CN101961493A - Ace2激活用于治疗心脏、肺和肾脏疾病及高血压 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于预防和治疗心血管疾病、肾脏疾病、肺疾病和高血压的ACE2激活化合物。本发明也包括通过测量ACE2表达或核苷酸多态性分析诊断心血管疾病、肾脏疾病、肺疾病和高血压的方法。
Description
本申请为申请日为2003年6月19日、申请号为03818359.5、国际申请号为PCT/CA03100882的同名专利的分案申请。
发明领域
本发明提供了用于诊断和治疗包括高血压、冠心病、心脏和肾衰竭、肺水肿和肺损伤(如中毒性休克或人工通气下的肺损伤)的心脏、肺和肾脏疾病的组合物和方法。
发明背景
心血管疾病将成为21世纪健康护理的最主要负担，预测到2020年时将成为世界范围内最常见的死因。高血压是心脏疾病的一个主要危险因素。高血压是一种既受遗传因素又受环境因素控制的多因子数量性状。虽然已知许多关于能导致高血压的环境因素，如饮食和体力活动，但是关于造成心血管疾病的遗传因素知道很少。尽管证明了一些与动物模型中高血压相关的推定的数量性状遗传位点(QTL)，但这些位点没有被翻译成基因。因而，导致高血压和其他心血管疾病的分子和遗传机制在很大程度上仍然不清楚。
血压稳态的一个关键调节剂是肾素-血管紧张素系统(RAS)。蛋白酶肾素切割血管紧张素原形成非活化的十肽(decamericpeptide)血管紧张素I(Ang I)。接着血管紧张素转化酶能催化切割Ang I形成活化的八肽血管紧张素II(Ang II)，其通过引起血管平滑肌收缩和肾小管钠重吸收作用导致高血压。ACE突变小鼠显示了自发性低血压、部分雄性不育和肾畸形。在人类中，ACE多态性与肾和心血管功能的决定因素相关，并且ACE与Ang II受体的药理学抑制能有效地降低血管压力和减少肾脏疾病。此外，ACE和Ang II受体的抑制对心力衰竭具有有益作用。
近来，一个ACE同系物，称为ACE2，已被证实主要在肾脏和心脏的血管内皮细胞中表达。有趣地是，两个ACE同系物也存在于蝇中。不像ACE，ACE2具有羧肽酶功能，从Ang I上切割单个残基，产生Ang1-9，和从Ang II上切割单个残基产生Ang1-7。这些体外生化数据暗示ACE2调节RAS并因此可能在血管压力调节中扮演一个角色。ACE2在心血管系统和RAS中的体内角色未知。
Acton等在美国专利6,194,556中描述了ACE2在诊断和治疗ACE2相关病症中的应用。该专利陈述了高血压中ACE2表达水平增加，和ACE2活性的拮抗剂或抑制剂可被用于治疗增加的血管压力或相关病症。加拿大第2,372,387号专利申请提供了ACE2抑制剂的具体例子，其有望被用于治疗心脏疾病，如高血压。其再一次强调了需要抑制，而不是增加ACE2的活性。这些仅仅基于体外试验数据的参考文献教导需要抑制ACE2活性。它们没有提供体内数据，如敲除的哺乳动物数据，来表征ACE2。迄今为止，没有一种ACE2抑制剂被批准可作为药物用于治疗高血压。而且，ACE2在心血管系统和RAS中的体内角色在很大程度上仍然未知。为了能设计合适的诊断测试剂和用于治疗心脏和肾脏疾病的药物，因此需要表征ACE2的功能。
发明简述
本发明提供了一种用于调节肾素-血管紧张素系统的新范例和显示了一种完全新的和预料不到的ACE2用法，其不同于基于体外数据的预测(Acton专利)并在现有技术中预料不到，即ACE2作为一种心功能和血压控制必需的RAS的关键的负调节物。ACE2的激活是用于治疗和预防心脏、肺和肾脏疾病的关键。本发明第一次证明了给动物施用ACE2激活剂能预防和治疗高血压和心脏和肾脏疾病，和肺损伤。
附图简述
本发明优选实施方案将结合下列附图描述，其中：
图1.大鼠ACE2的序列和染色体定位。
a.大鼠、小鼠和人ACE2与小鼠和人睾丸-ACE(T-ACE)的蛋白比对。黑影表示氨基酸同一性，灰影表示氨基酸相似性的程度。b.ACE和ACE2结构域示意图。注意ACE2仅含有一个ACE结构域，其带有一致锌结合位点HEMGH。黑色表示催化中心，灰色表示信号肽，阴影线表示跨膜结构域。c.小鼠和大鼠ACE2基因在不同成人组织和不同胚胎发育日(E7＝胚胎期第7天)中的表达模式。注意在小鼠中ACE2存在两种同种型，但在大鼠或人中不存在(未显示)，类似于在ACE中所见到的现象15。d.与在Sabra盐敏感性动物(SS-X)、SHRSP(BP3)和SHR大鼠(BB.Xs)中鉴定的QTL定位相比，大鼠ACE2放射性杂交定位的结果。多态性标记的名字显示在表意符号的左侧。显示了与ACE2连锁的标记的LOD得分和θ值。cR＝厘拉德。
图2.高血压大鼠模型中ACE2表达水平。
a.来自Sabra SBH/y和SBN/y大鼠肾脏的ACE2 mRNA的RNA印迹分析。上图显示了以肌动蛋白作为对照水平的RNA印迹图谱。下图显示了对于肌动蛋白水平标准化的ace2信使的相对水平。b.来自Sabra SBH/y和它们的对照SBN/y大鼠以及SHR和SHRSP和它们的对照WKY大鼠的肾脏的ACE2蛋白水平的蛋白质印迹分析。上图显示了代表性蛋白质印迹图谱。显示了每种Sabra大鼠的收缩血压(BP)，用mmHg表示。下图显示了对于肌动蛋白进行校正的ACE2蛋白相对水平。竖条显示了平均值+/-SEM，*＝p＜0.05，**＝p＜0.01。(对于所有组，n＝4)。
图3.通过同源重组对小鼠ACE2的靶向破坏
a.基因靶向策略。显示了鼠ace2野生型位点的一部分(上)。黑框表示外显子。设计靶向载体，从而以置于反义方向的新霉素(neo)抗性基因盒置换编码锌结合催化结构域外的显子9。胸苷激酶(TK)被用作负选择。阴影线框表示用于DNA印迹分析的3’和5’侧翼探针。b.ce+/y和ace-/y ES细胞的DNA印迹分析。用EcoR I消化基因组DNA并与(a)中显示的3’和5’侧翼探针杂交。c.ace2+/y和ace2-/y小鼠肾脏中ACE2蛋白表达的蛋白质印迹分析。抗-ACE2抗体与被删除的N-端的区域反应。d.ce2+/y和ace2-/y小鼠心脏和肾脏中ACE mRNA表达的RT-PCR分析。显示了用于线性扩增的不同的PCR循环和作为对照的GAPDH mRNA水平。
图4.正常的血压和肾功能
a.在不存在(左栏)或存在ACE阻断剂卡托普利条件下，3个月大小的ace2+/y(n＝8)和ace2-/y(n＝8)小鼠的血压测量结果。使用尾套测定血压并显示了平均值+/-SD。如“方法”部分所述，在进行血压测量前给小鼠施用卡托普利2周。使用侵入性血液动力学和Langendorf测量法证实上述血压值(未显示)。在卡托普利处理的ace2+/y和ace2-/y小鼠中的差异是明显地不同于它们分别未处理的组(**p＜0.01)。b.在6个月大小的ace2+/ y和ace2-/y小鼠中观察到正常的肾脏组织学结果。箭头表示肾小球。
图5.心脏形态学
a.分离自6个月大小的ace2+/y和ace2-/y小鼠的心脏H&E染色切片。在ace2-/y小鼠中观察到扩张的左心室(LV)和右心室(RV)。但是，两种基因型之间的总的心脏尺寸是相当的，且目视检查或在分离的心肌细胞中，没有证据表明心脏肥大。b.来自6个月大小的ace2+/y(n＝8)和ace2-/y(n＝8)小鼠的心脏/身体重量比值的测定值作为心脏肥大的指标。应注意在所有被分析的年龄的不同遗传组中，身体重量、心脏重量、胫骨长度和心脏重量/胫骨长度比值也没有改变(未显示)。c.d.在ace2-/y小鼠中不存在间质性纤维化。扩张性心肌病的一个标志性特征是间质性纤维化。但是，在ace2+/y(n＝8)和ace2-/y(n＝8)小鼠之间心脏的间质性纤维化是相当的。(c)显示了单个心脏的PSR染色。在野生型和突变动物中，注意到正常的血管周围纤维化被染成红色。(d)在间质中纤维化改变的定量表示。
图6.ACE2损失导致严重收缩性心力衰竭
a，在一只6个月大小的ace2+/y和两只ace2-/y小鼠中心脏收缩的超声心动图测量结果。波峰和波谷表示每一次心博的心脏收缩和心脏舒张。箭头表示收缩期收缩(LVESD)和舒张期松弛(LVEDD)之间的距离，测定分数缩短的百分比(％FS)。注意在ace2-/y小鼠中增加的舒张和收缩大小表示心脏扩张。实验数据见表1。b.在6个月大小的ace2+/y(n＝8)和ace2-/y(n＝8)小鼠和6个月大小的ace2+/-(n＝5)和ace2-/-(n＝5)雌性小鼠中，观察了两个心脏收缩的标志性参数即分数缩短百分数和纤维鞘(circumferetial fiber)缩短速率。通过超声心动描记术测定数值。显示了平均值+/-SD。在遗传组之间*p＜0.05和**p＜0.01。实验数据见表1。c，在6个月大小的ace2+/y(n＝8)和ace2-/y(n＝8)雄性小鼠和6个月大小的ace2+/-(n＝5)雌性小鼠和ace2-/-(n＝5)雌性小鼠中的血压测量值。显示了平均值+/-SD。使用侵入性血液动力学测量法证实血压值，见表2，*p＜0.05。
图7.在不存在ACE2条件下，组织缺氧标记的增量调节和增加的血管紧张素II水平
a，b，6个月大小的雄性ace2+/y(n＝5)和ace2-/y(n＝5)小鼠中两个组织缺氧诱导型基因即BNIP3和PAI-1 mRNA表达水平的RNA印迹分析。(a)显示了每个RNA印迹的数据，和(b)对gapdh对照水平进行标准后化的BNIP3和PAI-1 mRNA的相对水平。**p＜0.01。
c，在6个月大小的雄性ace2+/y(n＝8)和ace2-/y(n＝8)同窝出生小鼠的心脏和肾脏中，血管紧张素I(AngI)和血管紧张素II(AngII)肽水平。通过放射性免疫测定法测定AngI和AngII组织水平。显示了平均肽水平+/-SD。**p＜0.01。
图8.ACE-ACE2双突变小鼠不发展心力衰竭。
a，在6个月大小的雄性ace2+/y(n＝8)，ace-/-(n＝8)，和ace-/-ace2-/y双突变(n＝6)小鼠中测量血压。显示了平均值+/-SD。使用侵入性血液动力学测量法证实血压。与野生型小鼠比较，突变体的**p＜0.01。b，在6个月大小的雄性ace2+/y(n＝8)，ace2-/y(n＝8)，ace-/-(n＝8)，和ace-/-ace2-/y双突变(n＝6)同窝出生小鼠中分数缩短百分数和纤维鞘缩短速率。通过超声心动描记术测定数值。显示了平均值+/-SD。在遗传组之间**p＜0.01。实验数据见表3。c，在6个月大小的雄性ace2+/y，ace2-/y，ace-/-，和ace-/-ace2-/y双突变同窝出生小鼠中心脏收缩的超声心动图测量值。如图6a所示分析并标记超声心动图。注意在ace2空背景中完全除去ACE拯救了在ace2-/y单突变小鼠中观察到的收缩性心脏缺陷。
图9.计算一定时间内偏离基线的弹性(elastance)变化百分数。通过将气管峰值压力除以体积从而计算肺弹性。
图10.a，人ACE2 DNA(SEQ ID NO：1)。b，人ACE2多肽(SEQ IDNO：2)。
图11.a.小鼠ACE2 DNA(SEQ ID NO：3)。b.小鼠ACE2多肽(SEQ IDNO：4)。
图12.ACE2核苷酸多态性和序列。
发明详述
本发明提供了一种用于RAS系统调节的新范例，并且显示了ACE2是心功能和心血管功能、肾功能和肺损伤所必需的RAS的一种关键负调节物。在治疗和预防心脏和肾脏疾病和高血压及肺损伤中，ACE2的激活是关键。本发明第一次教导了给动物施用ACE2激活剂预防和治疗心力衰竭和高血压、肾脏疾病以及肺损伤。
鉴于现有技术的参考文献，如上述的美国专利6,194,556和加拿大第2,372,387号专利申请，教导应该抑制ACE2活性来治疗心脏疾病，因此本发明结果是完全预料不到的。因此令人惊奇的是，通过激活ACE2表达和/或活性实际治疗了心脏疾病。
本发明包括激活剂，该激活剂包括但不限于ACE2功能和/或ACE2mRNA和ACE2蛋白表达的激活剂，本发明也包括含有该激活剂的药物组合物。本发明也包括心脏疾病、肺病和肾病及高血压的医学治疗方法，通过施用有效量的激活剂予需要治疗的动物而实现。肺病包括但不限于慢性阻塞性肺部疾病、肺炎、哮喘、慢性支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、间质性肺病、原发性肺动脉高压、肺栓塞、肺结节病(pulmonary sarcodosis)、结核和肺癌。
本发明也包括用于检测ACE2激活剂的筛选检测法，该激活剂可被用于治疗心脏疾病和肾病和高血压及肺病。这些检测法是体外或体内的。在一个优选的实施方案中，本发明包括一种内皮、肾、肺或心脏细胞检测法，用于评估候选化合物是否能增加ACE2表达或活性。在存在至少一种其激活表达或活性的能力需要被测定的化合物的条件下培养细胞，和测量该细胞的ACE2表达水平是否增加。本发明的另一个方面包括一种用于鉴定可克服ACE2损失的影响的化合物的ACE2敲除小鼠。在这些检测法中多肽和小的有机分子被测试。本发明包括所有通过本发明的筛选方法被鉴定并适于以药物组合物的形式施用给动物的化合物。
本发明的另一个方面是心脏和/或肾脏疾病和/或高血压和/或肺病的发作或风险的诊断。可通过测量心脏、血清或肾脏或其他组织中的ACE2水平诊断。ACE2水平少于野生型水平表示“ACE2减少状态”，本发明显示该状态与心脏和/或肾脏疾病和/或高血压、和/或肺病、或疾病风险直接相关。对于本领域的技术人员而言，ACE2的野生型水平和减少的水平是显而易见的。ACE2减少状态也可通过如下所述的ACE2a-ACE2m多态性来指示。本发明对于治疗和诊断与减少的ACE2表达或活性相关的疾病是有用的。通过与ACE2减少状态相关的在ACE2基因中及其上游和下游的多态性的分析，诊断也可选地被完成。根据于此所述的方法，区分多态性的核苷酸的检测所需要的所有试剂可被提供于一个单一的试剂盒中，用于分离自动物基因组DNA的分析。为了提供用于诊断疾病的风险或发作的基因分型和表型分型，该试剂盒可含有可区分ACE2多态性的标记探针。多态性特异的探针可被适当地标记并在退火条件下加入到产生的DNA片段中，从而只有一个多态性特异的探针杂交并能被检测，因此鉴定特异的ACE2多态性。
治疗方法
如上文所述，本发明人已经证明了在高血压、心脏和肾脏疾病中ACE2基因表达是减量调节的。因此，本发明提供了一种治疗或预防高血压、心脏疾病、肺或肾脏疾病的方法，包含给由此需要的动物施用有效量的能增加ACE2表达的试剂。
于此使用的术语“能增加ACE2表达的试剂”指与在不存在该试剂下在相同类型的细胞中ACE2基因或蛋白的水平或活性相比，能增加ACE2基因或蛋白的水平或活性的任何试剂。该试剂可以是任何类型的物质，包括但不限于，核酸分子(包括ACE2或其片段)，蛋白(包括Ace2或其片段)，肽，糖类，小分子，或有机化合物。本领域技术人员使用已知的方法包括蛋白质印迹SDS-PAGE，免疫化学，RT-PCR，RNA印迹和原位杂交可容易地测定ACE2基因是否增加。
于此使用的术语“动物”包括动物界的所有成员。该动物优选为人。
于此使用的术语“有效量”指在增加ACE2水平必需的剂量和时间方面有效的量。
于此使用的术语“治疗”指一种用于获得有益的或想要的结果包括临床结果的方法。有益的或想要的临床结果可包括，但不限于，一或更多种症状或病症的缓和或改善，疾病程度的减小，疾病的稳定状态(即，不恶化)，预防疾病的扩散，延缓或减慢疾病的进展，疾病状态的改善或减轻，和症状缓解(无论部分的或全部的)，无论可检测的或不可检测的。“治疗”也可指与不接受治疗的预期存活相比延长的存活。
ACE2核酸分子的施用
在一个实施方案中，通过施用包含ACE2基因或其部分的核酸，而增加ACE2基因的表达。
在另一个实施方案中，通过施用增加ACE2基因表达的试剂，包括使用本申请中的筛选检测法而被鉴定的任何试剂，ACE2基因的表达可被增加。
因为可通过ACE2的增量调节治疗动物患病，失调或异常身体状态，所以增加ACE2表达的基因治疗有助于减轻心或肾或肺疾病的发展/进行
本发明包括用于提供ACE2基因治疗的方法和组合物，用于治疗以减少的ACE2表达或ACE2多肽活性水平为特征的疾病，失调或异常身体状态。
本发明包括用于提供编码ACE2的核酸分子或功能等价核酸分子给动物的细胞的方法和组合物，使得在所述细胞中ACE2的表达给那些细胞提供了ACE2多肽的生物学活性或表型。足够量的核酸分子被施用且以足够水平表达以给所述细胞提供ACE2多肽的生物学活性或表型。例如，所述方法可优选包括递送编码ACE2的核酸分子到患有心血管、肾脏或肺疾病的动物的细胞的方法，包含施用于患者包含编码ACE2的DNA的载体。所述方法也可涉及一种通过施用编码ACE2的DNA于患有心血管或肾脏、或肺疾病的动物提供生物活性的ACE2多肽的方法。所述方法可在体内或离体进行(如，用心、肺、内皮或肾干细胞、祖细胞或其他要被移植的细胞)。用于施用ACE2(包括在基因治疗中)到分离的细胞或动物中的方法和组合物被阐述于，例如美国专利第5,672,344，5,645,829，5,741,486，5,656,465，5,547,932，5,529,774，5,436,146，5,399,346，5,670,488，5,240,84，6,322,536，6,306,830和6,071,890号和美国专利申请第20010029040号，他们全文在此一并引入作为参考。
所述方法也涉及一种通过产生适合于基因治疗的包含编码ACE2的DNA的病毒而产生重组病毒品系的方法。所述方法优选包括转染可用于病毒复制的细胞(所述病毒含有所述核酸分子)和收集产生的病毒。
所述方法和组合物可用于体内或体外。本发明也包括组合物(优选用于基因治疗的药物组合物)。所述组合物包括含有ACE2的载体。所述载体可以是药学上的载体或包括该载体的宿主细胞转化体。本领域已知的载体包括但不限于反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、疱疹病毒载体，如牛痘病毒载体，HIV和基于慢病毒的载体、或质粒。本发明也包括产生所述载体所需要的包装和辅助细胞系。产生所述载体的方法和使用所述载体的基因治疗的方法也包括在本发明中。
本发明也包括含有所述载体和所述重组ACE2核酸分子序列的转化细胞。
ACE2变体-多肽序列修饰的用途
ACE2变体可被用于本发明的方法中。产生化学上等价的或化学上相似的氨基酸序列的改变也被包括在本发明的范围内。具有与ACE2受体序列同一性的多肽被测试以确保他们适合用于本发明的方法中。本发明多肽的变体可自然地产生，例如，通过突变，或可被制得，例如，用多肽工程技术如定向诱变，其在本领域中众所周知用于氨基酸的取代。例如，疏水残基如甘氨酸可被用于取代另外的疏水残基如丙氨酸。丙氨酸残基可被更疏水的残基如亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸取代。负电荷氨基酸如天冬氨酸可取代谷氨酸。正电荷氨基酸如赖氨酸可取代另一种正电荷氨基酸如精氨酸。
因此，本发明包括了在氨基酸序列中具有保守改变或取代的多肽。保守取代插入一个或多个具有与被置换的氨基酸相似的化学性质的氨基酸。本发明包括其中产生的保守取代不破坏化合物活性的序列。
包含一或多个d-氨基酸的多肽被考虑于本发明中。也考虑的是其中一或多个氨基酸在N-末端被乙酰化的多肽。本领域技术人员可意识到大量技术可被用于构建多肽模拟物，其具有与本发明相应的多肽化合物相同或相似的期望的化合物活性，但与所述多肽在溶解性、稳定性和/或对水解和蛋白酶解易感性方面具有更良好的活性。参见，例如，Morgan和Gainor，Ann.Rep.Med.Chem.，24：243-252(1989)。多肽模拟物的例子描述于美国专利第5,643,873号。其他描述如何制造和使用模拟物的专利包括，例如，5,786,322，5,767,075，5,763,571，5,753,226，5,683,983，5,677,280，5,672,584，5,668,110，5,654,276，5,643,873。也可根据本领域公知的其他技术制造本发明多肽的模拟物。例如，通过将本发明的多肽和一种试剂反应，该试剂通过将氢基团转变为其他基团如羟基或氨基基团而以化学方法改变侧链基团。模拟物优选包括完全由氨基酸制成的序列或包括氨基酸和修饰的氨基酸或其他有机分子杂合序列。
本发明也包括杂合体和多肽，例如其中一个核苷酸序列与另一个序列结合。
本发明也包括使用ACE2多肽片段的方法，如果该片段保持活性，其可被用于赋予化合物活性。本发明也包括多肽和本发明多肽的片段，其可被用作一种研究工具来表征所述多肽或其活性。这样的多肽优选由至少5个氨基酸组成。在优选的实施方案中，他们可由6至10，11至15，16至25，26至50，51至75，76至100或101至250或250至500个氨基酸组成。片段可包括具有一或多个氨基酸缺失的序列，例如，在化合物序列中C-末端氨基酸缺失。
ACE2多肽活性的增强
通过进行选择性定点诱变增加或减少ACE2的活性。含有所述核酸分子或具有序列同一性的核酸分子的DNA质粒或表达载体被优选用于使用来自Pharmacia Biotech的U.S.E(单一位点消除)诱变试剂盒或其他的可商业上获得的诱变试剂盒，或使用PCR的这些研究。一旦突变形成及通过DNA序列分析被证实，使用表达系统表达该突变多肽并监测其活性。
本发明也包括使用多肽的方法，该多肽与人或小鼠ACE2(或他们的部分序列)具有至少约＞20％，＞25％，＞28％，＞30％，＞35％，＞40％，＞50％，＞60％，＞70％，＞80％或＞90％，更优选至少约＞95％，＞99％或＞99.5％的序列一致性。修饰的多肽分子讨论如下。优选约：1，2，3，4，5，6至10，10至25，26至50或51至100，或101至250个核苷酸或氨基酸被修饰。
根据本领域公知的方法计算同一性。序列同一性最优选通过BLAST 2.1版程序高级搜索(参数如上)估算。BLAST是一系列的程序，其可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST在线获得。高级BLAST搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi？Jform＝1)设置为默认参数(即矩阵BLOSUM62；缺口罚分(Gap existence cost)11；每一残基缺口罚分(Per residue gap cost)1；λ比值0.85，默认值)。
关于BLAST检索的参考文献是：Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.&Lipman，D.J.(1990)″基本局部比对检索工具″J.Mol.Biol.215：403-410；Gish，W.&States，D.J.(1993)″通过数据库相似性搜索鉴定蛋白编码区域″Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.，Tatusov，R.L.&Zhang，J.(1996)″网络BLAST服务器的应用″Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.，Madden，T.L.，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.&Lipman，D.J.(1997)″Gapped BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库检索程序″Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang，J.&Madden，T.L.(1997)″PowerBLAST：一种新的应用于交互式或自动序列分析和注释的网络BLAST″Genome Res.7：649-656。
优选地约：1，2，3，4，5，6至10，10至25，26至50或51至100，或101至250个核苷酸或氨基酸被修饰。本发明包括具有导致在不涉及提供活性的多肽的部分中的氨基酸改变或在涉及提供活性的多肽的部分中的氨基酸改变的突变，使得该突变增加或减少多肽的活性。
筛选ACE2激活剂
小的有机分子被筛选以确定他们是否增加ACE2表达或活性。ACE2的多肽片段和具有与ACE2序列一致性的多肽也被测试以确定他们在体外检测和在体内细胞系是否增加ACE2活性。激活剂优选作用于ACE2的特定结构域以增加ACE2的激活作用。为获得特异性，激活剂应以ACE2的独特序列作为靶标。
本发明也包括能增加ACE2表达的物质的分离。特别是可分离能结合ACE2基因或蛋白的配体或物质。对于能结合ACE2基因或蛋白的物质如蛋白，可测试生物学样本和商业上可得到的文库。例如，ACE2蛋白的氨基酸序列可用于探查多肽文库，而编码ACE2的核苷酸序列可用于探查核苷酸文库。此外，制备的ACE2的抗体可被用于分离其他与ACE2具有亲合性的多肽。例如，标记抗体可被用于探查噬菌体展示文库或生物学样本。
根据一些因素，如物质和ACE2基因或蛋白的特性和数量，可以选择允许该物质和ACE2基因或蛋白形成复合物的条件。物质-蛋白或物质-基因复合物，游离的物质或非复合的物质可通过常规的分离技术被分离，例如，盐析、层析、电泳、凝胶过滤、分级、吸收、聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝集或其组合。为便于成分的检测，抗ACE2或该物质的抗体，或标记的蛋白，或标记的物质可被使用。如果合适，抗体、蛋白或物质可用如下所述的可检测的物质标记。
一旦潜在的结合配偶体被分离，可设计筛选方法以测定结合ACE2基因或蛋白的该物质是否可用于本发明方法中以在细胞中提高ACE2的表达并因此在疾病治疗中是有用的。
因此，本发明也提供了用于鉴定能结合ACE2基因或蛋白的物质的方法。特别是，该方法可被用于鉴定能结合和增加或提高ACE2的表达的物质。因此，本发明提供了一种鉴定能结合ACE2基因或蛋白的物质的方法，包含步骤：
(a)在允许形成复合物的条件下，将测试物质和ACE2基因或蛋白(优选固定化的)进行反应，和
(b)对复合物、游离的物质和非复合的基因或蛋白进行检测分析。
任何检测蛋白-蛋白相互作用的检测系统或测试方法可被使用，包括共免疫沉淀、交联和通过梯度或色谱柱共纯化。此外，X-射线结晶学研究可被用作评估物质和分子相互作用的手段。例如，当以适合的形式结晶时，本发明复合物中的纯化的重组分子适于通过X-射线结晶学检测分子内的相互作用。光谱学也可被用于检测相互作用和特别是，Q-TOF装置可被使用。生物学样本和商业上可获得的文库可被用于ACE2结合肽的测试。另外，抗ACE2的抗体可被用于分离其他具有ACE2结合亲和力的肽。例如，标记抗体可被用于探查噬菌体展示文库或生物学样本。在这方面，肽可使用生物学表达系统而被开发。这些系统的使用允许随机肽序列大文库的产生和对这些文库筛选结合特定蛋白的肽序列。文库可通过将编码随机肽序列的合成DNA克隆入合适的表达载体中而被产生。(参见，Christian等.1992，J.Mol.Biol.227：711；Devlin等，1990 Science 249：404；Cwirla等.1990，Proc.Natl.Acad，Sci.USA，87：6378)。文库也可通过重叠肽的并行合
成而被构建(参见，美国专利第4,708,871号)。在高血压、心脏或肾脏疾病动物模型中测试激活剂。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于评估候选化合物是否能增加ACE2表达或活性的检测法，其通过下列来实现：在存在至少一种其激活表达或活性的能力需要被测定的化合物的条件下，培养细胞(优选肾脏或心脏细胞)，其后监测细胞中ACE2表达水平和/或活性的增加。增加的ACE2表达和/或活性表明该候选化合物可用于治疗心脏或/肾脏疾病或高血压。
可以在本领域公知的易于患心脏疾病或肾脏疾病的哺乳动物上进行相似的筛选检测法。候选化合物被施用于哺乳动物和ACE2表达和/或活性被测量。增加的ACE2表达和/或活性表明该候选化合物可用于治疗心脏或肾脏疾病。
一种检测候选化合物是否增加ACE2活性(和用于治疗心血管疾病和/或肾脏疾病和/或肺、和/或高血压)的方法也包括：
a)将(i)ACE2、ACE2的片段或前述任一的衍生物和(ii)ACE2的底物在存在候选化合物的条件下接触；和
b)测定ACE2作用于底物的活性是否增加，从而指示该化合物增加了ACE2的活性。增加的ACE2活性表明该化合物可用于治疗列于本申请中的心脏疾病或肾脏或肺病或高血压。ACE2活性增加的测定优选包括测定该化合物是否增加了ACE2蛋白水解活性(增加的底物水解)。在本发明的一个变体中，本发明的检测法受限于下列条件：候选化合物不是卤化钠盐或卤化钾盐，并且该检测法不测量增加的离子浓度对ACE2蛋白质水解的影响。ACE2底物包括AngI，AngII，des-Ang，AngIIapelin-13，强啡肽13，β-酪啡肽和神经降压素。
用于产生ACE2的方法描述于CA2,372,387。用于ACE2激活的体外检测法的实例显示于Vickers等，通过人血管紧张素转变酶相关的羧肽酶水解生物肽，J Biol.Chem.2002，277(17)：14838。其他的检测法(以及上述检测法的变体)从本发明和那些描述于美国专利第5,851,788，5,736,337和5,767,075号中的技术中是显而易见的，其全文在此一并引入作为参考。
敲除的哺乳动物
ACE2小鼠的克隆和ACE2敲除小鼠的指导性实例描述于如下实施例中。术语“敲除”指哺乳动物的单个细胞、被选择的细胞或所有细胞的ACE2基因编码的多肽的至少一部分的表达被部分或完全减少。该哺乳动物可以是一种“杂合敲除”，其中内源基因的一个等位基因被破坏但另一个等位基因仍然存在。ACE2位于X染色体上，因此雌性可以是杂合的。在雄性中，只有一个等位基因，因此雄性是纯合的。可选择地，哺乳动物可以是一种“纯合敲除”，其中内源基因的两个等位基因都被破坏。
术语“敲除构建体”指核苷酸序列，其被设计成减少或抑制哺乳动物一个或多个细胞中内源基因编码的多肽的表达。被用作敲除构建体的核苷酸序列通常由下列组成：(1)来自待抑制的内源基因某一部分(一或多个外显子序列、内含子序列和/或启动子序列)的DNA；和(2)用于检测细胞中敲除构建体存在的标记序列。该敲除构建体被插入到含有要被敲除的内源基因的细胞中。接着该敲除构建体能整合入一或两个内源ACE2基因的等位基因中，和该ACE2敲除构建体的整合能阻止或打断全长内源ACE2基因的转录。一般借助于同源重组，ACE2敲除构建体整合入细胞染色体DNA中(即，当该敲除构建体被插入到该细胞中时，与内源ACE2 DNA序列同源或互补的ACE2敲除构建体区域可互相杂交；这些区域接着被重组使得该敲除构建体被整合入内源DNA的相应位置)。
典型地，该敲除构建体被插入到称为胚胎干细胞(ES细胞)的未分化的细胞中。ES细胞通常源自胚胎或胚泡，该胚泡与其所要导入的发育胚胎属于相同物种，如下所讨论的。
术语“基因的破坏”、“基因破坏”、“抑制表达”和“基因抑制”指ACE2核苷酸序列敲除构建体插入到内源ACE2基因的编码区(通常含有一或多个外显子)和/或该基因的启动子区的同源区中，以减少或阻止细胞中全长ACE2分子的表达。插入通常通过同源重组来完成。作为实例，核苷酸序列敲除构建体可制备如下：将包含抗生素抗性基因的核苷酸序列插入到要被破坏的编码ACE2的分离的核苷酸序列的一部分中。当该敲除构建体接着被插入到胚胎干细胞(“ES细胞”)中时，该构建体可整合入至少一个ACE2等位基因的基因组DNA中。因而，至少在一些细胞中，许多细胞后代将不再表达ACE2，或以减少的水平和/或以截短的形式表达，因为ACE2内源编码区的至少一部分被抗生素抗性基因破坏。
术语“标记序列”指一段核苷酸序列，其(1)被用作更大的用来破坏ACE2表达的核苷酸序列构建体(即，“敲除构建体”)的一部分；和(2)被用作鉴定那些已经整合ACE2敲除构建体到染色体DNA中的细胞的手段。该标记序列可以是任何适合这些目的的序列，尽管典型地其是一种编码蛋白的序列，该蛋白赋予细胞可检测的特性，如抗生素抗性基因或在该细胞中天然不出现的可检测的酶。该标记序列也典型地含有调节其表达的同源或异源启动子。
包括在本发明的范围中的是这样一种哺乳动物，其中一或两个ACE2等位基因，及一或两个其他基因的等位基因已经被敲除。这样的一种哺乳动物可产生如下：重复于此提出的用于产生ACE2敲除哺乳动物的方法但使用其他基因，或使两种哺乳动物互相杂交，一种哺乳动物中一或两个ACE2等位基因被敲除，和另一种哺乳动物中一或两个第二基因的等位基因被敲除，接着筛选那些具有双敲除基因型的后代(双杂合的或双纯合的敲除基因型，或其变体)。
可使用类似的技术制造其他敲除动物和细胞。
药物组合物
在一种药物组合物中，ACE2表达和活性的激活剂优选组合其他成分，如载体。这些组合物可以可溶的形式被施用于动物，优选人，来预防或治疗心脏疾病、肾脏疾病或高血压。心脏疾病包括慢性心力衰竭、左心室肥大、急性心力衰竭、心肌梗塞和心肌病。肾脏疾病包括肾衰竭。ACE2激活剂可用于调节血压和动脉高血压。正常血压具有小于85mm Hg的舒张压。高的正常血压具有85至89mm Hg之间的舒张血压。轻度高血压相应于90至104mm Hg之间的舒张血压。中度高血压具有105至114mm Hg之间的舒张血压。重度高血压具有高于115mm Hg的舒张血压。也通过收缩血压测定异常的血压(当舒张压低于90mm Hg时)。正常血压具有小于140mm Hg的收缩血压。临界收缩期高血压显示了在140至159mm Hg之间的收缩血压。单纯收缩期高血压具有高于160mm Hg的收缩血压(Cecil：Essentials ofMeidcine，第三版，Andreoli等.W.B.Saunders Company(1993))。在大于18岁的成年人中如果在至少两次就诊中，两次或更多次血压测量值的平均值是90mm Hg或更高的舒张压或140mm Hg收缩压，则被诊断为高血压。儿童和孕妇具有更低的血压，所以血压超过120/80(即，120mm Hg收缩血压/80mm Hg舒张血压)表示为高血压。
通过不同的方法包括，但不限于局部给药、口服、气溶胶给药、气管内滴注、腹膜内注射、和静脉内注射，药物组合物可被施用于人或动物。给药的剂量依赖于患者的需要、期望的效果和选择的给药途径。使用体内递送载体如但不陷限于脂质体，多肽可被导入细胞中。
该药物组合物可通过已知用于药学上可接受的可被施用于患者的组合物的制备方法而被制备，使得有效量的核酸分子或多肽与药学上可接受的载体混合为混合物。适合的载体被描述于，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack出版公司，Easton，Pa.，USA)。
于此基础上，该药物组合物可包括活性化合物或物质，如核酸分子或多肽，其结合有一或多种药学上可接受的载体或稀释剂，并包含于具有合适的pH的缓冲溶液中，用生理溶液等渗。将活性分子与载体组合或将他们与稀释剂组合的方法对于本领域技术人员而言是众所周知的。该组合物可包括用于递送活性化合物到组织内特定部位的靶向试剂。
ACE2的异源性过表达
表达载体可用于提供高水平的ACE2表达。用本发明的核酸分子转化的细胞培养物可用作研究工具，特别是用于研究ACE2减少的状态。本发明包括载体，其选择性作用于通常产生ACE2的心脏细胞和肾脏细胞，优选内皮细胞。本发明也包括包含这些载体的转染细胞。适合于心脏和肾脏细胞的载体的实例被描述于，例如Rosengart等，美国专利第6,322,536号；March等.美国专利第6,224,584号；Hammond等，美国专利第6,174,871号；Wolfgang-M.Franz等.通过含有心脏特异性启动子的重组腺病毒进行组织特异性基因递送的分析。Cardiovascular Research 35(1997)560-566；Rothmann T.等，使用复制缺陷型重组腺病毒表达心肌特异性基因。Gene Ther 1996Oct；3(10)：919-26；Phillips MI等，Vigilant载体：用于心脏保护的腺伴随病毒载体中的心脏特异性启动子。Hypertension 2002，Feb；39(2 Pt 2)：651-5；Herold BC等.作为模式载体系统用于肾病基因治疗的单纯疱疹病毒。Kidney Int 2002 Jan；61 Suppl 1：3-8；Figlin RA等.技术评估：白介素-2基因治疗用于治疗肾细胞癌。CurrOpin Mol Ther 1999 Apr；1(2)：271-8；Varda-Bloom N等.定向于肿瘤血管发生的组织特异性基因治疗。Gene Ther 2001Jun；8(11)：819-27；Scott-Taylor TH等..腺病毒有助于亲嗜性逆转录病毒感染人细胞。Gene Ther 1998May；5(5)：621-9；Langer JC等.腺伴随病毒基因转移入肾脏细胞：潜在地用于体内基因递送。ExpNephrol 1998 May-Jun；6(3)：189-94；Lien YH等.肾病的基因治疗。Kidney Int Suppl 1997 Oct；61：S85-8；和Ohno K等.展示了蛋白A的IgG结合域的辛德比斯病毒载体的细胞特异性靶向。NatBiotechnol 1997 Aug；15(8)：763-7。
根据本领域公知的众多技术，细胞培养物，优选心脏和肾脏细胞培养物和内皮细胞培养物，可用于过表达和研究。例如，细胞系(永生化细胞培养物或原代细胞培养物)可被含有ACE2核酸分子(或具有序列同一性的分子)的载体转染以测量该核酸分子的表达水平及该核酸分子和多肽的活性。该细胞也可用于鉴定能结合并激活该多肽的化合物。
测定ACE2活性和/或表达的诊断试剂盒
ACE2表达或活性的测定也被用于：i)心脏或肾脏疾病、肺病和/或高血压的诊断，ii)在疾病发作前鉴定处于该疾病发作风险中的患者，iii)测量患有心脏疾病如冠心病、慢性心力衰竭或肾脏疾病和/或高血压和/或肺损伤的患者的治疗反应和iv)测量在处于风险的这类患者中干预性疾病预防策略的成功率。本发明包括一种用于评估动物中ACE2水平的方法，包含如下步骤：(a)从动物标本制备心脏或肾脏或肺样本；(b)测试在该样本中ACE2的存在；和(c)使样本中的ACE2水平或存在与动物中的疾病如心脏或肾脏或肺病的存在(或风险)建立相关性。ACE2水平比正常低或者低的ACE2活性表明存在或处于疾病的风险中。
基于ACE2单核苷酸多态性的诊断试剂盒
本发明也显示了减少的人ACE2表达产生自控制ACE2基因表达的多态性。大鼠中的QTL作图显示了减少的ACE2表达水平与高血压和心血管和肾脏疾病100％相关。在ACE2编码区中没有发现任何如下所述的多态性。所有如下所述的多态性都在ACE2编码区的上游或下游。先前并不知道这些多态性或他们在心血管疾病、肾脏疾病、肺病和高血压中的角色。一种特定的SNP单元型与增加的疾病风险相关。该单元型是一种用于评估疾病风险和用于确定适合的医学治疗方法的重要诊断工具。
多态性如下所示：
SNP 名称 SNP 描述 非洲 亚洲人 白种人 对照
裔
美国
人
ACE2a C(C/G) 60 100 70 C
rs879922
ACE2b T(C/T) 100 100 70 T
rs757066
ACE2c C(C/G) 70 50 80 C
rs714205
ACE2d C(A/C) 50 90 90 A/C
rs329442
ACE2e C(C/T) 80 100 60 C
rs233574
ACE2f C(C/T) 90 100 50 C
rs1978124
ACE2g A(A/G) 70 100 100 A
rs1514282
ACE2h A(A/G) 20 50 30 A
rs1514282-2
ACE2i A(A/G) 70 100 100 A
rs1514281
ACE2j A(A/G) 20 50 50 A
rs1514281-2
ACE2k A(A/G) 失败 100 70 A
rs1514279
ACEI C(C/T) 80 100 80 C
2rs1514280
ACE2m C(C/T) 100 100 50 C
rs233575
描述于前述表格和图11中的控制ACE2基因表达的多态性的核苷酸数目可被本领域技术人员容易地测定。
该表格显示了表格中3种种群(非洲裔美国人、白种人、亚洲人)的每一种中发现的对照碱基的百分数。例如，对于SNP rs233574，预期的SNP是C/T，对照峰为C。在这种情况下，非洲裔美国人等位基因频率是80％C；亚洲人等位基因频率是100％C(换句话说，单态标记)；和白种人等位基因频率是60％C。
本发明提供了多核苷酸探针，其可被用于测定动物基因型，即人是否对于一种或其他多态性是纯合的，或是否对于这些多态性是杂合的，以及进一步推出人的表型。该表型指示了在人细胞中ACE2表达的量。进一步地，本发明提供了在上述的基因型和表型测定中使用上述多核苷酸的方法。根据本领域公知的技术(例如，见美国专利第5,792,851和5,851,788号)，本发明的该寡核苷酸可被用作探针来检测核酸分子。
例如，通过使用洋地黄毒苷-11-脱氧尿苷三磷酸末端标记，本发明的多核苷酸可被改造为探针。使用碱性磷酸酶缀合的多克隆绵羊抗洋地黄毒苷F(ab)片段和作为显色底物的具有5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸的氮蓝四唑，上述探针可被免疫检测。
因而，根据本发明的一个方面，提供了选择性地杂交到ACE上游或下游序列的一部分上的多核苷酸探针。探针可被设计为在严紧条件下杂交到一种ACE2多态性上而不杂交到其它的多态性上以区分一种特定的多态性。
本发明的多态性特异的多核苷酸杂交探针可包含，例如，基因组DNA或合成DNA。上述的寡核苷酸探针可通过自动合成法被合成和优选含有约10-30个碱基，尽管在寡核苷酸探针杂交分析领域可理解，8至约50个核苷酸也是有用的，其依赖于在探针中与靶序列可能的错配所处的位置，探针上的标记可能干扰杂交的程度，和探针和靶序列的杂交进行的物理条件(如，温度、pH、离子强度)。根据常规的方法，根据本发明的多核苷酸探针的设计优选包含调节探针的长度以适合杂交条件(温度、离子强度、暴露时间)，同时保证多态性特异性。根据本发明的另一方面，提供了一种用于基因分型的测试试剂盒，包含：
(a)用于扩增核酸的手段，该核酸包含ACE2 5’或3’区域的至少一部分，其中所述部分包括相应于ACE2a-ACE2m之一的核苷酸；和
(b)本发明的多核苷酸探针，用于区分ACE2多态性与其他多态性。
本领域技术人员可容易地理解，“用于扩增的手段”依赖于要被使用的扩增方法。因而，例如，如果通过PCR方法进行扩增，这些手段可以包括适合的引物，适合的DNA聚合酶，和四种2′-脱氧核糖核苷三磷酸(dA，dC，dG，dT)。在其他的实施例中，如果该扩增通过依赖于转录的方法如3SR法进行，该手段将包括两种引物(当形成双链时，其中的至少一种将提供启动子)，能从该启动子转录的RNA聚合酶，在引物起始的DNA指导的和RNA指导的DNA聚合反应中起作用的反转录酶(也可能参与RNA的RNAse H降解以将DNA链从RNA/RNA杂交体中释放出来)，四种核糖核苷三磷酸(A，C，G和U)，和四种2′-脱氧核糖核苷三磷酸。在另一个实施例中，如果通过连接酶链反应进行扩增，该手段将包括两种寡核苷酸(DNAs)和适合的DNA连接酶，其中如果靶标(在该靶标上所述两种寡核苷酸能以可连接的方向互相邻接并与靶标杂交)存在，则该DNA连接酶将所述两种寡核苷酸连接。
本发明的寡核苷酸探针优选被标记。该标记可以是任何本领域中可用于该探针的各种标记，包括但不限于32P；35S；生物素(在其上可以复合信号发生部分，该信号发生部分结合到或复合到抗生物素蛋白上)；荧光部分；酶如碱性磷酸酶(其能催化显色反应)；如上所述的洋地黄毒苷；等。
RFLP分析，电泳SSCP分析或测序分析也可用于检测ACE2多态性。
根据本发明的另一个方面，这里也提供了一种在来自动物的ACE2核酸中对ACE2多态性特异靶序列进行分型的方法，包含如下步骤，
(a)通过对来自心脏或肾脏的DNA进行靶核酸扩增方法，获得可检测量的扩增的核酸，该核酸具有ACE2的上游或下游区域的亚序列(或亚序列的互补链)，所述亚序列包括其中ACE2多态性可能出现的核苷酸；和
(b)分析(如，在使用根据本发明的多核苷酸探针的核酸探针杂交检测法中)获得自步骤(a)的扩增的核酸分子以测定多态性位点的碱基。
在本发明的分型方法的一种应用中，所述方法被用于个体以测定该个体是否处于发展心脏或肾脏疾病的风险中。
患有冠心病和/或接着进行外科分流术的病人具有心脏组织缺氧。其也已知为心脏抑顿(cardiac stunning)或心脏冬眠。这些患者显示了在心脏中很少的结构改变但具有降低的心功能。在缺少结构改变的条件下具有改变的心功能是十分罕见的。在心脏抑顿或缺氧的小鼠模型中，该动物具有非常类似于ACE2小鼠的表型。另外，我们已经证实了在ACE2缺陷小鼠中缺氧标记被诱导。综合我们的数据证明了由于长期的缺氧这些小鼠具有降低的心功能，因此它们是冠心病模型。因而，多态性和/或减少的ACE2表达或活性可被用于诊断人类中的这种状态。另一个实施例是要测试在患有扩张性心肌病患者心脏中是否具有这种机能和是否显示了该病症的结果与ACE2多态性相关。增加的ACE2表达和活性可被用于治疗该症状。
ACE2作为RAS负调节物的表征
在3种高血压大鼠模型中ACE2定位于与高血压相关的QTL，且在所有这些高血压大鼠品系中ACE2水平是减少的。在小鼠中，使用同源重组对ACE2的遗传失活导致了在组织中增加的AngII肽水平，在心脏中缺氧基因的增量调节，和严重的心功能障碍。在ace2缺陷背景上ACE表达的除去完全消除了ace2单敲除小鼠的心力衰竭表型。这些数据提供了用于RAS调节的新范例，并鉴定ACE2为控制心功能的RAS的负调节物。
ACE2和血压控制
大多数心血管疾病是既受遗传因素又受环境因素控制的多因子数量性状。对于心血管疾病而言一个主要的因素是RAS。与广泛表达的ACE形成对比，近来鉴定的ACE2显示了组织特异性的表达。通过与ACE竞争其AngI底物和/或通过切割AngII产生Ang1-7，ACE2调节内源AngII水平。在本发明之前，没有人知道心血管系统中ACE2在体内的角色。ACE2调节内源AngII水平。其也行使RAS负调节物的功能。
在三种不同的自发性或饮食诱导的高血压和心血管疾病的大鼠品系中，ACE2定位在X染色体上的确定的QTL中。在所有这些高血压易感的大鼠品系中，ACE2 mRNA和蛋白水平是减量调节的。在Sabra大鼠的QTL分析中鉴定的SS-X基因座也被鉴定为一种对盐负荷赋予抗性的基因座。在盐敏感品系中ACE2的减少和在抗性品系中其表达缺乏任何改变显示了ACE2对饮食诱导的血压改变赋予了抗性。
作图定位和减少的表达显示了ACE2是对X染色体上的高血压QTL起作用的基因。而且，在ace2基因敲除小鼠中增加的AngI和AngII表达证实了ACE2是一种RAS系统的体内调节物。然而，在我们小鼠中ACE2的丢失并不导致血压任何直接的改变，即使当ACE功能被阻断时。血压改变仅仅发生在当深度心脏机能障碍存在于年长的雄性小鼠中时。对高血压起作用的遗传因素自身不改变血压。反而，这些QTL定义了血压的单一决定因素，其与其他的遗传多态性一样促进了血压的改变。我们鉴定了人群中ACE2多态性和高血压之间的关系。重要地是，我们的数据显示了ACE2作为一种增加的血压的负调节物的功能。
ACE2和心功能的控制
出乎意料地，小鼠中ACE2的丢失导致了深度收缩性机能障碍，引起在年长的小鼠中全身血压的剧烈减少。重要地是，通过破坏ACE，该心脏机能障碍完全地逆转了，暗示在缺乏ACE2的条件下ACE的催化产物引发了收缩损伤。因为这些收缩损伤能发生在缺乏肥大或任何可检测到的血压改变的条件下，我们的数据也提供了遗传学证据，即RAS调节的心脏疾病表型能在遗传学上与其对血压和心脏肥大的作用分开。
ACE抑制剂和AngII受体阻断剂已被证实在人心力衰竭中具有一种心脏保护的作用，因此暗示了AngII与心脏疾病相关。在我们的ace/ace2双突变小鼠中心脏机能障碍的完全消失证明了RAS直接控制心功能和ACE2是一种关键的抗RAS和心力衰竭的负调节物。我们的遗传拯救实验强烈地显示，事实上是ACE的产物导致心力衰竭，即，在ace2基因敲除小鼠的心脏中看到的AngII的增加是导致心脏机能障碍的原因。AngII受体的药理学抑制作用是否拯救了ace2突变小鼠的心脏表型则需要被测定。令人感兴趣地是，我们在苍蝇中的结果显示了与ACE同系物ACER相关的P-因子突变导致了心脏形态发生的严重和致命的缺陷(数据未显示)，表明在心脏中ACE/ACE2的功能在进化中是保守的。
ace2突变心脏中的缺陷其特征为：严重的收缩性机能障碍，组织缺氧调节的基因的增量调节(在年长的小鼠中只具有轻微的重构)，没有肥大和没有肌细胞损失的证据。ace2突变小鼠中衰竭心脏的这些表型和分子参数不同于肥大和扩张性心肌病。更引起兴趣的是，ace2突变心脏类似于在人冠心病病例中和在外科分流术情况下发现的心脏抑顿和冬眠。在这些心脏抑顿/冬眠的人类疾病和动物模型中，慢性缺氧状况导致了肌细胞新陈代谢中补偿性的改变，缺氧诱导基因的增量调节，和心功能的降低。因为在血管内皮细胞中ACE2被表达，和在心肌细胞中不表达，所以很可能ACE2的作用被限制在脉管系统中。例如，AngII的局部增加能导致血管收缩，产生血流灌注不足和缺氧。通过诱导氧化应激，AngII也被证实能导致内皮机能障碍。ACE2的损失能导致缺氧诱导基因的增量调节的机制需要被测定。重要地是，我们的数据表明了ACE2多态性导致人冠心病的病理学。
实施例
在3种高血压大鼠品系中ACE2定位于X染色体上的QTL
在自然界中高血压和许多心血管疾病是多因子的且疾病发病机理受多个遗传易感性位点的影响。在不同的重组大鼠模型中，高血压的多个QTL已被鉴定。因为在人类中ACE2定位于X染色体及在一些高血压大鼠模型中QTL已定位于X染色体，并且其至今没有候选基因，所以ACE2应该是该QTL的一个候选基因。为便于大鼠ACE2的染色体定位，通过筛选大鼠肾脏cDNA文库克隆了全长的大鼠ACE2 cDNA。大鼠ACE2与人ACE2高度同源，且与人和小鼠ACE具有32％同一性和42％相似性(图1a)。类似于人ACE2，大鼠基因由带有保守的锌结合位点的单ACE结构域，信号肽和跨膜结构域构成(图1b)。类似于人，小鼠和大鼠中ACE2主要表达于肾脏和心脏中，在肺和肝脏中弱表达(图1c)。
放射杂交图谱显示了大鼠ACE2基因定位于X染色体上，与标记DXRat9，DXWox14，DXWox15和DXRat42具有显著的LOD分值，将ace2置于DXRat9和DXRat42之间(图1d)。比较图谱显示了ace2图谱位置与在Sabra盐敏感性大鼠中对高血压鉴定的QTL间隔区交迭，该间隔区发现位于标记DXMgh12和DXRat8(SS-X)之间。此外，染色体的ace2区域定位于中风易感性自发性高血压大鼠(SHRSP)中定义的BP3QTL间隔区，和通过同类系分析先前鉴定于自发性高血压大鼠(SHR)的X染色体上的高血压BB.Xs QTL(图1d)。因而，在3种独立的自发性和饮食诱导的高血压模型中，ACE2定位于大鼠X染色体上的QTL。在高血压大鼠中ACE2表达的减量调节
因为肾脏是血压调节的一个主要场所，所以测定了这3种高血压大鼠品系的肾脏中的ACE2的表达水平。最初，测量了盐敏感型Sabra高血压(SBH/y)大鼠和对照的抗盐型Sabra正常血压(SBN/y)大鼠肾脏中ACE2的mRNA水平。在血压正常的SBN/y大鼠中，盐负荷(DOCA盐)不影响ACE2 mRNA的表达。令人兴趣地，在SBH/y大鼠中，盐负荷和高血压的发展与和血压正常的SBN/y大鼠相比的ACE2mRNA表达明显减少相关(图2a)。注意的是，当与喂以常规饮食的SBN/y对照相比时，喂以常规饮食的SBH/y的ACE2 mRNA也更低。后一发现与在喂以常规饮食的SBH/y和SBN/y大鼠之间观察到的10-20mmHg血压差异是一致的。
为测量ACE2蛋白水平，产生了一种ACE2(小鼠ACE2的aa206-aa225)特异性兔抗血清，其和大鼠及人ACE2都有交叉反应(未显示)。与减少的ACE2 mRNA表达相一致，在正常饮食喂养的SBH/y动物中ACE2蛋白表达也明显地减少(图.2b)。在4周的DOCA-盐的饮食后，SBH/y大鼠血压的增加与ACE2蛋白水平的进一步减少相关(图.2b)。在抗盐型SBN/y对照大鼠中，盐负荷不引发血压增加也不改变ACE2表达(图.2b)。与他们的WKY对照相比，自发性高血压SHRSP和SHR动物肾脏中ACE2蛋白水平也明显地减少了(图.2b)。此外，在高血压SHRSP和SHR大鼠中ACE2 mRNA的水平明显地减少(未显示)。在高血压大鼠品系中ACE2编码区的克隆和测序没有显示任何序列改变，表明减少的ACE2表达很可能是由控制ACE2基因表达的多态性导致的。在3个不同的大鼠品系中图谱位置和减少的ACE2表达表明了，ace2是X染色体上的高血压QTL的强候选基因。此外，在所有3种高血压大鼠品系中减少的ACE2表达暗示了该酶行使负调节物的功能。克隆小鼠ACE2和ACE2敲除小鼠的产生
为证实ACE2作为QTL候选物的资格和为测试在心血管生理学和心血管疾病的发病机理中ACE2是否真正是一种必需的角色，克隆了小鼠ACE2基因(图.1a)。类似于大鼠和人ACE2，鼠ACE2也定位于X染色体(未显示)，含有单ACE-结构域(图.1b)，和主要表达于肾脏和心脏中(图.1c)。感兴趣地是，在小鼠中两种ACE2的同种型在所有的阳性组织中被观察到。在COS细胞中鼠ACE2过表达显示了ACE2切割AngI形成Ang1-9(未显示)，表明鼠ACE2与人ACE2具有同样的生物化学特异性。为测定ACE2的体内角色，在小鼠中ace2基因被破坏，即用新霉素抗性基因取代了外显子9，有效地删除了锌结合催化结构域(参见方法部分和图.3a)。两种在ace2基因座突变的ES细胞系被用于产生嵌合小鼠，其与C57BL/6回交以获得种系转移(germtransmission)。这两种小鼠品系显示了相同的表型。通过DNA印迹分析证实了ace2突变的转移(图.3b)。通过在RNA印迹(未显示)和蛋白质印迹分析(图.3c)中ace2 mRNA转录产物和蛋白质的缺失，证实了ace2基因的完全突变。ace2突变小鼠中，肾脏和心脏的ACEmRNA表达没有改变(图3d)。
因为ACE2基因定位于X染色体，所有的雄性后代不是完全敲除突变型(ace2-/y)就是ACE2野生型(ace2+/y)，而就ace2突变而言，雌性不是野生型(ace2+/+)、杂合子(ace2+/-)就是纯合子(ace2-/-)。应注意的是在所有下述试验中，ace2+/-雌性的表现类似于ace2+/+雌性和ace2+/y雄性，表明了ace2杂合性没有产生明显的作用。ACE2无效敲除小鼠以预期的孟德尔比率出生，看起来健康，并在所有被分析的器官中不显示任何可检测到的总的改变。此外，与ace-/-雄性小鼠(其显示了明显减少的生育力)相反，雄性和雌性ace2完全敲除小鼠都是能育的。
ace2突变小鼠的血压
先前已经证实了ace2突变小鼠显示减少的血压和肾脏病变。因此，首先测试ACE2表达的损失是否影响血压稳态和/或肾脏发育或功能。引起兴趣的是，与他们的对照同窝小鼠相比，在3个月大小的ace2-/y雄性(图.4a)或ace2-/-雌性小鼠(未显示)中ACE2的损失不导致血压的改变。由于可能是ACE能补偿ACE2的损失，我们用能阻断ACE但不阻断ACE2功能的卡托普利处理了ace2缺陷型小鼠。然而，用卡托普利体内抑制ACE减少了ace-/y雄性小鼠的血压，其减少的程度与在卡托普利处理的野生型同窝小鼠中观察到的程度相似(图.4a)。因而，即使在ACE抑制的情况下，在此定义的小鼠背景中ACE2的损失没有明显地直接影响血压稳态。基于我们的RAS QTL数据，我们将我们的突变小鼠和其他背景小鼠回交，显示了ACE2在血压控制中的角色类似于在人类中的遗传背景。
ace2突变小鼠的受损的肾功能
因为ACE2在肾脏中高表达，我们研究了肾脏形态学和功能。所有的3个月大小和6个月大小的ace2-/y雄性和ace2-/-雌性小鼠显示了正常的肾脏形态学，并且在任何的肾脏超微结构中没有明显的改变(图4b)。通过使用连续切片形态测定法也证实了正常的细胞结构和导管系统和肾小球的肾脏结构。
使用光学(PAS-染色)和电子显微镜(TEM)检测了来自3和12月大小的ace2缺陷型小鼠和年龄相一致的同窝对照小鼠的肾脏。在双盲方式(blinded manner)对每一个肾小球硬化症的严重程度从0至4+进行分级如下：0代表没有病灶、1+代表＜25％的肾小球硬化，而2+，3+，和4+分别代表25至50％，50至75％，和＞75％的肾小球硬化。在3个月大小时，在来自ace2缺陷型小鼠的肾脏中没有明显的病理变化。然而在12个月大小时，光学显微镜揭示了增加的肾小球硬化/损伤：1.45±0.2对0.25±0.06；n＝6；p＜0.01。电子显微镜显示了在肾血管系膜中增加的胶原纤维的沉积及增厚的基底膜。慢性接触提高的AngII水平引发了ace2缺陷型小鼠肾脏中的缺氧和氧化应激。蛋白质印迹分析揭示了ace2缺陷型小鼠肾脏中增加的缺氧诱导因子-1α(HIF1-α)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。脂质过氧化反应产物的测定显示了在6个月大小的ace2缺陷型小鼠中氧化应激程度的增加：己醛(1001±161对115±13nmol/g；n＝5；p＜0.01)和丙二醛(48±6.4对24.3±2.8nmol/g；n＝5；p＜0.01)。
这些结果证明了ACE2的损失导致了以组织特异性方式增强的血管紧张素II信号传导，最终在ace2缺陷型小鼠肾脏中介导了有害效应。减少的ACE2表达在肾病中扮演了一个重要的病理学角色。
ACE2的损失导致心功能严重缺陷
ACE或AngII受体的药理学抑制暗示了RAS在心功能和心脏肥大的调节中的角色。然而，ace完全敲除小鼠或血管紧张素原完全敲除小鼠都不发展明显的心脏疾病。因为ACE2在心脏血管系统的高度表达，所以分析了ace2缺陷型小鼠的心脏。ace2突变小鼠的心脏显示了左心室壁轻微变薄及增加的室维度(图5a)。在ace2缺陷型心脏中左心室前壁(AW)变薄和左心室舒张末期维度(LVEDD)的增加也可通过超声心动描记术观察(表1)。这些结构的改变主要在6个月大小的雄性小鼠中观察到。然而，在年龄匹配的3个月大小(未显示)和6个月大小的ace2-/y和ace2+/y小鼠之间心脏/身体重量比值是相当的(图5a，b)。超声心动描记术也显示了左心室质量(LVM)和LVM/身体重量比值是正常的(表1)。没有观察到扩张性心肌病的特性性结构和生物化学改变，因为没有间质性心脏纤维化的迹象(图5c，d)，在ANF，BNP，a-MHC，b-MHC，和骨骼肌肌动蛋白基因表达中也没有原型改变(未显示)。另外，ACE2无效敲除小鼠个体心肌细胞没有显示肥大的证据，并且当通过TUNEL染色检测(未显示)时我们在ACE2无效敲除小鼠中没有观察到任何心肌细胞凋亡改变的证据。因此，尽管在6个月大小的ACE2无效敲除小鼠中心脏轻微地扩张，但是没有心脏肥大或扩张性心肌病的证据。
有趣地是，通过超声心动描记术评估心功能揭示了所有的ace2-/y雄性和ace2-/-雌性小鼠(通过减少的分数缩短(FS)和减少的纤维鞘收缩速度(表1和图6a，b)来确定)显示了严重的收缩性心力衰竭。与年龄匹配的3个月大小的小鼠相比，在6个月大小的雄性和雌性小鼠中发现功能减少更剧烈，暗示了表型的进展(表1)。与减少的心脏收缩性一致的是，6个月大小的ace2-/y小鼠显示了降低的血压(图6c)，在年龄匹配的ace2-/-雌性和3个月大小的雄性中没有发现该特征，暗示了血压的降低可能是严重的心脏机能障碍所致，而不是ACE2损失对全身血压的直接效果。这些令人惊奇的结果表明ACE2是一种关键的心脏收缩的负调节物。
为确证在心功能中超声心动图缺陷，在ace2无效敲除小鼠中进行侵入性血液动力学测定。重要地是，侵入性血液动力学测定显示了在ace2突变小鼠中dP/dT-max和dP/dT-min都明显地减少(表2)，表明了心脏收缩功能的严重损伤。ACE2的损失也导致了主动脉压和心室压的明显减少，与所观察到的心脏收缩性减少是一致的(表2)。引人注目地，该数据证实了ace2突变小鼠的心脏收缩性的缺陷发生在不存在任何明显的心脏肥大的条件下，并且可以与血压改变在遗传学上分离。
在ace2无效敲除的小鼠中缺氧诱导基因的增量调节
ace2无效敲除小鼠中在不存在肥大或心脏纤维化下的严重的收缩机能障碍和轻微扩张类似于在人和动物模型中的心脏抑顿/冬眠。心脏抑顿和冬眠是对慢性缺氧如冠心病或其后的外科分流术的适应性反应。因为ACE2在血管内皮细胞中高表达，但收缩性是通过心肌细胞控制，所以推测ACE2的损失能导致心脏缺氧。因此通过RNA印迹分析了缺氧诱导基因如BNIP325和PAI-1的表达水平的变化。与他们的野生型同窝鼠相比，在所有被分析的ace2无效敲除小鼠的心脏中BNIP3和PAI-1的mRNA表达明显地被增量调节(图7a)。因此，ACE2的损失产生了缺氧调节基因表达模式的诱导。
ace2无效敲除小鼠的组织中增加的血管紧张素II水平
由于ACE2具有羧肽酶的功能，从AngI上切割下单个残基产生Ang1-9，和从AngII上切割下单个残基产生Ang1-7，因此假设ACE2通过与ACE竞争底物AngI和/或切割并失活AngII，而作为一种RAS的负调节物。如果该假设是正确的，则ACE2的损失可增加体内AngII水平。使用放射性免疫测定法，在ace2突变小鼠肾脏和心脏中确实发现AngII水平明显地增加(图7b)。此外，也观察到了AngI的增加(图7b)，这与AngI在体内是ACE2作用的底物相一致。与对照相比在ace2突变小鼠的心脏和肾脏中ACE mRNA水平没有发现有差异，表明了增加的AngII组织水平并不是由于ACE表达的增加(图3d)。这些数据表明了ACE2作为一种RAS的负调节物并控制AngII的内源性水平。
在ace2-缺陷型小鼠中除去ACE表达拯救了心力衰竭
如果ace2突变小鼠心脏中的表型是由于AngII水平的增加，那么在遗传学上除去ACE并破坏ACE2可能减少AngII水平并拯救在ACE2突变小鼠中观察到的表型。为检验这种观点，产生ace/ace2双突变小鼠。这些双突变小鼠以预期的孟德尔比率出生，并看起来健康。在该ace-ace2无效双敲除小鼠中血压(图8)和肾脏缺陷(未显示)类似于ace单突变小鼠。ace-ace2双突变小鼠的生育力没有被论述。因此，除在ace单突变小鼠中看到疾病的外，ACE和ACE2的损失也不能导致任何明显的其它疾病。
因为先前没有报道ACE敲除小鼠的心功能，因此在这些小鼠中的心脏参数首次被分析。在ace-/-小鼠中，心脏在组织学上是正常的(未显示)，在6个月年龄时没有可被检测到的心功能缺陷(图8b，c)。重要地是，ace2突变背景中ACE表达的除去完全地消除了ace2单敲除小鼠的心力衰竭表型(图8b，c)。此外，使用超声心动描记术，6个月大小的，年龄匹配的ace-ace2双突变小鼠与他们的ace单突变和野生型同窝鼠的所有心功能(表1)都是相当的。雄性和雌性ace-ace2双突变小鼠中都出现心功能的恢复。这些遗传学的数据显示了ACE表达是必需的，在不存在ACE2的情况下是引发收缩性心力衰竭必需的。重要地是，在ace和ace/ace2敲除小鼠之间血压也没有差异(图8a)，进一步暗示了在年长的雄性ace2小鼠中降低的血压是由于心功能的急剧降低。
ACE2对肺损伤的负控制
成人呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种严重的急性肺损伤，以及即使进行精心护理，仍具有40-70％的死亡率。创伤、严重的脓毒症(全身性感染)、弥漫型肺炎和休克是引发ARDS的最主要原因，在他们中酸诱导的肺损伤是最普遍的原因之一。导致酸吸入相关的肺损伤的潜在机理包括HCl诱导的对肺泡-毛细血管膜的损伤，和多形核中性粒细胞(PMN)粘附、激活和隔离，它们导致了肺水肿和气体交换的衰退。ARDS的疗法包括机械通气和沉淀性疾病或损伤的持续疗法。使用新药(保护肺免受进一步的肺泡-毛细血管膜损伤)的支持性疗法将保留ARDS病人的肺功能以便治疗该沉淀性疾病或损伤，使得ARDS的死亡率降低。
因为ACE2在肺中表达，我们评估了在急性肺损伤中ACE2的损失是否扮演某种角色。图9显示了在HCl处理和对照小鼠中3小时后肺弹性(EL)的变化。施用HCl后，野生型小鼠存活超过4个小时，而ACE2敲除小鼠在2-3小时内死亡。ACE2敲除小鼠显示了比野生型小鼠明显更严重的肺弹性响应，反映了生存率的不同。因此，ACE2在保护肺免受急性酸诱导损伤中扮演了一个重要角色。因此，增强ACE2功能和/或表达是一种用于治疗ARDS和肺病的新的和出乎意料的目标。
方法
克隆小鼠和大鼠ACE2及染色体QTL定位。鼠ACE2被克隆自一个非免费的EST数据库。使用小鼠ACE2探针，我们筛选大鼠肾脏cDNA(Invitrogen)以获得全长的大鼠cDNA，其通过DNA序列分析而确定。为进行染色体定位，大鼠ACE2 cDNA特异性探针被用于筛选大鼠PAC文库(RPCI-31，Research Genetics)，鉴定出两种阳性克隆(6M6和125K9)。测定这些克隆的末端序列并设计大鼠特异性引物(mc2L：5’-TCAATTTACTGCTGAGGGGG-3’，mc2R：5’-GAGGGATAACCCAGTGCAAA-3’)，通过筛选放射性杂交组(RH07.5，Research Genetics)以确定大鼠中ACE2的染色体图谱位置。SHR和对照WKY大鼠获得自Harlan，并根据研究所的指导方针饲养在Ontario癌症研究所动物实验室中。SHRSP大鼠组织是由德国Detlev Ganten博士友情提供的。繁殖抗盐型和盐敏感型Sabra大鼠并饲养在以色列Ben-Gurion University Barzilai Medical Center的动物实验室中。Doca-盐处理如前所述。
表达分析。使用tri-reagent制备大鼠肾脏总RNA。20毫克RNA在0.8％甲酰胺凝胶上进行分析。转印到尼龙膜(Amersham)，并用部分大鼠ACE2 cDNA克隆进行探查(9-1)。β-肌动蛋白探针和MultipleTissure Northern Blots购自Clontech。为进行蛋白质印迹分析，肾脏被匀浆于补充有“Complete”蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和1mMNa3VO4的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，20mM EDTA，和1％triton-X 100)中。通过SDS-PAGE于8％tris-甘氨酸凝胶中分析100毫克蛋白质。ACE2免疫血清获得自用小鼠特异性ACE2肽DYEAEGADGYNYNRNQLIED免疫的兔中。血清通过使用sulpho-link试剂盒(Pierce)用所述免疫肽亲和纯化。商业上可获得的β-肌动蛋白抗体被用作为上样对照(Santa Cruz)。
ACE2突变小鼠的产生。使用pKO Scrambler NTKV-1907载体(Stratagene)构建靶向载体(短臂559个碱基对，长臂8.1千个碱基对)。用新霉素抗性盒以反义方向置换含有核苷酸+1069至+1299的ace2基因组DNA部分。该靶向构建体被电穿孔入E14K ES细胞，并通过杂交有5’和3’侧翼探针的EcoRI消化的基因组DNA的DNA印迹进行阳性同源重组ES克隆的筛选。两种独立的ace-/y ES细胞株被注射到C57BL/6起源的胚泡中以产生嵌合小鼠，其与C57BL/6小鼠回交。两种ES细胞株进行独立的种系遗传。在该手稿中报道的数据在两种突变小鼠系之间是一致的。通过RT-PCR、RNA印迹和蛋白质印迹分析证实了ACE2表达的消除。只有同窝出生鼠被用于所有的试验中。所有组织的组织学、细胞凋亡分析、血清学和肾脏形态测量学按所描述的进行31。完全ACE突变小鼠已在先前被描述8，并获得自Jackson实验室。根据研究所的指导方针，小鼠饲养在Ontario Cancer Institute动物实验室中。
心脏形态测定法，超声心动描记术，血液动力学和血压测量方法。为进行心脏形态测定法，心脏用10％缓冲的福尔马林在60mmHg下灌注并随后埋入石蜡中。通过使用了减色电脑辅助图象分析定量形态测定法测定心肌间质性纤维化，其中使用了Image Processing Tool Kit2.5版和Photoshop 6.0软件。Picro-Sirius红染色切片被用于计算间质纤维化，以阳性PSR染色的面积与完整视野的比值表示。按照描述的方法32，使用野生型和突变同窝出生鼠进行超声心动描记术评估。小鼠用异氟烷/氧气进行麻醉，并通过使用装备有15MHz线性传感器的Sequoia C256的经胸壁超声心动描记术进行检查。FS被计算如下：FS＝[(EDD-ESD)/EDD]*100。Vcfc被计算为对心率经过校正的FS/射血时间。血液动力学测量描述如下。简单地说，小鼠被麻醉，右侧颈动脉被分离并插入连接到放大器(TCP-500，Millar Inc.)的1.4 French Millar导管(Millar Inc.，Houston)。在导管插入到颈动脉后，导管被推进到主动脉中并接着推进到左心室中以记录主动脉压和心室压。测量和分析的参数是心率、主动脉压、左心室(LV)收缩压、LV舒张压和LV压一次导数的最大值和最小值(分别是+dP/dtmax和dP/dtmax)。使用了Visitech Systems(Apex，NC)制造的Visitech BP-2000血压分析系统进行尾套血压测量。为进行卡托普利处理，在血压测量前饮用水被添加有400mg/L卡托普利(Sigma)达两周。
组织血管紧张素肽水平。心脏和肾脏在冰上于含有如前所述的肽酶抑制剂包括苯甲基磺酰氟(PMSF，100μM)的80％乙醇/0.1N HCl中被均浆化。蛋白匀浆在30,000g下离心20分钟，轻轻倒出上清液，并用1％(v/v)七氟丁酸(HFBA，Pierce，Rockford，IL)酸化。在Savant真空离心机(Savant，Farmingdale，NY)中该上清液被浓缩到5ml，且浓缩的抽提物被加到活化的Sep-Paks上，用0.1％HFBA洗涤，并用5ml 80％甲醇/0.1％HFBA洗脱。进行了来自心脏和肾脏组织的抽提物中血管紧张素肽内容物的放射性免疫测定分析。AngII和AngIRIAS的检测限度分别是0.5fmol/管和AngI 5fmol/管。
急性肺损伤模型。ACE2敲除小鼠和他们的同窝出生小鼠(8-12周大)被用于本研究中。在吸入刺激前1分钟，进行两口深吸气(3倍潮气体积)以使体积史标准化，并进行测量以作为基线。在麻醉和机械通气小鼠气管内注入2mL/kg HCl(pH＝1.5)，接着推注空气。在对照组中，小鼠注射生理盐水或不进行注射。在所有组中，测量以30分钟间隔进行持续3小时。为评估生理性肺损伤，通过测量气管峰值压力、流量和体积来评估肺弹性(EL；肺顺应性的倒数)。通过将气管峰值压力除以体积计算EL。EL的改变反映了肺薄壁组织的改变和肺硬化。
本发明已被详细描述并结合参考文献描述了优选的实施方案；然而，本领域普通技术人员可以理解可进行不背离本发明精神和范围的改变。例如，当本申请涉及蛋白质时，很清楚肽和多肽通常也可被使用。同样地，在描述基因时，很清楚核酸分子或基因片段通常也可被使用。
所有的出版物(包括Genbank条目)，专利和专利申请都以其整体引入作为参考，如同每一个独立的出版物，专利或专利申请被明确地和单独地指出全文引入作为参考一样。
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<212>DNA
<213>智人
<400>1
cgcccaaccc aagttcaaag gctgataaga gagaaaatct catgaggagg ttttagtcta 60
gggaaagtca ttcagtggat gtgatcttgg ctcacagggg acgatgtcaa gctcttcctg 120
gctccttctc agccttgttg ctgtaactgc tgctcagtcc accattgagg aacaggccaa 180
gacatttttg gacaagttta accacgaagc cgaagacctg ttctatcaaa gttcacttgc 240
ttcttggaat tataacacca atattactga agagaatgtc caaaacatga ataatgctgg 300
ggacaaatgg tctgcctttt taaaggaaca gtccacactt gcccaaatgt atccactaca 360
agaaattcag aatctcacag tcaagcttca gctgcaggct cttcagcaaa atgggtcttc 420
agtgctctca gaagacaaga gcaaacggtt gaacacaatt ctaaatacaa tgagcaccat 480
ctacagtact ggaaaagttt gtaacccaga taatccacaa gaatgcttat tacttgaacc 540
aggtttgaat gaaataatgg caaacagttt agactacaat gagaggctct gggcttggga 600
aagctggaga tctgaggtcg gcaagcagct gaggccatta tatgaagagt atgtggtctt 660
gaaaaatgag atggcaagag caaatcatta tgaggactat ggggattatt ggagaggaga 720
ctatgaagta aatggggtag atggctatga ctacagccgc ggccagttga ttgaagatgt 780
ggaacatacc tttgaagaga ttaaaccatt atatgaacat cttcatgcct atgtgagggc 840
aaagttgatg aatgcctatc cttcctatat cagtccaatt ggatgcctcc ctgctcattt 900
gcttggtgat atgtggggta gattttggac aaatctgtac tctttgacag ttccctttgg 960
acagaaacca aacatagatg ttactgatgc aatggtggac caggcctggg atgcacagag 1020
aatattcaag gaggccgaga agttctttgt atctgttggt cttcctaata tgactcaagg 1080
attctgggaa aattccatgc taacggaccc aggaaatgtt cagaaagcag tctgccatcc 1140
cacagcttgg gacctgggga agggcgactt caggatcctt atgtgcacaa aggtgacaat 1200
ggacgacttc ctgacagctc atcatgagat ggggcatatc cagtatgata tggcatatgc 1260
tgcacaacct tttctgctaa gaaatggagc taatgaagga ttccatgaag ctgttgggga 1320
aatcatgtca ctttctgcag ccacacctaa gcatttaaaa tccattggtc ttctgtcacc 1380
cgattttcaa gaagacaatg aaacagaaat aaacttcctg ctcaaacaag cactcacgat 1440
tgttgggact ctgccattta cttacatgtt agagaagtgg aggtggatgg tctttaaagg 1500
ggaaattccc aaagaccagt ggatgaaaaa gtggtgggag atgaagcgag agatagttgg 1560
ggtggtggaa cctgtgcccc atgatgaaac atactgtgac cccgcatctc tgttccatgt 1620
ttctaatgat tactcattca ttcgatatta cacaaggacc ctttaccaat tccagtttca 1680
agaagcactt tgtcaagcag ctaaacatga aggccctctg cacaaatgtg acatctcaaa 1740
ctctacagaa gctggacaga aactgttcaa tatgctgagg cttggaaaat cagaaccctg 1800
gaccctagca ttggaaaatg ttgtaggagc aaagaacatg aatgtaaggc cactgctcaa 1860
ctactttgag cccttattta cctggctgaa agaccagaac aagaattctt ttgtgggatg 1920
gagtaccgac tggagtccat atgcagacca aagcatcaaa gtgaggataa gcctaaaatc 1980
agctcttgga gataaagcat atgaatggaa cgacaatgaa atgtacctgt tccgatcatc 2040
tgttgcatat gctatgaggc agtacttttt aaaagtaaaa aatcagatga ttctttttgg 2100
ggaggaggat gtgcgagtgg ctaatttgaa accaagaatc tcctttaatt tctttgtcac 2160
tgcacctaaa aatgtgtctg atatcattcc tagaactgaa gttgaaaagg ccatcaggat 2220
gtcccggagc cgtatcaatg atgctttccg tctgaatgac aacagcctag agtttctggg 2280
gatacagcca acacttggac ctcctaacca gccccctgtt tccatatggc tgattgtttt 2340
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agatcggaag aagaaaaata aagcaagaag tggagaaaat ccttatgcct ccatcgatat 2460
tagcaaagga gaaaataatc caggattcca aaacactgat gatgttcaga cctcctttta 2520
gaaaaatcta tgtttttcct cttgaggtga ttttgttgta tgtaaatgtt aatttcatgg 2580
tatagaaaat ataagatgat aaagatatca ttaaatgtca aaactatgac tctgttcaga 2640
aaaaaaattg tccaaagaca acatggccaa ggagagagca tcttcattga cattgctttc 2700
agtatttatt tctgtctctg gatttgactt ctgttctgtt tcttaataag gattttgtat 2760
tagagtatat tagggaaagt gtgtatttgg tctcacaggc tgttcaggga taatctaaat 2820
gtaaatgtct gttgaatttc tgaagttgaa aacaaggata tatcattgga gcaagtgttg 2880
gatcttgtat ggaatatgga tggatcactt gtaaggacag tgcctgggaa ctggtgtagc 2940
tgcaaggatt gagaatggca tgcattagct cactttcatt taatccattg tcaaggatga 3000
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acccagtctc ttaaatcttt tgtatttgct cacagtgttt gagcagtgct gagcacaaag 3360
cagacactca ataaatgcta gatttacaca ctcaaaaaaa aaaaa 3405
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<212>PRT
<213>智人
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Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala G1n Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
20 25 30
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala
65 70 75 80
Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln
85 90 95
Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys
100 105 110
Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
115 120 125
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
130 135 140
Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
180 185 190
Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
195 200 205
Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu
210 215 220
Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu
225 230 235 240
His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys
275 280 285
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala
290 295 300
Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
305 310 315 320
Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro
325 330 335
Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
355 360 365
Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala
370 375 380
Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
385 390 395 400
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
405 410 415
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
420 425 430
Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly
435 440 445
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
450 455 460
Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
465 470 475 480
Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500 505 510
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
515 520 525
Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile
530 535 540
Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu
545 550 555 560
Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
580 585 590
Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
595 600 605
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu
610 615 620
Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met
625 630 635 640
Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu
645 650 655
Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro
675 680 685
Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile
690 695 700
Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln
725 730 735
Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val
740 745 750
Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg
755 760 765
Lys Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile
770 775 780
Asp Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp
785 790 795 800
Val Gln Thr Ser Phe
805
<210>3
<211>2739
<212>DNA
<213>Mus musculus
<400>3
catattggtc cagcagcttg tttactgttc tcttctgttt cttcttctgc tttttttttc 60
ttctcttctc agtgcccaac ccaagttcaa aggctgatga gagagaaaaa ctcatgaaga 120
gattttactc tagggaaagt tgctcagtgg atgggatctt ggcgcacggg gaaagatgtc 180
cagctcctcc tggctccttc tcagccttgt tgctgttact actgctcagt ccctcaccga 240
ggaaaatgcc aagacatttt taaacaactt taatcaggaa gctgaagacc tgtcttatca 300
aagttcactt gcttcttgga attataatac taacattact gaagaaaatg cccaaaagat 360
gagtgaggct gcagccaaat ggtctgcctt ttatgaagaa cagtctaaga ctgcccaaag 420
tttctcacta caagaaatcc agactccgat catcaagcgt caactacagg cccttcagca 480
aagtgggtct tcagcactct cagcagacaa gaacaaacag ttgaacacaa ttctgaacac 540
catgagcacc atttacagta ctggaaaagt ttgcaaccca aagaacccac aagaatgctt 600
attacttgag ccaggattgg atgaaataat ggcgacaagc acagactaca actctaggct 660
ctgggcatgg gagggctgga gggctgaggt tggcaagcag ctgaggccgt tgtatgaaga 720
gtatgtggtc ctgaaaaacg agatggcaag agcaaacaat tataacgact atggggatta 780
ttggagaggg gactatgaag cagagggagc agatggctac aactataacc gtaaccagtt 840
gattgaagat gtagaacgta ccttcgcaga gatcaagcca ttgtatgagc atcttcatgc 900
ctatgtgagg aggaagttga tggataccta cccttcctac atcagcccca ctggatgcct 960
ccctgcccat ttgcttggtg atatgtgggg tagattttgg acaaatctgt accctttgac 1020
tgttcccttt gcacagaaac caaacataga tgttactgat gcaatgatga atcagggctg 1080
ggatgcagaa aggatatttc aagaggcaga gaaattcttt gtttctgttg gccttcctca 1140
tatgactcaa ggattctggg caaactctat gctgactgag ccagcagatg gccggaaagt 1200
tgtctgccac cccacagctt gggatctggg acacggagac ttcagaatca agatgtgtac 1260
aaaggtcaca atggacaact tcttgacagc ccatcacgag atgggacaca tccaatatga 1320
catggcatat gccaggcaac ctttcctgct aagaaacgga gccaatgaag ggttccatga 1380
agctgttgga gaaatcatgt cactttctgc agctaccccc aagcatctga aatccattgg 1440
tcttctgcca tccgattttc aagaagatag cgaaacagag ataaacttcc tactgaaaca 1500
ggcattgaca attgttggaa cactaccgtt tacttacatg ttagagaagt ggaggtggat 1560
ggtctttcgg ggtgaaattc ccaaagagca gtggatgaaa aagtggtggg agatgaagcg 1620
ggagatcgtt ggtgtggtgg agcctctgcc tcatgatgaa acatactgtg accctgcatc 1680
tctgttccat gtttctaatg attactcatt cattcgatat tacacaagga ccatttacca 1740
attccagttt caagaagctc tttgtcaagc agctaagtat aatggttctc tgcacaaatg 1800
tgacatctca aattccactg aagctgggca gaagttgctc aagatgctga gtcttggaaa 1860
ttcagagccc tggaccaaag ccttggaaaa tgtggtagga gcaaggaata tggatgtaaa 1920
accactgctc aattacttcc aaccgttgtt tgactggctg aaagagcaga acagaaattc 1980
ttttgtgggg tggaacactg aatggagccc atatgccgac caaagcatta aagtgaggat 2040
aagcctaaaa tcagctcttg gagctaatgc atatgaatgg accaacaacg aaatgttcct 2100
gttccgatca tctgttgcat atgccatgag aaagtatttt tcaataatca aaaaccagac 2160
agttcctttt ctagaggaag atgtacgagt gagtgatttg aaaccaagag tctccttcta 2220
cttctttgtc acctcacccc aaaatgtgtc tgatgtcatt cctagaagtg aagttgaaga 2280
tgccatcagg atgtctcggg gccgcatcaa tgatgtcttt ggcctgaatg ataacagcct 2340
ggagtttctg gggattcacc caacacttga gccaccttac cagcctcctg tcaccatatg 2400
gctgattatt tttggtgttg tgatggcact ggtagtggtt ggcatcatca tcctgattgt 2460
cactggcatc aaaggtcgaa agaagaaaaa tgaaacaaaa agagaagaga acccttatga 2520
ctcgatggac attggaaaag gagaaagcaa tgcaggattc caaaacagtg atgatgctca 2580
gacttccttt tagcaaagca cttgtcatct tcctgtatgt aaatgctaac ttcatagtac 2640
acaaaatatg agagtataca catgtcatta gctatcaaaa ctatgatctg ttcagtaaac 2700
gttgtccaaa gagcatcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2739
<210>4
<211>805
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>4
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Thr
1 5 10 15
Ala Gln Ser Leu Thr Glu Glu Asn Ala Lys Thr Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Asn Gln Glu Ala Glu Asp Leu Ser Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Ala Gln Lys Met Ser Glu
50 55 60
Ala Ala Ala Lys Trp Ser Ala Phe Tyr Glu Glu Gln Ser Lys Thr Ala
65 70 75 80
Gln Ser Phe Ser Leu Gln Glu Ile Gln Thr Pro Ile Ile Lys Arg Gln
85 90 95
Leu Gln Ala Leu Gln Gln Ser Gly Ser Ser Ala Leu Ser Ala Asp Lys
100 105 110
Asn Lys Gln Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
115 120 125
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Lys Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
130 135 140
Glu Pro Gly Leu Asp Glu Ile Met Ala Thr Ser Thr Asp Tyr Asn Ser
145 150 155 160
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Gly Trp Arg Ala Glu Val Gly Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
180 185 190
Ala Asn Asn Tyr Asn Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
195 200 205
Ala Glu Gly Ala Asp Gly Tyr Asn Tyr Asn Arg Asn Gln Leu Ile Glu
210 215 220
Asp Val Glu Arg Thr Phe Ala Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu
225 230 235 240
His Ala Tyr Val Arg Arg Lys Leu Met Asp Thr Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
Ser Pro Thr Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Pro Leu Thr Val Pro Phe Ala Gln Lys
275 280 285
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Met Asn Gln Gly Trp Asp Ala
290 295 300
Glu Arg Ile Phe Gln Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
305 310 315 320
Pro His Met Thr Gln Gly Phe Trp Ala Asn Ser Met Leu Thr Glu Pro
325 330 335
Ala Asp Gly Arg Lys Val Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
340 345 350
His Gly Asp Phe Arg Ile Lys Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asn
355 360 365
Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala
370 375 380
Tyr Ala Arg Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
385 390 395 400
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
405 410 415
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Pro Ser Asp Phe Gln Glu Asp Ser
420 425 430
Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Le u ThrIle Val Gly
435 440 445
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
450 455 460
Arg Gly Glu Ile Pro Lys Glu Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
465 470 475 480
Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Leu Pro His Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500 505 510
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Ile Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
515 520 525
Leu Cys Gln Ala Ala Lys Tyr Asn Gly Ser Leu His Lys Cys Asp Ile
530 535 540
Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Leu Lys Met Leu Ser Leu
545 550 555 560
Gly Asn Ser Glu Pro Trp Thr Lys Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
Arg Asn Met Asp Val Lys Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Gln Pro Leu Phe
580 585 590
Asp Trp Leu Lys Glu Gln Asn Arg Asn Ser Phe Val Gly Trp Asn Thr
595 600 605
Glu Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu
610 615 620
Lys Ser Ala Leu Gly Ala Asn Ala Tyr Glu Trp Thr Asn Asn Glu Met
625 630 635 640
Phe Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Lys Tyr Phe Ser
645 650 655
Ile Ile Lys Asn Gln Thr Val Pro Phe Leu Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
Ser Asp Leu Lys Pro Arg Val Ser Phe Tyr Phe Phe Val Thr Ser Pro
675 680 685
Gln Asn Val Ser Asp Val Ile Pro Arg Ser Glu Val Glu Asp Ala Ile
690 695 700
Arg Met Ser Arg Gly Arg Ile Asn Asp Val Phe Gly Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile His Pro Thr Leu Glu Pro Pro Tyr Gln
725 730 735
Pro Pro Val Thr Ile Trp Leu Ile Ile Phe Gly Val Val Met Ala Leu
740 745 750
Val Val Val Gly Ile Ile Ile Leu Ile Val Thr Gly Ile Lys Gly Arg
755 760 765
Lys Lys Lys Asn Glu Thr Lys Arg Glu Glu Asn Pro Tyr Asp Ser Met
770 775 780
Asp Ile Gly Lys Gly Glu Ser Asn Ala Gly Phe Gln Asn Ser Asp Asp
785 790 795 800
Ala Gln Thr Ser Phe
805
<210>5
<211>73
<212>DNA
<213>智人
<400>5
ttaacttgaa gtccaaaaac atatgttctt cacctacgta accccagtcc ttgaatttgc 60
tggagctcag ttt 73
<210>6
<211>64
<212>DNA
<213>智人
<400>6
gtatctcacc atcagaaaac acaagcttgt gtctaggata ttagctaata aagtttgtaa 60
acat 64
<210>7
<211>77
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>(44)..(44)
<223>n＝c或g
<400>7
ccatgagttc tagccagact ttcttcaacc agcacctgct cccntttacc agagagcatt 60
ctcagaccac aagatcc 77
<210>8
<211>101
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>(51)..(51)
<223>n＝c或a
<400>8
acaggtttgt cttaaaactt catatcagag ttatgtgaaa actgcacatc ncactattgg 60
aatattctgg tgttatcttt gtatttaatt tctcagtggg t 101
<210>9
<211>74
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>(43)..(43)
<223>n＝c或t
<400>9
attgtgccac tgccctctag cctaggtgac agagcaagac tcngtttcaa aaaaaaaaaa 60
aaggaatata cacc 74
<210>10
<211>89
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>(55)..(55)
<223>n＝c或t
<400>10
ctttggaaac ctgttttaac caagcttttt tttccatatc tctatctgat ggacntctcc 60
acacttctac atcagcagct ttatgacac 89
<210>11
<211>89
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>(53)..(53)
<223>n＝g或a
<400>11
ctttggaaac ctgttttaac caagcttttt tttccatatc tctatctgat ggncctctcc 60
acacttctac atcagcagct ttatgacac 89
<210>12
<211>112
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>(54)..(54)
<223>n＝g或a
<400>12
aacacagcag tcacaaatga ataaatgcca accatttata catttccaca cttncaactc 60
aattttccaa tggagctgtt gatgaaccta atctaggttg caaggcatga aa 112
<210>13
<211>114
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>(57)..(57)
<223>n＝g或a
<400>13
ttcttgccaa atatgataac tttgccctta aacacagcag tcacaaatga ataaatncca 60
accatttata catttccaca cttacaactc aattttccaa tggagctgtt gatg 114
<210>14
<211>121
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>(65)..(65)
<223>n＝g或a
<400>14
gaaattcttg ccaaatatga taactttgcc cttaaacaca gcagtcacaa atgaataaat 60
accanaccat ttatacattt ccacacttac aactcaattt tccaatggag ctgttgatga 120
a 121
<210>15
<211>120
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>(61)..(61)
<223>n＝g或a
<400>15
gaaattcttg ccaaatatga taactttgcc cttaaacaca gcagtcacaa atgaataaat 60
nccaaccatt tatacatttc cacacttaca actcaatttt ccaatggagc tgttgatgaa 120
<210>16
<211>69
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>(37)..(37)
<223>n＝g或a
<400>16
atagtcacta aaatgtattg caccaggtac tatgctntat cttatatgat ggttctttat 60
gaatatctg 69
<210>17
<211>68
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(29)
<223>n＝c或t
<400>17
gtttacaaag tgttattttt catttgaang tcaagttttt cttttacact tatagataag 60
tacatttc 68
<210>18
<211>76
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<222>(41)..(41)
<223>n＝c或t
<400>18
gtgctacctc caaatgccaa taccttttat ttggaaaata ntactataga gacttggtca 60
taggacctga ttcatt 76
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>19
tcaatttact gctgaggggg 20
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>20
gagggataac ccagtgcaaa 20
<210>21
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的
<400>21
Asp Tyr Glu Ala Glu Gly Ala Asp Gly Tyr Asn Tyr Asn Arg Asn Gln
1 5 10 15
Leu Ile Glu Asp
20
<210>22
<211>732
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>22
Met Gly Gln Gly Trp Ala Thr Pro Gly Leu Pro Ser Phe Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Leu Cys Cys Gly His His Leu Leu Val Leu Ser Gln Val Ala Thr
20 25 30
Asp His Val Thr Ala Asn Gln Gly Ile Thr Asn Gln Ala Thr Thr Arg
35 40 45
Ser Gln Thr Thr Thr His Gln Ala Thr Ile Asp Gln Thr Thr Gln Ile
50 55 60
Pro Asn Leu Glu Thr Asp Glu Ala Lys Ala Asp Arg Phe Val Glu Glu
65 70 75 80
Tyr Asp Arg Thr Ala Gln Val Leu Leu Asn Glu Tyr Ala Glu Ala Asn
85 90 95
Trp Gln Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Ile Glu Gly Ser Lys Ile Leu Leu
100 105 110
Glu Lys Ser Thr Glu Val Ser Asn His Thr Leu Lys Tyr Gly Thr Arg
115 120 125
Ala Lys Thr Phe Asp Val Ser Asn Phe Gln Asn Ser Ser Ile Lys Arg
130 135 140
Ile Ile Lys Lys Leu Gln Asn Leu Asp Arg Ala Val Leu Pro Pro Lys
145 150 155 160
Glu Leu Glu Glu Tyr Asn Gln Ile Leu Leu Asp Met Glu Thr Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Asn Ile Cys Tyr Thr Asn Gly Thr Cys Met Pro Leu Glu
180 185 190
Pro Asp Leu Thr Asn Met Met Ala Thr Ser Arg Lys Tyr Glu Glu Leu
195 200 205
Leu Trp Ala Trp Lys Ser Trp Arg Asp Lys Val Gly Arg Ala Ile Leu
210 215 220
Pro Phe Phe Pro Lys Tyr Val Glu Phe Ser Asn Lys Ile Ala Lys Leu
225 230 235 240
Asn Gly Tyr Thr Asp Ala Gly Asp Ser Trp Arg Ser Leu Tyr Glu Ser
245 250 255
Asp Asn Leu Glu Gln Asp Leu Glu Lys Leu Tyr Gln Glu Leu Gln Pro
260 265 270
Leu Tyr Leu Asn Leu His Ala Tyr Val Arg Arg Ser Leu His Arg His
275 280 285
Tyr Gly Ser Glu Tyr Ile Asn Leu Asp Gly Pro Ile Pro Ala His Leu
290 295 300
Leu Gly Asn Met Trp Ala Gln Thr Trp Ser Asn Ile Tyr Asp Leu Val
305 310 315 320
Ala Pro Phe Pro Ser Ala Pro Asn Ile Asp Ala Thr Glu Ala Met Ile
325 330 335
Lys Gln Gly Trp Thr Pro Arg Arg Ile Phe Lys Glu Ala Asp Asn Phe
340 345 350
Phe Thr Ser Leu Gly Leu Leu Pro Val Pro Pro Glu Phe Trp Asn Lys
355 360 365
Ser Met Leu Glu Lys Pro Thr Asp Gly Arg Glu Val Val Cys His Pro
370 375 380
Ser Ala Trp Asp Phe Tyr Asn Gly Lys Asp Phe Arg Ile Lys Gln Cys
385 390 395 400
Thr Ser Val Asn Met Glu Asp Leu Val Ile Ala His His Glu Met Gly
405 410 415
His Ile Gln Tyr Phe Met Gln Tyr Lys Asp Leu Pro Val Thr Phe Arg
420 425 430
Glu Gly Ala Asn Pro Gly Phe His Glu Ala Ile Gly Asp Ile Met Ala
435 440 445
Leu Ser Val Ser Thr Pro Lys His Leu Tyr Ser Leu Asn Leu Leu Ser
450 455 460
Thr Glu Gly Ser Gly Tyr Glu Tyr Asp Ile Asn Phe Leu Met Lys Met
465 470 475 480
Ala Leu Asp Lys Ile Ala Phe Ile Pro Phe Ser Tyr Leu Ile Asp Gln
485 490 495
Trp Arg Trp Arg Val Phe Asp Gly Ser Ile Thr Lys Glu Asn Tyr Asn
500 505 510
Gln Glu Trp Trp Ser Leu Arg Leu Lys Tyr Gln Gly Leu Cys Pro Pro
515 520 525
Val Pro Arg Ser Gln Gly Asp Phe Asp Pro Gly Ser Lys Phe His Val
530 535 540
Pro Ala Asn Val Pro Tyr Val Arg Tyr Phe Val Ser Phe Ile Ile Gln
545 550 555 560
Phe Gln Phe His Glu Ala Leu Cys Arg Ala Ala Gly His Thr Gly Pro
565 570 575
Leu His Lys Cys Asp Ile Tyr Gln Ser Lys Glu Ala Gly Lys Leu Leu
580 585 590
Ala Asp Ala Met Lys Leu Gly Tyr Ser Lys Pro Trp Pro Glu Ala Met
595 600 605
Lys Leu Ile Thr Gly Gln Pro Asn Met Ser Ala Ser Ala Met Met Asn
610 615 620
Tyr Phe Lys Pro Leu Thr Glu Trp Leu Val Thr Glu Asn Arg Arg His
625 630 635 640
Gly Glu Thr Leu Gly Trp Pro Glu Tyr Asn Trp Ala Pro Asn Thr Ala
645 650 655
Arg Ala Glu Gly Ser Thr Ala Glu Ser Asn Arg Val Asn Phe Leu Gly
660 665 670
Leu Tyr Leu Glu Pro Gln Gln Ala Arg Val Gly Gln Trp Val Leu Leu
675 680 685
Phe Leu Gly Val Ala Leu Leu Val Ala Thr Val Gly Leu Ala His Arg
690 695 700
Leu Tyr Asn Ile Arg Asn His His Ser Leu Arg Arg Pro His Arg Gly
705 710 715 720
Pro Gln Phe Gly Ser Glu Val Glu Leu Arg His Ser
725 730
<210>23
<211>732
<212>PRT
<213>智人
<400>23
Met Gly Gln Gly Trp Ala Thr Ala Gly Leu Pro Ser Leu Leu Phe Leu
1 5 10 15
Leu Leu Cys Tyr Gly His Pro Leu Leu Val Pro Ser Gln Glu Ala Ser
20 25 30
Gln Gln Val Thr Val Thr His Gly Thr Ser Ser Gln Ala Thr Thr Ser
35 40 45
Ser Gln Thr Thr Thr His Gln Ala Thr Ala His Gln Thr Ser Ala Gln
50 55 60
Ser Pro Asn Leu Val Thr Asp Glu Ala Glu Ala Ser Lys Phe Val Glu
65 70 75 80
Glu Tyr Asp Arg Thr Ser Gln Val Val Trp Asn Glu Tyr Ala Glu Ala
85 90 95
Asn Trp Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Thr Glu Thr Ser Lys Ile Leu
100 105 110
Leu Gln Lys Asn Met Gln Ile Ala Asn His Thr Leu Lys Tyr Gly Thr
115 120 125
Gln Ala Arg Lys Phe Asp Val Asn Gln Leu Gln Asn Thr Thr Ile Lys
130 135 140
Arg Ile Ile Lys Lys Val Gln Asp Leu Glu Arg Ala Ala Leu Pro Ala
145 150 155 160
Gln Glu Leu Glu Glu Tyr Asn Lys Ile Leu Leu Asp Met Glu Thr Thr
165 170 175
Tyr Ser Val Ala Thr Val Cys His Pro Asn Gly Ser Cys Leu Gln Leu
180 185 190
Glu Pro Asp Leu Thr Asn Val Met Ala Thr Ser Arg Lys Tyr Glu Asp
195 200 205
Leu Leu Trp Ala Trp Glu Gly Trp Arg Asp Lys Ala Gly Arg Ala Ile
210 215 220
Leu Gln Phe Tyr Pro Lys Tyr Val Glu Leu Ile Asn Gln Ala Ala Arg
225 230 235 240
Leu Asn Gly Tyr Val Asp Ala Gly Asp Ser Trp Arg Ser Met Tyr Glu
245 250 255
Thr Pro Ser Leu Glu Gln Asp Leu Glu Arg Leu Phe Gln Glu Leu Gln
260 265 270
Pro Leu Tyr Leu Asn Leu His Ala Tyr Val Arg Arg Ala Leu His Arg
275 280 285
His Tyr Gly Ala Gln His Ile Asn Leu Glu Gly Pro Ile Pro Ala His
290 295 300
Leu Leu Gly Asn Met Trp Ala Gln Thr Trp Ser Asn Ile Tyr Asp Leu
305 310 315 320
Val Val Pro Phe Pro Ser Ala Pro Ser Met Asp Thr Thr Glu Ala Met
325 330 335
Leu Lys Gln Gly Trp Thr Pro Arg Arg Met Phe Lys Glu Ala Asp Asp
340 345 350
Phe Phe Thr Ser Leu Gly Leu Leu Pro Val Pro Pro Glu Phe Trp Asn
355 360 365
Lys Ser Met Leu Glu Lys Pro Thr Asp Gly Arg Glu Val Val Cys His
370 375 380
Ala Ser Ala Trp Asp Phe Tyr Asn Gly Lys Asp Phe Arg Ile Lys Gln
385 390 395 400
Cys Thr Thr Val Asn Leu Glu Asp Leu Val Val Ala His His Glu Met
405 4l0 415
Gly His Ile Gln Tyr Phe Met Gln Tyr Lys Asp Leu Pro Val Ala Leu
420 425 430
Arg Glu Gly Ala Asn Pro Gly Phe His Glu Ala Ile Gly Asp Val Leu
435 440 445
Ala Leu Ser Val Ser Thr Pro Lys His Leu His Ser Leu Asn Leu Leu
450 455 460
Ser Ser Glu Gly Gly Ser Asp Glu His Asp Ile Asn Phe Leu Met Lys
465 470 475 480
Met Ala Leu Asp Lys Ile Ala Phe Ile Pro Phe Ser Tyr Leu Val Asp
485 490 495
Gln Trp Arg Trp Arg Val Phe Asp Gly Ser Ile Thr Lys Glu Asn Tyr
500 505 510
Asn Gln Glu Trp Trp Ser Leu Arg Leu Lys Tyr Gln Gly Leu Cys Pro
515 520 525
Pro Val Pro Arg Thr Gln Gly Asp Phe Asp Pro Gly Ala Lys Phe His
530 535 540
Ile Pro Ser Ser Val Pro Tyr Ile Arg Tyr Phe Val Ser Phe Ile Ile
545 550 555 560
Gln Phe Gln Phe His Glu Ala Leu Cys Gln Ala Ala Gly His Thr Gly
565 570 575
Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Tyr Gln Ser Lys Glu Ala Gly Gln Arg
580 585 590
Leu Ala Thr Ala Met Lys Leu Gly Phe Ser Arg Pro Trp Pro Glu Ala
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Met Gln Leu Ile Thr Gly Gln Pro Asn Met Ser Ala Ser Ala Met Leu
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His Gly Glu Lys Leu Gly Trp Pro Gln Tyr Asn Trp Thr Pro Asn Ser
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Ala Arg Ser Glu Gly Pro Leu Pro Asp Ser Gly Arg Val Ser Phe Leu
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Gly Leu Asp Leu Asp Ala Gln Gln Ala Arg Val Gly Gln Trp Leu Leu
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Leu Phe Leu Gly Ile Ala Leu Leu Val Ala Thr Leu Gly Leu Ser Gln
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Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Ala Gln Lys Met Asn Glu
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785 790 795 800
Ala Gln Thr Ser Phe
805
Claims (66)
1.一种治疗ACE2减少状态的方法，包含给具有该状态的哺乳动物施用治疗有效量的ACE2激动剂。
2.根据权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。
3.权利要求1或2的方法，其中减少的ACE2状态与选自高血压、充血性心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、心肌梗塞、动脉粥样硬化和肾衰竭及肺疾病的病症相关。
4.一种ACE2减少状态的基因治疗方法，包含递送有效量的转基因编码区到器官。
5.根据权利要求4的方法，其中受影响的器官是心脏或肾脏或肺或血管。
6.权利要求4或5的方法，其中ACE2转基因以基因治疗载体的形式被施用于患者。
7.权利要求6的方法，其中基因治疗载体包含病毒载体。
8.权利要求4-7任一项的方法，其中患者是人。
9.权利要求4-8任一项的方法，其中ACE2减少状态与选自高血压、充血性心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、心肌梗塞、动脉粥样硬化和肾衰竭及肺疾病的病症相关。
10.一种包含ACE2基因的非人哺乳动物，其中该基因的一个等位基因已经被破坏。
11.一种包含编码ACE2的基因的非人哺乳动物，其中该基因的两个等位基因都已经被破坏。
12.一种包含破坏型ACE2突变的非人哺乳动物，其中破坏导致编码ACE2的基因的无效突变。
13.权利要求10到12任一项的非人哺乳动物，其是啮齿类动物。
14.权利要求13的非人哺乳动物，其是小鼠。
15.权利要求10到14的非人哺乳动物，其特征在于高血压或心收缩缺陷或肾缺陷或对肺损伤增加的敏感性。
16.一种包含ACE2敲除构建体的核酸。
17.一种包含权利要求16的核酸的载体。
18.一种包含权利要求17的核酸的鼠胚胎干细胞系。
19.一种筛选调节高血压、心脏收缩及肾衰竭和肺损伤的化合物的方法，包含将化合物引入权利要求11到14任一项的非人哺乳动物中，并测定血压和/或心脏收缩和/或肾功能和/或肺感染的增加或减少。
20.一种筛选是ACE2活性的激动剂的化合物的方法，包含：
a.提供：i)包含ACE2的纯化的制剂，ii)底物，和iii)测试化合物；
b.在所述ACE2能作用于所述底物以产生产物的条件下混合所述ACE2和所述底物，其中所述混合在存在和不存在所述测试化合物的条件下进行；和
c.直接或间接测量在存在或不存在所述测试化合物的条件下产生的所述产物的量。
21.权利要求20的方法，其中所述底物是血管紧张素I或血管紧张素II。
22.权利要求20的方法，其中所述产物包含Ang1-9或Ang1-7。
23.根据权利要求20到22分离的化合物。
24.ACE2激活剂的作为药物的应用。
25.ACE2激动剂用于治疗心血管疾病或肾脏疾病或肺疾病的应用。
26.ACE2激动剂用于制备治疗心血管疾病或肾脏疾病或肺疾病的药物的应用。
27.哺乳动物中心血管疾病或肾脏疾病或肺疾病的医学治疗方法，包含对需要治疗的哺乳动物施用有效量的ACE2激动剂。
28.权利要求27的方法，其中ACE2激动剂与ACE抑制剂共同施用。
29.一种分离的编码ACE2多肽的核酸分子，所述核酸分子包含ACE2核酸编码区上游或下游的核苷酸多态性，其中相对于野生型ACE2，所述多态性减少了ACE2的表达量。
30.根据权利要求1的分离的核酸分子，其中所述多态性选自ACE2a-ACE2m中的至少一个。
31.一种检测动物中ACE2减少状态的方法，包括从所述动物获得DNA样本和在所述DNA样本中鉴定权利要求29或30的核酸。
32.一种在动物中用于诊断ACE2减少状态为特征的疾病或疾病倾向的方法，包括在来自所述动物的DNA样本中鉴定权利要求29或30的核酸。
33.根据权利要求31或32的方法，包括测定所述动物对于所述核苷酸多态性是纯合还或杂合的。
34.权利要求31到33任一项的方法，其中所述ACE2减少状态与选自高血压、充血性心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、心肌梗塞、动脉粥样硬化和肾衰竭的心血管疾病或肾脏疾病或肺疾病相关。
35.一种多核苷酸，包含特异性结合(i)ACE2核酸编码区的上游或下游区域的序列，其中所述区域紧接减少ACE2表达的核苷酸多态性。
36.权利要求35的多核苷酸，包含8至10，8至15，8至20，8至25，25，25至50，50至75，50至100，100至200，200至500或500至1000个核苷酸。
37.权利要求35或36的多核苷酸，其中所述核酸在高度严紧杂交条件下特异性结合紧接ACE2a-ACE2m之一的。
38.权利要求37的多核苷酸，其中所述严紧杂交条件包含0.1XSSC，0.1％ SDS，在65℃。
39.权利要求35的多核苷酸，包含与ACE2多态性互补的序列。
40.权利要求39的多核苷酸，包含选自下面的序列：
a.紧接核苷酸多态性的ACE2上游或下游区域的8-50个核苷酸，其中所述序列包括ACE2a-ACE2m之一并包含图11中所示序列之一的全部或部分
b.与(a)中所述的序列互补的序列；和
c.与(a)或(b)中的序列具有至少70％序列一致性的序列，其中所述具有一致性的序列在高度严紧杂交条件下能和ACE2杂交。
41.权利要求35的多核苷酸，其中所述核酸在杂交检测法中能作为探针。
42.权利要求41的多核苷酸，其中所述核酸序列被可检测地标记。
43.权利要求42的多核苷酸，其中所述可检测的标记包括：
a.荧光染料；和/或
b.生物素化修饰；和/或
c.放射性标记。
44.一种ACE2基因分型试剂盒，包含用于检测来自动物的核酸样本中的ACE2多态性存在的检测试剂。
45.权利要求44的试剂盒，其中所述检测试剂包含核酸和/或限制性内切酶。
46.权利要求44的试剂盒，进一步包含用于容纳所述检测试剂的生物样品容器。
47.权利要求44的试剂盒，进一步包含具有多孔的平板，该平板上结合有探针，所述探针具有特异性结合包括ACE2多态性的ACE2序列的核酸序列。
48.权利要求44的试剂盒，进一步包含用于扩增所述核酸的扩增试剂。
49.权利要求48的试剂盒，其中所述扩增试剂扩增紧接选自ACE2a-ACE2m的ACE2单核苷酸多态性的ACE2核苷酸区域。
50.权利要求48的试剂盒，其中所述扩增试剂包含引物组，其中每一引物是特异性结合紧接ACE2a-ACE2m之一的位置的核酸，和/或使延伸穿过ACE2a-ACE2m之一的核酸。
51.权利要求144的试剂盒，用于检测动物患有或处于ACE2减少状态的疾病的风险中。
52.权利要求51的试剂盒，其中所述疾病包括心血管疾病或肾脏疾病或肺疾病或影响血管。
53.权利要求52的试剂盒，其中所述疾病选自高血压，充血性和扩张性慢性心力衰竭，急性心力衰竭，心肌梗塞，冠心病，动脉粥样硬化，和肾衰竭及肺疾病。
54.一种对动物进行ACE2基因分型的方法，包括：
a.获得来自所述动物的ACE2核酸样本，该ACE2核酸样本包含ACE2编码区的上游和下游区域；和
b.检测包含ACE2单核苷酸多态性的ACE2核酸的区域。
55.权利要求54的方法，其中所述核苷酸多态性选择ACE2a-ACE2m。
56.权利要求55的方法，包括确定所述动物对于ACE2多态性是纯合的还或杂合的。
57.权利要求56的方法，其中所述动物是人，并且所述ACE2基因型被用于确定所述动物是否患有ACE2减少状态的疾病或处于ACE2减少状态的疾病的风险中。
58.权利要求57的方法，其中所述疾病包含心血管疾病或肾脏疾病或肺疾病或影响血管。
59.权利要求54的方法，其中通过扩增来自动物的核酸来获得所述核酸。
60.权利要求59的方法，其中通过用权利要求7到15任一项的多核苷酸的全部或部分进行扩增来获得所述核酸。
61.权利要求54的方法，其中所述检测步骤包括确定ACE2核酸的核苷酸序列。
62.权利要求54的方法，其中所述检测步骤包括在高度严紧条件下使所述核酸和权利要求7到15任一项的多核苷酸接触。
63.权利要求62的方法，其中所述多核苷酸选择地与紧接(i)包含不同于ACE2多态性的单多态性的ACE2核酸区域的位置选择性杂交。
64.权利要求54的方法，其中所述检测步骤包括：
a.进行所述核酸的限制性内切酶消化，从而提供核酸消化物；和
b.将消化物与所述多核苷酸接触。
65.权利要求64的方法，其中杂交发生在PCR扩增中或之后，并且通过“实时”PCR分析或荧光测定分析进行所述分析。
66.权利要求64的方法，其中所述检测步骤包括核酸的大小分析。
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