JP2007300845A - 心肥大ならびに拡張型心筋症非ヒトモデル動物 - Google Patents
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Abstract
【課題】人工的に作製可能な心疾患モデル非ヒト動物（特に心肥大ならびに拡張型心筋症モデル非ヒト動物）、該モデル動物を用いた心疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法、心疾患治療薬を特定する試験方法等を提供すること。
【解決手段】一部アミノ酸に変異を持つ、二重特異性ホスファターゼをコードするＤＮＡ（ＤＵＳＰ１３遺伝子、変異型ＤＵＳＰ１３遺伝子、ＤＵＳＰ２６遺伝子、又は変異型ＤＵＳＰ２６遺伝子）を体細胞染色体中に保有する心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物。および、それを用いた薬剤の評価法。
【選択図】図２
【解決手段】一部アミノ酸に変異を持つ、二重特異性ホスファターゼをコードするＤＮＡ（ＤＵＳＰ１３遺伝子、変異型ＤＵＳＰ１３遺伝子、ＤＵＳＰ２６遺伝子、又は変異型ＤＵＳＰ２６遺伝子）を体細胞染色体中に保有する心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物。および、それを用いた薬剤の評価法。
【選択図】図２
Description
本発明は、心疾患（特に心肥大ならびに拡張型心筋症）のモデル非ヒト動物や、該モデル非ヒト動物を用いた心疾患（特に心肥大ならびに拡張型心筋症）の予防・治療剤のスクリーニング方法や、心疾患（特に心肥大ならびに拡張型心筋症）治療薬を特定する試験方法に関する。
心筋細胞は、胎生期に急速に分裂増殖を行い、生後その分裂能を失うことが知られている。実際には、最近、心筋梗塞後の心臓において、分裂増殖する心筋細胞が数％存在することが認められたが（非特許文献１）、出生後の心筋層の正常な増殖、ならびにストレスによって誘導される心筋の再構築は、細胞分裂を伴わない肥厚性増殖、すなわち筋原線維の幅の増加、あるいは筋原線維の長さの増加を通して行われる（非特許文献２）。結果として、筋原線維の幅の増加は、心筋壁の肥厚化である求心性心肥大を生じ、筋原線維の長さの増加は、心室の拡張を伴う遠心性心肥大を生じ、対照的な心肥大の形態を呈する。
心肥大が、正常な生理的増殖または運動によって誘導される場合、上記の求心性心肥大及び遠心性心肥大は同時にかつ均衡をもって起こり、要求量の増加に応答して心拍出能力を増加させることを可能にする。一方、心筋障害や、圧負荷あるいは容量負荷等の機械的負荷を生じる疾患も心肥大を惹起し得るが、この場合、基礎疾患に応じて、求心性心肥大または遠心性心肥大のいずれかが優位となる。例えば、求心性心肥大は、高血圧、弁閉鎖不全に伴った逆流などの圧負荷が原因となり、一方、遠心性心肥大は、体液量増加やシャント流量増加による容量負荷が原因となって引き起こされる。
心筋症は、現在、原因が解明されつつある特発性心筋症、及び特定の疾患に伴って生じる特定心筋症に分類される。特発性心筋症は、「心機能障害を伴う心筋疾患」と定義され、臨床病態的に、さらに拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、不整脈原性右室心筋症の４型に分類（非特許文献３）されるが、このうち、拡張型心筋症は、心筋収縮不全と左室内腔の拡張を特徴とする進行性、予後不良の症候群である。現在のところ、拡張型心筋症の発症原因の詳細は不明であるが、ウイルス性心筋炎、遺伝性素因、免疫異常などの関与が考えられており、特に遺伝子異常としては、心筋ミトコンドリアＤＮＡ、心筋βミオシン重鎖遺伝子、ジストロフィン遺伝子等の異常によって拡張型心筋症の病態を示すことが知られている（非特許文献４）。
心肥大は、心臓への慢性的過剰負荷の増大に対する代償機序として生じ、ある程度まではそれらに対する適応を可能とするが、過剰な負荷が持続的に加わり著しい肥大を生じた時には、やがて心室の拡張障害や収縮障害等の心機能の低下や心不全を引き起こし生命の危険を伴うことが少なくない。また、心肥大は、それ自体が虚血性心疾患、不整脈や慢性心不全の独立した危険因子であり、これらの疾患の発病率が２．５〜３倍に上昇することが明らかとなっている（非特許文献５）。心肥大に対する治療としては、ＡＣＥ阻害剤（非特許文献６）及び長時間作用型Ｃａ拮抗薬（非特許文献７）において、左室肥大の退縮効果を有することが明らかになっているが、現在のところ、その効果は未だ十分なものとは言えず、さらなる作用機序に基づき心肥大を抑制する必要がある。それ故、心肥大の発生機序を明らかにし、過度の心肥大の形成を抑制、あるいは退縮させる薬剤は、慢性心不全を含む心臓病の発症進展の予防に有用であると考えられる。
拡張型心筋症は、心室の心収縮力低下による心拍出量低下あるいは拡張した心腔内に生じた血栓のため、しばしばうっ血性心不全や血栓塞栓症を生じ、また突然死の原因となる不整脈を高率に合併する。治療としては、心不全に対する対症療法が主体であり、利尿薬、強心薬、ＡＣＥ阻害薬、β遮断薬等の薬物療法を行い、これらが有効でない場合には、心筋部分切除術（バチスタ手術）、補助人工手術、あるいは心臓移植などの外科的治療の適応となる場合がある。また、これまで、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いて、サルコグリカンを生体に発現させ心機能の改善を図る（特許文献１、特許文献２）、あるいはＮＦ-κＢ阻害剤（特許文献３、特許文献４）、肝実質細胞増殖因子（特許文献５、特許文献６）、線維芽細胞増殖因子またはその遺伝子（特許文献７）を拡張型心筋症治療薬の有効成分として投与する方法が報告されている。しかしながら、現状においては、拡張型心筋症は多くの場合進行性で、重篤なうっ血性心不全及び治療抵抗性の不整脈を起こす予後不良の疾患であり、５年生存率は国内外を通じて約５０％である。それ故、その原因解明及び有効な治療法の確立が急務と考えられている。
本発明は、上述したような事情を鑑みてなされたものであり、人工的に作製可能な心疾患モデル非ヒト動物（特に心肥大ならびに拡張型心筋症モデル非ヒト動物）や、該心疾患モデル非ヒト動物を用いた心疾患（特に心肥大ならびに拡張型心筋症）の予防・治療剤のスクリーニング方法や、心疾患（特に心肥大ならびに拡張型心筋症）治療薬を特定する試験方法等を提供することを課題とする。
本発明者らは、これまでにヒトＤＵＳＰ１３タンパクをコードするヒトＤＵＳＰ１３遺伝子（配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子）、ヒトＤＵＳＰ２６タンパクをコードするヒトＤＵＳＰ２６遺伝子（配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子）、ヒトＤＵＳＰ１３タンパクの優性阻害酵素をコードする変異型ＤＵＳＰ１３遺伝子（ＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓ：配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードする遺伝子）、及びヒトＤＵＳＰ２６タンパクの優性阻害酵素をコードする変異型ＤＵＳＰ２６遺伝子（ＤＵＳＰ２６ Ｃ１５２Ｓ：配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードする遺伝子）のクローニングを行うと共に、その発現解析を行ってきた（特願２００６−１１２５２４）。また、それらの遺伝子をラットの心筋細胞Ｈ９ｃ２に導入し、その心筋細胞の分化を、筋分化指標となるＭｙＨＣ(Myosin Heavy Chain)、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔの発現により調べたところ、ヒトＤＵＳＰ１３タンパクは、ラットの心筋細胞Ｈ９ｃ２においてその分化を抑制することが示唆され、ヒトＤＵＳＰ１３ Ｃ１３８Ｓタンパク、ヒトＤＵＳＰ２６タンパクはその分化を促進することが示唆された。そこで、本発明者らはヒトＤＵＳＰ１３遺伝子をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに導入し、ヒトＤＵＳＰ１３タンパクを過剰発現させたトランスジェニックマウスを作製したところ、心肥大ならびに拡張型心筋症発症モデルマウスが得られた。ラットの心筋細胞の分化を抑制するタンパクをコードするヒトＤＵＳＰ１３タンパクを過剰発現させることにより、心肥大ならびに拡張型心筋症のモデルマウスが得られることは、予想外のことであった。
すなわち本発明は、
（１）以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを体細胞染色体中に保有する心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；や、
（２）ＤＮＡがヒト由来である上記（１）に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物や、
（３）以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを体細胞染色体中に保有する心疾患モデル非ヒト哺乳動物
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；や、
（４）ＤＮＡがヒト由来である上記（３）に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物や、
（５）以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを体細胞染色体中に保有する心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；や、
（６）ＤＮＡがヒト由来である上記（５）に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物や、
（７）以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを体細胞染色体中に保有する心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；や、
（８）ＤＮＡがヒト由来である上記（７）に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物や、
（９）非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサルからなる群から選ばれるいずれかの非ヒト哺乳動物である上記（１）〜（８）のいずれかに記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物や、
(１０)心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物が、心肥大のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物である上記（１）〜（９）のいずれかに記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物や、
(１１)心肥大のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物が、遠心性心肥大のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物である上記（１０）に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物や、
(１２)遠心性心肥大のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物が、拡張型心筋症のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物である上記（１１）に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に関する。
（１）以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを体細胞染色体中に保有する心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；や、
（２）ＤＮＡがヒト由来である上記（１）に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物や、
（３）以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを体細胞染色体中に保有する心疾患モデル非ヒト哺乳動物
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；や、
（４）ＤＮＡがヒト由来である上記（３）に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物や、
（５）以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを体細胞染色体中に保有する心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；や、
（６）ＤＮＡがヒト由来である上記（５）に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物や、
（７）以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを体細胞染色体中に保有する心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；や、
（８）ＤＮＡがヒト由来である上記（７）に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物や、
（９）非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサルからなる群から選ばれるいずれかの非ヒト哺乳動物である上記（１）〜（８）のいずれかに記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物や、
(１０)心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物が、心肥大のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物である上記（１）〜（９）のいずれかに記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物や、
(１１)心肥大のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物が、遠心性心肥大のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物である上記（１０）に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物や、
(１２)遠心性心肥大のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物が、拡張型心筋症のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物である上記（１１）に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に関する。
また本発明は、
(１３)以下の（ｑ）及び（ｒ）の工程を含む、心疾患の予防又は治療効果を有する物質の薬理評価方法
（ｑ）上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与して薬理効果を評価する工程；
（ｒ）該トランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、該被検物質が該トランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に与えた薬理効果を評価する工程；や、
(１４)心疾患が、心肥大である上記（１３）に記載の心疾患の予防又は治療効果を有する物質の薬理評価方法や、
（１５）心肥大が、遠心性心肥大である上記（１４）に記載の心疾患の予防又は治療効果を有する物質の薬理評価方法や、
（１６）遠心性心肥大が、拡張型心筋症である上記（１５）に記載の心疾患の予防又は治療効果を有する物質の薬理評価方法に関する。
(１３)以下の（ｑ）及び（ｒ）の工程を含む、心疾患の予防又は治療効果を有する物質の薬理評価方法
（ｑ）上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与して薬理効果を評価する工程；
（ｒ）該トランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、該被検物質が該トランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に与えた薬理効果を評価する工程；や、
(１４)心疾患が、心肥大である上記（１３）に記載の心疾患の予防又は治療効果を有する物質の薬理評価方法や、
（１５）心肥大が、遠心性心肥大である上記（１４）に記載の心疾患の予防又は治療効果を有する物質の薬理評価方法や、
（１６）遠心性心肥大が、拡張型心筋症である上記（１５）に記載の心疾患の予防又は治療効果を有する物質の薬理評価方法に関する。
本発明の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物の利用により、心疾患（特に心肥大ならびに拡張型心筋症）の発症の分子レベルでの解析が可能となる。また、本発明の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物の利用により、心疾患（特に心肥大ならびに拡張型心筋症）の予防又は治療効果を有する物質の薬理評価が可能となる。さらに、本発明の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物は、心肥大ならびに拡張型心筋症の新たな発症機序の解明等の用途にも好適に用いることができる。
本発明のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物は、特定のＤＮＡ（ＤＵＳＰ１３遺伝子、ＤＵＳＰ２６遺伝子、変異型ＤＵＳＰ１３遺伝子又は変異型ＤＵＳＰ２６遺伝子）（以下、「本発明におけるＤＮＡ」という。）を体細胞染色体中に保有する心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物である。心疾患としては、特に制限されないが、求心性心肥大や遠心性心肥大等の心肥大を例示することができる。
求心性心肥大は、心臓の壁が厚くなるのが特徴であり、例えば高血圧のように心臓から血液が送り出される際に負荷があると生じることがある。求心性心肥大を生じる典型が、「肥大型心筋症」である。一方、遠心性心肥大は、心室内腔が拡張し、心臓全体が大きくなるのが特徴である。遠心性心肥大は、心筋炎のような心臓全体の炎症の後などに生じることがある。遠心性心肥大を生じる典型が、「拡張型心筋症」である。拡張型心筋症は、心室内腔の拡張に加えて、心筋収縮不全が臨床的に認められた場合に診断される。また、求心性心肥大と遠心性心肥大は、互いに排他的ではなく、求心性心肥大と遠心性心肥大を両方生じることもある。
本発明のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物は、求心性心肥大及び遠心性心肥大の少なくとも一方を発症することが好ましいが、その両方を発症していてもよい。また、遠心性心肥大としては特に制限されないが、拡張型心筋症が好ましく、求心性心肥大としては特に制限されないが、肥大型心筋症が好ましい。
求心性心肥大は、心臓の壁が厚くなるのが特徴であり、例えば高血圧のように心臓から血液が送り出される際に負荷があると生じることがある。求心性心肥大を生じる典型が、「肥大型心筋症」である。一方、遠心性心肥大は、心室内腔が拡張し、心臓全体が大きくなるのが特徴である。遠心性心肥大は、心筋炎のような心臓全体の炎症の後などに生じることがある。遠心性心肥大を生じる典型が、「拡張型心筋症」である。拡張型心筋症は、心室内腔の拡張に加えて、心筋収縮不全が臨床的に認められた場合に診断される。また、求心性心肥大と遠心性心肥大は、互いに排他的ではなく、求心性心肥大と遠心性心肥大を両方生じることもある。
本発明のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物は、求心性心肥大及び遠心性心肥大の少なくとも一方を発症することが好ましいが、その両方を発症していてもよい。また、遠心性心肥大としては特に制限されないが、拡張型心筋症が好ましく、求心性心肥大としては特に制限されないが、肥大型心筋症が好ましい。
非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサル等を例示することができるが、実験動物としての汎用性や利便性を考慮してマウス、ラットであることが好ましく、マウスであることが特に好ましい。
本発明におけるＤＮＡとしては、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサル等の哺乳動物のＤＵＳＰ１３遺伝子やＤＵＳＰ２６遺伝子、及びそれらに由来する遺伝子をコードするＤＮＡ等を例示することができるが、ヒトＤＵＳＰ１３遺伝子やヒトＤＵＳＰ２６遺伝子、及びそれらに由来する遺伝子をコードするＤＮＡであることが好ましい。例えばヒトＤＵＳＰ１３遺伝子は、GenBank accession No. AB103375として、ヒトＤＵＳＰ２６遺伝子は、GenBank accession No. AB103376として既に登録されている。なお、ヒトＤＵＳＰ１３遺伝子の塩基配列は、配列番号１の塩基番号７８〜６７４に示されており、ヒトＤＵＳＰ１３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。また、ヒトＤＵＳＰ２６遺伝子の塩基配列は、配列番号３の塩基番号３３４〜９６９に示されており、ヒトＤＵＳＰ２６タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４に示されている。
本発明におけるＤＮＡとしては、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサル等の哺乳動物のＤＵＳＰ１３遺伝子やＤＵＳＰ２６遺伝子、及びそれらに由来する遺伝子をコードするＤＮＡ等を例示することができるが、ヒトＤＵＳＰ１３遺伝子やヒトＤＵＳＰ２６遺伝子、及びそれらに由来する遺伝子をコードするＤＮＡであることが好ましい。例えばヒトＤＵＳＰ１３遺伝子は、GenBank accession No. AB103375として、ヒトＤＵＳＰ２６遺伝子は、GenBank accession No. AB103376として既に登録されている。なお、ヒトＤＵＳＰ１３遺伝子の塩基配列は、配列番号１の塩基番号７８〜６７４に示されており、ヒトＤＵＳＰ１３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。また、ヒトＤＵＳＰ２６遺伝子の塩基配列は、配列番号３の塩基番号３３４〜９６９に示されており、ヒトＤＵＳＰ２６タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４に示されている。
本発明におけるＤＮＡ（ＤＵＳＰ１３遺伝子）は、以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなる。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
本発明におけるＤＮＡ（ＤＵＳＰ２６遺伝子）は、以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなる。
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
本発明におけるＤＮＡ（変異型ＤＵＳＰ１３遺伝子）は、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列からなる。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
本発明におけるＤＮＡ（変異型ＤＵＳＰ２６遺伝子）は、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列からなる。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列；
ここで、「二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質」とは、リン酸化チロシンを脱リン酸化できるチロシンフォスファターゼにおいて、さらにリン酸化セリンあるいはリン酸化スレオニンを脱リン酸化する活性を有するタンパク質を意味する。あるタンパクが二重特異性ホスファターゼ活性を有するかどうかは、リン酸化されたＥＲＫやリン酸化されたＭＥＫ等の、リン酸化された適当な基質に適当な溶媒中でそのタンパクを作用させた場合に、リン酸化チロシンに加えて、リン酸化セリンあるいはリン酸化スレオニンが脱リン酸化されるかどうかを調べることによって容易に確認することができる。
ここで、「二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質」とは、例えば、二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質（以下、「タンパク質Ａ」という）を、本発明の二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質（以下、「タンパク質Ｂ」という）と同じモル濃度で共存させた場合のタンパク質Ｂの脱リン酸化活性が、タンパク質Ａを共存させなかった場合のタンパク質Ｂの脱リン酸化活性と比較して、９０％以下、好ましくは７０％以下、より好ましくは５０％以下、さらに好ましくは３０％以下となるようなタンパク質Ａをいう。ここで、脱リン酸化活性を測定する際に用いる基質としては、公知のいずれか一つの基質でよく、例えばＥＲＫ２を例示することができる。
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
例えば、これら１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１や３に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
また、同様の方法を用いて、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡや、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを取得でき、さらにこれらのＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
また、同様の方法を用いて、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡや、配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを取得でき、さらにこれらのＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.（以後 "モレキュラークローニング第２版"と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、プローブとして使用する塩基配列（ポリヌクレオチド）の塩基配列と一定以上の相同性を有する塩基配列を挙げることができ、例えば、プローブとして使用する塩基配列に対して６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する塩基配列を好適に例示することができる。
本発明におけるＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１や３に示される塩基配列情報又は配列番号２や４に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
具体的には、本発明におけるＤＮＡが単離されたヒト等より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明におけるＤＮＡに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明におけるＤＮＡを取得することができる。上記ｃＤＮＡの起源としては、ヒト由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明におけるＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
また、例えば、ＤＵＳＰ１３遺伝子に関する、前記（Ａ）〜（Ｃ）、（Ｅ）〜（Ｆ）のいずれかに示される塩基配列からなる本発明の変異ＤＮＡ又は相同ＤＮＡとしては、配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の生物体等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
本発明におけるタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って本発明におけるタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明におけるタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明におけるタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明におけるタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明におけるタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明におけるタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。
さらに、配列番号２や４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２や４に示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２や４に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号１や３に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１や３に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡをプローブとしてヒト以外の生物より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
本発明のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物は、公知のトランスジェニック動物の作出方法（例えば、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 77:7380-7384,1980）を用いて作出することができる。より具体的には、上述の本発明におけるＤＮＡを、例えば、非ヒト哺乳動物細胞内で機能するプロモーター等の制御配列を有する非ヒト哺乳動物発現ベクターに導入し、この遺伝子発現ベクターをリニアライズした、導入遺伝子を含む直鎖ＤＮＡフラグメントを、マウス等の非ヒト哺乳動物由来の分化全能性細胞に導入し、導入後仮親に移植する。移植した分化全能性細胞から個体を発生させ、その個体の組織から抽出したＤＮＡを用いたＰＣＲ法等により、本発明におけるＤＮＡが体細胞染色体中に組み込まれた個体を選別することによって、本発明のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物を作出することができる。ＤＮＡフラグメントの分化全能性細胞への導入としては、マイクロインジェクション法を好ましく例示することができる。
トランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物を作製するために用いる分化全能性細胞としては、受精卵、初期胚の他、多分化能を有するＥＳ細胞等の培養細胞を例示することができる。
動物細胞用の発現ベクターとして、例えば、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１（クローンテック社製）、ｐＧＢＴ−９(クローンテック社製)、ｐｃＤＮＡＩ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３.１（インビトロジェン社製）、ｐＥＦ-ＢＯＳ (Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990)、ｐＡＧＥ１０７（Cytotechnology, 3, 133, 1990）、ｐＣＤＭ８（Nature, 329, 840, 1987）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３（J.Blochem., 101, 1307, 1987）、ｐＡＧＥ２１０等を例示することができる。動物細胞用のプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（immediate early）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。
上述の導入ＤＮＡの存在が確認された個体を交配することにより、本発明におけるＤＮＡを染色体の一部に安定的に発現可能に組み込んだトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物を効率よく作出することができる。例えば、導入ＤＮＡの存在が確認された個体を野生型の個体と交配させると、本発明におけるＤＮＡをヘテロに有するトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物を得ることができる。また、導入ＤＮＡの存在が確認された個体同士を交配させると、本発明におけるＤＮＡをホモに有するトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物を得ることができる。
本発明におけるＤＮＡ（ＤＵＳＰ１３遺伝子）を体細胞染色体中に保有するトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物（以下、「ＤＵＳＰ１３トランスジェニックモデル動物」という）は、心肥大及び拡張型心筋症を発症する。また、本発明者らの出願である特願２００６−１１２５２４に記載されているように、ＤＵＳＰ２６、変異型ＤＵＳＰ１３、変異型ＤＵＳＰ２６は、ＤＵＳＰ１３と同様に、心筋細胞の分化の制御に関与することが示唆されている。したがって、本発明におけるＤＮＡ（ＤＵＳＰ２６遺伝子）を体細胞染色体中に保有するトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物（以下、「ＤＵＳＰ２６トランスジェニックモデル動物」という）や、ＤＮＡ（変異型ＤＵＳＰ１３遺伝子）を体細胞染色体中に保有するトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物（以下、「変異型ＤＵＳＰ１３トランスジェニックモデル動物」という）や、ＤＮＡ（変異型ＤＵＳＰ２６遺伝子）を体細胞染色体中に保有するトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物（以下、「変異型ＤＵＳＰ２６トランスジェニックモデル動物」という）も、ＤＵＳＰ１３トランスジェニックモデル動物と同様に、何らかの心肥大を生じるものと考えられる。より詳細に言えば、ＤＵＳＰ１３トランスジェニックモデル動物と同様の心拡大を伴う遠心性心肥大を生じるか、あるいはＤＵＳＰ１３トランスジェニックモデル動物とは若干異なり、心筋壁の肥厚化である求心性肥大等の心肥大を生じるものと考えられる。
得られたトランスジェニックモデル動物が心肥大を生じているかどうかは、トランスジェニックモデル動物の作製に用いた動物と同種の動物であって、同性別、同週齢のモデル動物と比較した場合に、心臓／体重比が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上増加していることを調べることによって容易に確認することができる。ここで、心臓／体重比とは、動物の心臓の重量を、その動物の重量で割った値をいう。心臓の重量は、その動物を解剖して心臓を取り出し、その重量を測定することにより測定できる。また、同週齢とは、特に制限はないが、例えば１６週齢等であってもよい。
また、得られたトランスジェニックモデル動物の心肥大が、遠心性心肥大か求心性心肥大であるか、又は拡張型心筋症であるか肥大型心筋症であるかは、公知の診断基準により診断することができる。
また、得られたトランスジェニックモデル動物の心肥大が、遠心性心肥大か求心性心肥大であるか、又は拡張型心筋症であるか肥大型心筋症であるかは、公知の診断基準により診断することができる。
また、より詳細な心疾患の病理学的所見及び超音波心臓図所見は次のようにして確認することができる。病理学的所見は、トランスジェニックモデル動物から調製された心臓切片をヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）、アザン染色及び抗ＮＣＸ１抗体染色し、顕微鏡下に観察することができる。また、麻酔したマウスの超音波心臓図所見は、超音波診断装置（左室Ｍモード）を用いて観察することができる。
例えば、本発明のＤＵＳＰ１３トランスジェニックモデル動物は、野生型動物に比べて心臓／体重比が増加している他、ＨＥ染色した心臓横断面において心筋の肥大が確認でき、ＨＥ染色した心臓組織切片像においても筋原線維の長さの増加が確認できる。
本発明の心疾患の予防又は治療効果を有する物質の薬理評価方法は、以下の（ｑ）及び（ｒ）の工程を含んでいる。
（ｑ）本発明のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与して薬理効果を評価する工程；
（ｒ）該トランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、該被検物質が該トランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に与えた薬理効果を評価する工程；
本発明の薬理評価方法における薬理効果の指標は、予防又は治療効果を期待する心疾患の種類により異なるため一概にいうことはできないが、心臓組織を調製し、心肥大、線維化、心筋壊死及び変性などの病理変化の改善を観察することにより、並びに、超音波心臓図検査（左心室拡張期径、左心室収縮期径及び左室内径短縮率の評価）により、投与群と非投与群を比較し、その心不全改善効果の程度を調べることによって、薬理効果を確認することができる。より具体的には、例えば、予防又は治療効果を期待する心疾患が、心肥大である場合は、上述の心臓／体重比等を指標とすることができる。より詳細にいえば、モデル動物の出生前又は出生後に被検物質を投与し、被検物質の投与群の心臓／体重比が、非投与群の心臓／体重比より小さい場合は、該被検物質は心肥大の予防又は治療効果が認められることになる。投与群のモデル動物と、非投与群のモデル動物は、同腹でなくてもよいが、同腹であることがより好ましい。
（ｑ）本発明のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与して薬理効果を評価する工程；
（ｒ）該トランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、該被検物質が該トランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に与えた薬理効果を評価する工程；
本発明の薬理評価方法における薬理効果の指標は、予防又は治療効果を期待する心疾患の種類により異なるため一概にいうことはできないが、心臓組織を調製し、心肥大、線維化、心筋壊死及び変性などの病理変化の改善を観察することにより、並びに、超音波心臓図検査（左心室拡張期径、左心室収縮期径及び左室内径短縮率の評価）により、投与群と非投与群を比較し、その心不全改善効果の程度を調べることによって、薬理効果を確認することができる。より具体的には、例えば、予防又は治療効果を期待する心疾患が、心肥大である場合は、上述の心臓／体重比等を指標とすることができる。より詳細にいえば、モデル動物の出生前又は出生後に被検物質を投与し、被検物質の投与群の心臓／体重比が、非投与群の心臓／体重比より小さい場合は、該被検物質は心肥大の予防又は治療効果が認められることになる。投与群のモデル動物と、非投与群のモデル動物は、同腹でなくてもよいが、同腹であることがより好ましい。
上記本発明の薬理評価方法により得られる心疾患の予防又は治療剤を医薬品として用いる場合、経口的あるいは非経口的に投与することができるが、経口的投与が好ましい。経口投与剤としては散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。また、非経口投与剤として注射剤、経皮製剤あるいは座薬等とすることができる。これらの製剤は活性成分に薬理学的、製剤学的に認容される助剤を加えることにより常法に従って製造することができる。助剤としては、例えば、経口剤および粘膜投与剤にあっては、軽質無水ケイ酸、澱粉、乳糖、結晶セルロース、乳糖カルシウム等の賦形剤、カルボキシメチルセルロ−ス等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシム等の滑沢剤などの製剤用成分が、また注射剤にあっては、生理食塩水、マンニトール、プロピレングリコ−ル等の溶解剤ないし溶解補助剤、界面活性剤などの懸濁化剤などの製剤用成分が、さらに外用剤にあっては、水性ないし油性の溶解剤ないし溶解補助剤、粘着剤などの製剤用成分が使用される。また、投与量は、対象疾患の種類、患者の年齢、性別、体重、症状、投与形態に応じて適宜決定することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
１．ヒトＤＵＳＰ１３遺伝子及びヒトＤＵＳＰ２６遺伝子の単離
ヒトＨｅＬａ細胞又はヒト組織由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトＤＵＳＰ１３をコードする遺伝子及びヒトＤＵＳＰ２６をコードする遺伝子をクローニングした。ヒトＤＵＳＰ１３をコードする遺伝子については、プライマーとして、配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。また、ヒトＤＵＳＰ２６をコードする遺伝子については、プライマーとして、配列番号７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、High Fidelity DNA ポリメラーゼであるKOD-Plus- (東洋紡社製）を用い、９８℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分間を１サイクルとして、これを３５サイクル行った（Perkin-Elmer社製のGene Amp PCR Systemを使用）。
このように、ヒトＤＵＳＰ１３（ｈＤＵＳＰ１３）及びヒトＤＵＳＰ２６（ｈＤＵＳＰ２６）のクローニングを行った。それぞれのアミノ酸配列を、配列番号２及び配列番号４にそれぞれ示す。
ヒトＨｅＬａ細胞又はヒト組織由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ヒトＤＵＳＰ１３をコードする遺伝子及びヒトＤＵＳＰ２６をコードする遺伝子をクローニングした。ヒトＤＵＳＰ１３をコードする遺伝子については、プライマーとして、配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。また、ヒトＤＵＳＰ２６をコードする遺伝子については、プライマーとして、配列番号７に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、High Fidelity DNA ポリメラーゼであるKOD-Plus- (東洋紡社製）を用い、９８℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分間を１サイクルとして、これを３５サイクル行った（Perkin-Elmer社製のGene Amp PCR Systemを使用）。
このように、ヒトＤＵＳＰ１３（ｈＤＵＳＰ１３）及びヒトＤＵＳＰ２６（ｈＤＵＳＰ２６）のクローニングを行った。それぞれのアミノ酸配列を、配列番号２及び配列番号４にそれぞれ示す。
２．ＤＵＳＰ１３トランスジェニックマウスの作製
上記１．で得られたヒトＤＵＳＰ１３遺伝子をコードするＤＮＡに、ＭｙｃタグをコードするＤＮＡをつなげてｐＭＥベクターに組み込むことにより、ｐＭＥ-Ｍｙｃ-ＤＵＳＰ１３を得た。このＭｙｃタグは、ヒトＤＵＳＰ１３のＮ末側に付加されている。次に、このｐＭＥ-Ｍｙｃ-ＤＵＳＰ１３を制限酵素ＨｉｎｄIII及びＫｐｎＩで処理した。この処理にて直鎖状に切り出された１．２ＫｂｐのＤＮＡは、ＳＲαプロモーター及びＳＶ ｅａｒｌｙ ｐｏｌｙＡを含んでいる。直鎖化したこのＤＮＡをアガロースゲルにて電気泳動して、このＤＮＡを含む部分を切り出し、該ＤＮＡをそこから精製した。この精製したＤＮＡを、マウス受精卵の前核（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）にマイクロピペットで導入した。それらの受精卵のうち、２９５個を偽妊娠雌マウスの卵管に移植し、６１匹のマウスが誕生した。誕生したマウスを、離乳するまで生育させた。離乳後のマウスの尻尾の一部を切断し、常法に従いゲノムＤＮＡを精製した。得られたゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、トランスジーン（ヒトＤＵＳＰ１３遺伝子）の導入を確認した。このＰＣＲの際、プライマーとして、配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
上記１．で得られたヒトＤＵＳＰ１３遺伝子をコードするＤＮＡに、ＭｙｃタグをコードするＤＮＡをつなげてｐＭＥベクターに組み込むことにより、ｐＭＥ-Ｍｙｃ-ＤＵＳＰ１３を得た。このＭｙｃタグは、ヒトＤＵＳＰ１３のＮ末側に付加されている。次に、このｐＭＥ-Ｍｙｃ-ＤＵＳＰ１３を制限酵素ＨｉｎｄIII及びＫｐｎＩで処理した。この処理にて直鎖状に切り出された１．２ＫｂｐのＤＮＡは、ＳＲαプロモーター及びＳＶ ｅａｒｌｙ ｐｏｌｙＡを含んでいる。直鎖化したこのＤＮＡをアガロースゲルにて電気泳動して、このＤＮＡを含む部分を切り出し、該ＤＮＡをそこから精製した。この精製したＤＮＡを、マウス受精卵の前核（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）にマイクロピペットで導入した。それらの受精卵のうち、２９５個を偽妊娠雌マウスの卵管に移植し、６１匹のマウスが誕生した。誕生したマウスを、離乳するまで生育させた。離乳後のマウスの尻尾の一部を切断し、常法に従いゲノムＤＮＡを精製した。得られたゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、トランスジーン（ヒトＤＵＳＰ１３遺伝子）の導入を確認した。このＰＣＲの際、プライマーとして、配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
３．ＤＵＳＰ１３トランスジェニックマウスの解析
トランスジーンの導入が確認されたマウスのうち、一匹のメス（ＤＵＳＰ１３Ｔｇ）について１６週齢にて外観の観察を行った。対照として、１６週齢メスの野生型マウス（ＷＴ）の外観も観察した。その結果を図１に示す。図１から分かるように、ＤＵＳＰ１３ Ｔｇの方が、ＷＴより体長が長い。体重を測定したところ、ＤＵＳＰ１３ Ｔｇは２９．９ｇ、ＷＴは２１．７gであった。
トランスジーンの導入が確認されたマウスのうち、一匹のメス（ＤＵＳＰ１３Ｔｇ）について１６週齢にて外観の観察を行った。対照として、１６週齢メスの野生型マウス（ＷＴ）の外観も観察した。その結果を図１に示す。図１から分かるように、ＤＵＳＰ１３ Ｔｇの方が、ＷＴより体長が長い。体重を測定したところ、ＤＵＳＰ１３ Ｔｇは２９．９ｇ、ＷＴは２１．７gであった。
次に、ＤＵＳＰ１３ Ｔｇ及びＷＴをそれぞれ解剖し、心臓を取り出して重量を測定した。取り出したそれぞれの心臓の肉眼的所見を図２に示す。心臓の重量は、ＤＵＳＰ１３ Ｔｇが０．２４ｇ、ＷＴが０．１３６ｇであった。体重と心臓の重量から、心臓／体重比を算出したところ、ＤＵＳＰ１３ Ｔｇは０.００８であり、ＷＴは０．００６であった。このことから、ＤＵＳＰ１３ Ｔｇの心臓は、心肥大を発症していることが示された。なお、ＤＵＳＰ１３ Ｔｇ（Ｔｇ）及びＷＴの心臓重量（図５上）、及び心臓／体重比（図５下）を図５に示す。
また、上記のＤＵＳＰ１３ Ｔｇ及びＷＴにおいて、同じ横紋筋である心筋、大腿筋のヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）による病理組織学検査を行った。ＨＥ染色した心臓の横断面を図３に示す。また、ＨＥ染色した左右心室における心臓組織切片像を図４に示す。図３及び図４から分かるように、ＤＵＳＰ１３ Ｔｇの心臓では、ＷＴに対する絶対重量及び相対重量の増加に対応して、心筋の肥大が認められた。一方、大腿筋におけるＨＥ染色の結果、大腿筋では、特記すべき明らかな変化は認められなかった。
４．ＤＵＳＰ２６トランスジェニックマウスの作製
上記１．で得られたヒトＤＵＳＰ２６遺伝子をコードするＤＮＡに、ＨＡタグをコードするＤＮＡをつなげてｐＭＥベクターに組み込むことにより、ｐＭＥ-ＨＡ-ＤＵＳＰ２６を得た。このＨＡタグは、ヒトＤＵＳＰ２６のＮ末側に付加されている。次に、このｐＭＥ-ＨＡ-ＤＵＳＰ２６を、制限酵素ＨｉｎｄIII及びＫｐｎＩで処理した。この処理にて直鎖状に切り出された１．７ＫｂｐのＤＮＡは、ＳＲαプロモーター及びＳＶ ｅａｒｌｙ ｐｏｌｙＡを含んでいる。
直鎖化したこのＤＮＡをアガロースゲルにて電気泳動して、このＤＮＡを含む部分を切り出し、該ＤＮＡをそこから精製した。この精製したＤＮＡを、マウス受精卵の前核（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）にマイクロピペットで導入した。それらの受精卵のうち、４９３個を偽妊娠雌マウスの卵管に移植し、３４匹のマウスが誕生した。誕生したマウスを、離乳するまで生育させた。離乳後のマウスの尻尾の一部を切断し、常法に従いゲノムＤＮＡを精製した。得られたゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、トランスジーン（ヒトＤＵＳＰ２６遺伝子）の導入を確認した。このＰＣＲの際、プライマーとして、配列番号９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
上記１．で得られたヒトＤＵＳＰ２６遺伝子をコードするＤＮＡに、ＨＡタグをコードするＤＮＡをつなげてｐＭＥベクターに組み込むことにより、ｐＭＥ-ＨＡ-ＤＵＳＰ２６を得た。このＨＡタグは、ヒトＤＵＳＰ２６のＮ末側に付加されている。次に、このｐＭＥ-ＨＡ-ＤＵＳＰ２６を、制限酵素ＨｉｎｄIII及びＫｐｎＩで処理した。この処理にて直鎖状に切り出された１．７ＫｂｐのＤＮＡは、ＳＲαプロモーター及びＳＶ ｅａｒｌｙ ｐｏｌｙＡを含んでいる。
直鎖化したこのＤＮＡをアガロースゲルにて電気泳動して、このＤＮＡを含む部分を切り出し、該ＤＮＡをそこから精製した。この精製したＤＮＡを、マウス受精卵の前核（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）にマイクロピペットで導入した。それらの受精卵のうち、４９３個を偽妊娠雌マウスの卵管に移植し、３４匹のマウスが誕生した。誕生したマウスを、離乳するまで生育させた。離乳後のマウスの尻尾の一部を切断し、常法に従いゲノムＤＮＡを精製した。得られたゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、トランスジーン（ヒトＤＵＳＰ２６遺伝子）の導入を確認した。このＰＣＲの際、プライマーとして、配列番号９に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
Claims (16)
- 以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを体細胞染色体中に保有する心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物。
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号１の塩基番号７８〜６７４からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１３８位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列； - ＤＮＡがヒト由来である請求項１に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物。
- 以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを体細胞染色体中に保有する心疾患モデル非ヒト哺乳動物。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１３８位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１３８位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１３８位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列； - ＤＮＡがヒト由来である請求項３に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物。
- 以下の（Ａ）〜（Ｆ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを体細胞染色体中に保有する心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物。
（Ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ（Dual Specificity Phosphatase）活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステインであるアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｄ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列；
（Ｅ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（Ｆ）配列番号３の塩基番号３３４〜９６９からなる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ、１５２位がシステインであり、二重特異性ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列； - ＤＮＡがヒト由来である請求項５に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物。
- 以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかの塩基配列からなるＤＮＡを体細胞染色体中に保有する心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物。
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１５２位のシステインが他のアミノ酸に置換され、１５２位のシステイン以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、１５２位がシステイン以外のアミノ酸であり、かつ該アミノ酸配列からなるタンパク質が二重特異性ホスファターゼ阻害活性を有するアミノ酸配列； - ＤＮＡがヒト由来である請求項７に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物。
- 非ヒト哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサルからなる群から選ばれるいずれかの非ヒト哺乳動物である請求項１〜８のいずれかに記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物。
- 心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物が、心肥大のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物である請求項１〜９のいずれかに記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物。
- 心肥大のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物が、遠心性心肥大のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物である請求項１０に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物。
- 遠心性心肥大のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物が、拡張型心筋症のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物である請求項１１に記載の心疾患のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物。
- 以下の（ｑ）及び（ｒ）の工程を含む、心疾患の予防又は治療効果を有する物質の薬理評価方法。
（ｑ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載のトランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与して薬理効果を評価する工程；
（ｒ）該トランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に被検物質を投与しなかった場合の薬理効果と比較し、該被検物質が該トランスジェニックモデル非ヒト哺乳動物に与えた薬理効果を評価する工程； - 心疾患が、心肥大である請求項１３に記載の心疾患の予防又は治療効果を有する物質の薬理評価方法。
- 心肥大が、遠心性心肥大である請求項１４に記載の心疾患の予防又は治療効果を有する物質の薬理評価方法。
- 遠心性心肥大が、拡張型心筋症である請求項１５に記載の心疾患の予防又は治療効果を有する物質の薬理評価方法。
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| CN114097710A (zh) * | 2021-12-01 | 2022-03-01 | 成都合拓创展生物科技有限公司 | 一种心肌肥大和骨质疏松的动物模型的构建方法及应用 |
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