所示，同上，进行促进皮肤伤口修复活性跟踪，图1B中的活性峰用箭头标出。接着，在和图1B同样的条件下，将图1B中的活性峰进行第二次反向高效液相色谱过滤层析，结果如图1C所示，活性峰用箭头标出，命名为Ot-WHP。
实施例2：Ot-WHP的氨基酸测序
将实施例1中纯化到的Ot-WHP上样到岛津蛋白脉冲液相测序仪(PPSQ-31A;Shimadzu，Kyoto，Japan)，按照仪器说明书，进行Edman降解测序，测序完毕后，获得氨基酸序列为ATAWDLGPHGIRPLRPIRIRPLCG（SEQ ID No.1）。
在实际应用过程中，可根据已知的Ot-WHP的氨基酸序列，采用化学合成法直接合成Ot-WHP。
实施例3：Ot-WHP可显著促进小鼠皮肤伤口愈合
实验动物BALB/c小鼠，雌性，6～8周龄，体质量18～20 g，购于上海斯莱克动物有限公司。将小鼠腹腔注射2%的戊巴比妥钠(0.1 mL/20 g)使其麻醉后，用电动剃刀剃去背部毛发后碘伏消毒，在裸露的背部用直径8mm的活检打孔器打一个洞。术后小鼠单独分笼饲养直至实验结束。将小鼠随机分为6组，每组5只，分别为阴性对照组 (20 μL PBS)，天然Ot-WHP组(20 μL，200 μg/mL)，合成Ot-WHP组 (20 μL，200 μg/mL)，乱序Ot-WHP组(SEQ IDNo.2，20 μL，200 μg/mL)，AH90阳性多肽对照组(20 μL，200 μg/mL)，EGF生长因子对照组(20 μL，100 μg/mL) ，将相应药物分别滴加到对应小鼠伤口处，每天一次，共8天。
结果如图2-3所示，其中图2为术后0，2，4，6，8天拍摄的不同实验组小鼠伤口愈合情况结果；图3A1-A4依次.为术后2，4，6，8天不同实验组小鼠伤口愈合率测试结果。图中，Vehicle代表阴性对照组；synthetic Ot-WHP代表合成Ot-WHP组；NaturalOt-WHP代表天然Ot-WHP组；Scrambled Ot-WHP代表乱序Ot-WHP组。结果表明，天然Ot-WHP和合成Ot-WHP都可以显著促进小鼠皮肤伤口愈合，效果与AH90和EGF相当，而乱序Ot-WHP则没有促进伤口修复的活性。
实施例4：Ot-WHP通过招募中性粒细胞及巨噬细胞迁移至伤口处，加速伤口愈合的炎症起始阶段
按照实施例3的方法处理小鼠，在阴性对照组和天然Ot-WHP组的相应药物分别滴加到对应小鼠伤口处术后指定时间点（0.5，1，2，3天）处死小鼠，取包含伤口中心的活检组织用10%的福尔马林固定，然后通过乙醇脱水，二甲苯清洗，最后石蜡包埋。将石蜡块切成5µm的薄片，经过脱蜡，再水化和抗原修复后进行免疫组化分析。先将切片用5% 的BSA封闭非特异位点，一抗4℃过夜（中性粒细胞的抗体anti-Ly6G，巨噬细胞的抗体anti-F4/80），用辣根过氧化物酶和DBA来免疫显色。中性粒细胞和巨噬细胞的浸润通过统计免疫染色anti-Ly6G和anti-F4/80的细胞数。
结果如图4所示，图4A1-A4分别为不同组小鼠.术后第0.5天和1天招募的中性粒细胞的免疫组化结果，图4C1-C4分别为不同组小鼠.术后第2天和3天招募的巨噬细胞的免疫组化结果，图4B1-B2为不同组小鼠.术后第0.5天和1天招募的中性粒细胞的数量统计结果，图4D1-D2分别为不同组小鼠.术后第2天和3天招募的巨噬细胞的数量统计结果。结果表明，Ot-WHP可促进中性粒细胞及巨噬细胞迁移至伤口处。
实施例5：Ot-WHP不直接引起中性粒和巨噬细胞的迁移，而是需要巨噬细胞的共存才可以引起中性粒和巨噬细胞的迁移
为了明确Ot-WHP如何趋化中性粒细胞和巨噬细胞至伤口局部，将制备好的小鼠中性粒细胞（neutrophils）或骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）重悬于含有2%FBS的RPMI 1640培养基中，细胞密度为7 × 106 cells/mL，吸取100 μL加入到3.0 μm孔径的Transwell小室中（上室，24孔板），然后吸取500 μL的Ot-WHP (25，50，100 μg/mL，Ot-WHP溶解于2% FBS的RPMI 1640培养基中)或培养基（对照）加入到下室中，再在37 ℃细胞培养箱中培养8小时，收集下室中的细胞用血球计数板计数。
在共培养体系中，用2%FBS的RPMI 1640培养基重悬好的小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs，4×106 cells/mL，500 μL）铺于共培养小室的下室（24孔板），待贴壁后，将制备好的小鼠中性粒细胞（neutrophils，7 × 106 cells/mL，100 μL）或骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs，7 × 106 cells/mL，100 μL）加入到3.0 μm孔径的Transwell小室中（上室，24孔板），然后吸取500 μL的Ot-WHP (25，50，100 μg/mL，Ot-WHP溶解于2% FBS的 RPMI 1640培养基中)或培养基（对照）加入到下室中，再在37 ℃细胞培养箱中培养8小时，收集上室中的细胞用血球计数板计数，上室中减少的细胞即为迁移的细胞。
结果如图5所示，Ot-WHP在25-100 μg/mL的浓度范围内，并不直接引起中性粒细胞（图5A）和巨噬细胞（图5C）的迁移，但有巨噬细胞共存时，Ot-WHP在25-100 μg/mL的浓度范围内，以剂量依赖的方式，显著引起中性粒细胞（图5B）和巨噬细胞（图5D）的迁移。
实施例6：Ot-WHP可诱导小鼠巨噬细胞和皮肤伤口处产生趋化因子和细胞因子
为了明确为什么在巨噬细胞共存的情况下，Ot-WHP可引起中性粒细胞和巨噬细胞的迁移，将小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs，5×105 cells/well，DMEM培养基，2% FBS)铺于24孔板中，加入Ot-WHP (25，50，100 μg/mL)或等体积的PBS（Vehicle），培养24小时候，收取上清，10000 × g离心10分钟，测趋化因子和细胞因子。
结果如图6A1-A8所示，与Vehicle（PBS，对照）处理组相比，Ot-WHP以剂量依赖的方式，诱导小鼠BMDMs产生趋化因子（CXCL1，CXCL2，CXCL3和CCL2）和细胞因子（TNF-α，IL-1β，IL-6和 TGF-β1）。
然后检测Ot-WHP是否可以诱导小鼠皮肤伤口处产生趋化因子和细胞因子。在指定时间点（第0，0.5，1，2，4和6天）取小鼠的伤口组织，用0.1M的PBS（含1mM的PMSF，1mL/g组织），将伤口组织用玻璃匀浆器进行匀浆。匀浆完成后，12000 × g、4℃离心30分钟，收集上清，测趋化因子（CXCL1和CCL2）和细胞因子（包括TNF-α和 TGF-β1）。
结果如图6B1-B4所示，与Vehicle（PBS，对照）处理组相比，Ot-WHP可有效诱导小鼠皮肤伤口处产生趋化因子（CXCL1和CCL2）和细胞因子（TNF-α和 TGF-β1）。
实施例7：Ot-WHP可激活小鼠骨髓来源的巨噬细胞的MAPKs，NF-кB，TGF-β/Smad信号通路
小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）接种至6孔板中无血清培养16h。对于MAPKs和NF-κB的检测，BMDMs 与不同浓度的Ot-WHP (0，25，50，100 μg/mL)孵育30min，对于TGF-β/Smad信号通路检测，BMDMs 与不同浓度的Ot-WHP (0，25，50，100 μg/mL)孵育24h 或与100μg/mL Ot-WHP孵育时加或不加TGF-β1的抗体。
结果如图7所示，与Vehicle（PBS，对照）处理组相比，Ot-WHP以剂量依赖的方式激活小鼠BMDMs的MAPKs（ERK，JNK亚基，图7A，7C）、NF-κB（IκBα，p65亚基，图7B，7C）和Smad（Smad2，Smad3，图7D）信号通路，而且Ot-WHP对Smad信号通路的激活是依赖于Ot-WHP诱导的TGF-β的产生（图7E-G）。
实施例8：Ot-WHP不直接促进角质细胞和成纤维细胞增殖，而是需要巨噬细胞的共存才可以促进角质细胞和成纤维细胞的增殖
角质细胞HaCat与小鼠成纤维细胞(5×103cells/well，100 μL/well)接种到96孔板中，与不同浓度的Ot-WHP (25，50，and 100 μg/mL)共同孵育，同时用PBS作对照。HaCat与Ot-WHP孵育24小时后，成纤维细胞与Ot-WHP孵育72小时后，每孔加入细胞计数试剂盒-8（CCK-8）溶液10 µl，37°C继续孵育2-4 h，酶标仪检测450nm处的光吸光值。
对于共培养细胞，HaCat与THP-1来源的巨噬细胞共培养，小鼠成纤维细胞与小鼠巨噬细胞BMDMs共培养。先将HaCat(1×105cells/well)或小鼠成纤维细胞(1×105 cells/well)提前一天接种到24孔板中（下室），待贴壁后，然后在共培养小室（上室）中加入对应的巨噬细胞（1×105 cells/well，100 μL）和不同浓度的Ot-WHP (25，50，100 μg/mL)或Vehicle（PBS，对照）。HaCat与THP-1来源的巨噬细胞共培养24小时后，成纤维细胞与小鼠巨噬细胞BMDMs共培养72小时候后，弃掉共培养的上室，用CCK-8检测下室中的细胞活性。
结果如图8所示，Ot-WHP并不能直接促进角质细胞（图8A）和成纤维细胞（图8B）的增殖；而在巨噬细胞共存的条件下，才可以促进角质细胞（图8C）和成纤维细胞（图8D）的增殖。表明，Ot-WHP可以促进巨噬细胞与角质细胞/成纤维细胞之间的相互作用。
实施例9：Ot-WHP不直接促进成纤维细胞向成纤维母细胞的转化，不直接促进成纤维细胞的胶原产生，而是需要巨噬细胞的共存才可以促进成纤维细胞向成纤维母细胞的转化，才可以促进成纤维细胞的胶原产生
方法同实施例8，用RIPA细胞裂解液，裂解实施例8中处理的成纤维细胞，提取蛋白，用Western blot检测α-SMA的表达，α-SMA表达水平越高，代表成纤维细胞向成纤维母细胞转化的越多）；收集实施例8中处理的成纤维细胞的上清，用ELISA试剂盒定量检测上清中胶原的产生情况。
结果如图9所示，Ot-WHP对成纤维细胞α-SMA表达没有直接影响，Ot-WHP不直接促进成纤维细胞向成纤维母细胞的转化（图9A），且Ot-WHP对成纤维细胞胶原生成没有直接影响，不直接促进成纤维细胞的胶原产生（图9B）；而是需要巨噬细胞的共存，才可以促进成纤维细胞α-SMA的表达，即促进成纤维细胞向成纤维母细胞的转化（图9C），才可以促进成纤维细胞的胶原产生（图9D）。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 一种凹耳蛙免疫调节肽及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 1
Ala Thr Ala Trp Asp Leu Gly Pro His Gly Ile Arg Pro Leu Arg Pro
1 5 10 15
Ile Arg Ile Arg Pro Leu Cys Gly
20
<210> 2
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<212> PRT
<213> （人工序列）
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Pro Gly Pro Ile Pro Ala His Leu Gly Arg Arg Trp Ala Ile Leu Ile
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20
Claims (3)
1.一种免疫调节肽，其特征在于，其氨基酸序列是SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的免疫调节肽在制备促进皮肤伤口愈合的药物或护肤品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药物用于促进人类的皮肤伤口愈合。
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